UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CENTRO DE AQUICULTURA CAMPUS DE JABOTICABAL

TOXICIDADE AGUDA DO SULFATO DE COBRE E DO TRICLORFON PARA TRS ESPCIES DE DAPHNIAS EM PRESENA E AUSNCIA DE SEDIMENTO

LUIS RICARDO ROMERO A RAUCO

Dissertao apresentada ao Centro de Aquicultura da Universidade Estadual Paulista Cmpus de laboticabal, como requisito parcial para obteno do ttulo de Mestre em Aquicultura de guas Continentais.

Jaboticabal SP Outubro de 2002

A Deus,

A meus irmos, Miriam, Waldo, Ivan e primos Rugo e Miguel Obrigado pelo grande apoio

Dedico este trabalho

Agradecimento
Ao Centro de Aquicultura da UNESP de Jaboticabal pela estrutura oferecida; Ao Prof Dr. Joaquim Gonlves Machado Neto por aceitar minha orientao; Aos membros da banca examinadora Prof Dr. Flbio Ruas de Moraes e Dr. Julio Lombardi pelas sugestes e correo deste trabalho; A todos os professores do Caunesp que amim trasmiteram seusconhecimentos, em especial ao Prof Edivaldo Pezzato, Elisabeth Criscuolo Urbinati, Elisabete Maria Macedo Viegas, Marta Vemardino De Stfani, Lcia Reina Sipaba Tabares, Francisco Manuel de Souza Braga, Roberto Goitein, Newton Castagnolli, Wagner Cotroni Valenti, Gilson Luiz Valpato, Antnio de Pdua Sousa, Mauiricio LateraMartins; Agradeo especialmente as amigas colegas do Caunesp. Rachei e Carla, pela ajuda na correo da aula de qualificao e dissertao; Aos amigos colegas do Caunesp Adriana Sacioto, Adriana Mufioz, Denise, Rosangela, Sonia, Virginia, Claudia Franco, Daniaela, Fabiana, Janessa, Karina, Lusiene, Leda, Maria Isabel, Ana Isabel, Ana Paula, Ana Eliza, Antonio, Claudinei, Eduardo, Flvio, GilbertoMarcel, Marcelo, Marcos, Rodrigo, Ronald, Adriano, Antonio Femando, Atomu, Camilo Ernesto, rico, Faviano, Jaime, Leonardo, Lot, Marcelo Assano, Newton e Nilton por terem compartilhado bons momentos e amizade; Aos amigos e colegas do Departamento de Fitosanidade da FCA V: Glaucia, Marcelo, Adriano, Maurcio e Daniele pela amizade e convivncia; Aos amigos administrativos do Caunesp Veralice, Fatima, Juliana, Ana, Simone, Mnica, Suerli, Alta, Valdecir, Marcio, Mauro, Silvinha, por tenn sido to prestativos.

Aos amigos administrativos do Departamento de Fitosanidade da FCAV Unesp- Jaboticabal Gilson, Reinaldo, Dionisio, Luiz Carlos, Jos Valdeci, Raquel, Maria Isabel, Natalina e Rosangela pela amizade e convivncia;

Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade aguda CE50-48 h do sulfato de cobre e trichlorfon, comparar a sensibilidade e avaliar o risco de intoxicao ambiental para trs espcies de daphnias (D. similis, D. magna e D. laevis) na ausncia e presena de sedimento. Os testes de toxicidade aguda foram realizados em condies de laboratrio, em sala climatizada de acordo com metodologias normatizadas com algumas adaptaes. Os valores de CE50-48h calculados para D. magna foram de 0,345 mg de sulfato de cobre /L com sedimento e 0,045 sem sedimento; para D. similis, 0,282 com sedimento e 0,042 sem sedimento e para D. laevis, 0,140 com sedimento e 0,107 sem sedimento. Os valores de CE5048h

calculados para D. magna foram de 299,70 g de trichlorfon /L com sedimento e 0,70

sem sedimento; para D. similis, 381,62 com sedimento e 0,52 sem sedimento e para D. laevis, 282,72 com sedimento e 0,92 sem sedimento. O trichlorfon foi mais txico que o sulfato de cobre para as trs espcies de daphnias. O sedimento reduziu significativamente a biodisponibilidade do trichlorfon e do sulfato de cobre na gua de cultivo para as trs espcies de daphnias. Em ausncia de sedimento, a Daphnia magna e a Daphnia similis no apresentam diferena de sensibilidade aos dois agrotxicos, mas a Daphnia laevis foi significativamente mais sensvel que as outras duas espcies. Na presena do sedimento houve diferena de sensibilidade entre as espcies de daphnia, sendo a Daphnia magna mais sensvel, seguida pela Daphnia similis e Daphnia laevis, que apresentou a menor sensibilidade ao sulfato de cobre. Na ausncia do sedimento, as trs espcies de daphnia no apresentam diferena de sensibilidade ao trichlorfon. Na presena do sedimento, a Daphnia magna e a Daphnia laevis no apresentam diferena de sensibilidade ao trichlorfon. O uso do sulfato de cobre e trichlorfon na piscicultura foi classificado como de alto risco de intoxicao ambiental para as trs espcies de daphnias.

1 INTRODUO A utilizao de agrotxicos, indiscutivelmente, tem contribudo para o aumento da produo agrcola e agropecuria mundial. Contudo, o uso indiscriminado destes compostos txicos tem causado impactos negativos ao meio ambiente (RAND e PETROCELLI, 1985). Os lanamentos mais comuns de poluentes na rede hidrogrfica envolvem a entrada de determinados elemento txico em perodos de tempo de curta durao e em alta concentrao, o qual transportado no meio aqutico como um pulso, reduzindo a concentrao e aumentando a extenso da distribuio. Diante de toda esta problemtica surgiu, nos ltimos anos, uma nova linha de pesquisa denominada de toxicologia aqutica. Segundo RAND e PETROCELLI (1985), a toxicidade aqutica compreende o estudo quantitativo e qualitativo do efeito txico de substncias qumicas e de outras substncias antropognicas sobre os organismos aquticos. A contaminao do ambiente aqutico por agrotxicos pode ocorrer por diversas vias, sendo as mais comuns a aplicao direta visando o controle de elementos patognicos e de doenas dos organismos e de plantas aquticas, e indireta: como conseqncia de pulverizaes agrcolas, em que os contaminantes de so carregados com partculas de solo, lixiviao com a gua e por lavagem de equipamentos utilizados nas aplicaes (BAPTISTA, 1988).

O sulfato de cobre e o tricholorfon so agrotxicos usados na aqicultura para o controle de agentes com potencial patognicO e doenas de peixes. Entretanto, esses usos podeM alterar a composio natural da flora e fauna aqutica. Alm disso, a

deteriorao e a poluio dos recursos hdricos naturais tm como conseqncia importante a impossibilidade de aproveitamento das guas para uso humano (FONSECA, 1991), ou de animal. Alm da intoxicao aguda, resultante da exposio a substncias txicas, os organismos aquticos podem sofrer intoxicao crnica quando expostos por prolongados perodos de tempo a concentraes subletais. Este problema agravado devido tendncia de metais pesados, como o cobre, se acumularem no sedimento, onde podero ser translocados atravs dos diversos componentes da cadeia biolgica, ocasionando sua bioconcentrao (RAND e PETROCELLI, 1985) e biomagnificao. O estudo da biota uma das maneiras de se avaliar e detectar possveis mudanas no corpo de gua como conseqncia do lanamento de substncias poluidoras. Os bioensaios aquticos fornecem dados de toxicidade que podem ser utilizados na formulao de padres de qualidade de gua para compostos cujos contaminao ambiental que representam riscos de intoxicao potencial risco. Os bioensaios de avaliao de toxicidade dos compostos txicos realizados em diferentes laboratrios podem fornecer resultados que podero ser comparativos. Esforos tm sido realizados para padronizao de procedimentos de tais testes, determinar boas espcies de indicadoras e boa reprodutibilidade em laboratrio, alm dos envidados para estabelecer padres de qualidade de gua, temperatura e de todos os parmetros conhecidos como modificadores da toxicidade (PASCOE, 1977).

Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a toxicidade aguda (CE50-48h) do sulfato de cobre e do inseticida trichlorfon para trs espcies de daphnias (Daphnia similis, Daphnia magna e Daphnia laevis) na ausncia e presena de sedimento; 2) comparar a sensibilidade destas trs espcies de microcrustceos ao sulfato de cobre, ao trichlorfon e dicromato de potssio (substncia de referncia); 3) estimar o risco de intoxicao ambiental devido contaminao resultante do uso desses dois agrotxicos em piscicultura, na ausncia e presena do sedimento em condies de laboratrio.

2. REVISO DE LITERATURA

2.1. Teste de avaliao da toxicidade aguda de substncias txicas 2.1.1. Histrico O primeiro trabalho no pas sobre avaliao de toxicidade de agrotxicos para organismos aquticos foi realizado por ALMEIDA (1987), na tentativa de determinar a toxicidade do DDT para fmeas de Phallocero caudimaculatus. Nesta poca no existia qualquer padronizao quanto aos procedimentos laboratoriais e ao estabelecimento de parmetros biolgicos e fsico-qumicos para a realizao dos testes. BRANCO (1960) estudou a ao de sulfato de zinco, cloreto de zinco, sulfato de cobre e dimetiltiocarbato de zinco sobre guar-guar. Verificou que os efeitos da exposio deste peixe soluo de cloreto de zinco poderiam ser alterados pela utilizao de aeradores na soluo. De fato, a soluo arejada foi mais txica para os organismos, embora as concentraes fossem as mesmas. No final da dcada de 70 foi constitudo um grupo de pesquisadores com o objetivo de padronizar metodologias e editar normas nacionais sobre testes de avaliao de toxicidade aguda e crnica utilizando-se organismos-testes j eleitos nas normas internacionais e nativos. Foram realizados testes de toxicidade com os peixes das seguintes

espcies: Hemigramus marginaltus (nativo), Tilapia melanopleura e Cyprinus carpio, Salmo gairdneri, Poecilia reticulata e Brachyodaphnia dubia (extico). Tambm foram realizados testes de toxicidade com cladceros das espcies: Daphnia similis, Ceriodaphnia dubia (exticas). Estes organismos foram expostos a efluentes industriais, solues de compostos metlicos e detergentes com a finalidade de se avaliar a concentrao letal 50 % (PEREIRA et al., 1987). Testes de toxicidade crnica foram realizados com o Geophagus brasiliensis (espcie nativa), exposto a ons cpricos. PEREIRA et al. (1987) verificaram que exposio crnica a ions cpricos pode provocar degenerao nas clulas do bao, fgado e intestinos, enquanto que nas brnquias ocorreu apenas o acmulo de sais de cobre. Poucas espcies de organismos nativos utilizadas em testes de toxicidade no Brasil, sejam agudos ou crnicos. Este fato deve-se maior facilidade na interpretao dos resultados quando se utilizam espcies j padronizadas, possibilidade de estabelecer comparaes com estudos j feitos em diferentes pases, s dificuldades decorrentes da ausncia de estudos minuciosos sobre a biologia e ecologia de espcies nativas que possam ser utilizadas (FONSECA, 1991). No Brasil, os rgos governamentais responsveis pela regulamentao e edio de diretrizes e normas so os Ministrios da Sade e do Meio Ambiente, e a CETESB, no Estado de So Paulo, entre outras, essas institues tm demostrado a necessidade da avaliao de riscos de intoxicao ambiental decorrentes do uso dos agrotxicos (GUIMARES, 1996).

2.1.2. Conceituao e metodologias dos testes de avaliao de toxicidade de substncias txicas.

Os bioensaios com organismos aquticos em condies de laboratrio possibilitam a qualificao e a mensurao dos efeitos dos compostos orgnicos txicos sobre a biota e a estimativa dos riscos de intoxicao ambiental. Os bioensaios, aplicados ao controle da poluio da gua, permitem estimar os efeitos dos principais poluentes do meio ambiente, frente a organismos aquticos (marinhos ou dulccolas), pertencentes a diferentes nveis trficos destes ecossistemas (Soares, 1985, apud. ALMEIDA, 1987). A toxicologia clssica estuda, em condies de laboratrio, os efeitos de txicos sobre organismos individuais, sistemas, rgos, tecidos e clulas, objetivando extrapolar os resultados obtidos para a populao humana. A toxicologia do ecossistema limitada a dados disponveis sobre espcies de interesse. A ecotoxicologia uma cincia complexa e multidisciplinar, que se preocupa com a avaliao do risco que determinada perturbao pode trazer a determinado ecossistema, bem como o desenvolvimento de mtodo que contribua para a determinao desse risco. Assim, a ecotoxicologia estuda os efeitos dos agentes txicos sobre a estrutura e a funo de comunidades biticas e sobre sua integrao com os componentes abiticos (GUIMARES, 1996). O universo de testes de toxicidade grande e, por razes prticas e econmicas, a escolha deve atender as exigncias cientficas, de modo que as tcnicas sejam reconhecidas ou padronizadas nacional ou internacionalmente (Cabidenc, 1980 apund ZAGATTO e GOLDTEIN, 1991). Com esta finalidade, para o ambiente aqutico, foram desenvolvidos e utilizados principalmente testes com peixes, microcrustceos, algas e

bactrias, sendo que alguns mtodos j foram padronizados e outros esto em vias de padronizao. O termo teste de toxicidade aqutica foi proposto por RAND e PETROCELLI (1985), por acharem que o termo bioensaio seria aplicado apenas s indstrias farmacuticas, que deles se utilizam para avaliar a potncia de vitaminas e outros compostos farmacologicamente ativos. O teste de toxicidade aqutica um procedimento no qual as respostas de organismos aquticos so usadas para detectar ou medir a presena ou efeito de uma ou mais substncias, resduos ou fatores ambientais, sozinhos ou em combinao. Estes testes so utilizados para avaliar a poluio do corpo de gua quando os testes qumicos e fsicos no so suficientes para avaliar os efeitos potenciais sobre a biota aqutica e, conseqentemente, estabelecer procedimentos para proteg-la (GOLTEIN et al, 1983). Por meio dos testes de avaliao da toxicidade determina-se o tempo e as concentraes em que o agente qumico potencialmente prejudicial para determinado organismo. Para qualquer produto, o contato com a membrana celular ou sistema biolgico pode no produzir efeito adverso se a concentrao do produto for baixa ou o tempo de contato for insuficiente. Por outro lado, concentraes e tempo de exposio podero no ter efeitos prejudiciais em tempo de exposio extremamente curtos (RAND e PETROCELLI, 1985). Os testes de toxicidade so realizados para estudar a toxicidade aguda, crnica, a bioacumulao e a biodegradao das substncias txicas, alm dos testes subletais, que podem ser reunidos em trs grupos bsicos: bioqumicos e fisiolgicos, comportamentais e histolgicos. Existem ainda os testes realizados em condies onde os organismos so expostos dentro de gaiolas nas guas dos rios ou lagos, que eventualmente estejam contaminadas (RAND e PETROCELLI, 1985).

