ENZIMAS E CINTICA ENZMICA

NDICE
1. Reviso dos conceitos de Keq e de QR................................................................................... 2 2. Reviso de conceitos de cintica qumica. ............................................................................. 3 3. O que so enzimas? ................................................................................................................ 5 4. O que a cintica enzmica? .................................................................................................. 6 5. Como fazer um estudo cintico de uma enzima?................................................................... 7 6. Que tipo de resultados podem ser obtidos no estudo cintico de uma enzima?..................... 7
6.1. Noo de actividade enzmica ou actividade cataltica de uma enzima. ..................................................... 7 6.2. Noo de v0 ou velocidade inicial. .............................................................................................................. 8 6.3. Influncia da quantidade de enzima na velocidade de converso v0. .......................................................... 8 6.4. Influncia da temperatura na actividade enzmica....................................................................................... 9 6.5. Influncia do pH........................................................................................................................................ 10 6.6. Influncia da concentrao dos substratos na actividade enzmica e saturabilidade. ................................ 10 6.7. Influncia da concentrao do substrato em enzimas com cintica de tipo michaeliano ou hiperblico. .......................................................................................................................................................................... 11 6.8. Influncia da concentrao de substrato em enzimas com cintica de tipo cooperativo ou sigmoide. .. 15 6.9. Representaes grficas lineares nas enzimas de cintica michaeliana e de cintica de tipo cooperativo. .................................................................................................................................................... 18 6.10. Modificadores da actividade enzmica: inibidores e activadores. ........................................................... 20 6.11. Inibidores competitivos. Sua representao grfica linear. ..................................................................... 20 6.12. Inibidores no competitivos. Sua representao grfica linear................................................................ 23 6.13. Efeitos alostricos. .................................................................................................................................. 26 6.14. Efeitos induzidos por modificao covalente de enzimas catalisada por outras enzimas........................ 27

7. Para que pode servir o estudo cintico de uma enzima? ...................................................... 28 8. Nota final: a actividade das enzimas como factores de regulao do metabolismo. ........... 30 9. Bibliografia consultada: ....................................................................................................... 32

Este texto foi escrito por Rui Fontes em Janeiro de 1996 e corrigido em Janeiro de 2007. O autor agradece a todos os que lerem este texto todas as crticas que entendam fazer.

1. Reviso dos conceitos de Keq e de QR.

Todas as reaces tendem a alcanar um equilbrio, mas nem sempre isto aparente. Se a concentrao de um dos reagentes est estequiometricamente em defeito em relao aos outros e a reaco tem uma constante de equilbrio de valor elevado pode parecer que, quando macroscopicamente a reaco terminou, esse reagente foi completamente consumido. Para efeitos prticos foi exactamente isso que ocorreu mas, em rigor, algumas molculas desse reagente permanecem no meio. Todos os sistemas que reagem alcanam um estado de equilbrio no qual permanecem pelo menos algumas molculas dos reagentes. So caractersticas dos estados de equilbrio: a) As propriedades macroscpicas do sistema mantm-se constantes no tempo. b) escala microscpica, a reaco prossegue nos sentidos directo e inverso com velocidades iguais. c) Um mesmo estado de equilbrio pode obter-se quer a partir dos reagentes quer dos produtos. d) Um estado de equilbrio qumico s pode obter-se, no exacto sentido da palavra em sistemas fechados. Um ser vivo no um sistema fechado e por isso, em sentido estrito, o equilbrio qumico no existe nos seres vivos. Associada a uma reaco qumica determinada (em condies de presso, temperatura e concentrao dos reagentes e produtos determinadas) descrita pela equao: aA+bB pP+qQ existem dois valores de constantes de equilbrio: a) uma constante de equilbrio estequiomtrica em que quer o numerador quer o denominador so um produto de concentraes. [P](eq) p [Q](eq) q Keq = [A](eq) a [B](eq)b (1.1)

Esta Keq no verdadeiramente uma constante pois depende em certa medida da grandeza dessas concentraes. b) uma constante de equilbrio termodinmica em que quer o numerador quer o denominador so um produto de actividades: aP (eq) p aQ(eq) q Keq = aA (eq) a aB (eq)b (1.2)

Para a mesma reaco tambm se podem definir quocientes de reaco (QR) estequiomtrico e termodinmico. As equaes que definem QR tm um aspecto semelhante das constantes de equilbrio mas em vez das concentraes (ou das actividades) de equilbrio usam-se as concentraes (ou as actividades) que efectivamente se observam num dado momento da reaco. Em reaces em meio aquoso costume ignorar a concentrao da gua assim como a concentrao das substncias que intervenham na reaco mas que no estejam dissolvidas na gua (por exemplo precipitados) quando se definem quer as constantes de equilbrio quer os Pgina 2 de 32

quocientes de reaco. Admitindo-se que estas concentraes no variam durante o processo reactivo; quer concentrao da gua quer dessas substncias na fase slida se atribui convencionalmente o valor 1. Em investigao bioqumica laboratorial no habitualmente necessrio conhecer com rigor o valor da constante de equilbrio de uma reaco implicada no estudo que se est a realizar; ter uma ideia da ordem de grandeza da constante de equilbrio , em geral, suficiente e por isso indiferente usar uma constante termodinmica ou estequiomtrica. No ser vivo, os compostos qumicos reagem entre si respeitando a lei do equilbrio qumico. Admitamos que num dado momento, no citoplasma da clula, os compostos A, B, P e Q, todos hidrossolveis, esto em presena uns dos outros em concentraes tais que o valor do quociente de reaco (QR) inferior ao da constante de equilbrio (Keq): a reaco tem tendncia a processar-se no sentido da formao dos produtos P e Q com consumo de A e B. No caso em que QR > Keq a reaco tem tendncia a ocorrer no sentido inverso; quando QR = Keq a reaco, macroscopicamente, no tem tendncia a evoluir em nenhum dos sentidos.

2. Reviso de conceitos de cintica qumica.

Quando se diz que uma determinada reaco tem tendncia a ocorrer (Keq > QR) no se quer dizer com isso que ela ocorra de facto a uma velocidade aprecivel num intervalo de tempo determinado. A velocidade a que ocorre uma determinada reaco depende de vrios factores como a natureza dos reagentes e a sua concentrao, a temperatura, e nalguns casos da presena de radiaes e de catalisadores. As reaces qumicas elementares de 1 ordem (ou unimoleculares: A P + ...) obedecem lei de velocidade expressa pela equao: d [A] - = - k [A] (2.1) dt A velocidade de reaco , neste caso, proporcional concentrao do reagente A sendo k a constante de proporcionalidade; porque relaciona a concentrao de um reagente com a velocidade da sua converso em produtos diz que k uma constante cintica. Pode acontecer que uma determinada reaco (A + B P + ...) seja elementar e de 1 ordem em relao a cada um dos dois reagentes A e B, sendo globalmente de 2 ordem ou bimolecular: d [A] - = - k1 [A] [B] dt (2.2)

Os valores de k e k1 (constantes cinticas) so independentes da concentrao dos reagentes mas variam com a natureza destes e com a temperatura, aumentando com esta de acordo com a equao de Arrhenius. Atentemos no esquema que se apresenta a seguir: A+B k1 k2 P+Q

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Se a transformao de A + B em P + Q uma reaco qumica elementar o valor da velocidade de reaco que podemos observar experimentalmente na ausncia de P e Q igual a k1 [A] [B]. Se a reaco inversa tambm uma reaco qumica elementar ento, na ausncia de A e de B, a velocidade que se pode observar experimentalmente nesta reaco igual a k2 [P] [Q]. Qualquer que seja a concentrao de A, B, P e Q a velocidade de formao de P (= velocidade de formao de Q = velocidade de consumo de A ou de consumo de B) que podemos observar experimentalmente, sem recurso a compostos marcados radioactivamente, dada pela equao: v aparente = k1 [A] [B] - k2 [P] [Q] (2.3)

De notar que a velocidade microscpica a que ocorrem as reaces elementares no influenciada pela presena de produtos e este facto pode ser comprovado experimentalmente usando compostos marcados radioactivamente. A equao anterior permite-nos relacionar a Keq com as constantes k1 e k2.. O sistema est em equilbrio quando as propriedades macroscpicas do sistema se mantm constantes no tempo ou seja, quando v aparente = 0. Donde: [P](eq) [Q](eq) k1 Keq = = [A](eq) [B](eq) k2 (2.4)

Deve notar-se que conhecer o valor da Keq no nos diz nada acerca do valor absoluto das constantes k1 e k2 . Se, por exemplo, na reaco em anlise o valor de Keq for 1 a nica informao que este valor fornece a um cinetista que k1 = k2 . Assim, podemos dizer sem contradio, que uma reaco se est a processar muito rapidamente (ou muito lentamente) e que se encontra no estado de equilbrio. A maioria das reaces qumicas e todas as reaces em que intervm catalisadores so reaces complexas e podem tentar interpretar-se como uma sequncia de reaces elementares em que ocorre a formao de compostos intermedirios que no chegam a atingir no meio reactivo uma concentrao aprecivel por mtodos correntes de anlise. Na presena de um catalisador a velocidade das reaces modifica-se de forma marcada. Se no se disser explicitamente que se trata de um catalisador negativo admite-se implicitamente que estamos a falar de aumento da velocidade das reaces. Do ponto de vista de um cinetista interessado no mecanismo das reaces qumicas o catalisador um novo reagente que foi adicionado no meio reactivo e que tem a caracterstica especial de ser regenerado no final do processo reactivo microscpico em que intervm. A sua concentrao total no varia durante o processo reactivo. Admitamos que a reaco de transformao de A em P+Q , na ausncia de catalisador, uma reaco elementar de primeira ordem, e que v(sem catalisador) = k1 [A]. k1 A P + Q Admitamos que na presena de catalisador o mecanismo reactivo diferente. Cada vez que uma molcula de A se encontra com uma molcula de catalisador C elas reagem para gerar um complexo activado AC e que este complexo se pode dissociar em C + P + Q. As constantes de velocidade dependem, como dissemos, da natureza dos reagentes e portanto os valores das constantes de velocidade associadas ao processo de formao de AC e ao

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processo de dissociao deste complexo em P + Q + C podem ser muito maiores que o valor de k1. Admitindo que o catalisador C um reagente temos tambm de admitir que um produto. A P + Q Keq1 = [P](eq) [Q](eq) [A](eq) (2.5)

C + A P + Q + C

[P](eq) [Q](eq) [C] Keq2 = [A](eq) [C]

(2.6)

As expresses Keq1 e Keq2 referem-se, respectivamente, s reaces no catalisada e catalisada mas bvio que Keq1 = Keq2 = Keq. Os catalisadores modificam a velocidade das reaces mas no modificam o valor da constante de equilbrio nem o sentido em que a reaco, macroscopicamente, vai ocorrer e que pode ser previsto pela relao Keq /QR. Se a constante de equilbrio no for demasiado alta impedindo-nos de observar a reaco inversa (sntese de A a partir de P+Q) podemos constatar que esta reaco tambm catalisada pelo mesmo catalisador C.

