Capítulo II

Método Experimental

21
2. Método experimental

2.1 Lugar de ejecución

El experimento se ejecutó en el Laboratorio de Microbiología del Centro

Médico Naval “Santiago Tavara” en el distrito de Bellavista, Lima.

2.2 Materiales

2.2.1 Materiales utilizados en la preparación de medios de cultivo:

- 60 placas petri de plástico de 10cm de diámetro

- 40g de agar Muller Hinton
- Balanza mecánica ± 0,1g
- Mechero Bunsen
- Autoclave (Marca Senco automatic, modelo grande)
- Gradilla
- Jarra de metal
- Espátula
- 100ml de agua destilada
- 4 vasos precipitados de 500ml
- 20mL de solución buffer (ph ácido 4,01)
- 20mL de solución buffer (ph neutro 7,01)
- 20mL de solución buffer (ph alcalino 10,01)

22
2.2.2 Materiales utilizados en la siembra y observación

- Cultivo de hongo Penicillium notatum

- Cultivo de la bacteria Staphylococcus aureus
- 60 hisopos largos
- pipeta Pasteur
- Asa de coli
- 4 tubos pequeños con 5mL de agua destilada
- Inoculum Water with Pluronic-D ( Turbidímetro marca Dade Behring,
modelo B1015-7)
- 120 discos de papel filtro de 2cm de diámetro
- Estufa (Incubadora de 37ºC, modern Laboratory, marca THELCO)
- Refrigeradora (Marca Westinghc)
- Regla graduada
- Pinza

23
2.3. Procedimiento

2.3.1. Preparación de los medios de cultivo:

Para preparar los medios de cultivo se utilizó 100mL de agua destilada. Se

puso a hervir el agua en una jarra de metal utilizando el mechero bunsen.
Luego se pesó en la balanza mecánica 40g de agar Muller Hinton que se
agregaron a la jarra. Con la espátula se agitó la solución para que no se
produzcan grumos, y después de hervir se vació en cuatro vasos precipitados.

Vaso 1 400mL de agar

Vaso 2 200mL de agar y se agregó 20ml de ph 4,01

Vaso 3 200mL de agar y se agregó 20ml de ph 7,01

Vaso 4 200mL de agar y se agregó 20ml de ph 10,01

Los cuatro vasos fueron llevados a la autoclave para esterilizarlos por 10

minutos. Luego se dejó enfriar los vasos por 15 minutos. En 30 placas petri se
vaciaron 15mL aproximadamente del vaso 1. En otras 10 placas se vació el
agar del vaso 2 (aprox.20mL por placa). El agar del vaso 3 se vació en 10
placas petri (aprox. 20mL por placa). El agar del vaso 4 se vació en 10 placas
(aprox.20mL por placa). Todas las placas fueron marcadas y enumeradas
según el ph que contenían y se llevaron a la refrigeradora a una temperatura
de 10ºC por 24 horas.

24
2.3.2 Siembra de la bacteria y del hongo:

Para realizar la siembra de la bacteria y del hongo, primero se debe

preparar la inoculación de ambos microorganismos. Para esto se trabajó cerca
al mechero, se raspó el cultivo del penicillium notatum con la asa de coli, y se
disolvió en un tubo con 5mL de agua destilada (ver anexo 1). Se realizó este
procedimiento cuatro veces hasta que se observó que el agua estaba turbia.
El grado de turbidez del inóculo de un hongo debe ser de 0,30 NTU
(Nephelometer Turbidity Units). Para comprobarlo se colocó el tubo en el
orifico de muestra del turbidímetro, y en el otro orifico se colocó un tubo con
agua destilada. La lectura dio 0,31 NTU por lo que el grado de turbidez era
cercano a la escala recomendada.
Foto Nº 2.3.1

Turbidímetro con el tubo con penicillium notatum

Seguidamente se realizó la preparación del inóculo de la bacteria

Staphylococcus aureus. Para esto se trabajó cerca al mechero, se raspó la
cepa de la bacteria con el asa de coli y se disolvió en un tubo con 5mL de
agua destilada. Se repitió tres veces este procedimiento hasta que el agua se
volvió turbia. El grado de turbidez debe de ser de 0,08 NTU, por lo que se
comprobó con el turbidímetro.