Os testes de avaliao da toxicidade das substncias txicas obedecem a um modelo geral de procedimento, que consiste na exposio de organismos-teste a diferentes concentraes do agente txico em recipientes sob rigoroso controle das condies ambientais como temperatura, pH e alcalinidade (RAND e PETROCELLI, 1985). Para efeito de monitoramento de um corpo da gua receptor de efluentes contaminados contendo substncias txicas, os testes de toxicidade mais utilizados em laboratrio so os de avaliao da toxicidade aguda e crnica. Nos testes agudos, os organismos so expostos aos agentes txicos em curto perodo de tempo, e nos testes crnicos o tempo de exposio envolve perodos bem mais longos, podendo incluir todo o ciclo de vida do organismo. Assim, o impacto dos agrotxicos sobre os organismos do ambiente aqutico pode ser estimado e monitorado por testes de toxicidade conduzidos em condies de laboratrio (RAND e PETROCELLI, 1985). Nos testes de avaliao da toxicidade aguda das substncias txicas estimase, por meios de modelos matemticos e/ou estatsticos, a CL50 concentrao letal 50% (CE50), definida como a concentrao estimada que produz mortalidade em 50% da populao exposta ao agente txico por determinado perodo de tempo. Este perodo varivel com a espcie teste utilizada, mas geralmente situa-se entre 24 e 96 horas (RAND e PETROCELLI, 1985). Os testes de avaliao da toxicidade aguda so freqentemente conduzidos em o sistema esttico, ou seja, sem renovao de gua no decorrer do experimento. Este sistema muito utilizado por ser mais simples e menos dispendioso quanto comparado ao sistema semi-esttico (renovao parcial) ou ao sistema de fluxo contnuo (renovao contnua) (RAND e PETROCELLI, 1985). O valor CE50 ou CL50 pode ser calculado por diferentes mtodos estatsticos, entre os quais o da interpolao Moving Average (BENNET, 1952), o Probit (FINNEY,

1971), o mtodo Binomial (STEPHAN, 1977) e o mtodo Treimed Sperman Karber (HAMILTON et. al., 1977). LOMBARDI (1999), estudando a toxicidade aguda de diferentes agrotxicos para o camaro de gua doce, verificou resultados estatisticamente semelhantes com esses diferentes mtodos de clculo da CE50.

2.3. Seleo dos organismos teste para avaliao de toxicidade aguda.

Os resduos de compostos qumicos introduzidos num ecossistema aqutico podem provocar efeitos txicos em vrias espcies, principalmente quando a descarga alta, em termos de concentrao, em rea relativamente pequena (FONSECA, 1991). Para a escolha de organismos-teste visando ensaios de toxicidade aqutica, em condies de laboratrio, vrios critrios podero ser utilizados. BAUDO (1987) cita que para a United States Enviromental Protection Agency USEPA so considerados os

seguintes aspectos: - que o organismo seja representativo de um importante grupo ecolgico, em termos de taxonomia ou nvel trfico, ocupando, portanto, uma importante posio na cadeia alimentar; - a disponibilidade para execuo dos testes, implicando, em fcil cultivo e manuteno em laboratrio, alm de estabilidade gentica; e - a existncia de informaes em relao biologia e ecologia da espcie. RAND e PETROCELLI (1985) enumeram algumas caractersticas bsicas que devem ser observadas em relao aos organismos-teste, e so as seguintes: usar espcies representativas de vrias sensibilidades substncia-teste; dar preferncia a espcies abundantes e facilmente disponveis; sempre que possvel, estudar espcies nativas, ou representativas dos sistemas que iro receber o impacto;

dar preferncia s espcies econmica e ecologicamente importantes; as espcies utilizadas devem ser facilmente adaptveis s condies de laboratrio; e preferencialmente utilizar espcies de comportamento fisiolgico e gentica conhecida. Segundo TRARWEL e DOUDOROFF (1952) e SPRAGUE (1969), os

cientistas que trabalham com testes de toxicidade aqutica seguem trs diferentes tendncias para a seleo de espcies a serem testadas. Tais tendncias so complementares, dependendo principalmente do objetivo do trabalho. A primeira delas consiste em testar vrias espcies. Isto seria o desejvel, mas normalmente no feito devido demanda de tempo e esforo. Freqentemente, as espcies mais sensveis so testadas inicialmente e detalhadamente. A segunda consiste na escolha da espcie local mais importante e a terceira o uso de espcie padres. Entretanto, no existem espcies testes padres que possam ser utilizadas como representante de diferentes tipos de ecossistemas (BUIKEMA e CAIRS., 1980). Certamente a deteco e reaes txicas torna-se mais precisa com o conhecimento detalhado da fisiologia, histologia e comportamento da espcie teste. Os resultados obtidos com espcies padres devem ser comparados com os de espcies locais, visando contribuir para a identificao e a quantificao dos efeitos txicos (SPRAGUE, 1969).

2.4. Testes de avaliao da toxicidade aguda com daphnia

Os

testes

de

avaliao

da

toxicidade,

de

compostos

qumicos

tradicionalmente tm sido realizados com ampla variedade de espcies aquticas representantes de diferentes nveis trficos, como os mais diversos grupos de invertebrados e peixes e, dentro de cada grupo taxonmico, so selecionados os organismos mais sensveis (FONSECA, 1991). As daphnias so abundantes no meio aqutico, possuem papel importante

na cadeia alimentar (como presa e predador), ocupam diferentes nveis trficos e, quando cultivadas em laboratrio, apresentam sensibilidade definida (Soares,1985 apud ALMEIDA., 1987). A Daphnia magna um microcrustceo comum no meio aqutico usado como alimento na criao de alevinos de peixes (PAUW et al., 1981). a espcie-teste mais usada no mundo em testes de toxicidade devido sua sensibilidade e eficincia nos testes. Foi selecionada e adaptada nas metodologias normatizadas por instituies internacionais (ISO, USEPA, OECD, DIN, AFFNOR) e nacionais (CETESB, ABNT, IBAMA). Seu ciclo biolgico curto, reproduz-se por partenognese e de fcil manejo no laboratrio (IBAMA, 1987; ABNT, 1993; CETESB, 1991; KOVISTO, 1995; USEPA, 1985; BUIKEMA e CAIRS., 1982), Prestando-se para a execuo de testes de toxicidade crnica e aguda. Daphnia magna e Daphnia similis ocorrem em diversos ecossistemas da Europa e Estados Unidos (BROOKES, 1957; SCOURFIELD e HARDING, 1966; PENNAK, 1953). A Daphnia laevis uma espcie nativa que ocorre em diversos ecossistemas aquticos nos Estados Unidos (BROOKES, 1957), Brasil (ELMOOR, 1997), Argentina (PAGGI, 1977), Colmbia (SINGERLIN, 1914) e Amrica Central (VANDE VELDE, et al., 1978). Assim, verifica-se que as espcies Daphnia magna e Daphnia similis so utilizadas em testes de toxicidade no Brasil, mesmo no sendo nativas do pas. Por outro lado, a Daphnia laevis ocorre naturalmente no pas, mas no est includa nas normas brasileiras de testes de avaliao da toxicidade aguda e ainda no foi utilizada neste tipo de estudo. Portanto, a avaliao da possibilidade de usar esta espcie como organismo-teste em ensaios de toxicidade aguda de agrotxicos atende s premissas bsicas para a seleo de tais organismos- teste (SPRAGUE, 1969; BUIKEMA e CAIRS., 1982; RAND e PETROCELLI, 1985; BAUDO, 1997).

As daphnias podem ser cultivadas em gua natural com pH entre 7,2 e 7,6; dureza entre 40 mg/L a 48 mg/L CaCO3 ; condutividade 160 S/cm ou gua natural superficial ou subterrnea, filtrada em rede de zooplncton com 30 ou 45 m e pH prximo da neutralidade (IBAMA, 1987; CETESB, 1991; ABNT, 1993). As daphnias tambm podem ser cultivadas no meio denominado de M4, com pH 7,0 0,2, dureza total de 250 15 mg/L de CaCO3 (DEUUSCHES INSTITUT FUR NORMUNG, 1982).

2.5. Caracterstica das espcies de daphnias selecionadas para estudo neste trabalho

Segundo ELMOOR (1997) as daphnias pertencem Ordem Anomopoda (Sars, 1865); Famlia Daphniidae (Straus, 1820); e ao Gnero Daphnia (MULLER, 1785). Na Figura 1 verifica-se um exemplar de cada uma das espcies de Daphnia utilizadas nesse trabalho.

A
B C

Figura 1. Espcimes das trs espcies de daphnias Daphnia similis (A) Daphnia magna (B) Daphnia laevis (C).

A Famlia Daphniidae apresenta antnulas pequenas e nove setas olfativas na fmea. Antenas cilndricas, com setas. Olhos grandes e ocelos geralmente pequenos ou ausentes. Estes organismos tm o ps-abdmen geralmente comprido, sempre com espinhos anais, setas natatrias no colocadas em projeo ou papila. As garras no tm espinhos, sendo sempre denticuladas e algumas vezes pectinada. Tm cinco pares de patas, sendo os dois primeiros prnseis; o quinto par tem uma grande seta recurvada, estendendo-se ao saco branquial. O intestino simples, com dois cecos hepticos. O macho, em geral, tem um gancho no primeiro par de patas (ELMOOR, 1997). O gnero Daphnia tem forma oval ou elptica, exceto quando modificada pelo elmo e o corpo comprido lateralmente. Os organismos tm valvas reticuladas, com espinho no ngulo posterior-dorsal e espculas nas margens ventral e dorsal. O rostro desenvolvido e pontiagudo na fmea adulta. As antnulas so pequenas ou rudimentares, no mveis e situadas sob o rostro. Estes organismos tm trs ou quatro processos abdominais, geralmente todos bem desenvolvidos, sendo o primeiro mais longo e em forma de lngua. Apresentam efipios com ovos quando as condies ambientais so desfavoraveis. Os machos tm rostro, antnulas longas e moveis, normalmente com flagelo e o primeiro par de patas com longo flagelo e gancho (ELMOOR, 1997). A Daphnia magna um microcrustceo utilizado em testes de toxicidade por serem de fcil e econmica manuteno em condies em laboratrio, pois so relativamente pequenos, tem ciclo de vida curto, alta fecundidade e reproduzem-se por partenognese (IBAMA, 1987; CETESB, 1991; KOVISTO, 1995). A Daphnia laevis (BIRGE, 1878) tem o espinho da carapaa longa, freqentemente com 2/3 ou mais do comprimento da valva; tem cerca de da margem ventral e parte da margem dorsal da carapaa com espculas; cabea alongada, nunca formando um elmo pontiagudo; rostro pontiagudo direcionado posteriormente e, em geral,

com a extremidade entre as margens anteriores ventrais da carapaa. Ocelo presente. As antenas so curtas, com cerdas que no alcanam a margem posterior da carapaa. Tm garras com trs pectens de espculas finas e iguais em tamanho. O segundo processo abdominal cerca do comprimento do primeiro e aproximadamente igual ao terceiro; comprimento total do animal entre 1,0 e 2,0 mm (ELMOOR, 1997).