3. O que so enzimas?
A palavra enzima (do Grego: en, na + zima, levedura) foi inventada em 1878 por Fredrich Wilhelm Khne. Na poca, esta palavra no era inocente pois apoiava uma das teorias em disputa acerca das causas das fermentaes. Com esta palavra se apoiava a teoria de Justus Liebig segunda a qual havia dentro da levedura substncias qumicas (fermentos = enzimas) responsveis pela transformao da glicose em dixido de carbono e etanol contra a teoria vitalista em moda na poca, que defendia que as fermentaes s podiam ocorrer na presena da levedura (a clula viva). Em 1897 os irmos Buchner foram capazes de obter a partir da levedura um extracto isento de clulas capaz de levar a cabo a fermentao da glicose. Desta forma se apoiava de forma marcante a teoria de Liebig. Com o desenvolvimento da cincia bioqumica se foi consolidando a ideia de que existiam dentro dos seres vivos substncias capazes de catalisar de modo muito especfico determinadas reaces qumicas e que o conjunto sequenciado dessas reaces explicavam as transformaes qumicas observadas nos seres vivos. A natureza proteica das enzimas s foi definitivamente aceite nos anos 30 deste sculo, na sequncia dos trabalhos de James Summer (que purificou e cristalizou a urease do feijo) e de John Northrop e Moses Kunitz (que demonstraram correlao directa entre a actividade cataltica de preparaes purificadas de enzimas digestivas e o seu contedo proteico). Curiosamente, estudos da dcada de 80 de Thomas Cech num protozorio (Tetrahymena thermophila) e de Sidney Altman em E. coli demonstraram actividade cataltica em certas molculas de RNA. Daqui surgiu o termo ribozimas: catalisadores biolgicos de natureza no proteica mas sim cidos ribonucleicos. Tal como acontece com todos os catalisadores quando se diz que uma enzima E catalisa a transformao AP est-se implicitamente a dizer que tambm catalisa a transformao

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inversa; a reaco vai progredir macroscopicamente no sentido AP ou no sentido PA dependendo da relao Keq/QR. Numa reaco enzmica chamam-se aos reagentes substratos da enzima. Relativamente aos catalisadores no enzmicos as enzimas so em geral mais potentes, actuam em condies pouco agressivas (pH prximo da neutralidade, temperatura << 100C, etc.), tm uma enorme especificidade quer em relao aos substratos quer em relao aos produtos da reaco que catalisam e a sua actividade pode ser, frequentemente, regulada por substncias diferentes dos substratos e dos produtos. Sendo as enzimas molculas proteicas o seu tamanho , geralmente, muito grande relativamente ao tamanho das molculas dos substratos. Este facto assim como a enorme especificidade das enzimas relativamente aos substratos com que podem interagir levaram introduo do conceito de stio activo (ou talvez mais correctamente stio cataltico), um local especfico modelado de tal forma que permite a interaco especfica com o substrato ou substratos e onde ocorre a reaco qumica.

Fig.1: Modelos de chave-fechadura e de encaixe induzido para a interaco enzima-substrato. O primeiro modelo (chave-fechadura) surgiu para explicar a alta especificidade das enzimas em relao aos substratos nomeadamente a sua interaco com apenas um dos enantimeros de uma mesma substncia. O segundo modelo (encaixe induzido) surgiu da necessidade de explicar certos casos de inibio competitiva (ver captulo 6.11). Em algumas enzimas estudos de difraco de raios X apoiam o segundo modelo (por exemplo, no caso da transcarbamlase do aspartato).

Em 1894, Emil Fisher descobriu que as enzimas da via glicoltica podem distinguir enantimeros (formas D de L) e esse facto levou-o a propor uma analogia com a chave e a fechadura como modelo de interaco entre as enzimas e os seus substratos. Este modelo admite a existncia de locais preformados na enzima onde os substratos se podem ligar e reagir. Koshland, em 1959, props um modelo diferente a que podemos chamar de encaixe induzido; quando os substratos interagem com a enzima provocam nestas modificaes conformacionais que ocorrem no s no sitio cataltico mas tambm se podem repercutir em toda a estrutura do protedo (ver Fig.1).

4. O que a cintica enzmica?

A cintica enzmica um ramo da bioqumica que estuda as enzimas em aco; a sua actividade cataltica. No entanto, pode tambm ser encarada como um ramo da cintica qumica que estuda as propriedades catalticas das enzimas. O estudo cintico de uma enzima visa primariamente caracterizar, ou seja descrever, a actividade dessa enzima. In vitro estuda-se a actividade da enzima procurando saber que tipo de reaces pode catalisar, com que substratos pode interactuar e como se modifica essa

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actividade (qualitativa e/ou quantitativamente) quando se fazem variar as condies em que ensaiada. O valor de pH, a temperatura, o tempo de incubao, as concentraes dos substratos, de cofactores ou de outras substncias (inibidores ou activadores) so exemplos de condies de ensaio que podem ser modificadas com o objectivo de observar como varia a actividade da enzima.

5. Como fazer um estudo cintico de uma enzima?

O estudo cintico de uma enzima feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima, preparaes que a contenham em estado mais ou menos purificado; quanto mais purificada estiver a preparao enzmica mais fcil ser o seu estudo cintico. De acordo com os objectivos definidos no devem estar presentes na preparao enzimas que interfiram no estudo que estamos a fazer. Durante o complexo processo de purificao podem ocorrer alteraes nas caractersticas cinticas da enzima de tal forma que as caractersticas observadas podem no ser as mesmas da enzima no seu estado nativo; alm disso as condies que usamos in vitro para estudar a enzima so diferentes daquelas que a enzima tem no seu meio natural, a clula. Se o objectivo dos estudos visa compreender o papel da enzima na clula os resultados experimentais devem ser interpretados com especial prudncia. Estes estudos podem servir de guia para planear e interpretar experincias realizadas em condies menos artificiais. Quando uma actividade enzmica estudada escolhe-se um meio de ensaio apropriado para o seu estudo; o objectivo pode ser estudar como varia a actividade cataltica da enzima quando modificamos as caractersticas desse meio, mas numa fase precoce do estudo necessrio buscar condies que permitam, no mnimo, reconhecer a existncia dessa actividade. Se a enzima catalisa a transformao reversvel A + B P + Q e a constante de equilbrio muito superior unidade as dificuldades do estudo podem ser minimizadas se escolhermos estudar a transformao de A + B em P + Q e no o inverso. Assim adicionaramos no meio de ensaio os compostos A e B. Um amortecedor de pH com um pH determinado assim como outras substncias como, por exemplo, cofactores essenciais actividade da enzima esto, em geral, tambm presentes no meio de ensaio. O meio de ensaio est a uma temperatura determinada e a reaco pode ser iniciada adicionando ao meio a preparao que contm a enzima. Para determinar a velocidade de converso de A+B em P+Q indispensvel termos uma maneira de seguir (de modo contnuo ou descontnuo) como cresce a concentrao de P ou Q (ou desce a concentrao de A ou B) em funo do tempo.

6. Que tipo de resultados podem ser obtidos no estudo cintico de uma enzima?
6.1. Noo de actividade enzmica ou actividade cataltica de uma enzima.
A actividade enzmica uma propriedade medida pelo aumento de velocidade de converso de uma reaco qumica que uma enzima produz num sistema de ensaio especificado. Num meio de ensaio foram introduzidos os compostos A e B: a velocidade de converso na reaco A + B P + Q pode ser expressa em mol de P (ou Q) formados/min e esta velocidade (v1) pode no ser nula na ausncia de enzima. Se a reaco catalisada pela enzima a velocidade de converso na presena desta pode ser v2. A quantidade (v2 - v1) uma medida da actividade cataltica presente na preparao enzmica adicionada ao meio de ensaio. Em geral o valor de v1 to pequeno comparado com v2 que se pode considerar v2 o valor da actividade cataltica da enzima.

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 importante referir que a velocidade de converso (e a actividade enzmica) uma quantidade extensiva e que portanto as suas dimenses so quantidade de substncia / tempo (n/t). A actividade enzmica de um dado volume de preparao pode ser expresso em UI (Unidades Internacionais = moles de produto formado ou substrato consumido por min).