25
 Foto Nº 2.3.2

Turbidímetro con el tubo con Staphylococcus aurus

Una vez preparadas las dos suspensiones, se procede a sembrar en las

placas la bacteria.

Previamente se retiraron las 60 placas de la refrigeradora y se colocaron

cerca al mechero para que no estén a una temperatura tan baja.

Para inocular las placas, se utiliza un hisopo largo que se remoja en la

suspensión de la bacteria y se frota en el medio de cultivo en tres direcciones
diferentes (ver anexo 2). Se siembra la bacteria en las 60 placas y se dejan
secar por 5 minutos para que el agar absorba cualquier exceso del inóculo.
Luego utilizando una pinza se coloca dos discos de papel filtro (de 2cm. de
diámetro) en extremos opuestos de las 60 placas, y manipulando una pipeta
pasteur se agrega dos gotas de la suspensión del penicillium a cada disco.
(Ver anexo 3 y 4)

Para determinar la temperatura óptima en que crece el hongo y hace efecto

sobre la bacteria, 10 placas se llevaron a la refrigeradora a una temperatura
de 10ºC, 10 placas se dejaron en el medio ambiente a una temperatura de
23ºC y 10 placas se llevaron a la estufa a una temperatura de 37ºC.
(Ver anexo 5, 6 y 7).

26
 Para determinar el ph óptimo en que crece el hongo y su efecto sobre la
bacteria, se dejaron 30 placas que contenían distintas soluciones buffer, 10
placas con ph ácido, 10 placas con ph neutro y 10 con ph alcalino, a medio
ambiente.

En los resultados se consideró el diámetro de crecimiento (en centímetros)

del hongo pasado las 24 y 48 horas en las 60 placas.

2.4. Evaluaciones

2.4.1. Determinación del diámetro del hongo.

Pasada las 24 horas se procedió a observar el efecto del hongo sobre

la bacteria, para esto se midió el diámetro de crecimiento del penicillium
notatum de los discos de cada una de las 60 placas, utilizando una regla.
Pasada las 48 horas se volvió a medir las 60 placas. Los resultados fueron
anotados en centímetros. (ver anexo 8)

27
Capítulo III

Resultados

28
3. Resultados

3.1. Resultados de la prueba de temperatura

Cuadro Nº 3.1.1

Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo

considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a 10ºC

Número de placas Diámetro del Diámetro del crecimiento

sometidas a una crecimiento del hongo del hongo en centímetros
temperatura de 10ºC en centímetros pasada pasada las 48 horas
las 24 horas
10 0 0

Cuadro Nº 3.1.2
Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo
considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a 23ºC

Placas sometidas a una Diámetro del crecimiento Diámetro del crecimiento

temperatura de 23ºC del hongo en del hongo en
centímetros pasada las centímetros pasada las
24 horas 48 horas
Disco1: 2,5 Disco1: 3
Nº 1 Disco2: 3 Disco2: 3.3
D.1: 2,3 D.1: 2,6
Nº 2 D.2: 2,4 D.2: 3,1
D.1: 2,2 D.1: 2,5
Nº 3 D.2: 2,0 D.2: 2,2
D.1: 2,2 D.1: 2,5
Nº 4 D.2: 2,3 D.2: 2,6
D.1: 2,2 D.1: 2,5
Nº 5 D.2: 2,2 D.2: 2,6
D.1: 2,6 D.1: 2,7
Nº 6 D.2: 2,3 D.2: 2,5
D.1: 2,4 D.1: 2,8
Nº 7 D.2: 2,3 D.2: 2,7
D.1: 2,5 D.1: 2,9
Nº 8 D.2: 2,4 D.2: 2,6
D.1: 2,4 D.1: 2,8
Nº 9 D.2: 2,3 D.2: 2,7
D.1: 2,2 D.1: 2,6
Nº 10 D.2: 2,3 D.2: 2,5