2.6. Uso dos agrotxicos selecionados para estudo neste trabalho

O trichlorfon um inseticida organofosforado muito para o controle de pragas como lagartas, brocas, cigarras, percevejos, moscas da fruta e mariposa que ocorre nas culturas de algodo, amendoim, arroz, banana, cacau, caf, cana-de-acar, citros, feijo, girassol, goiaba, mangueira, milho, pastagem, seringueira, soja, tomate, trigo e videira (ANDREI, 1996). Este inseticida tambm recomendado para o controle de parasitos de peixes em piscicultura (KUBITZA e KUBITZA, 1998). O trichlorfon (metrifonato) pode ser usado para o tratamento de girodactildeos, dactilogirdeos na dose de 0,5 mg/L de gua, durante trs dias. Tambm pode ser usado para o controle de coppodos ergasilidae em banhos de imerso rpida, de cinco a dez minutos, no concentrao de 2,5 g/L de gua usa-se quatro vezes por semana a temperatura no superior de 32 C. Para o controle de Lernea sp., banhos de imerso rpida, cinco a dez minutos na concentrao de 25 g/L quatro vezes por semana ou banhos

prolongados de 0,5 mg/L de gua, durante trs dias. Para tratamento de Argulus foliaceus, 20 ml/L de gua, em banhos de imerso de apenas dois minutos (PAVANELLI et al., 1999). O trichlorfon um inseticida organofosforado bastante usado no controle de crustceos parasitos de peixes (Lernaea sp., Argulus sp. e Ergasilus sp.), tremtodos monogneos e sanguessugas, bem como na erradicao de ninfas aquticas em forma de

tratamentos indefinidos com concentraes de 0,13 a 0,25 mg/L; banhos prolongados com 1 a 2,5 mg/L e banho 1 a 3 minutos com 10 mg/L (KUBITZA, 1999). O sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e recomendado na aquicultura para o controle de protozorios, tremtodos monognios, fungos e baterias externas. Nos Estados Unidos usado como algicida e sem restrio para uso em cultivos de peixes de mesa (KUBITZA e KUBITZA, 1998). um potente algicida, herbicida, eliminando o fitoplncton e plantas aquticas, podendo causar drstica reduo na concentrao de oxignio dissolvido na gua (KUBITZA, 1998). O artigo 21 da Resoluo CONAMA n 020, de 18 de julho de 1986 estabelece que o valor mximo admissvel de 1,0 mg de sulfato de cobre /L de gua e de 1,0 g de inseticidas organofosforados /L de gua (IBAMA, 1987). O sulfato de cobre pode ser usado para o controle de protozorios em peixes na dose de 0,33 a 2 mg/L por tempo indefinido (REICHENBACH-KLINKE, 1982; POST, 1987; KINKLELIN et al., 1991; NOGA , 1996).

2.7. Caractersticas principais dos agrotxicos selecionados para estudo neste trabalho 2.7.1. Trichlorfon O trichlorfon (dimetil-hidroxi-2,2,2,-tricloroel) um inseticida no sistmico com ao de contato e ingesto. Atua inibindo a enzima acetilcolinesterase no sistema colinrgico do sistema nervoso dos organismos vivos (TOMLIN, 1995). De acordo com seus dados de toxicidade aguda, est classificado na classe toxicolgica II, altamente txico (ANDREI, 1997). No homem, os inseticidas organofosforados podem causar transtornos sensoriais marcantes como imagens confusas, agravadas pela miose, salivao intensa, lacrimejamento, clica, diarria, tenesmo vesical e intestinal, mico dificultada e dolorosa, secreo bronquiolar seguida de tosse e dificuldades respiratrias, ansiedade, confuso mental seguida de alterao depressiva ligado ao sistema neurovegetativo com repercusso sobre os sistemas circulatrio e respiratrio, convulses, transtornos na circulao perifrica. O paciente intoxicado apresenta cimbra, dores musculares agudas, palidez e episdios de hipertenso arterial e, quando no tratado a tempo, vai a bito (SAMPAIO e GUERRA, 1998). No organismo do peixe, o trichlorfon se liga enzima acetilcolinesterase, formando um complexo irreversvel. A acetilcolinesterase responsvel pela hidrlise da acetilcolina nas sinapses entre as clulas nervosas e musculares. Unidas ao trichlorfon, a acetilcolinesterase incapaz de cumprir esta funo, fazendo com que as fibras musculares fiquem em constante estado de contrao. Portanto, os peixes expostos concentrao excessiva de trichlorfon ou submetidos a tratamentos freqentes com este inseticida, mesmo que nas doses recomendadas, podem apresentar o corpo deformado, com sinais similares a escoliose e lordose (desvio na coluna), devidos contrao muscular. O peixe perde o equilbrio e a habilidade natatria, tem dificuldades para encontrar alimento, evitar predadores

e acaba morrendo. O trichlorfon apresenta baixa persistncia ambiental na gua, sendo degradado em menos de uma semana (KUBITZA e KUBITZA, 1998). Os organosfosforados, quando aplicados em tanques, reduzem a populao de crustceos, coppodos e cladceros planctnicos, mas no afetam rotferos e fitoplncton (Mccraaen e Philips, 1977, apud MARTINS, 1998).

2.7.2. Sulfato de cobre

O sulfato de cobre um dos produtos mais utilizados atualmente para tratamento de parasitoses dos peixes (protozorios, tremtodos, monognio, fungos e bactrias externas) (Griffn, 1994 apud MARTINS, 1998). Porm estudos devem ser feitos para analisar sua ao sobre o ambiente e o tempo residual em peixe cultivado (MARTINS, 1998). Quanto ao impacto ambiental do sulfato de cobre, em experimentos realizados no Laboratrio de Patologia de Organismos Aquticos do Caunesp foi verificado por MARTINS (1998) que, aos dez dias aps a aplicao na gua, a fauna e flora voltam ao normal. Na anlise residual desse produto na carne do peixe foi verificado que somente aps 30 dias da exposio o nvel de cobre j estava prximo ao observado em peixes no expostos. Devido formao do on cprico Cu+2, durante a sua dissoluo na gua, o sulfato de cobre bastante txico aos peixes, principalmente em guas com baixa alcalinidade total. Doses excessivas de sulfato de cobre, quando no matam, podem causar injrias e excessiva produo de muco nas brnquias, distrbios nervosos e reduo da eficiencia do sistema imune dos peixes (KUBITZA, 1998).

2.7.3. Dicromato de potssio

Nos testes de toxicidade usados para o controle da poluio hdrica, substncias consideradas como referncia so utilizadas para avaliar e controlar a manuteno da sensibilidade de organismos aquticos ao longo do tempo. Assim, a utilizao de uma substncia de referncia como o dicromato de potssio (K2Cr2O7) num mtodo padronizado aumenta a confiabilidade (Peltier, e Weber, 1985, Bukema et al., 1982 apud BERTOLETTI et. al., 1989). O dicromato de potssio (K2Cr2O7) utilizado como substncia de referncia nos testes padronizados de toxicidade para microcrustceos (IBAMA, 1987), em que a sensibilidade da daphnia varia com a dureza da gua de cultivo (DEUUSCHES INSTITUT FUR NORMUNG, 1982). A faixa aceitvel da CE50-24 h de dicromato de potssio para Daphnia similis de 0,04 mg/L a 0,17 mg/L na gua do meio de cultivo com pH 7,6, condutividade 160 S/cm e dureza de 40 a 48 mg/L em CaCO3 (IBAMA, 1987; CETESB, 1991; ABNT, 1993). Esse mtodo pode ser aplicado a outras espcies do gnero daphnia, desde que sejam conhecidas as condies bsicas para sua manuteno e cultivo em laboratrio e tambm sua sensibilidade s substncias de referncia (CETESB, 1991; ABNT, 1993).

Outro mtodo utilizado para se fazer o controle da sensibilidade da cultura de daphnia o que estabeleceu o intervalo de aceitao da CE50-24 h calculado por mdia 2 S, sendo o valor do limite inferior igual a X - 2S e o limite superior do intervalo igual a X+ 2S (USEPA 1985), onde X = mdia e S = desvio padro da mdia.

2.8. Toxicidade aguda de agrotxicos e da substncia de referncia para daphnias

Em testes de toxicidade aguda de trichlorfon para Daphnia magna, cultivada em meio M4, com dureza de 250 15 mg/L em CaCO2, foram calculados os valores de CE5048 h

de 0,00096 mg/L (TOMLIN, 1995); 0,01 mg/L (EXOTOXNET, 1996) e 0,000586 mg/L

(FERREIRA, 1998). Em testes de toxicidade aguda de sulfato de cobre a Daphnia magna cultivada em meio M4, com dureza 250 15 mg/L em CaCO3 estudadas por SECOGORDILLO et al. (1998), KANGAROT e RAY (1989) e ELNABARAWY e ROBIDEN. (1986) calcularam CE50-48 h, respectivamente de 0,21mg/L, 0,54 mg/L e 0,017 mg/L,

0,054mg/L e 0,041 mg/L. Nestas mesmas condies, MOUNT e NORBERG (1984) encontraram valores respectivos para D. pulex e C. dubia de 0,053 mg/L e 0,017 mg/L e ELNABARAWY e ROBIEN., (1986) encontraram, para os mesmos organismos, valores de CE50 - 48h, respectivos de 0,031 mg/L e 0,023 mg/L. BERTOLETTI et al. (1992),

encontraram valores de CE50-24 h para Daphnia similis de 0,022 mg/L; 0,019 mg/L; 0,024 mg/L; 0,034 mg/L; 0,023 mg/L, tambm para esse o sulfato de cobre. Na norma DIN 38.412 (1982), a faixa aceitvel de CE50-24 h do dicromato de potssio para Daphnia magna, cultivada em meio M4, com dureza 250 15 mg/L em CaCO3, de 0,9 a 2,0 mg/L, Na norma ISO 6341 (1983), a faixa aceitvel de CE50-24 h para D. magna de 0,9 a 2,4 mg/L. Em testes de avaliao de toxicidade aguda com Daphnia magna, FERREIRA (1998) calculou valores de CE50-48 h de 0,07 mg de K2Cr2O7 /L em gua de mina ajustada com pH 7,6, condutividade 160 S/cm e dureza de 40 a 48 mg/L em CaCO3 SORVARI e SILLAMPAA (1996) calcularam valores de 0,34 mg/L do dicromato de potssio para D. magna, cultivada em M4, com dureza 250 15 de carbonato de

clcio. BASSFELD (2001) encontrou valores de 0,19 mg/L do dicromato de potssio, para D. magna, cultivada em M4 com dureza 118 12 em CaCO3. Para Daphnia similis, BERTOLETTI et al. (1992) calcularam valores de CE50-24h em 0,023 mg/L de CuSO4. 5H2O. Para Dahnia laevis no foi encontrado nenhum trabalho sobre a sensibilidade desta espcie ao dicromato de potssio.

2.9. Efeito do sedimento sobre a toxicidade de agrotxicos para organismos aquticos

O sedimento um material particulado natural, orgnico ou mineral, que pode ser transportado e depositado normalmente no fundo de ecossistemas aquticos, (SETAC, 2001). O prprio solo do fundo dos corpos da gua tambm pode ser denominado de sedimento. A funo primordial do sedimento agir como filtro para contaminantes da gua, fixando e removendo elementos nocivos ao homem e natureza (CIHACEK et. al., 1996). Os compostos qumicos podem existir sobre trs formas de disponibilidade preferenciais em ecossistemas aquticos: dissolvidos ou adsorvidos em um componente bitico ou abitico, suspenso na coluna de gua ou depositado no fundo, e acumulado nos organismos (MURILO, 2000). A taxa de adsoro de substncias qumicas na gua depende de fatores como a temperatura, o pH, a concentrao de material em suspenso, a dureza, a alcalinidade, o fluxo, a profundidade e o tamanho das partculas presentes e dos compostos qumicos (MURILO, 2000). Os herbicidas, assim como os demais agrotxicos, podem sofrer partio entre a fase aquosa e o sedimento no ambiente aqutico. Este fenmeno depende das

propriedades fsicas e qumicas do sedimento, da gua e da natureza da molcula. Portanto, assume-se que a biodisponibilidade dos herbicidas para os organismos aquticos, o potencial destes produtos em manifestar efeitos adversos sobre a biota, so afetados pela partio das molculas entre as fases aquosas e slida (JONSSON e MAIA, 1999). Estes autores verificaram tambm que na ausncia de sedimento, o herbicida clamozone aproximadamente 175 vezes mais txico que o quimclorac na presena de sedimento. Para o glyphosate, a maior valor da CL(I)50 na presena de sedimento deveu-se imobilizao do herbicida no sedimento. Por tanto, h necessidade de maior concentrao, ou quantidade do herbicida para causar o mesmo efeito na Daphnia pulex. Portanto, o sedimento imobiliza e deixou disponvel para atingir a Daphnia pulex apenas 59,5% da concentrao do herbicida adicionado na gua. KUSK (1996) estimou valores de CE50-48 h do piramicarb para Daphnia magna de 16 g/L em ausncia de sedimento e de 24 g/L em presena de sedimento. Este autor concluiu que o sedimento imobiliza 33,3 % do piramicarb da gua, tornando-o menos biodisponivel para a Daphnia magna. JONSSON e MAIA (1999) calcularam valores de CE5048 h do herbicida clamazone para Daphnia similis equivalentes a 1,51 mg/L em sistema sem sedimento e 11,28 mg/L em sistema com sedimento. Nestes resultados, verifica-se que o sedimento imobilizou 86,6% do herbicida na gua. Os metais pesados, nos processos de infiltrao e percolao, so bem retidos pela maioria dos solos, principalmente quando ricos em matria orgnica e com pH > 7. Quando o pH muito cido, o solo no tem capacidade de reter os metais pesados e, por lixiviao, acabam sendo encaminhados aos corpos da gua abaixo mais prximo (NUCCI et al., 1978).

Na bibliografia consultada no for encontrado estudos sobre os efeitos do sedimento na a toxicidade aguda de sulfato de cobre e trichlorfon para as trs espcies de daphnias consideradas.