6.2. Noo de v0 ou velocidade inicial.

Fig.2: Quantidade de produto formado versus tempo. A actividade enzmica uma quantidade extensiva (n/t) e em cada momento t corresponde ao declive de uma curva como a desta figura. A velocidade de converso A P diminui com o tempo de ensaio. v0 o valor do declive no tempo zero e o valor da actividade cataltica para as condies de ensaio nesse tempo zero. No caso em anlise o resultado da operao de dividir a quantidade (moles) de produto formado ao fim de 5 minutos por 5 min poderia ser uma boa estimativa de v0: a actividade da enzima na preparao enzmica que foi adicionada neste meio de ensaio seria 1UI.

Quando se faz uma experincia visando desenhar um grfico quantidade de P formado versus tempo e se espera tempo suficiente, obtemos quase sistematicamente um grfico com um aspecto semelhante ao da Fig. 2. Num dado momento t a actividade cataltica dada pelo declive da curva nesse tempo t. medida que o tempo de ensaio aumenta diminui a velocidade e esse facto pode ser causado pela diminuio de concentrao de reagentes (que se vo consumindo), pelo aumento de concentrao de produtos (que podem tornar significativa a velocidade da reaco inversa1) ou/e simplesmente porque a enzima instvel nas condies de ensaio. A esmagadora maioria dos estudos de cintica baseiam-se na estimativa da velocidade para tempo zero (v0); nesse momento as caractersticas do meio de ensaio, nomeadamente a concentrao dos substratos, so aquelas que foram escolhidas para o realizar.

6.3. Influncia da quantidade de enzima na velocidade de converso v0.

Mantendo invariantes todas as outras condies de ensaio a velocidade de converso v0 directamente proporcional quantidade de enzima adicionada no meio de ensaio. O grfico v0 versus quantidade de enzima uma linha recta de declive positivo que passa pela origem (ver Fig. 3). Este facto permite-nos definir quantidades derivadas da actividade cataltica. Se conhecermos o nmero de moles de enzima adicionada no meio de ensaio (o que s muito

1 Se, de modo contnuo, um dos produtos eliminado do meio reactivo a reaco inversa no pode ter lugar. No entanto se os produtos so mais que um, o produto ou produtos no eliminados podem ligar-se enzima e diminuir a velocidade de catlise; i.e. provocar inibio da actividade enzmica.

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Fig.3: Actividade enzmica versus quantidade de enzima. Os trs grficos desta figura representam o resultado de uma mesma experincia. Em cada um de 4 tubos de ensaio contendo um meio especificado foram adicionadas 4 diluies de uma mesma preparao enzmica; 1E, 2E, 3E e 4E representam as distintas quantidades de enzima adicionadas. No grfico da esquerda esto representados os traados obtidos (quantidade de produto formado versus tempo) para cada um dos tubos e as rectas que estimam v0. O grfico acima direita representa v0 versus quantidade de enzima. Os pontos do grfico abaixo direita representam a actividade especfica obtida em cada um dos quatro ensaios (neste caso em UI/mg protedo). A equao 6.7.7 mostra claramente que para determinadas condies de ensaio fixadas v0 proporcional a [Et], a concentrao total de enzima no meio de ensaio.

raramente acontece) podemos calcular a actividade especfica e, por exemplo, exprimi-la em moles de substrato convertido por segundo e por mole de enzima (s-1). Para permitir comparar os resultados de experincias diferentes costume exprimir a actividade especfica em UI/mg de protena, UI/ml de preparao enzmica ou em UI/g de tecido donde essa enzima foi extrada.

6.4. Influncia da temperatura na actividade enzmica.

Quantidade de produto formado

30

45

60

t1

tempo

t2

Fig.4: Quantidade de produto formado versus tempo a vrias temperaturas. O uso de temperaturas elevadas pode dificultar ou mesmo impedir uma boa estimativa de v0; assim habitual usar temperaturas de ensaio em que a enzima estvel. Esta figura mostra como pode variar a quantidade de produto ao longo do tempo para ensaios de uma mesma enzima a vrias temperaturas. Se usssemos um tempo de incubao suficientemente curto poderamos concluir que a enzima era mais activa a 60C; nesse tempo muito curto a velocidade da reaco enzmica foi alta e ainda no houve tempo suficiente para que a desnaturao se processasse em extenso aprecivel. Temperaturas mais baixas facilitam a estimativa de v0 pois a actividade mantm-se constante durante mais tempo.

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Em todas as reaces qumicas, incluindo as catalisadas por enzimas, a velocidade das reaces aumenta com a temperatura, mas a velocidade com que um protedo sofre desnaturao (e uma enzima se inactiva) tambm aumenta com a temperatura. O nmero de enzimas capazes de resistir a temperaturas da ordem dos 100C durante alguns segundos extremamente restrito. A temperaturas elevadas a velocidade de desnaturao da enzima muito alta podendo acontecer que a actividade enzmica se anule pouco tempo aps o incio do ensaio (ver Fig. 4).

6.5. Influncia do pH.

O pH a que uma reaco enzmica estudada normalmente imposto pelo experimentador adicionando no meio de ensaio uma quantidade adequada de um determinado amortecedor de pH. Um determinado amortecedor s funciona adequadamente como amortecedor de pH numa faixa limitada de valores de pH e se o objectivo estudar uma reaco enzmica numa ampla gama de valores de pH temos de escolher amortecedores diferentes. Assim, um determinado resultado experimental actividade versus pH pode reflectir apenas a influncia do amortecedor na actividade cataltica. Excluda esta possibilidade os grficos experimentais actividade versus pH podem traduzir que o estado ligado ou desligado a protes num determinado local da enzima (ou nos substratos) se pode reflectir na actividade enzmica. Para determinadas condies de ensaio existe um pH ptimo, o pH a que se obtm maior actividade (ver Fig. 5).
2000

1500 25 mM 1000

500 750 M 0 8.5 9 9.5 pH 10 100 M 10.5

Fig.5: Esta figura foi recolhida e simplificada a partir de um artigo publicado no Biochemical Journal: R.K. Morton, 1957, Biochemical Journal, 65: 674. Mostra um grfico actividade versus pH para a actividade hidroltica da fosftase alcalina de intestino de vitelo sobre o fenil-fosfato a distintas concentraes deste composto.

6.6. Influncia da concentrao dos substratos na actividade enzmica e saturabilidade.

As observaes feitas em estudos sobre a influncia da concentrao de substratos, (assim como a de inibidores e activadores) na velocidade das reaces enzmicas sempre foram temas de especial interesse para os cinetistas.

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Quando se estuda a influncia da concentrao de um substrato na actividade duma enzima comea por fixar-se a concentrao dos outros substratos (se os houver) e das demais condies de ensaio e estuda-se como varia a actividade versus concentrao de um dos substratos. Em 1902 Adrian Brown estudando a reaco de hidrlise da sacarose [sacarose (+ H2O) glicose + frutose] e usando como catalisador sacarase (= invertase ou -frutofuranosdase) observou que para concentraes altas do substrato sacarose a ordem de reaco era zero em relao sacarose; ou seja, nessas concentraes a velocidade da reaco no variava quando variava a concentrao de substrato. Brown props um mecanismo que explicaria o fenmeno: E + sacarose E sacarose E + glicose + frutose

A enzima formaria com o substrato um complexo intermedirio (mais tarde chamado complexo de Michaelis); este complexo daria origem aos produtos regenerando-se a enzima e a velocidade de reaco seria proporcional concentrao deste complexo. Se a concentrao de sacarose muito alta relativamente concentrao de enzima, a enzima pode estar saturada de substrato; aumentando a concentrao de substrato a concentrao do complexo intermedirio no pode aumentar mais e portanto no aumenta a velocidade de reaco. Ver Fig. 6.

enzima s enzima h

v0

[Substrato]
Fig. 6: Nalgumas enzimas o grfico actividade versus concentrao do substrato tem um aspecto semelhante a enzima h (uma hiprbole rectangular passando pela origem); noutras um aspecto semelhante a enzima s (um sigmoide). Em ambos os casos para altas concentraes de substrato a actividade pouco sensvel a variaes na concentrao de substrato: as enzimas so saturveis.

6.7. Influncia da concentrao do substrato em enzimas com cintica de tipo michaeliano ou hiperblico.
Para muitas enzimas o grfico v0 versus concentrao de um dos substratos, mantendo constantes todas as outras condies do meio, um ramo de hiprbole rectangular passando pela origem (ver Fig. 6). Um tratamento matemtico possvel que explica este tipo de grficos em reaces enzmicas com apenas um substrato (ou mais de um mas os outros a concentrao fixada) foi proposto por Leonor Michaelis e Maude Menten em 1913. Estes autores admitiram vrios pressupostos: Pgina 11 de 32

1) Um mecanismo representado pelo esquema seguinte: k1 k3 E+S ES E + P +.... k2 A velocidade de formao do complexo ES seria de 1 ordem em relao a S (o substrato) e a E (a enzima livre; no ligada a S) e a constante cintica associada ao processo seria k1. Quer a velocidade de formao dos produtos quer a de dissociao do complexo ES em S + E seriam proporcionais concentrao deste complexo: ambos os processos seriam de 1 ordem em relao a ES e as constantes cinticas seriam respectivamente k3 e k2. 2) A velocidade de formao dos produtos a partir do complexo ES era muito lenta relativamente velocidade de dissociao do complexo em E + S (k2>>k3) donde se poderia admitir que a reaco de formao e dissociao do complexo E S se encontrava num estado muito prximo do equilbrio qumico. 3) Que a concentrao de stios catalticos na enzima, [Et], era muito baixa relativamente concentrao de [S] de maneira que para que esse estado de equilbrio fosse atingido muito poucas molculas de S tinham que reagir com E; que esse estado de equilbrio se atingia to rapidamente que na escala de tempo da transformao macroscpica de S em P se poderia considerar instantneo e se mantinha durante todo o tempo em que ocorria a transformao S P+... Para a reaco de dissociao do complexo ES definiram a constante de equilbrio Ks (s de substrato). [S] [E] Ks = = [ES] k2 k1 (6.7.1)