2.10. Risco de intoxicao da contaminao ambiental causado pelo uso de sulfato de cobre e trichlorfon na piscicultura

A recomendao de uso de agrotxicos resulta em uma concentrao ambiental estimada (CAE) que definida como uma estimativa da exposio de organismos no alvos aos agrotxicos, resultante da aplicao direta no ambiente (SETAC, 1994). As decises em avaliaes de risco que envolvem organismos aquticos so baseadas na taxa de uma nica CAE para uma nica referncia do nvel do efeito do agrotxico. Esta inter-relao conhecida como o quociente de risco. O quociente mximo aceitvel de risco 0,1; 0,5 e 1 (SETAC, 1994). O critrio de aceitao do risco na CAE equivalente a 0,1 x CE50 a concentrao regulatria atual. Esta concentrao baseada na suposio de que intoxicao aguda significativa no ocorrer neste nvel de exposio (SETAC, 1994). As concentraes ambientais estimadas (CAEs) nos ecossistemas aquticos dependem diretamente da quantidade de produto que os atingem aps o processo de degradao e mobilidade para fora do local de aplicao. Estes fatores, por sua vez, dependem de outras variveis como propriedades fsico-qumicas do agrotxico, caracterstica do solo, cobertura vegetal e regime pluviomtrico entre outras (SETAC, 1994; SOLOMON, 1995). De acordo com o procedimento proposto pela SETAC (1994), os riscos de intoxicao ambiental, devido contaminao com os agrotxicos, podem ser classificados uma

em funo da comparao da CE50 com a CAE. O critrio de classificao do risco de intoxicao ambiental das CAEs o seguinte: Alto risco de intoxicao da espcie se CAE 0,5 x CE50 CAE < 0,5 x CE 50

Moderado risco de intoxicao da espcie se 0,1 X CE50 Baixo risco de intoxicao da espcie se CAE < 0,1 x CE50

3. MATERIAL E MTODO

Todo o material e a metodologia utilizados nesse trabalho seguiram as recomendaes estabelecidas nas normas e metodologia da APHA (1991), MURTY (1988) e RAND e PETROCELLI (1985), IBAMA (1987) CETESB (1991), ABNT (1993) e DEUTSCHES INSTITUT FUR NORMUNG DIN 38.412 (1982), mas com ligeiras modificaes, e esto descritos nos itens a seguir.

3.1. Local da realizao dos testes

Os testes de avaliao da toxicidade aguda do sulfato de cobre e do trichlorfon para as trs espcies de daphnias foram conduzidos no Laboratrio de Ecotoxicologia dos Agrotxicos e Sanidade Ocupacional, do Departamento de Fitossanidade, da FCAV/Unesp Cmpus Jaboticabal, associado ao Centro de Aqicultura da Unesp/Caunesp.

3.2. Organismos-teste 3.2.1 Espcies de daphnias estudadas

Os exemplares de Daphnia similis (Figura 1 A) foram provenientes de uma cultura mantida em recipientes de vidro com dois litros de gua, em uma estufa incubadora, tipo BOD, mod. 347 FANEM, na temperatura de 20 2C, no Laboratrio de Ecotoxicologia do Departamento de Defessa Fitossanitria da FCAV / Unesp Cmpus de Jaboticabal, SP. O fotoperodo utilizado foi de 12 horas, com intensidade luminosa em torno de 1000 lux, Os exemplares de Daphnia magna (Figura 1 B) foram obtidos de culturas mantidas na Universidade Federal do Paran (UFP) reproduzidos e mantidos em condies de laboratrio. Os exemplares de Daphnia laevis (Figura 1 C) foram coletados em tanques de cultivo de peixes no Centro de Aqicultura da Unesp Jaboticabal SP e adaptados as condies de laboratrio, usando as mesmas condies de criao das outras duas espcies, mencionadas acima. no Centro de Estudos do Mar,

3.2.2. Cultivo das daphnias 3.2.2.1. gua de cultivo As daphnias foram cultivadas em gua natural de mina filtrada em rede de zooplncton com 30 m, de acordo com as normas do IBAMA (1987), CETESB (1991); ABNT (1993), com condutividade de 160 S/cm, pH 7,6 e dureza de 45 mg/L em CaCO3, previamente aerada por 48 horas, com aerador de aqurio modelo TROPICAL 11. A gua de cada cristalizador (Figura 2) foi renovada completamente toda semana, com repicagem e descarte dos organismos mais velhos, no momento da troca de gua. Uma vez por semana as daphnias foram selecionadas e passadas para novos recipientes de cultivo, com gua nova. Os organismos mais velhos e a maioria dos neonatos

foram descartados nas trocas de gua. No meio da semana os recipientes de cultivos foram limpados com sifoneamento das sujeiras dos fundos.

Figura 2. Vista geral da cmara de cultivo das trs espcies de daphnias. 3.2.2.2. Alimentao das daphnias A alimentao das daphnias foi realizada com uma suspenso de clulas de alga da espcie Scenedesmus subspicatus, na concentrao de 5x106 clulas de alga por daphnia, fornecida uma vez por dia, segundo recomendaes da CETESB (1991). Juntamente com a suspenso algcea tambm foi fornecida diariamente rao de peixe fermentada na quantidade de 0,5 mL para cada 2 L de gua de cultura, mais leveduras. Juntamente com a suspenso algcea foi administrado 1 mg de complexo vitamnico Vit. B1(7mg), Vit. B2 (7mg), Vit. B6 (5mg), Vit.B12 (33mg) e Vit. H (1mg) de acordo com as recomendaes de SIPAUBA-TAVARES (2001).

3.2.2.2.1. Cultivo de alga

A alga utilizada na alimentao das daphnias foi cultivada em erlenmeyer de 2 L provido de aerao dentro de uma cmara BOD (Figura 3), na temperatura de 20 2C, luminosidade de 500 lux de intensidade e fotoperodo de 15 h. O meio utilizado para manuteno da cultura de algas foi o LC OLIGO autoclavado, recomendado pela CETESB (1991).

Figura 3. Vista geral da cmara de cultivo de alga Scenedesmus subspicatus utilizadas na alimentao das daphnias. 3.2.2.2.2.2. Rao fermentada A rao fermentada foi preparada misturando-se 5 g de rao para peixe AlconColours em um litro de gua destilada, mantida com aerao constante durante uma semana. Depois de uma semana de fermentao, o caldo foi filtrado com rede de zooplncton

de 350 m e misturada com fermento biolgico seco instantneo na proporo de 0,5 g por 100 mL do filtrado (CETESB, 1991).

3.3. Caractersticas fsico-qumicas do solo utilizado como sedimento

O sedimento utilizado foi da camada superficial de 0 a 20cm do solo de uma rea isenta de resduos txicos, localizada no Centro de Pesquisas em Sanidade Animal (CPPAR) da FCAV/Unesp Campus de Jaboticabal. O solo foi peneirado e sua composio qumica e granulomtrica foi analisada antes de ser usada nos experimentos e esto contidos na Tabela 1. Tabela 1. Anlises qumicas e granulomtricas do solo usado como sedimento nos testes de toxicidade aguda. Elementos pH (em Ca) MO (g/dm3) P (g/dm3) K (mmlcd/dm3) Ca (mmlcd/dm3) Mg (mmlcd/dm3) H + AL (mmlcd/dm3) SB (mmlcd/dm3) T (mmlcd/dm3) V (%) Argila (g/kg) Limo (g/kg) Areia fina (g/kg) Areia grosa (g/kg) Classe textural 3.4. Preparo das solues-estoque dos agrotxicos Valores 5,8 24,0 46,0 4,3 47,0 16,0 25,0 67,3 92,3 73,0 440,0 226,0 100,0 200,0 Argilosa

As solues-estoque utilizadas em todos os testes foram preparadas por meio da adio de alquotas da formulao comercial Diterex, contendo 500 g de trichlorfon/ L,

produzido pela empresa BAYER Brasileira S.A O sulfato de cobre (CuSO4.5H2O), produzido pela CYRQ Ind. Brasileira. O dicromato de potssio, produzido pela Chimie Test Ind. Brasileira, com grau analtico, foi utilizado como substncia de referncia, para o controle da sensibilidade dos organismos-teste IBAMA (1987), CETESB (1991) e ABNT (1993).

3.5. Controle da sensibilidade dos organismos-teste com a substncia de referncia dicromato de potssio

Foram realizados testes de sensibilidade para as trs espcies de daphnias ao dicromato de potssio (K2Cr2O7) de acordo com as metodologias normatizadas por IBAMA (1987), CETESB (1991) e ABNT (1993). Os testes foram realizados uma semana antes, durante e aps a realizao dos testes com os dois agrotxicos em estudo. Os valores da CL(I)5024 h foram calculados em cada teste e todos os valores foram utilizados no clculo da media durante o perodo. O critrio da mdia 2 desvios padres foi utilizado para fazer o controle da sensibilidade dos organismos cultivados, de acordo com o controle de qualidade estabelecido na metodologia do IBAMA (1991) e da CETESB (1991). Os testes de sensibilidade foram realizados a partir de solues estoques com concentraes de 0,1; 1 e 10 mg/L, em uma srie de frascos de vidro com capacidade de 50 mL, utilizando-se 30 mL, contendo solues-teste de K2Cr2 O7, diludas em gua natural ajustada. Cada teste foi realizado com cinco concentraes crescentes da substncia de referncia e um controle, e todos com quatro repeties, totalizando 24 frascos de vidro (Figura 4).

Figura 4. Frascos de vidro utilizados nos testes de sensibilidade das trs espcies de daphnia substncia de referncia dicromato de potssio.

As concentraes nominais do dicromato de potssio utilizadas nos testes definitivos foram selecionadas de acordo com os dados dos testes preliminares, onde se estabeleceu a faixa de sensibilidade de cada espcie de daphnia. Em cada frasco de vidro foram colocados cinco organismos neonatos, com idade entre seis e 24 horas (Figura 5) e mantidos em BOD por 24 horas, na temperatura a 20 2 C e no escuro. Aps as 24 horas foram realizadas avaliaes da mobilidade dos organismos-teste. Os valores da CE50- 24 h foram calculados pelo mtodo de Sperman Karber (HAMILTON et al., 1977).

Figura 5 Espcimes de Daphnia similis: adulto (A) e neonato (B) com idade entre seis e 24 horas.

3.6. Testes de toxicidade aguda do sulfato de cobre e do trichlorfon para as daphnias

Os testes preliminares e definitivos com o sulfato de cobre e trichlorfon foram realizados de acordo com a metodologgia estabelecida pelo IBAMA (1987), CETESB (1991) e ABNT (1993). Entretanto, nos primeiros testes instalados com trichlorfon ocorreu morte de todos os organismos, inclusive nas parcelas sem o agrotxico. Para solucionar este problema, os testes com trichlorfon foram realizados em frascos de vidro fechados com tampa de plstico, conforme observa-se na Figura 6. Esta modificao na metodologia viabilizou a realizao dos testes com o trichlorfon, pois o fechamento dos frascosteste evitam a

volatilizao do ingrediente ativo durante os testes e no afetam a sobrevivncia dos organismos-teste.

Figura 6. Frascos de vidro fechados utilizados nos testes definitivos com trichlorfon na ausncia e presena de sedimento.

3.6.1. Testes preliminares com as trs espcies de daphnias

As fmeas ovadas das trs espcies de daphnias foram colocadas separadamente em recipiente de vidro (cristalizador) limpo, contendo gua natural filtrada modificada, com pH 7,6; dureza de 45 mg/L em CaCO3 e condutividade de 160 S/cm. Aps a separao, estas fmeas foram alimentadas como descrito no item 3.2.2.2. Depois de 24 horas e seis horas antes do incio dos testes, as fmeas ovgeras foram retiradas e os neonatos foram utilizados nos testes de toxicidade (CETESB, 1991). O preparo de todas as solues e das etapas de montagem e conduo dos testes foram realizadas em salas climatizadas, sem a presena de vapores ou poeiras txicas, na temperatura de 20 2 C (CETESB, 1991).

3.6.2. Solues estoques de sulfato de cobre e trichlorfon

Antes de comear os testes as solues estoque de trichlorfon , foram preparadas pipetando 2 mL de Dipterex 500, contendo 500 g de ingrediente ativo/ L e transferido diretamente para balo volumtrico de 1000 mL. O volume do balo foi completado com gua destilada agitando com movimentos circulares, obtendo-se soluo estoque de 1000 mg/L. Esta soluo foi diluda e solues estoques com concentraes de 0,0001 e 0,00001 mg/L foram obtidas. A partir destas se obteve as solues-teste (Tabelas Anexos). Para o dicromato de potssio dilui-se um grama e completado para um litro de gua destilada, em balo volumtrico de 1000 mL. Esta soluo foi diluda obtendo-se soluo estoque de 1000 mg/L com concentraes de 1,0 e 10 mg/L. A partir destas solues se obteve as solues-teste (Tabelas Anexo). Para obteno das solues estoques e solues-teste, utilizou-se a seguinte formula: C1 x V1 = C2 x V2, onde: C1 = Concentrao inicial C2 = Concentrao Final V1 = Volume inicial V2 = Volume final

3.6.3. Testes sem sedimento

Numa srie de recipientes de vidros com 30 mL de capacidade, foram preparados volumes conhecidos de solues estoque de sulfato de cobre nas concentraes de 1 e de 10 mg/L ou de trichlorfon, nas concentraes de 0,0001 e de 0,00001 mg/L,

completando-se para 9 mL de gua de cultivo previamente aerada por 48 horas, para garantir a saturao mnima de oxignio nas soluesteste desejadas. Em seguida, para completar o volume das solues-teste, foi adicionado 1,0 mL com gua de cultivo contendo cinco neonatos coletados nos recipientes das fmeas ovgeras.

3.6.4. Testes com sedimento

Em uma srie de recipientes de vidro foram colocados 3,0 g de solo, utilizado como sedimento, e sobre esse foram colocados cuidadosamente 8 mL de gua de cultivo previamente aerada por 48 horas, para garantir a saturao mnima de oxignio. Volumes conhecidos da soluo-estoque de sulfato de cobre 10 e 100 mg/L ou de trichlorfon, 0,1 e 0,01 mg/L, foram depositadas nos recipientes de vidro e completado para 9,0 mL com gua de cultivo. Imediatamente aps a colocao das solues-teste sobre o sedimento foram colocados 1,0 mL da gua de cultivo com cinco neonatos de daphnia coletados dos recipientes das fmeas ovgeras. Foram conduzidos experimentos com cinco tratamentos para cada uma das trs espcies de daphnia com sulfato de cobre ou trichlorfon, em presena e ausncia do sedimento. Cada tratamento foi composto por quatro repeties e um controle para tratamento. As daphnias neonatas dos testes permaneceram na sala de bioensaios durante 48 h na temperatura de 20 2 C, em ambiente escuro, sem alimentao. Depois de 24 e 48 horas de exposio foi realizada a contagem dos organismos imveis de cada recipiente. Os

organismos que no conseguiam nadar por 15 segundos aps leve agitao do frasco foram considerados imveis (CETESB, 1991).

3.7. Testes definitivos com as trs espcies de daphnia

Com os intervalos das concentraes estabelecidos nos testes preliminares, foram conduzidos os testes definitivos, seguindo-se o mesmo procedimento do teste preliminar para cada uma das trs espcies de daphnia, sem e com sedimento (Figura 7; Figura 8; Figura 9 e Figura 10). Estas figuras so dos testes com sulfato de cobre, identificados pela ausncia de tampas nos frascos de vidro, pois nos testes com trichlorfon, todos os frascos de vidro foram fechados com tampa de plstico (Figura 6)

Figura 7. Frascos de vidro utilizados nos testes definitivos com sulfato de cobre em ausncia de sedimento.

Figura 8. Frascos de vidro utilizados nos testes definitivos com sulfato de cobre em presena de sedimento.

Figura 9. Vista da sala climatizada com os frascos-teste contendo os neonatos de daphnia.

Figura 10. Vista do local das avaliaes e contagem dos neonatos aps os perodos de exposio dos neonatos de daphnia aos agrotxicos.

3.8. Clculo da CE50 48h

Com os dados de imobilidade das daphnias s 48 h de exposio foram calculados os valores de CE5048 h utilizando-se o mtodo Treimed Sperman Karber (HAMILTON et. al., 1977), definido por RAND & PETROCELLI (1985) como sendo a concentrao estimada que produz 50% de mortalidade, no caso , imobilidade, da populao exposta a um agente txico por determinado perodo de tempo. Nos resultados dos testes com a substncia de referncia dicromato de potssio foram calculados os valores de CE50-24 h apenas. 3.9. Avaliao do risco de intoxicao ambiental das daphnias devido contaminao proporcionada pelo uso de sulfato de cobre e trichlorfon em piscicultura

As avaliaes dos riscos de intoxicao ambiental das trs espcies de daphnias devido contaminao proporcionada pelo uso de sulfato de cobre e trichlorfon

foram realizadas de acordo com a proposta da SETAC (1994). Os riacos de intoxicao ambiental foram avaliados por meio das comparaes dos valores de CE50-48 h calculados nos testes de toxicidade aguda, sem e com sedimento, com os valores das concentraes ambientais estimadas (CAE) das recomendaes de uso destes dois agrotxicos em piscicultura (SETAC (1994). Os clculos das CAEs foram realizados com a dosagem recomendada dos dois agrotxicos em estudo para o controle de insetos predadores aquticos, parasitos e patgenos de peixes em piscicultura em geral. A CAE do sulfato de cobre utilizada foi de 0,33 mg/L, de acordo com as recomendaes de POST (1987), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e PAVANELLI et al., (1999). A CAE do trichlorfon utilizada foi de 0,13 mg/L, de acordo com as recomendaes de REICHENBACH-KLINKE (1982), POST (1987), KINKLELIN et al., (1991), NOGA (1996), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e PAVANELLI et al., (1999). O critrio utilizado para classificar os riscos ambientais dos agrotxicos para as daphnias baseia-se na comparao dos valores da CE5048 h e das CAE, de acordo com a SETAC (1994) e o seguinte: Alto risco de intoxicao da espcie se CAE 0,5 x CE 50 CAE < 0,5 x CE50

Moderado risco de intoxicao da espcie se 0,1 x CE50 Baixo risco de intoxicao da espcie se CAE < 0,1 x C50

3.10. Anlise estatstica

Para o clculo do coeficiente de variao dos resultados dos testes de toxicidade aguda com dicromato de potssio (K2Cr2O7), para as trs espcies de daphnias, foi utilizada a seguinte frmula:

C.V.= S.100 / X Onde : C.V.= coeficiente de variao em %; S = desvio-padro dos valores de CE50-24h, em mg/L; X= Mdia das CE5024 h, em mg/L. Os valores das CE5048 h calculados para cada repetio de cada um dos testes definitivos realizados com o dicromato de potssio foram analisados estatisticamente, de acordo com GOMES (2000), por meio do delineamento inteiramente ao acaso considerando-se como tratamento as trs espcies de daphnias e cada um dos seis testes como repeties. Os valores das CE5048 h calculados para cada repetio dos tratamentos utilizados nos testes definitivos com sulfato de cobre e trichlorfon, com as trs espcies de daphnias, foram analisados estatisticamente, de acordo com GOMES (2000), por meio do delineamento inteiramente ao acaso e os tratamentos dispostos no esquema fatorial 3x2, sendo os fatores: E= Espcies de daphnias (D. magna, D. similis e D. laevis); e S= Sedimento (ausente e presente)

4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Testes de controle da sensibilidade das daphnias com dicromato de potssio Os valores calculados de CE50-24 h dos seis testes de toxicidade aguda com a substncia de referncia dicromato de potssio, para as trs espcies de daphnias, esto apresentados na Tabela 2, com os respectivos valores de intervalo de confiana, mdias do teste (X), desvio padro (S) e coeficiente de variao (C.V.). Os resultados da anlise de varincia dos valores de CE50-24h h calculados nos testes com dicromato de potssio encontram-se na Tabela 2. Verifica-se nestes dados que no existe diferena de sensibilidade entre as trs espcies de daphnias ao dicromato de potssio.

Tabela 2. Valores mdios de CE50-24 h (mg de K2Cr2O7/L) calculados para os testes de toxicidade aguda e do intervalo de confiana (95%) em gua natural ajustada, para as trs espcies de daphnias. Daphnia magna CE50-24h
(mg/L)

Data do teste
20/02/02 27/02/02 07/03/02 11/03/02 18/03/02 25/03/02 X S C.V.(%)

0,06 0,05 0,09 0,08 0,08 0,09 0,06 0,04 0,07 0,06 0,04 0,09 0,07 0,05 0,09 0,08 0,07 0,10 0,13 0,11 0,17 0,14 0,12 0,17 0,13 0,17 0,19 0,16 0,15 0,17 0,10 0,09 0,12 0,10 0.09 0.13 0,09 A 0,10 A 0,03 0,04 36,11 39,42 F espcie de daphnia = 0,38 NS ; DMS (%) = 0,0596 mg/L

Intervalo de confiana (95%)

Daphnia similis CE50-24h

(mg/L)

Intervalo de confiana (95%)

Daphnia laevis CE50-24h

(mg/L)

Intervalo de confiana (95%)

0,07 0,03 0,04 0,12 0,15 0,09 0,09 A 0,04 52,05

0,06 0,10 0,02 0,06 0,03 0,07 0,09 0,18 0,14 0,17 0,08 0,12

Mdias seguidas por mesma letras maisculas nas linhas no diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey, ao nvel de 5% de probabilidade.

Considerando-se o critrio de media 2 S para determinar o intervalo de aceitao dos valores de CE50-24 h , para o controle da sensibilidade das daphnias (USEPA, 1985), verifica-se nas Figuras 10, 11 e 12 que as trs espcies tambm o atendem.

CL(I)50-24h ( mg/L)

0,09

D. magna

0 0 1 2 3 4 5 6 7 Numero do teste

Figura 11. Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa aceitvel, de CE50-24 horas do dicromato de potssio a Daphnia magna (LS = limite superior;
LI = limite inferior; x = mdia e s = desvio padro)

CL(I) 50 -24h (mg/L)

0,1 D. similis

0 0 1 2 3 4 5 6 7 Numero do teste

Figura 12. Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa aceitvel, de CE50-24 horas do dicromato de potssio a Daphnia similis (LS = limite superior; LI
= limite inferior; x = mdia e s = desvio padro).

CL(I) 50-24h (mg/L)

0,09

D. laevis

0 0 1 2 3 4 5 6 7 Numero do teste

Figura 13 Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa aceitvel, de CE50-24 horas do dicromato de potssio a Daphnia laevis (LS = limite superior; LI
= limite inferior; x = mdia e s = desvio padro).

Observa-se na Tabela 2 que os valores de CE5024 h do K2Cr2O7 para as trs espcies de daphnias, comparados com os resultados de outros pesquisadores (Tabela 3) para Daphnia similis estiveram dentro do intervalo estabelecido como controle de qualidade pelo CETESB (1991), ABNT (1993) e IBAMA (1987). Nestas metodologias, o intervalo de aceitabilidade da CE50-24h est entre 0,04 e 0,17 mg/L de K2Cr2O7 para D. similis. Estes dados tambm concordam com os resultados obtidos por BERTOLETTI et al., (1992). Para D. magna, o valor de CE5024 h calculado para o dicromato de potssio (K2Cr2O7) est prximo aos resultado obtido por FERREIRA (1998). Os valores calculados neste trabalho para D. magna esto muito inferiores aos calculados por SORVARI e SILLAMPAA (1996) e BASSFELD (2001). Os maiores valores calculados por estes dois autores podem ser devidos maior dureza da gua de cultivo que utilizaram, de 250 e 118 mg/L em CaCo3, respectivamente. Assim, as diferenas de

sensibilidade podem ser atribudas ao mtodo utilizado para o cultivo das daphnias, visto que ela varia em funo da dureza da gua de cultivo (DEUUSCHES INSTITUT FUR NORMUNG, 1982). Tabela 3. Valores mdios de CE50-24 h (mg de K2Cr2O7/ L) calculados para as trs espcies de daphnias neste trabalho e por outros autores.
FONTE Este trabalho RESULTADOS em (mg/L) gua de cultivo dureza 40-48 mg/L em CaCO3 D.m.= 0,09; D.s.= 0,10; D.l = 0,09 FERREIRA (1998) gua de cultivo dureza 40-48 mg/L em CaCO3 D.m = 0,07 BERTOLETTI et al. (1998) gua mole dureza 40-48 mg/L em CaCO3 D. s = 0,13; 0,15; 0,07; 0,05; 0,09; 0,17; 0,11; 0,09 0,06; 0,05 CETESB (1991); IBAMA(1987); ABNT (1993) gua mole dureza 40-48 mg/L em CaCO3 D. s = 0,04 0,17 I.S.O. 6.341 (1983) Meio M4 dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m = 0,9 2,4 DIN 38.412 (1982) Meio M4 dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m = 0,9 - 2,0 SORVARI e SILLAMPAA (1996) Meio M4 dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m = 0,34 BASSFELD (2001) Meio M4 dureza 118 12 mg/L em CaCO3 D. m = 0,21; 0,20; 0,18; 0,18

D. m = Daphnia magna, D. s = Daphnia similis, D. l = Daphnia laevis Para D. laevis na bibliografia consultada, no foi encontrado qualquer artigo sobre a sensibilidade desta espcie ao dicromato de potssio Os valores da CE50-24 h calculados do dicromato de potssio para as trs espcies de daphnia demostra que o cultivo destes organismos-teste atenden ao controle de qualidade estabelecido nas normas da ABNT (1993), CETESB (1991) e do IBAMA (1987), cujo valor de CE50-24 horas deve estar entre 0,04 e 0,17 mg/L. e tambm ao critrio do intervalo correspondente X = 2 S (Figura 10,11 e 12).

4.2. Testes de toxicidade aguda do sulfato de cobre para trs espcies de daphnias na ausncia e presena de sedimento

Os resultados da anlise de varincia dos valores de CE50-48 h calculados nos testes com sulfato de cobre encontram-se na Tabela 4. Verifica-se nestes dados os efeitos altamente significativos dos dois fatores estudados e da interao entre ambos. As anlises dos desdobramentos dos graus de liberdade dos nveis dos fatores e da interao esto apresentados na Tabela 5 Tabela 4. Anlise de varincia dos valores de CE50-48 h do sulfato de cobre para as trs espcies de daphnias na ausncia e presena de sedimento.
Causas de variao Espcies (E) Sedimento (S) Interao E x S G.L. 2 1 2 S. Q. 0,211 0,2204 0,799 Q. M. 0,0105 0,2204 0,0400 F 12,3** 257,6** 46,6**

**significativo ao nvel de 1% de probabilidade C.V. = 18,2(%)

G.L= Grau de liberdade; S.Q.= Soma dos quadrados; Q.M.= Quadrado mdio.