Com base nestes pressupostos definiram v0 como a velocidade da reaco para concentrao nula de produtos: v0 = k3 [ES] (6.7.2)

k3 a constante de velocidade para a reaco elementar e unimolecular ES E + P +... A concentrao total de enzima ([Et]) igual soma das concentraes de enzima livre ([E]) mais enzima complexada ([ES]) quaisquer que sejam as unidades em que estas se exprimam: [Et] = [E] + [ES] (6.7.3)

As equaes 6.7.1, 6.7.2 e 6.7.3 constituem um sistema que pode ser desenvolvido de forma a obter v0 em funo de [Et], Ks e [S]. Ks [ES] [E] = [S] (6.7.4)

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Ks [ES] Ks [Et] = + [ES] = ( + 1) [ES] [S] [S] [Et] [Et] [S] [E S] = = (Ks / [S] + 1 ) Ks + [S] k3 [Et] [S] v0 = Ks + [S]

(6.7.5)

(6.7.6)

(6.7.7)

Um grfico v0 versus [S] um ramo de hiprbole rectangular passando pela origem tendo uma assmptota horizontal (y = k3 [Et]) e uma assimptota vertical (x= -Ks). Quando [S] >> Ks a equao de velocidade simplifica: v0= k3 [E]; nestas circunstncias praticamente toda a enzima est complexada com o substrato, est saturada ([Et] [ES]), e nas condies do ensaio no seria possvel aumentar a velocidade aumentando a concentrao de substrato. Assim podemos definir o conceito de velocidade mxima como a actividade enzmica para concentrao saturante de substrato: Vmax = k3 [Et] e nestas circunstncias v0 = Vmax. de notar que o valor de Vmax obtido em determinadas condies de temperatura e pH pode ser diferente daquele que obtido noutras condies de temperatura e pH. Vmax apenas significa v0 para concentraes saturantes de substrato. Assim podemos escrever a equao de Michaelis-Menten como se segue: Vmax [S] v0 = Ks + [S] (6.7.8)

Quando [S]<<Ks a equao de velocidade simplifica: v0 = Vmax [S]/Ks; para muito baixas concentraes de substrato praticamente toda a enzima est na forma no complexada ([Et] [E]) e a velocidade directamente proporcional concentrao de substrato. Quando [S] = Ks ento [E] = [ES] e a enzima est igualmente distribuda entre as formas complexada e no complexada: v0 = Vmax / 2. Ver Fig.7.

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Fig. 7: Distribuio das formas enzmicas complexada e no complexada com o substrato para trs concentraes de substrato. Para valores de concentrao de substrato muito superiores a Ks a soma no denominador da equao 6.7.8 pode simplificar para [S]; a enzima est saturada, v0 Vmax e a hiprbole, para estas concentraes de substrato, tende para uma recta de declive nulo. Para valores de concentrao de substrato muito inferiores a Ks a soma no denominador da equao 6.7.8 pode simplificar para Ks; v0 proporcional a [S] (e a constante de proporcionalidade = Vmax/Ks) e a hiprbole, para estas concentraes de substrato, tende para uma recta de declive = Vmax/Ks. Quando a concentrao de substrato igual a Ks a enzima est hemisaturada e na equao 6.7.8 o denominador pode simplificar para 2*[S]; v0 = Vmax/2. Ks a concentrao de substrato para a qual v0 igual a metade de Vmax. Na equao 6.7.9 Ks ser substitudo por Km e todas estas afirmaes continuam a fazer sentido.

Um dos pressupostos de Michaelis e Menten, concretamente a imposio de k3<<k2 e a consequente a necessidade de equilbrio qumico na formao e dissociao de ES, foi questionados por Briggs e Haldane em 1925. Estes autores resolveram matematicamente o problema que o mecanismo aceite por Michaelis e Menten coloca, admitindo que a concentrao do complexo ES se mantm constante (estacionria) durante praticamente todo o processo cataltico; ou seja que a soma das velocidades de desagregao do complexo ES (k2 [ES] + k3 [ES]) iguala a velocidade da sua formao (k1 [S] [E]). O desenvolvimento matemtico com base neste pressuposto leva a uma equao semelhante proposta por Michaelis e Menten mas em que a constante de equilbrio Ks substituda por uma outra Km sendo que Km = (k2 + k3 )/ k1. Vmax [S] v0 = Km + [S] (6.7.9)

Km , a constante de Michaelis (em homenagem a Leonor Michaelis) poderia assim ser definida como o valor da concentrao de substrato quando a velocidade de reaco metade de Vmax (ver Fig. 8).

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Fig.8: Actividade versus concentrao de substrato em enzimas com cintica de tipo hiperblico. O Vmax o limite para que tende v0 quando a concentrao do substrato S tende para infinito. O Km a concentrao de substrato para o qual o valor de v0 metade do valor de Vmax. A equao v0= Vmax [S]/ (Km + [S] ) descreve uma hiprbole rectangular passando pela origem, com uma assmptota horizontal (y= Vmax) e outra vertical (x=- Km).

Aceitando como Michaelis que k3<<k2 a constante de Michaelis ser a constante de dissociao do complexo ES em S + E (enzima livre). Se aceitarmos tal como Briggs e Haldane o valor do Km (Km = (k2+k3)/k1) ser tanto maior quanto maiores forem os valores das constantes cinticas associadas dissociao do complexo ES (em E+S no caso de k1; em E+P no caso de k3) e tanto menor quanto maior for o valor da constante cintica associada formao do complexo ES. Em ambos os casos o valor do Km uma medida da afinidade do substrato em relao enzima (quanto maior for o seu valor menor ser a afinidade). Como Briggs e Haldane podemos aceitar que Km = Ks + k3/k1; nesse caso Km pode ter um valor da mesma ordem de grandeza de Ks se admitirmos que o valor de k3/k1 no muito grande relativamente ao valor de Ks. Para determinadas condies de ensaio os valores de k1, k2 e k3 so constantes e portanto constante o valor de Km; este valor no varia com a quantidade de enzima e portanto uma caracterstica da actividade dessa enzima.

6.8. Influncia da concentrao de substrato em enzimas com cintica de tipo cooperativo ou sigmoide.
a) Quando se estuda a influncia da concentrao de alguns substratos na actividade de algumas enzimas podem obter-se grficos v0 versus concentrao de substrato com a forma de um sigmoide (ver Fig. 6). Este fenmeno ocorre por exemplo nos casos da glicocnase, da fosfofrutocnase-1, da cnase do piruvato, da desidrognase do glutamato, da amidofosforibosil-transferase e da transcarbamlase do aspartato. Para baixas concentraes de substrato a actividade cresce de forma exponencial com a concentrao deste. Para altas concentraes de substrato manifesta-se o fenmeno da saturao; o facto de existir uma quantidade limitada de enzima no meio de ensaio implica que, quando a enzima est prxima da saturao, as variaes da concentrao de substrato provocam modificaes mnimas na actividade.

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b) s cinticas de tipo sigmoide chamam-se tambm de tipo cooperativo ou de cooperatividade positiva. A palavra cooperatividade surgiu na sequncia das teorias que foram formuladas para explicar o traado sigmoide nos grficos que relacionam a quantidade de oxihemoglobina (hemoglobinaO2) com a presso parcial de oxignio (pO2); a chamada curva de saturao da hemoglobina. A hemoglobina no uma enzima mas sim um protedo tetramrico, em que cada um dos quatro monmeros (muito semelhantes entre si) pode ligar uma molcula de O2. Um outro protedo capaz de ligar o O2 a mioglobina mas monomrica e apenas pode ligar uma molcula de O2 por molcula. Em contraste com a hemoglobina a curva de saturao da mioglobina uma hiprbole (como a das enzimas de tipo michaeliano). Estes factos induziram Jacques Monot, Wyman e Changeux a propor em 1965 um modelo terico que explica a sigmoidicidade da curva de saturao da hemoglobina. Resumidamente o modelo de Monot, Wyman e Changeux admite a existncia de dois estados conformacionais possveis para a molcula tetramrica da hemoglobina: R e T; estas duas conformaes estariam em equilbrio qumico e, na ausncia de O2 a forma T seria largamente predominante. Admite ainda que a afinidade do O2 para a forma R muito superior sua afinidade para a forma T; a introduo e o enriquecimento em O2 num meio contendo hemoglobina aumentaria a razo entre o nmero de tetrameros na forma R e T. Assim a ligao de uma molcula de O2 hemoglobina faz aumentar a concentrao da forma R (a forma que melhor liga o O2) facilitando a ligao de outras molculas de O2. As molculas de O2 j ligadas na hemoglobina cooperam na ligao das que podem ser ligadas se a pO2 for aumentada. Um modelo alternativo foi proposto por Koshland em 1966 desenvolvendo para o caso de protedos (ou enzimas) com mais que um local de ligao para o ligando (ou o substrato) um modelo por si formulado em 1959 (o modelo de encaixe induzido). Este modelo, na sua formulao mais simples, admite que a ligao de uma molcula de O2 num dos monmeros da hemoglobina induz uma modificao conformacional na estrutura desse monmero; esse monmero modificado pode influenciar a conformao dos outros protmeros de um mesmo tetramero. No caso da hemoglobina a ligao do oxignio induziria uma forma conformacional com maior afinidade para o oxignio. Em ambas as teorias a ligao de uma molcula de ligando (o oxignio ou um substrato) a um dos monmeros da protena em anlise influncia positivamente a ligao de uma segunda molcula de ligando aos outros monmeros. Os modelos matemticos e as equaes associadas a qualquer destas teorias podem (escolhidos valores adequados para os parmetros dessas equaes) adequar-se de forma perfeita aos dados experimentais da curva de saturao da hemoglobina. Essas equaes e essas teorias podem tambm explicar e descrever adequadamente as curvas sigmoides nos grficos actividade versus concentrao de substrato de todas as enzimas oligomricas com mais de um local de ligao para o substrato. No entanto, deixam sem explicao alguns casos de enzimas monomricas que apresentam cinticas de tipo sigmoide, como por exemplo a glicocnase. Foram propostas teorias que explicam estas situaes; em muitas delas se admite a existncia de mais de uma forma conformacional para a enzima. de notar que nem todas as enzimas oligomricas tm cinticas de tipo cooperativo; por exemplo os dados experimentais obtidos com a desidrognase lctica (uma enzima tetramrica) ajustam-se a uma cintica de tipo michaeliano. c) As equaes resultantes do tratamento matemticos dos modelos de Monot, Wyman e Changeux e de Koshland so extremamente complexas; na prtica s muito raramente se usam essas equaes para estudar e descrever os resultados experimentais obtidos com enzimas com cinticas de tipo cooperativo.

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Uma forma mais simples e muito mais comum usar (para a descrio paramtrica dessas sigmoides) de forma pragmtica uma equao proposta por Hill em 1913 para descrever a curva de saturao da hemoglobina. A equao de Hill pode escrever-se da seguinte maneira: Vmax [S]h v0 = (6.8.1) (S50)h + [S]h [S] a concentrao de substrato. S50 a concentrao de substrato para a qual a enzima est hemisaturada e em que a velocidade metade de Vmax. A expresso constante de Michaelis (Km) deve ser reservada para as cinticas hiperblicas. h o coeficiente de Hill e uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade): quando h=1 a equao acima simplifica e igual equao de Michaelis-Menten (ausncia de cooperatividade), quando h>1 dizemos que a cooperatividade positiva e o grfico v0 versus [S] um sigmoide (ver Fig. 9). No caso da hemoglobina a equao de Hill teria de ser reescrita: Y= pO2h / ((p50)h + pO2h) (6.8.2)

Y a fraco de hemoglobina saturada (o nmero de protmeros ligados ao O2 / nmero total de protmeros), p50 a presso de oxignio correspondente a hemisaturao e pO2 a presso de oxignio. Para a hemoglobina, Hill determinou experimentalmente o valor h como sendo 2,8. Koshland props um outro parmetro (RS = ndice de cooperatividade) como forma de medir a sigmoidicidade das curvas em anlise. RS seria a razo entre as concentraes de substrato (ou de ligando) requeridas para obter para obter um v0 de 90% de Vmax (ou 90% de saturao) e um v0 de 10% de Vmax (ou 10% de saturao). Rs igual a 81 nos casos de cintica michaeliana e tem um valor inferior a este nos casos de enzimas com cinticas de tipo cooperativo. d) Por razes que sero discutidas frente frequente chamar s enzimas que exibem uma cintica de tipo cooperativo enzimas alostricas. No entanto estas duas expresses no so sinnimas: existem muitas enzimas sensveis a efectores alostricos e que podem por isso chamar-se tambm de alostricas que no apresentam cinticas de tipo cooperativo.
Vmax
Vo 10

h=4 h=2 h=1

Vmax/2

0 0 5 10 15 [Substrato]

S50

Fig.9: Grficos v0 versus [S] usando a equao 6.8.1 para diferentes valores de h; S50=5 e Vmax = 10 para todos os casos. S50 a concentrao de substrato para v0= Vmax/2.

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6.9. Representaes grficas lineares nas enzimas de cintica michaeliana e de cintica de tipo cooperativo.
a) Os resultados experimentais do estudo da influncia da concentrao de substrato na actividade enzmica adaptam-se bem equao de Michaelis-Menten em muitas enzimas (enzimas com cintica michaeliana). Nestes casos os valores de Km e de Vmax descrevem de modo adequado o resultado da experincia. Embora actualmente existam mtodos estatsticos sofisticados e inclusive programas informticos para calcular a partir dos dados experimentais os valores destes dois parmetros continuam a ser usados mtodos de representao grfica para o seu clculo. A representao grfica de Lineweaver-Burk ou de dupla inverso sem dvida a mais popular e merece uma referncia neste texto. Invertendo ambos os termos na equao de Michaelis-Menten (ver equao 6.7.9) obtemos: 1 Km = v0 Vmax 1 [S] + 1 Vmax (6.9.1)

O grfico 1/v0 versus 1/[S] uma recta de declive positivo (Km / Vmax) que intercepta o eixo das ordenada num ponto cujas coordenadas so (0,1/ Vmax) e o eixo das abcissas noutro ponto de coordenadas (-1/ Km, 0). Ver Fig. 10. Assim um mtodo simples de calcular o Km e o Vmax a partir de resultados experimentais comear por calcular os inversos 1/v0 e 1/[S], desenhar os pontos correspondentes s coordenadas (1/[S]i , 1/v0 i ) e desenhar uma recta que una esses pontos. O inverso do valor da ordenada na origem ser o Vmax; o simtrico do inverso do valor de x onde a recta cruza o eixo das abcissas o Km. de notar que num grfico de Lineweaver-Burk os pontos mais prximos dos eixo das ordenadas so os que representam as concentraes de substrato mais elevadas. Assim o ponto de abcissa zero representa uma concentrao infinita de substrato; de facto o Vmax um parmetro e raramente um resultado experimental que se obtenha directamente. Um clculo simples com a equao de Michaelis-Menten leva-nos a concluir que quando a concentrao de substrato 10 vezes superior ao Km, v0 ser 90,9 % do Vmax.

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1/vo

declive = Km / Vmax

1 / Vmax

1/[S]

-1/Km

Fig.10: Grfico de Lineweaver-Burk ou de dupla inverso em enzimas com cintica de tipo hiperblico. A equao 6.9.1 mostra que neste tipo de cintica o grfico 1/v0 versus 1/[S] uma recta de declive positivo. Os pontos da recta esquerda do eixo das ordenadas no tm significado experimental pois no existem concentraes negativas de substrato. No entanto podem ter um significado cintico: o valor no eixo das abcissas para o ponto de intercepo da recta com o eixo das abcissas -1/Km. Quando associado a duas enzimas (ou a uma mesma enzima em condies de ensaio distintas) existem dois valores de Km distintos o valor mais alto corresponde com um ponto de intercepo mais prximo do ponto 0,0. O valor no eixo das ordenadas para o ponto de intercepo da recta com o eixo das ordenadas 1/Vmax. Quando associado a duas enzimas (ou a uma mesma enzima em condies de ensaio distintas) existem dois valores de Vmax distintos o valor mais alto corresponde com um ponto de intercepo mais prximo do ponto 0,0.

b) A equao de Hill tambm linearizavel: v0= Vmax [S]h / ((S50)h + [S]h) Vmax - v0 = Vmax - (Vmax [S]h / ((S50)h + [S]h)) Vmax - v0 = Vmax (S50)h / ((S50)h + [S]h) v0 Vmax - v0 log = Vmax [S]h /((S50)h + [S]h) [S]h = Vmax (S50)h / ((S50)h + [S]h) (S50)h [S]h [S] = log = h log (S50)h (S50) = h log [S] - h log (S50) (6.9.2) (6.9.3) (6.9.4) (6.9.5)

v0 Vmax - v0 v0 Vmax - v0

(6.9.6)

log

(6.9.7)

O grfico log [v0/(Vmax -v0)] versus log [S] uma recta cujo declive h e a ordenada na origem o simtrico de (h log (S50)). A aplicao desta equao a resultados experimentais pode permitir determinar graficamente os valores de h e de S50 se previamente o valor de Vmax tiver sido estimado. Ver Fig. 11.

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log

vo Vmax-vo declive = h

log [S]

-h log S50

log S50

Fig.11: Grfico linear obtido a partir do desenvolvimento matemtico da equao de Hill. A equao 6.9.7 mostra que o grfico log (v0/( Vmax- v0)) versus log [S] uma recta de declive positivo h. Quando v0 = Vmax/2 a concentrao de substrato S50, a fraco v0/( Vmax- v0) toma o valor 1 e o log desta mesma fraco zero.

6.10. Modificadores da actividade enzmica: inibidores e activadores.

Quando comparamos um par de ensaios enzmicos feitos nas mesmas condies (inclusive a concentrao de substrato), excepto a presena e a ausncia de uma substncia M, pode acontecer que as actividades sejam significativamente diferentes. Nestes casos pode ser til usar o conceito de grau de modificao (inibio ou activao) induzido por M (inibidor ou activador). O grau de inibio pode ser definido como a variao de actividade provocada pelo inibidor relativamente ao ensaio em que ele estava ausente: = (v0 - v0inibidor) /v0. No caso de activao o grau de activao seria: = (v0activador - v0) /v0. Ver Fig. 12.
140 120 Actividade enzmica 100 80 60 40 20 0

{
+activador

}
+inibidor

Fig. 12: Pela adio de determinadas substncias ao meio de ensaio podemos eventualmente aumentar ou diminuir a actividade cataltica da enzima. Quando em determinadas condies de ensaio uma substncia pode aumentar a actividade enzmica diz-se um activador; se diminui a actividade cataltica diz-se um inibidor. O grau de activao ou de inibio pode ser expresso em valor percentual e neste caso o seu valor ser 100*v0 /(v0 na ausncia de modificador).