Tabela 5. Desdobramento dos graus de liberdade dos fatores do teste de toxicidade aguda de sulfato de cobre para as trs espcies de daphnias na ausncia e presena do sedimento. Espcies CE50 48h (mg/L) Agrotxico Sedimento D. magna CE50-48h
0,045 b B 0,347 a A

D. similis CE50-48h
0,042 b B 0,282 b A

D. laevis CE50-48h
0,107 a A 0,140 c A

Mdias
0,065 B 0,257 A

Ausente sulfato de cobre Presente

Mdias seguidas seguidas por letras minsculas diferentes, na linha, indica diferenas significativas entre espcies. Mdias seguidas por letras maisculas diferente na coluna, indica diferenas entre presena e ausncia de sedimento DMS (5%) Espcies = 0,4 mg/L; DMS (5%) Sedimento = 0,02 mg/L

Na Tabela 5 verifica-se que na ausncia de sedimento, a Daphnia magna e a Daphnia similis no apresentaram diferenas de sensibilidade ao sulfato de cobre, enquanto que a Daphnia laevis foi significativamente menos sensvel que as outras duas espcies. A maior tolerncia de Daphnia laevis ao sulfato de cobre pode ser devida ao fato de ser uma espcie nativa e, conseqentemente, mais rstica. Poucos estudos de avaliao da sensibilidade constataram similar sensibilidade entre membros da famlia Daphnidae. Esta constatao podem ser devida a comparaes de pequeno nmero de dados de toxicidade aguda (CANTON e ADEMA, 1978; HIECKEY, 1989, MARCHINI et al.; 1993; LILIUS et al, 1995; VESSTEEG, et al, 1996). Estas pesquisas evidenciam uma comparao sistemtica da histria de vida, distribuio geogrfica e mtodos de testes de toxicidade com Ceriodaphnia sp. e Daphnia magna. Na Tabela 5 verifica-se que a presena do sedimento reduziu significativamente a biodisponibilidade do sulfato de cobre na gua de cultivo para D. magna,

e D. similis. A maior diferena de CE50-48 h ocoreu com a D. magna, demostrando maior imobilidade do sulfato de cobre no sedimento que foi 7,7 vezes a concentrao na gua de cultivo. A segunda maior imobilidade do sulfato de cobre pelo sedimento foi verificado com a D. similis, que foi de 6,7 vezes a concentrao na gua de cultivo. Por outro lado, verifica-se que no houve diferena significativa entre os valores de CE50-48 h calculados para D. laevis na ausncia e presena de sedimento. Este resultado pode ser devido a maior tolerncia desta espcie nativa ao sulfato de cobre, entre as trs espcies estudadas. Considerando-se estes resultados, verifica-se que a presena de sedimento imobiliza as molculas do sulfato de cobre da gua de cultivo das daphnias imediatamente aps o contato inicial. Acredita-se que este processo de imobilizao deve ser crescente ao longo do tempo, dentro de certos limites, dependendo de diversos fatores relacionados ao prprio sedimento e molcula txica. As diferenas entre as valores de CE50-48 h na ausncia e presena de sedimento podem estar relacionadas ao efeito de absoro, floculao e oxidao do sulfato de cobre na presena de sedimento. JONSON e MAIA (1999) citam que, na maioria dos estudos, o sedimento influencia a intoxicao aguda ou bio-concentrao de agentes qumicos, de modo que a reduo do efeito causada pelo fenmeno de adsoro ao material particulado, que, por sua vez, diminui a bio-disponibilidade para os organismos-teste. MARTINS (1998) verificou que o aumento no teor de matria orgnica na gua diminuiu a ao txica do permanganato de potssio e do sulfato de cobre para peixes, e pode inativar a formalina. Verifica-se tambm que a baixa alcalinidade tambm aumenta a intoxicao de peixes com o sulfato de cobre e a salinidade diminui a ao da formalina e do sulfato de cobre. Na Tabela 6 observa-se que os resultados obtidos neste experimento esto de acordo com os dados obtidos por BERTOLETTI et al. (1992), que calcularam valores da

CE5024 h similares de sulfato de cobre para D. similis cultivada em gua mole. Os resultados obtidos com D. magna corroboram os de ELNABARAWY et al. (1986) que calcularam valores similares da CE50-48 h para D. magna criadas em meio M4, bem como os de SECOGORDILLO et al. (1998), MOUNT e NORBERG (1984), KHANGAROT e RAY (1989). Os resultados obtidos com D. similis esto de acordo com os de BERTOLETTI et al. (1992). Tabela 6. Valores mdios de CE5048 h de sulfato de cobre calculados para as trs espcies de daphnias neste trabalho e por outros autores. Pesquisador ou norma Neste trabalho SECO et al. (1998) MOUNT e NORBERG (1984) ELNABARAWY et al. (1986) KHANGAROT e RAY (1989) BERTOLETTI et al. (1992) Resultados em (mg/L) gua do cultivo, dureza 45 mg em CaCO3 D. m. = 0,045; D. s. = 0,043; D. l. = 0,10 Meio M4, dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m. = 0,21 Meio M4, dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m. = 0,054; D. p = 0,053. Meio M4, dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m. = 0,041; D. p = 0,031. Meio M4, dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m. = 0,54. gua mole, dureza 40 48 mg em CaCO3 D. s. = 0,022; 0, 019; 0,020; 0,024; 0,034; 0,023

D. m = Daphnia magna; D. s = Daphnia similis; D. l = Daphnia laevis; D. p = Daphnia pulex.

As diferenas dos resultados obtidos podem estar relacionadas com o meio usado para o cultivo e a exposio das daphnias ao sulfato de cobre, ou com o mtodo da norma utilizado para realizar os testes de toxicidade. Na reviso bibliogrfica no foram encontrados resultados de CL(I)50-48 h para D. laevis para serem comparados com os dados obtidos.

4.3. Testes de toxicidade aguda do trichlorfon para trs espcies de daphnias em ausncia e presena do sedimento

Na Tabela 7 encontram os resultados da anlise de varincia dos valores de CL(I)50 - 48h calculados nos testes com trichlorfon. Nestes resultados so claros os efeitos altamente significativos do fatores estudados e da interao entre ambos. As anlise com desdobramentos dos graus de liberdade dos nveis dos fatores e da interao esto apresentados na Tabela 8

Tabela 7. Anlise de varincia dos valores de CE50-48 h do trichlorfon para as trs espcies de daphnias na ausncia e presena de sedimento.
Causas de variao Espcie (E) Sedimento (S) Interao ExS G.L. 2 1 2 S. Q. 11.110,58 616.834,40 11.264,49 Q. M. 5.555,29 616.834,40 5.632,24 F 12,33 ** 1.370,00 ** 12,51 **

**significativo ao nvel de 1% de probabilidade C.V. = 13,2 (%)

G.L= Grau de liberdade; S.Q.= Soma dos quadrados; Q.M.= Quadrado mdio.

Na Tabela 8 observa-se que na ausncia do sedimento as trs espcies de daphnias no apresentam diferena de sensibilidade ao trichlorfon . Esta sensibilidade similar entre as trs espcies de daphnias possivelmente seja explicada pelo fato de pertenceram ao mesmo gnero, pois geralmente as daphnias no apresentam diferena da sensibilidade entre espcies. Todavia, podem apresentar diferenas quanto a famlia e outros microcrustceos. Todavia, VESSTEEG et al., (1996) verificaram que muitos membros da famlia Daphnidae apresentam sensibilidades semelhantes toxicidade aguda e crnica de compostos qumicos txicos. CANTON e ADEMA (1978) reportam que D. magna, D. cucullata e D. pulex apresentam similar sensibilidade. HICKEY (1989), comparando a toxicidade de aguda e crnicas varias substncias puras e guas poludas para a sensibilidade de cinco espcies de cladceros (D. magna D. carinata, S. vetulus, C. dubia, e C. cf. pulchella) verificam que, no geral, os valores das diferenas so pequenos.

Tabela 8. Desdobramento dos graus de liberdade dos fatores testados no teste de toxicidade aguda de trichlorfon para as trs espcies de daphnias na ausncia e presena do sedimento Espcies CE50 48h (g/L) Agrotxico Sedimento D. magna CE50-48h
0,70 a B 299,70 b A

D. similis CE50-48h
0,53 a B 381,62 a A

D. laevis CE50-48h
0,92 a B 282,73 b A

Mdias
0,72 B 321,35 A

Trichlorfon

Ausente Presente

Mdias seguidas seguidas por Letras minsculas diferentes, na linha, indica diferenas significativas entre espcies. Mdias seguidas por letras maisculas diferente na coluna, indica diferenas entre presena e ausncia de sedimento DMS (5%) Espcies = 27,1 mg/L; DMS Sedimento = 18,2 mg/L.

Na Tabela 8 observa-se que na presena do sedimento a Daphnia magna e a Daphnia laevis no apresentam diferena de sensibilidade ao trichlorfon, sendo que ambas apresentam sensibilidade significativamente superior Daphnia similis. Em mdia, houve a necessidade de concentraes 446,3 vezes maiores na gua de cultivo para causar o mesmo efeito nas trs espcies de daphnias (CE50-48 h). Nestes resultados verifica-se o efeito da alta adsoro do trichlorfon no sedimento, que um solo de textura argilosa (Tabela 1), imediatamente aps o seu contato com a gua de cultivo contendo agrotxico. Isto porque os organismosteste foram expostos imediatamente a deposio da gua de cultivo com o trichlorfon nos recipientes de vidro com o sedimento no fundo.

Este fato merece considerao pois se os organismosteste forem expostos em diferentes perodos aps o contato do agrotxico com o sedimento, podese ter adsoro crescente com o passar do tempo e, conseqentemente, menor biodisponibilidade na gua de cultivo e maiores valores de CL(I)50-48 h podero ser calculados. JONSON e MAIA (1999) citam que, na maioria dos estudos, o sedimento influencia a toxicidade aguda ou a bio-concentrao de agentes qumicos, de modo que a reduo do efeito txico causada pelo fenmeno de adsoro ao material particulado, que, por sua vez, diminui a bio-disponibilidade para o organismo teste, concordando com os resultados deste trabalho. Com relao preciso dos testes com as trs espcies de daphnias, verifica-se nas Tabelas 2, 4 e 7 que, independentemente dos agentes txicos testados, os coeficientes de variao obtidos concordam com os dados obtidos por BERTOLETTI et al. (1992) para o sulfato de cobre (C.V.= 21,7%) e o determinado pela Norma ISO (1982) que aceita valores at 39%. Segundo a definio do Standard Methods (APHA, 1989), a preciso refere-se medida do grau de concordncia entre anlises em rplica de uma amostra, enquanto que a exatido diz respeito proximidade do valor mdio em relao a um valor verdadeiro. A exatido dos resultados de testes de toxicidade no pode ser determinada, pois existem, normalmente, variaes biolgicas entre indivduos de mesma espcie. Este aspecto dificulta a identificao de erros sistemticos inerentes ao procedimento analtico como a sensibilidade individual dos organismos, no possibilitando obter concentraes efetivas aps vrios ensaios. Conseqentemente, no existe um valor (ou concentrao) exato (ou de referncia) de determinado agente qumico que cause efeito txico especfico

(BERTOLETTI et al., 1992). Os resultados de testes de toxicidade com organismos aquticos permitem estimar apenas a preciso do mtodo utilizado (BERTOLETTI et al., 1992). Na Tabela 9 observa-se que os dados obtidos da CE50-48 h para as trs espcies de daphnias so muito inferiores ao dado citados por TOMLIN (1995), e EXOTOXNET (1996) e calculado por FERREIRA (1998). As diferenas dos resultados obtidos podem ser atribuda modificao na metodologia utilizada para a obteno da CE5048 h no teste de toxicidade com trichlorfon. A diferena entre os dados obtidos neste ensaio com os dados obtidos por outros pesquisadores pode ser devido ao fato de que o trichlorfon altamente voltil e os frascos de vidro utilizados como parcelas experimentais foram mantidos tampados durante todo o tempo de durao do teste impidindo a volatilizao de molculas do inseticida para fora dos recipientes. A presso de vapor do trichlorfon e 0.21 mPa (EXTOXNET, 1996) que caracteriza o inseticida como de alta volatilidade. Com esta modificao, todas as molculas do inseticida ficaram em

condies de entrar em contato com os organiamos-testes e, conseqentemente, causar intoxicao. Desta forma, acredita-se ter quantificado o potencial mximo de toxicidade aguda do trichlorfon para as daphnias, pois com o fechamento dos frascos de vidro impide-se a volatilidade de molculas do inseticida. Assim esta modificao metodolgica, fechamento do frascos de vidro, a explicao para que os valores de CE50-48h calculados neste trabalho foram to inferiores aos citados por TOMLIN (1995) e EXOTOXNET (1996) e calculados por FERREIRA (1998), Tabela 9 Estes dados foram obtidos em recipientes abertos, com provvel volatilizao de parte das molculas adicionadas, durante o perodo de exposio. verifica-se tambm na Tabela 9 h diferena entre os valores de CE50-48h citados calculados nas referencias bibliogrficas citadas. ou

Tabela 9 Valores mdios de CE5048 h de trichlorfon calculados para as trs espcies de daphnias neste trabalho e por outros autores. Pesquisador ou norma Neste trabalho TOMLIN (1995) EXOTOXNET (1996) FERREIRA (1998) Resultados gua natural, 45 de dureza em CaCO3 D.m = 0,70; D.s. = 0,53; D. l. = 0,92 em (g/L). Meio M4, dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D. m = 960,0 em (mg/L). Meio M4, dureza 250 15 mg/L em CaCO3 D.m = 10,000 (mg/L) gua natural, 40 48 mg/L em CaCO3 D. m = 586,0 (mg/L).