6.11. Inibidores competitivos. Sua representao grfica linear.

Quando se estuda o efeito da concentrao de substrato na actividade podemos, multiplicando o nmero de tubos, faz-lo tambm na presena de vrias concentraes de uma substncia I: um inibidor da actividade da enzima. Algumas vezes observa-se que o inibidor no altera o Vmax mas que o valor de Km que cresce linearmente com o valor de I. O grau de inibio marcado para baixas concentraes de substrato diminuindo ou podendo mesmo deixar de observar-se inibio para altas concentraes de substrato. Ver Fig. 13.

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Nos casos em que a cintica hiperblica um mecanismo enzmico como o que apresentado a seguir pode explicar o fenmeno: k1 E+S + I k2 k3 ES E + P +....

k5

k6

EI O esquema acima representa um mecanismo em que E, I e EI esto em equilbrio qumico durante todo o processo cataltico; existe assim uma constante Ki (constante de inibio) que relaciona as concentraes de equilbrio destas trs substncias e que pode ser definida como a constante de dissociao do complexo EI. [I] [E] Ki= [EI] k6 = k5 (6.11.1)

O desenvolvimento matemtico deste modelo conduz seguinte equao: Vmax [S] v0 = Km (1+[I]/Ki ) + [S] (6.11.2)

Esta equao mostra que o valor da constante de Michaelis para um determinado valor de [I], a constante de Michaelis aparente (=observvel) nessas condies pode ser dada pela expresso: Km(aparente) = Km(1+[I]/Ki ). A constante Ki pode ser redefinida como a concentrao de inibidor que dobra o valor de Km; quanto menor for o seu valor maior ser a capacidade inibidora da substncia I. Ambos os termos da equao 6.11.2 podem ser invertidos dando origem equao de Lineweaver-Burk: 1 Km 1 = ( 1 +[I]/ Ki ) v0 Vmax [S] + 1 Vmax (6.11.3)

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Vmax
vo

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 [S] 40 -0.3

0.9

S
1/vo

0.8 0.7

S+I

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2

S+I

1/Vmax

0.1 0 0.2 1/[S] 0.7

Km Km'

-1/Km -1/Km'

Fig.13: Os inibidores competitivos actuam elevando o Km aparente. Do lado esquerdo desta figura a hiprbole S representa v0 versus [S] na ausncia de inibidor e a hiprbole S+I v0 versus [S] na presena de uma determinada concentrao do inibidor I. Do lado direito esto os grficos de Lineweaver-Burk correspondentes. Km e Km representam respectivamente a constante de Michaelis observvel na ausncia e presena do inibidor. Na presena do inibidor o valor de Km aumenta mas o valor de Vmax no se modifica: o efeito inibidor anula-se para concentrao infinita de substrato e as rectas de Lineweaver-Burk cruzam-se sobre o eixo das ordenadas.

Na posse de dados experimentais podemos num nico grfico desenhar uma famlia de rectas (1/v0 versus 1/[S]) cada uma delas correspondendo a ensaios com uma determinada concentrao de inibidor. No tipo de inibio em discusso as rectas cruzam-se entre si sobre o eixo das ordenadas. Concentraes crescentes de I correspondem-se com rectas com declive crescente. Ver Fig. 13. Este tipo de inibio diz-se competitiva pois que, para uma dada concentrao de inibidor o grau de inibio sempre mais marcado em ensaios com baixas concentraes de substrato que com altas concentraes de substrato. Aumentando a concentrao de substrato pode ser possvel anular (Vmax invariante) ou pelo menos diminuir o grau de inibio: o substrato e o inibidor parecem ter afinidade para um mesmo stio activo na enzima e competirem na ligao a esse stio activo. Se o substrato e I forem estruturalmente semelhantes esta ideia fica reforada. Ver Fig. 14. Algumas vezes uma mesma enzima pode ligar-se a dois substratos diferentes (embora com estruturas relacionadas) catalisando duas reaces diferentes: ligando A pode catalisar a transformao AP, ligando B pode catalisar a transformao BQ. Neste caso A um inibidor competitivo da reaco BQ e B um inibidor competitivo da reaco AP. O valor do Ki A (constante de inibio associada a A na reaco BQ) igual a KmA (constante de Michaelis associada a A na reaco AP); tambm KiB = KmB.

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Fig. 14: Modelo interpretativo na inibio de tipo competitivo. Os factos observados nas experincias de cintica enzmica usando inibidores competitivos podem ser interpretados da seguinte maneira: no stio activo da enzima podem ligar-se de forma reversvel quer o substrato quer o inibidor; substrato e inibidor competem por esse local de ligao mas apenas se geram os produtos da actividade enzmica em estudo quando a enzima est ligada ao substrato.

6.12. Inibidores no competitivos. Sua representao grfica linear.

Em situaes experimentais semelhantes quelas que foram descritas no captulo 6.11 s vezes observa-se que o inibidor I provoca uma diminuio no Vmax sem provocar modificao no valor de Km. Se a enzima tem uma cintica de tipo michaeliano dizemos que I um inibidor no competitivo. Ver Fig. 15. Um mecanismo compatvel com esta situao seria o representado no esquema a seguir: k1 E+S + I
k2

k3 E S E + P +.... + I

k5

k6

k9

k10

k7 EI + S k8 Para que este modelo responda de forma adequada ao problema colocado, nomeadamente que o valor da constante de Michaelis no seja modificado pela presena de I, teremos ainda de impor que as constantes de dissociao dos complexos EI (=Ki1) e EIS (=Ki2) relativamente a I tenham o mesmo valor: Ki1 = Ki2. EIS

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[I] [E] Ki1= [EI] [I] [ES] Ki2= [EIS]

k6 = k5 k10 = k9

(6.12.1)

(6.12.2)

O desenvolvimento matemtico deste modelo conduz seguinte equao: Vmax [Ki / (Ki + [I]) ] [S] v0 = Km + [S] (6.12.3)

Esta equao mostra que o valor de Vmax para um determinado valor de [I], a velocidade mxima aparente nessas condies pode ser dada pela expresso: Vmax (aparente) = Vmax [ Ki / (Ki + [I])]. A constante Ki pode ser redefinida como a concentrao de inibidor que reduz a metade o valor da Vmax. Ambos os termos da equao 6.12.3 podem ser invertidos dando origem equao de Lineweaver-Burk:
1 Km = (1+ [I]/Ki) v0 Vmax 1 [S] + 1 Vmax (1+ [I]/Ki) (6.12.4)

Na posse de dados experimentais podemos num nico grfico desenhar uma famlia de rectas (1/v0 versus 1/[S]) cada uma delas correspondendo a ensaios com uma determinada concentrao de inibidor. No tipo de inibio em discusso as rectas cruzam-se entre si sobre o eixo das abcissas. Concentraes crescentes de I correspondem-se com rectas com declive crescente. Ver Fig. 15. O modelo pode ser descrito da seguinte maneira: quer a enzima livre E, quer o complexo ES podem ligar I com uma afinidade idntica; I ligado enzima no perturba a ligao de S enzima mas impede que a forma ligada a S seja capaz de gerar P. O inibidor I actua como se eliminasse enzima activa da soluo; de facto parte da enzima fica excluda do processo cataltico. O modelo compatvel com a existncia na enzima de um local distinto do stio activo onde I pudesse ligar-se; a ligao de I nesse local poderia provocar uma modificao conformacional na enzima; na presena de I a enzima podia ligar o substrato mas no podiam desencadear-se as reaces necessrias para a formao dos produtos. Se a estrutura de I for muito diferente de S esta hiptese aparece reforada. Ver Fig. 16. Estamos assim a colocar a hiptese de que I se liga enzima um stio diferente do stio activo, um stio alostrico (do Grego: allos, outro + stereos, espao). Dixon e Webb num clebre livro chamado Enzymes assim como Sols nos seus ltimos escritos (ver referncias) comentam acerca da confuso de conceitos existente na literatura cientfica a propsito do termo alostrico. Segundo estes autores alostrico deve ser um adjectivo que classifica um activador ou um inibidor que actua ligando-se enzima num local distinto do(s) substrato(s), o seu efeito (o efeito alostrico), o local onde se ligam (o stio alostrico) ou uma enzima (enzima alostrica) onde ocorrem efeitos alostricos. frequente encontrar na literatura cientfica a expresso enzima alostrica como sinnimo de enzima com cintica de tipo cooperativo. Compreende-se o uso dessa expresso porque nestas enzimas extremamente

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frequente observar efeitos comprovadamente alostricos e no caso de poderem ligar mais de uma molcula de substrato em distintos monmeros pode considerar-se que o local de ligao de uma molcula de substrato um stio alostrico em relao ao local de ligao da segunda molcula de substrato. Neste caso o substrato ligado num monmero pode ser designado de modificador alostrico homotrpico usando-se a expresso heterotrpico para classificar os modificadores alostricos que no so substratos. Como j referido as expresses enzima alostrica e enzima com cintica de tipo cooperativo (sigmoide) no so sinnimas porque a existncia de efeitos alostricos no exclusivo das enzimas com grficos v0 versus concentrao de substrato de tipo sigmoide. O antnimo de alostrico isostrico e um efeito inibidor de tipo competitivo baseado num mecanismo de competio com o substrato em relao ao stio activo da enzima podia classificar-se desta maneira. A possibilidade de um inibidor se ligar no stio activo (inibidor isostrico) e ser um inibidor no competitivo tambm existe. Se a ligao do inibidor ao centro activo de tipo covalente e estvel (a velocidade com que se pode dissociar do centro activo muito baixa ou nula) e impede a ligao do substrato as molculas de enzima ligadas ao inibidor esto excludas do processo cataltico.