D. m = Daphnia magna; D. s = Daphnia similis; D. l = Daphnia laevis

4.4. Risco de intoxicao da contaminao ambiental das aplicaes de sulfato de cobre para as daphnias

Na Tabela 10 esto apresentados os valores das concentraes ambientais estimadas (CAEs) e a classificao dos riscos de intoxicao de D. magna, D. similis e D. laevis devido contaminao ambiental resultante do uso do sulfato de cobre na piscicultura, em ausncia e presena de sedimento.

Tabela 10. Valores das CAEs e classificao do risco de intoxicao da contaminao ambiental devido ao uso do sulfato de cobre nas doses recomendadas em piscicultura na ausncia e na presena do sedimento para Daphnia magna, Daphnia similis e Daphnia laevis.
Espcie Daphnia magna Daphnia similis Daphnia laevis sedimento ausente presente ausente presente ausente presente CAE (mg/L) 0,33 0,33 0,33 0,33 0,33 0,33 CE50-48h (mg/L) 0,045 0,347 0,042 0,282 0,107 0,140 Classificao do risco de Intoxicao Alto Alto Alto Alto Alto Alto

Na Tabela 10 observa-se que os riscos de intoxicao devido a contaminao ambiental causada pelo uso do sulfato de cobre, aplicado na menor dose recomendada em piscicultura, na ausncia e presena do sedimento, clasificam-se como altos riscos para D. magna, D. similis e D. laevis Estes resultados esto de acordo com os de BOYD e MASSAUT (1999), que reportam o uso do algicida sulfato de cobre, nas concentraes, recomendadas para os diversos organismos alvos de controle de 0,33 a 2 mg/L, como de alto risco para as trs espcies de daphnias. Como pode ser observado na

Tabela 10, se o risco para a menor concentrao 0,33 mg/L foi classificado como alto, que deve ser mais alta ainda para a maior concentrao de 2 mg/L. A CAE do sulfato de cobre utilizada foi de 0,33 mg/L, de acordo com as recomendaes de POST (1987), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e PAVANELLI et al., (1999). O sulfato de cobre recomendado para o controle de protozorios, tremtodos, monognia, fungos e bactrias externas e tambm um potencial algicida, herbicida eliminando o fitoplncton e as plantas aquticas respectivamente, cujas doses recomendadas so calculadas pela relao alcalinidade total/100 e expressa em mg/L (KUBITZA e KUBITZA., 1999). No obstante ao alto risco de intoxicao ambiental devido ao uso do sulfato de cobre na piscicultura, MARTINS (1998) cita que aos 10 dias aps da aplicao na gua a flora e fauna voltam ao normal e que, aps 30 dias de exposio, os resduos de cobre na carne dos peixes expostos esto prximos ao normal. O sulfato de cobre um dos produtos mais utilizados atualmente para tratamento de parasitoses (GRIFIN, 1994), porm (MARTINS, 1998) cita estudos devem ser feitos para analisar sua ao sobre o ambiente e o tempo residual no peixe. O sulfato de cobre pode ser usado para o controle de protozorios em peixes na dose de 0,33 a 2 mg/L por tempo indefinido (REICHENBACH-KLINKE, 1982; POST, 1987; KINKLELIN et al., 1991; NOGA , 1996). Tais concentraes, entretanto, so muito altas e proporcionaro altos riscos de intoxicao ambiental, conforme os resultados encontrados no presente trabalho. O sulfato de cobre pode ser usado para o tratamento de saprolegnia em peixes na diluio de 15 mg/L ou 25 mg/L dependendo do estado da brnquia, durante uma hora (PAVANELLI et al., 1999). Pelos resultados obtidos, estas concentraes tambem

proporcionaro altos riscos. Por tanto, este tratamento deve ser realizado em tanques de banho de forma a no atingir o ambiente aqutico.

4.5. Risco de intoxicao da contaminao das aplicaes de trichlorfon para as daphnia

Na Tabela 11 esto apresentados os valores das concentraes ambientais estimadas (CAEs) e a classificao dos riscos de intoxicao da D. magna, D. similis e D. laevis devido contaminao ambiental resultante do uso do trichlorfon em ausncia e presena de sedimento. Tabela 11. Valores de CAEs e classificao do risco de intoxicao ambiental devido uso do trichlorfon na menor doses recomendadas em piscicultura na ausncia e na presena do sedimento para Daphnia magna, Daphnia similis e Daphnia laevis
Espcie Daphnia magna Daphnia similis Daphnia laevis Sedimento ausente presente ausente presente ausente presente CAE (mg/L) 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 CE50-48h (g/L) 0,70 299,70 0,53 381,62 0,92 282,73 Classificao do risco de Intoxicao Alto Alto Alto Alto Alto Alto

Na Tabela 11 observa-se que o risco de intoxicao devido contaminao ambiental com trichlorfon na dose de 0,13 mg/L recomendada para o tratamento de doenas de peixes em ausncia e presena de sedimento de alto risco para D. magna, D. similis e D. laevis. O valor da concentrao ambiental estimada (CAE) para o trichlorfon de 0,13 mg/L, o valor mais baixo de concentrao na qual recomendado para o controle de Lernea sp., Argulus sp. e Ergasilus sp.; todos parasitos de peixes REICHENBACH-KLINKE

(1982), POST (1987), KINKLELIN et al., (1991), NOGA (1996), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e PAVANELLI et al., (1999). As aplicaes de trichlorfon, de acordo com recomendaes da menor dose usada na piscicultura, foram classificados como de alto risco de intoxicao para as trs espcies de daphnias, pois todas as CE50 48
horas

em ausncia ou presena de sedimento so bem menores que CAE considerada. O trichlorfon foi classificado como de alta periculosidade ambiental quanto

toxicidade aguda as espcies de peixes tambaqui e tambacu, segundo o critrio de classificao de periculosidade citado por GUIMARES (1996), enquadrando-se na classe II (CE5096 h entre 0,1 10 ppm). Esta classificao tambem foi realizada por FERREIRA (1998), que classificou a recomendaes do trichlorfon como de alta periculosidade ambiental para peixes da espcie guaru (Poecilia reticulata). O trichlorfon tambm foi classificado como de alta perigosidade ambiental por MIYAZAKI (1998), que avaliou a toxicidade aguda do trichlorfon para o pacu (Calossoma macropomus) e para o tambaqui (Calossoma

macropomus X Piaractus mesopotamicus). O triclorfon (Diterex) pode ser usado para o controle de monogenas e crustceos nas doses de 0,13 a 0,15 mg/L por tempo indefinido (REICHENBACH-KLINKE, 1982; POST, 1987; KINKLELIN, et al., 1991; NOGA , 1996). Os riscos da utilizao do trichlorfon nas piscigranjas no se restringem apenas a morte dos peixes, mas tambm h a possibilidade de se encontrar resduos nos peixes de consumo humano (MIYASAKI, 1998). O trichlorfon um inseticida organofosforado bastante usado no controle de crustceos parasitas (Lernea sp., Argulus sp. e Ergasilus sp.), tremtodos monognos e sanguessugas, bem como na erradicao de ninfas e insetos aquticos. A quantidade do produto comercial Diterex, a ser aplicada corresponde concentraes entre 0,13 a 0,25 mg i.a./L em banhos indefinidos, de 1 a 2,5 mg i.a. /L em banhos prolongados, e 10g i.a./L em

banhos de 1 a 3minutos (KUBITZA e KUBITZA, 1999). As guas onde o trichlorfon for utilizado em dilaes igual ou superior CAE considerado de 0,13 mg/L devem ser descartadas de forma a no atingirem os ambientes aquticos, pois classificam-se como de alto risco de intoxicao ambiental. O trichlorfon pode ser usado para o tratamento de girodactildeos, dactilogirdeos na dose de 0,5 mg/L de gua, durante trs dias, para controle de coppodos ergasilidae em banhos de imerso rpida, de 5 a 10 minutos, na concentrao de 2,5 g/L de gua quatro vezes por semana, na temperatura no superior de 32C. Para controle de Lernea sp., banhos de imerso rpida, cinco a 10 minutos a concentraes de 25 g/L quatro vezes por semana, ou banhos prolongados de 0,5 mg/L de gua, durante trs dias. Para tratamento de Argulus foliaceus a recomendao e de 20 ml/L de gua em banhos de imerso de apenas 2 minutos (PAVANELLI et al., 1999) O artigo 21 da Resoluo CONAMA n. 020, de 18 de julho de 1986, estabelece que os efluentes de qualquer fonte poluidora somente podero ser lanados, diretamente e indiretamente nos corpos de gua com os valores mximos admissveis de sulfato de cobre de 1,0 mg/L e organofosforados de 1,0 g/L. As doses recomendadas de sulfato de cobre e de trichlorfon para os tratamentos de doenas de peixes esto acima dos limites aceitveis pelo Instituto Brasileiro de Meio Ambiente (IBAMA), na Resoluo CONAMA n 20, de 18 de Julho de 1986, para serem lanadas nas guas no ambiente. Por tanto, estas concentraes recomendadas devem ser realizadas em guas contidas e no devem ser descartadas de modo a atingir a rede hidrogrfica local.

5. CONCLUSES Considerando-se as condies em que os testes foram realizados e os resultados obtidos, pode-se concluir que: 1) o trichlorfon mais txico que o sulfato de cobre para as trs espcies de daphnias (D. magna D. similis e D. laevias) na presena ou ausncia de sedimento; 2) o sedimento diminui a biodisponibilidade do trichlorfon na gua para as trs espcies de daphnias; 3) as trs espcies de daphnias apresentaram sensibilidades especficas para o dicromato de potssio e para sulfato de cobre e trichlorfon; 4) a Daphnia laevis menos sensvel ao sulfato de cobre na ausncia de sedimento em relao Daphnia magna e a Daphnia similis, que no diferiram sensibilidade entre si; 5) a Daphnia similis mais sensvel ao trichlorfon na presena de sedimento em relao Daphnia magna e Daphnia laevis, que so menos sensveis e no diferem entre si na presena de sedimento; 6) como no existe diferena de sensibilidade entre as trs espcies de daphnias na ausncia de sedimento, a Daphnia laevis, espcie nativa do Brasil, pode ser usada como organismo teste em testes de toxicidade aguda e crnica de compostos txicos, exceto para o sulfato de cobre; e 7) o sulfato de cobre e o trichlorfon, nas doses recomendadas em piscicultura apresentam alto risco de intoxicao ambiental para as daphnias devido contaminao ambiental na presena ou ausncia de sedimento.

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7. ABSTRACT The aim of this study was to determine the acute toxicity, LE50-48h, of copper sulfate and of trichlorfon, to compare sensitivities and to evaluate the risk of environmental poisoning for three species of daphnias (Daphnia similis, Daphnia magna and Daphnia laevis), in the presence and absence of sediment. The tests for acute toxicity were performed under laboratory conditions, in a climatized room according to standardized methods with some adaptations. The LE50-48h values of copper sulfate calculated for D. magna were 0.345 mg/L with sediment and 0.045 mg/L without sediment; for D. similis, 0.282 mg/L with sediment and 0.042 mg/L without sediment; and for D. laevis 0.140 mg/L with sediment and 0.107 mg/L without sediment. The LE50-48h values of trichlorfon calculated for D. magna were 299.70 ng/L with sediment and 0.70 without sediment; for D. similis, 381.62 with sediment and 0.52 ng/L without sediment; and for D. laevis, 282.72 ng/L with sediment and 0.92 ng/L without sediment. Trichlorfon was more toxic than copper sulfate for the three species of daphnias. Sediment diminished the toxicity of both trichlorfon and copper sulfate for the three species of daphnias. In the absence of sediment, D. magna and D. similis did not show any difference in sensitivity to the two agrochemicals. However, D. laevis was significantly more sensitive than the other two species. In the presence of sediment, there was a difference in sensitivity among the species of daphnias, with D. magna being the most sensitive, followed by D. similis and D. laevis, showing less sensitivity to copper sulfate. In the absence of sediment, the three species of daphnias did not show any difference in sensitivity to trichlorfon. In the presence of sediment, D. magna and D. laevis showed no difference in sensitivity to trichlorfon. The use of copper sulfate and trichlorfon in pisciculture was classified as being of high risk of environmental poisoning for species of daphnias.