Fig. 15: Os inibidores no competitivos actuam diminuindo o Vmax aparente e o grau de inibio invariante com a concentrao de substrato. Do lado esquerdo desta figura a hiprbole S representa v0 versus [S] na ausncia de inibidor e a hiprbole S+I v0 versus [S] na presena de uma determinada concentrao do inibidor I. Do lado direito esto os grficos de Lineweaver-Burk correspondentes. Vmax e Vmax representam respectivamente o Vmax observvel na ausncia e presena do inibidor. Na presena do inibidor o valor de Vmax diminui mas o valor de Km no se modifica: as rectas de Lineweaver-Burk cruzam-se sobre o eixo das abcissas.

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Fig. 16: Modelo interpretativo na inibio de tipo no competitivo. Os factos observados nas experincias de cintica enzmica usando inibidores no competitivos podem ser interpretados da maneira que a seguir se descreve. Na enzima, para alm do stio activo onde o substrato pode ligar-se, existe um outro local onde, de forma reversvel, se pode ligar o inibidor. A enzima ligada ao inibidor pode ligar o substrato mas no capaz de gerar produtos. Para que de facto o valor do Km no seja modificado pela presena de inibidor temos de admitir que a afinidade das formas enzmicas E e ES pelo inibidor so iguais, i.e. Ki1 e Ki2 tm o mesmo valor.

6.13. Efeitos alostricos.

Em enzimas com cinticas de tipo cooperativo (mas no exclusivamente nestas como j referido) frequente observar efeitos activadores ou/e inibidores que foram interpretados como estando relacionados com a interaco reversvel de efectores (substncias activadoras ou inibidoras), com um ou mais stios alostricos existentes na enzima. Frequentemente, estes efeitos, observados in vitro, foram interpretados como tendo importantes implicaes metablicas na fisiologia qumica da clula. A ligao do efector (um ligando L) enzima provocaria uma alterao na conformao da enzima que se reflectiria numa modificao na sua actividade cataltica. Outro possvel mecanismo seria a existncia prvia de duas formas enzmicas (duas conformaes) em equilbrio qumico com actividades distintas e que L teria maior afinidade para uma das formas. Por exemplo, se L tem maior afinidade para a forma enzmica com menor actividade aumentar a concentrao de L no meio de ensaio corresponde a aumentar a concentrao da forma menos activa da enzima custa da diminuio da forma mais activa: L seria, neste caso, um inibidor. Em alguns casos o efeito activador ou inibidor relaciona-se com uma alterao no valor do Vmax relativamente a um ou mais dos substratos da enzima. Outras vezes o efeito activador ou inibidor relaciona-se com uma alterao no valor do Km (ou do S50) relativamente a um ou mais dos substratos da enzima. No primeiro caso diz-se que h um efeito de tipo V e no segundo um efeito de tipo K e uma combinao dos dois tambm possvel. De notar que um efeito de tipo K activador significa um diminuio no valor de Km (ou de S50), ou seja um aumento da afinidade da enzima para o substrato; um efeito de tipo K inibidor significa um aumento no valor de Km (ou de S50), ou seja uma diminuio da afinidade da enzima para o substrato. Ver Fig. 17. Em enzimas com cinticas de tipo cooperativo em relao com um substrato S no qual se pode observar um efeito K activador frequente observar-se paralelamente com uma diminuio do valor de S50 uma diminuio da sigmoidicidade da curva que descreve a

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relao v0 versus [S]; para valores altos de concentrao de activador o aspecto sigmoide da curva pode desaparecer e surgir um aspecto hiperblico. Para o caso de inibidores de tipo K frequente observar-se o oposto: um aumento do valor do S50 e, paralelamente, um aumento da sigmoidicidade da curva em anlise. Ver Fig. 18. Em algumas enzimas, como no caso da redtase dos nucleotdeos, podem observar-se efeitos alostrico que se reflectem em alteraes na especificidade em relao com determinados substratos. Em algumas enzimas oligomricas compostas por subunidades diferentes observou-se que os efeitos catalticos da enzima estavam relacionados com um tipo de subunidades e que os efeitos alostricos com um segundo tipo: ou seja que o(s) centro(s) activo(s) e o(s) centro(s) alostrico(s) se situavam em diferentes monmeros da enzima.

6.14. Efeitos induzidos por modificao covalente de enzimas catalisada por outras enzimas
Em geral, quando se fala de efeitos alostricos pensa-se num local da enzima diferente do stio activo no qual o ligando L pode ligar-se de forma no covalente e que a velocidade com que se atinge o estado de equilbrio qumico nessa ligao extraordinariamente rpida e no catalisada enzimicamente. No entanto, nalguns casos a actividade de uma enzima pode ser modificada pela aco cataltica de outras enzimas. O caso mais frequente a modificao reversvel por aco de cnases (que catalisam fosforilaes) e de fosftases (que catalisam desfosforilaes). Algumas enzimas podem apresentar conformaes e caractersticas cinticas muito distintas consoante esto numa forma desligada ou ligada a um ou mais grupos fosfato (ligao covalente de tipo fosfoester num resduo aminoacdico hidroxilado distante do stio activo) sendo a transformao reversvel entre as duas formas catalisada enzimicamente por outras enzimas. Neste caso no costume falar de efeito alostrico embora de facto o local de ligao do fosfato seja distinto do stio activo.
Vmax
14

+Activador +Activador Vmax 10

9 8
vo

vo 12

Vmax

10 8

7 6 5

+Inibidor

Vmax

6 4 2 0 0 10 20 30 [S] 40

+Inibidor

4 3 2 1 0 0 10 20 30
[S]

40

S50

Km Km Km

Fig. 17: Efeitos alostricos activadores e inibidores de tipo V ( esquerda) e de tipo K ( direita) em enzimas com cinticas de tipo sigmoide. Existe um efeito activador ou inibidor de tipo V quando, respectivamente o Vmax aumenta ou diminui por aco do efector. No caso de efeitos de tipo K um efeito activador significa uma diminuio no valor do S50 e um efeito inibidor um aumento no valor de S50.

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sem efector alostrico

vo

+ATP +CTP

10

20

30

40

Aspartato (m M)

Fig. 18: Efeito de tipo K inibidor (CTP) e activador (ATP) sobre a actividade cataltica da transcarbamlase do aspartato. A transcarbamlase do aspartato catalisa a seguinte reaco: fosfato de carbamilo + aspartato Pi + carbamil-aspartato; esta reaco integra-se na via metablica da sntese dos nucleotdeos pirimidnicos. Na presena de CTP o valor de S50 para o substrato aspartato aumenta e paralelamente aumenta a sigmoidicidade da curva v0 versus [aspartato]. O contrrio ocorre na presena do ATP.

7. Para que pode servir o estudo cintico de uma enzima?

O estudo cintico de uma enzima informa-nos acerca do modo como a actividade da enzima se modifica quando se alteram as condies do meio em que esta est a ser ensaiada. a) Essas observaes levantam uma pergunta: porqu? Como se poderia explicar este comportamento cintico? A tentativa de responder a esta pergunta levou elaborao de modelos tericos e matemticos que visam fornecer uma explicao para os factos observados. Em grande medida essas teorias limitam-se a propor um ou mais mecanismos de reaco compatveis com as observaes feitas. Os mecanismos compatveis com os dados experimentais podem eventualmente ser testados por novas experincias de cintica enzmica mas o mais frequente que estudos qumicos e estruturais da enzima em anlise, dos substratos ou de enzimas com actividades semelhantes forneam dados decisivos para uma melhor compreenso da maneira como esta funciona. b) Outra pergunta pode ser colocada, e no seguramente menos importante: para qu? Para que podem servir os dados de observao das experincias de cintica enzmica? b.1) Como j referido, o valor da actividade cataltica de uma determinada enzima num meio especificado directamente proporcional quantidade de enzima presente nesse meio. Esta observao assim como as caractersticas de especificidade (de substrato e tipo de reaco), actividade versus temperatura e pH e a aco de modificadores da actividade de uma enzima podem permitir, com base em estudos de cintica, o desenho de condies de ensaio adequadas ao doseamento de uma enzima numa preparao biolgica complexa. importante escolher condies de ensaio em que outras enzimas possveis interferentes tenham baixa actividade e em que a enzima em estudo tenha uma alta actividade. frequente a escolha de concentraes de substratos bastante mais altas que os Km (ou S50): nestas condies a actividade enzmica pouco sensvel diminuio da concentrao de substrato durante o ensaio tornando mais fcil estimar v0. O interesse desses mtodos de doseamento enorme e alguns exemplos podem ser referidos: Pgina 28 de 32

a) Em certas doenas, como por exemplo a pancreatite aguda, certas enzimas que esto normalmente presentes no plasma sanguneo em quantidades vertigiais, aumentam a sua concentrao no plasma sanguneo. Nesta situao patolgica o contedo enzmico das clulas pancreticas excrinas vertido no plasma. Uma actividade enzmica especfica pode ser avaliada atravs de um ensaio enzmico e uma medida da quantidade de enzima presente no plasma. O doseamento da actividade amiloltica no soro sanguneo um ensaio laboratorial muito importante no diagnstico da pancreatite aguda. b) O efeito de hormonas e de condies fisiolgicas (jejum, por exemplo) ou patolgicas (doenas genticas em que uma enzima no sintetizada ou anormal sob o ponto de vista funcional, por exemplo) nos nveis tecidulares de uma determinada enzima pode ser estudado avaliando a actividade dessa enzima no tecido em estudo. b.2) As caractersticas cinticas de uma enzima, nomeadamente a especificidade em relao a substratos, a inibidores, a activadores e ao tipo de reaco podem tambm ser usadas no doseamento e na sntese de compostos qumicos. O contributo da cintica enzmica para o desenvolvimento de mtodos de anlise em contextos mdicos (anlises clnicas), cientficos, industriais ou de investigao criminal no pode deixar de ser realado. Um exemplo o uso comum de uma enzima de origem bacteriana altamente especfica, a glicose oxdase, no doseamento da glicose. b.3) O estudo cintico de uma enzima importante para caracterizar essa enzima, desta maneira distinguindo-a funcionalmente das demais enzimas inclusive das que podem catalisar a mesma reaco. Dentro da mesma espcie biolgica, duas enzimas estruturalmente distintas podem catalisar a mesma reaco. Chamam-se a estas enzimas isoenzimas. Pode acontecer que estas enzimas sejam funcionalmente indistinguveis mas em alguns casos um estudo cintico sistemtico pode mostrar algumas diferenas como por exemplo no valor do Km (ou do S50) em relao a um ou mais substratos, na especificidade, activao ou inibio por certos efectores, nos valores de pH ptimo, etc. Exemplos so a hexocnase cerebral e a glicocnase heptica: para alm de especificidades diferentes tem valores de Km muito distintos em relao ao substrato glicose e apenas a primeira inibida pela glicose-6-P. b.4) Os estudos in vitro da actividade das enzimas foram e so de extraordinria relevncia no esclarecimento das vias metablicas dos seres vivos e da sua regulao. O reconhecimento da existncia (identificao) de cada uma das enzimas, das reaces por elas catalisados (identificao de seus substratos e produtos) num determinado organelo celular, clula, tecido ou organismo so aspectos chave na compreenso do metabolismo em geral e das vias metablicas em particular. O reconhecimento in vitro da possibilidade de inibir uma enzima purificada com um determinado inibidor pode servir de base para experimentar esse inibidor em sistemas menos artificiais como organelos celulares, clulas ou animal de experincia. Os resultados dessas experincias podem fornecer dados importantes para a compreenso da via metablica em que essa enzima est integrada. O efeito da concentrao de substratos ou de outros factores como, por exemplo, substncias que adicionadas no meio de ensaio modificam a actividade de uma enzima pode fornecer pistas para a descoberta da forma como na clula a actividade da enzima regulada e orientar a investigao futura quer de cintica enzmica quer por outros mtodos. Normalmente muito difcil conhecer com preciso as concentraes estacionrias celulares dos intermedirios metablicos quer porque esto habitualmente em concentraes muito baixas quer porque no momento em que a clula destruda para se fazer a anlise esta concentrao pode alterar-se dramaticamente. Apesar disso a estimativa das concentraes de substratos ou

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de outras substncias (como efectores da actividade enzmica) e a sua comparao com as suas constantes de afinidade em relao a uma enzima podem ser decisivos para compreender a regulao dessa enzima a nvel celular. Pode acontecer, como por exemplo no caso da glicocnase heptica, que o valor do Km para a glicose seja mais alto que a concentrao habitual de glicose dentro do hepatcito: a enzima funciona in vivo em condies de sub-saturao no que respeita glicose. Por isso, flutuaes na concentrao estacionria da glicose resultantes, por exemplo, de situaes ps-pandriais ou de jejum, refletem-se em alteraes na actividade desta enzima. Outro exemplo: demonstrou-se que a fosfofrutocnase-1 inibida in vitro de forma alostrica por concentraes de ATP e de citrato da ordem de grandeza das encontradas na clula; flutuaes nessas concentraes so considerados factores importantes na regulao da actividade dessa enzima a nvel celular. b.5) Muitos dos medicamentos usados no tratamento de doentes so inibidores especficos da actividade de determinadas enzimas. Daremos trs exemplos: i) As sulfamidas so antibiticos que exercem a sua aco numa enzima bacteriana da via da sntese do cido flico competindo com o seu substrato natural (so inibidores competitivos isostricos). Essa enzima no existe no homem (o cido flico , para o homem, uma vitamina) e portanto em doses adequadas as sulfamidas podem matar as bactrias sem provocar efeitos graves no metabolismo humano. ii) O metotrexato usado no tratamento de doenas neoplsicas inibindo por mecanismo competitivo isostrico a dihidrofolato redtase, uma enzima que catalisa a converso do dihidrofolato em tetrahidrofolato. As clulas neoplsicas reproduzem-se rapidamente e nestas a sntese de ADN e dos nucleotdeos percursores extremamente rpida. Para que a sntese de um destes precursores (o TTP) possa ocorrer necessria a sntese de tetrahidrofolato que est dependente da actividade da dihidrofolato redtase. Assim em doses adequadas o metotrexato pode impedir a multiplicao das clulas neoplsicas embora tambm exera efeitos menos desejados em clulas que, fisiologicamente, se multiplicam rapidamente. iii) O alopurinol um medicamento usado no tratamento da gota e exerce a sua aco por ser um inibidor potente da xantina oxdase, uma enzima da via metablica onde se sintetiza o cido rico. A gota uma doena em que as concentraes de cido rico esto muito aumentadas no meio interno e estas altas concentraes, independentemente das causas que as provocam, so nocivas para o organismo.

8. Nota final: a actividade das enzimas como factores de regulao do metabolismo.

Na clula a actividade de uma enzima pode depender de mltiplos factores. Se, no citoplasma da clula ou num organelo celular, a razo entre as concentraes estacionrias de produtos e reagentes de uma reaco catalisada por uma determinada enzima (seja A+B P+Q) no se afasta muito da Keq podemos deste facto deduzir duas consequncias: i) que flutuaes nessas concentraes estacionrias podem fazer com que na reaco enzmica celular umas vezes predomine a reaco em sentido directo (A+B P+Q) e noutras a reaco em sentido inverso (P+Q A+B) e ii) que a actividade dessa enzima suficientemente alta a nvel celular para no ser um passo limitante da velocidade da via metablica em que est inserida. A regulao da actividade deste tipo de enzimas depende basicamente da concentrao de reagentes e produtos e da sua relao com os Km (ou S50) a eles associados. Noutras reaces a actividade da enzima a nvel celular relativamente baixa e o valor da QR (tendo em conta concentraes estacionrias de reagentes e produtos) muito mais baixo, pelo menos em condies fisiolgicas, que o da Keq; neste caso a reaco progride na clula,

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macroscopicamente, apenas em um dos sentidos (seja o sentido A+BP+Q). Neste tipo de enzimas frequente observar-se que a sua actividade pode variar em funo de outros factores e mecanismos para alm da concentrao de substratos ou produtos (de acordo com as premissas formuladas P e Q, embora no sejam, pelo menos na clula, substratos da enzima, podem funcionar a nvel celular como inibidores da transformao A+BP+Q). Entre esses factores ou mecanismos possveis podem destacar-se: i) Efeitos alostricos inibidores exercidos por efectores que so produtos finais da via metablica em que a enzima se insere (inibio de tipo feed-back). ii) Efeitos alostricos activadores exercidos por efectores que so substratos da via metablica em que a enzima se insere (no necessariamente substratos da enzima), por efectores cuja concentrao est sujeita a regulao hormonal (caso da frutose-2,6-bisfosfato) ou por substncias indicadoras de dficit relativo de um produto dessa via metablica (caso do AMP e sua aco activadora na cnase-1 da frutose-6-P). iii) Efeitos inibidores ou activadores resultantes da fosforilao covalente ou desfosforilao da prpria enzima atravs da aco cataltica de outras enzimas tambm estas reguladas por mecanismos mais ou menos complexos. iv) Alterao da quantidade de enzima na clula mediada atravs de efeitos positivos ou negativos nos seus mecanismos de sntese ou de degradao. De notar que as hormonas e os neurotransmissores podem exercer um papel determinante na regulao das vias metablicas atravs de vrios mecanismos nos quais a regulao da actividade enzmica a chave do processo. Entre esses mecanismos podemos destacar: i) Promoo da sntese de enzimas especficas. ii) Promoo do transporte de substncias atravs das membranas desta forma possibilitando o acesso de substratos ou de reguladores da actividade enzmica (nomeadamente ies como o clcio), s enzimas. iii) Promoo da sntese ou da degradao de efectores da actividade enzmica.

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9. Bibliografia consultada:
Cornish-Bowden A., Crdenas M.L, 1987, Mini Review. Co-operativity in Monomeric Enzymes. J. Theor. Biol. , 124: 1-23. Dixon M & Webb E.C., 1979, Longman Group Ltd. Enzymes. 3rd edition. Great Britain. Engel P.C.. 1981, Brammer WJ & Edidin M. eds. Enzyme Kinetics. A Steady-state Approach. 2nd edition. London: Chapman and Hall. Macarulla J.M., Marino A., Macarulla A., 1992. Editorial Revert, S.A. Bioqumica Cuantitativa. Barcelona McGilvery R. W., 1983, W. B. Saunders Company. Biochemistry . A Functional Approach. 3rd edition. Japan. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A. & Rodwell, 1990, Appleton & Lange. Harpers Biochemistry. 22nd edition. USA. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. 1982. Symbolism and Terminology in Enzyme Kinetics-recommendations 1981. Eur. J. Biochem: 128: 281-291. Sols A. 1981. Multimodulation of Enzyme Activity. in Current Topics in Cellular Regulation. Vol. 19. Academic Press, Inc., New York. Pag 77-101. Sols A. 1990. Enzyme Regulation: from Allosteric Sites to Intracellular Behavior. in Selected Topics in the History of Biochemistry: Personal Recollections, III. Vol. 37. Elsevier Sciences Publishers., Pag 177-199. Voet D. & Voet J. G., 1990, John Wiley & Sons, Inc. Biochemistry. USA.

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