8. APNDICE

Apndice 1. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (20/02/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,05 1 0,07 1 0,09 3 0,12 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48

Imobilidade
final 48 24 48

OD mg/L

pH

0 0 2 2 3 5

24

0 0 1 3 3 4

0 1 2 3 4 5

24

0 1 2 2 2 4

0 1 2 4 4 4

24

0 1 2 4 4 4

0 2 3 4 5 5

0 2 6 9 12 17

0 5 10 12 15 20

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 2. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (27/02/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,05 1 0,10 3 0,13 3 0,17 4 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48

Imobilidade
final 48 24 48

OD mg/L

pH

0 0 1 4 4 5

24

0 1 1 3 4 5

0 1 3 4 5 5

24

0 0 2 3 4 5

0 0 2 3 4 4

24

0 0 2 3 4 5

0 1 3 3 4 5

0 1 7 12 15 19

0 2 10 15 17 20

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 3. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (07/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,05 2 0,10 3 0,13 4 0,17 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

1 2 3 4 5 5

24

0 0 2 3 4 5

0 1 2 3 5 5

24

0 0 0 2 3 5

0 1 2 4 5 5

1 1 3 11 15 15

24

1 1 3 4 5 5

1 0 5 11 15 20

24

1 5 10 15 20 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 4. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (11/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,05 0 0,10 2 0,13 2 0,17 4 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 0 3 3 4

24

0 0 0 1 2 3

0 0 0 2 3 3

24

0 0 0 2 3 3

0 0 0 3 4 4

24

0 0 1 1 3 3

0 0 1 2 4 4

0 0 1 6 10 13

24

0 0 1 10 14 16

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 5. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24h e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,10 0 0,13 0 0,14 1 0,17 2 0,19 4 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 1 2 4 5

24

0 0 1 1 3 5

0 0 0 3 4 5

24

0 0 0 2 4 5

0 0 2 2 5 5

24

0 0 0 3 4 5

0 0 1 4 5 5

0 0 1 7 13 19

24

0 0 4 11 18 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 6. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24h e 48 horas (25/03/02) Tratamentos Testemunha 0,06 0,09 0,13 0,17
24 A B 48 C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 2 3 4

0 2 3 3 5

24

0 1 3 3 5

0 1 4 4 5

24

0 0 2 3 4

0 1 3 4 5

24

0 0 1 2 5

0 2 2 3 5

0 2 8 11 18

24

0 6 12 14 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

0,20 5 dados acumulados.

20

20

7,1

7,6

Apndice 7. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (20/02/02) Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,05 0 0,07 2 0,09 2 0,12 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 1 3 3 5

24

0 1 1 2 2 5

0 2 2 3 3 4

24

0 0 1 1 2 5

0 1 1 2 3 5

24

0 0 0 2 3 4

0 1 1 3 4 5

0 1 2 7 9 18

24

0 4 5 11 13 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 8. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (27/02/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,05 2 0,09 3 0,12 3 0,15 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 2 3 4 5

24

0 1 1 3 3 5

0 1 2 4 4 5

24

0 1 3 3 4 5

0 1 3 3 4 5

24

0 0 2 3 4 5

0 0 3 5 5 5

0 2 7 11 14 20

24

0 10 35 55 70 100

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 9. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (07/03/02). Tratamentos Testemunha 0,01
24 A B 48 C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0

1 1

24

0 1

0 2

24

0 0

0 0

24

0 0

0 2

24

0 1

48

1 6

7,1 7,1

7,6 7,6

0,05 1 0,09 3 0,12 4 0,15 5 dados acumulados

2 4 5 5

0 2 4 4

3 4 5 5

1 3 3 4

3 3 4 5

1 3 3 5

3 4 5 5

3 11 14 18

11 16 19 20

7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 10. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (11/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 1 0,05 1 0,09 1 0,12 2 0,15 3 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 1 2 3 4

24

0 0 0 1 1 2

0 0 0 1 2 3

24

0 0 1 1 1 3

0 0 1 1 2 3

24

0 0 1 1 2 3

0 0 1 1 3 3

0 1 3 4 6 11

24

0 1 3 15 10 13

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 11. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,09 0 0,12 0 0,15 1 0,18 3 0,23 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 1 2 4 5

24

0 0 0 2 4 5

0 0 0 3 5 5

24

0 0 1 2 4 5

0 0 2 3 5 5

24

0 0 0 1 3 5

0 0 1 1 4 5

0 0 1 6 14 20

24

0 0 3 9 18 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 12. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (25/03/02). Tratamentos
A B C D Imobilidade final OD mg/L pH

Testemunha 0 0,05 0 0,09 1 0,12 3 0,17 3 0,20 5 dados acumulados

24

48

0 0 2 4 4 5

24

0 1 2 3 3 5

48

0 1 2 4 4 5

24

0 1 2 3 4 5

48

0 2 3 3 5 5

24

0 1 3 3 3 5

48

0 1 3 4 5 5

0 3 8 12 13 20

24

0 4 10 15 18 20

48

7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 13. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (20/02/02). Tratamentos
24 A 48 24 B 48 24 C 48 24 D 48 imobilidade final 24 48 OD mg/L pH

Testemunha 0 0,001 0 0,005 1 0,02 1 0,6 1 010 3 dados acumulados

0 0 2 2 2 4

0 2 1 1 1 3

0 3 1 3 3 4

0 0 1 2 2 4

0 1 1 3 3 5

0 0 1 2 2 4

0 0 2 2 3 3

0 2 4 6 6 14

0 4 6 10 11 18

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 14. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (27/02/02). Tratamentos Testemunha 0 0,001 0 0,006 1 0,03 1 0,09 4 0,14 4 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 1 2 5 5

24

0 0 1 2 3 5

0 0 2 3 5 5

24

0 1 1 1 3 5

0 1 2 2 4 5

24

0 0 0 1 5 5

0 1 1 3 5 5

0 1 3 5 15 19

24

0 2 6 10 19 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 15. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24e 48 horas (07/03/02).

Tratamentos Testemunha 0 0,001 0 0,006 0 0,03 2 0,09 4 0,14 5 dados acumulados

24

A 48

C 48

D 48

Imobilidade final 48

OD mg/L

pH

0 1 2 3 5 5

24

0 0 0 1 3 5

0 2 2 3 4 5

24

0 0 1 1 3 5

0 1 2 3 4 5

24

0 0 1 2 3 4

0 1 2 4 5 5

0 0 2 6 13 19

24

0 5 7 13 18 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 16. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (11/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,001 0 0,006 0 0,03 0 0,09 1 0,14 2 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 0 1 2 3

24

0 0 0 0 1 3

0 0 1 0 2 3

24

0 0 0 1 2 3

0 0 0 1 3 4

24

0 0 1 1 2 3

0 0 1 2 3 4

0 0 1 2 6 11

24

0 0 2 4 10 14

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 17. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,03 0 0,09 0 0,14 1 0,18 3 0,21 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 0 1 4 5

24

0 0 0 1 4 5

0 0 0 1 4 5

24

0 0 1 0 2 4

0 0 1 1 4 5

24

0 0 0 1 3 5

0 0 1 1 4 5

0 0 1 3 17 19

24

0 0 2 4 16 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 18. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com dicromato de potssio por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (25/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,03 0 0,07 1 0,10 3 0,14 3 0,18 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 2 2 3 4 5

24

0 0 2 2 3 4

0 1 3 2 5 5

24

0 1 1 2 4 5

0 2 3 4 5 5

24

0 0 1 2 3 5

0 2 2 3 5 5

0 1 5 9 15 19

24

0 7 10 12 19 20

48

7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 19. Dados de imobilidade de Daphnia magna com sulfato de cobre por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (25/02/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,03 0 0,23 1 0,33 3 0,48 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 3 4 5 5

24

0 0 0 1 3 5

0 1 2 4 4 5

24

0 1 1 0 2 5

0 2 2 3 3 5

24

0 0 0 1 3 5

0 2 3 3 4 5

0 1 1 6 11 20

24

0 6 10 14 16 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 20. Dados de imobilidade de Daphnia magna com sulfato de cobre em presencia de sedimento, por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (04/03/02). Tratamentos Testemunha 0,1 0,3 0,5 0,8
24 A B 48 C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 2 3 5

1 0 2 3 5

24

0 1 2 3 5

0 1 2 3 5

24

0 0 1 4 4

0 0 1 4 4

24

0 0 2 4 4

0 0 2 4 4

0 1 7 14 18

24

0 1 7 14 18

48

7,3 7,3 7,3 7,3 7,3

7,6 7,6 7,6 7,5 7,6

1,0 5 dados acumulados

20

20

7,3

7,5

Apndice 21. Dados de imobilidade de Daphnia similis com sulfato de cobre nas avaliaes de 24 e 48 horas (25/02/02). Tratamentos Testemunha 0 0,01 0 0,07 2 0,14 3 0,21 4 0,28 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48

por repetio

OD mg/L

pH

0 0 3 4 4 5

24

0 1 2 3 4 5

0 1 3 3 4 5

24

0 1 3 3 4 5

0 2 3 3 4 5

24

0 0 2 3 4 5

0 1 3 4 5 5

0 2 9 12 16 20

24

0 4 12 14 17 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 22. Dados de imobilidade de Daphnia similis com sulfato de cobre em presena de sedimento, por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (04/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,1 1 0,3 2 0,5 5 0,7 5 0,9 5 dados acumulados
24 A 48 B C 24 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 2 5 5 5

24

0 1 2 3 5 5

0 1 2 3 5 5

24

0 0 2 4 5 5

1 0 2 4 5 5

24

0 1 3 4 4 5

0 1 3 4 4 5

0 3 9 16 19 20

24

1 3 9 16 19 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5

Apndice 23. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com sulfato de cobre por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (25/03/02). Tratamentos Testemunha 0,01
24 A B 48 C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0

0 1

24

0 1

0 2

24

0 1

0 1

24

0 0

0 1

24

0 2

48

0 5

7,2 7,2

7,6 7,6

0,06 0 0,12 1 0,18 2 0,24 5 dados acumulados

1 3 4 5

1 1 2 4

2 2 4 4

1 1 4 4

2 2 2 4

1 1 5 5

1 2 4 5

3 4 13 18

6 9 16 18

7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 24. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com sulfato de cobre em presena de sedimento, por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (04/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,05 1 0,08 2 0,1 2 0,3 5 0,5 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 2 2 5 5

24

0 1 1 2 4 5

0 1 1 2 4 5

24

0 0 1 2 3 5

0 0 1 2 3 5

24

0 1 2 2 3 5

0 1 2 2 3 5

0 3 6 8 15 20

24

0 3 6 8 15 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5

Apndice 25. Dados de imobilidade de Daphnia magna com trichlorfon (g/L) por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0, 1 0 0,5 0 0,9 2 3,0 4 7,0 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 1 3 5 5

24

0 0 0 3 4 5

0 0 2 4 5 5

24

0 0 0 4 5 5

0 0 1 5 5 5

24

0 0 0 3 5 5

0 0 0 3 5 5

0 0 0 12 18 20

24

0 0 4 15 20 20

48

7,3 7,3 7,3 7,3 7,3 7,3

7,6 7,5 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 26. Dados de imobilidade de Daphnia magna com trichlorfon (g/L) em presena de sedimento, por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos
A B C D Imobilidade final OD mg/L pH

Testemunha 0 150,0 0 250,0 1 300,0 1 400,0 3 500,0 5 dados acumulados

24

48

0 0 1 1 3 5

24

0 0 1 2 4 5

48

0 0 1 2 5 5

24

0 1 1 3 5 5

48

0 0 1 3 5 5

24

0 0 1 4 4 5

48

0 1 1 4 4 5

0 1 4 10 16 20

24

0 2 4 10 17 20

48

7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0

7,5 7,5 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 27. Dados de imobilidade de Daphnia similis com trichlorfon (g/L) por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 0,2 0 0,6 2 1,0 3 4,0 4 9,0 5 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 3 4 4 5

24

0 0 1 3 4 4

0 0 2 4 5 5

24

0 1 2 4 4 5

0 2 3 5 5 5

24

0 0 3 3 5 5

0 0 3 4 5 5

0 1 8 13 17 19

24

0 3 11 17 19 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 28. Dados de imobilidade de Daphnia similis com trichlorfon (g/L) em presena de sedimento, por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 250,0 1 300,0 1 350,0 2 450,0 3 600,0 5 dados acumulados Apndice 29.
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 1 1 2 3 5

24

0 1 1 1 4 5

0 1 1 1 4 5

24

0 1 1 2 5 5

0 1 1 2 5 5

24

0 0 1 1 4 5

0 0 1 2 4 5

0 3 4 6 16 20

24

0 3 4 7 16 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,5 7,5 7,6 7,6 7,5

Dados de mortalidade de Daphnia laevis com trichlorfon (g/L) por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02).

Tratamentos Testemunha 0 0,2 0 0,6 1 1,0 2 5,0 3 8,0 5 dados acumulados

24

A 48

C 48

D 48

Imobilidade final 48

DO mg/L

pH

1 1 1 3 4 5

24

0 0 1 2 3 5

0 0 2 2 5 5

24

0 1 1 3 4 5

0 2 2 4 5 5

24

0 1 1 2 3 5

0 1 2 3 4 5

0 2 4 9 13 20

24

1 4 7 12 18 20

48

7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6

Apndice 30. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com trichlorfon (g/L) em presena de sedimento, por repetio nas avaliaes de 24 e 48 horas (18/03/02). Tratamentos Testemunha 0 100,0 0 150,0 2 350,0 3 450,0 4 600,0 4 dados acumulados
24 A 48 B C 48 D 48 Imobilidade final 48 OD mg/L pH

0 0 2 3 4 5

24

0 0 1 3 3 5

0 0 1 3 3 5

24

1 0 0 3 4 4

1 0 0 3 5 5

24

0 1 0 2 4 5

0 1 0 2 4 5

1 1 3 11 15 18

24

1 1 3 11 16 20

48

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6