29
 Cuadro Nº 3.1.3

Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo

considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a 37ºC

Placas sometidas a una Diámetro del crecimiento Diámetro del crecimiento

temperatura de 37ºC del hongo en del hongo en centímetros
centímetros pasada las pasada las 48 horas
24 horas
Disco1: 2,1 Disco1: 2,5
Nº 1 Disco2: 2 Disco2: 2,3
D.1: 2,1 D.1: 2,4
Nº 2 D.2: 2,2 D.2: 2,5
D.1: 2,2 D.1: 2,4
Nº 3 D.2: 2,3 D.2: 2,5
D.1: 2,1 D.1: 2,3
Nº 4 D.2: 2,1 D.2: 2,1
D.1: 0,0 D.1: 0,0
Nº 5 D.2: 2,0 D.2: 2,1
D.1: 2,2 D.1: 2,2
Nº 6 D.2: 2,2 D.2: 2,3
D.1: 0,0 D.1: 0,0
Nº 7 D.2: 0,0 D.2: 0,0
D.1: 0,0 D.1: 0,0
Nº 8 D.2: 0,0 D.2: 0,0
D.1: 2,1 D.1: 2,2
Nº 9 D.2: 2,0 D.2: 2,1
D.1: 2,2 D.1: 2,2
Nº 10 D.2: 2,0 D.2: 2,1

Foto Nº 3.1.1
Placas sometidas a distintas temperaturas

Izquierda: placa a 10ºC

Centro: placa a 23ºC
Derecha: placa a 37ºC

30
3.2. Resultados de la prueba de pH.

Cuadro Nº 3.1.4

Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo

considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas
a pH 4,01

Placas con pH 4,01 Diámetro del crecimiento Diámetro del crecimiento

del hongo en del hongo en centímetros
centímetros pasada las pasada las 48 horas
24 horas
Disco1: 2,4 Disco1: 2,5
Nº 1 Disco2: 2,3 Disco2: 2,6
D.1: 2,2 D.1: 2,4
Nº 2 D.2: 2,5 D.2: 2,6
D.1: 2,5 D.1: 2,7
Nº 3 D.2: 2,3 D.2: 2,6
D.1: 2,3 D.1: 2,6
Nº 4 D.2: 2,2 D.2: 2,5
D.1: 2,4 D.1: 2,9
Nº 5 D.2: 2,3 D.2: 2,7
D.1: 2,3 D.1: 2,6
Nº 6 D.2: 2,5 D.2: 2,6
D.1: 2,4 D.1: 2,5
Nº 7 D.2: 2,5 D.2: 2,7
D.1: 2,5 D.1: 2,6
Nº 8 D.2: 2,4 D.2: 2,8
D.1: 2,2 D.1: 2,5
Nº 9 D.2: 2,5 D.2: 2,7
D.1: 2,3 D.1: 2,5
Nº 10 D.2: 2,5 D.2: 2,6

31
 Cuadro Nº 3.1.5

Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo

considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas
a pH 7,01

Placas con pH 7,01 Diámetro del crecimiento Diámetro del crecimiento

del hongo en del hongo en centímetros
centímetros pasada las pasada las 48 horas
24 horas
Disco1: 2,3 Disco1: 2,3cm
Nº 1 Disco2: 2,2 Disco2: 2,4cm
D.1: 2,2 D.1: 2,4
Nº 2 D.2: 2,4 D.2: 2,5
D.1: 2,5 D.1: 2,7
Nº 3 D.2: 2,4 D.2: 2,5
D.1: 2,3 D.1: 2,6
Nº 4 D.2: 2,3 D.2: 2,7
D.1: 2,4 D.1: 2,8
Nº 5 D.2: 2,2 D.2: 2,4
D.1: 2,5 D.1: 2,6
Nº 6 D.2: 2,4 D.2: 2,7
D.1: 2,6 D.1: 2,7
Nº 7 D.2: 2,5 D.2: 2,7
D.1: 2,2 D.1: 2,5
Nº 8 D.2: 2,3 D.2: 2,4
D.1: 2,6 D.1: 2,6
Nº 9 D.2: 2,4 D.2: 2,5
D.1: 2,5 D.1: 2,6
Nº 10 D.2: 2,0 D.2: 2,3

Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo

considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas
a pH 10,01
Cuadro Nº 3.1.6
Número de placas con Diámetro del crecimiento Diámetro del
pH 10,01 del hongo en centímetros crecimiento del hongo
pasada las 24 horas en centímetros pasada
las 48 horas
10 0,0 0,0

32
 Foto Nº 3.1.2

Placa con pH 4.01

Foto Nº 3.1.3.

Placa con pH 7.01

Foto Nº 3.1.4

Placa con pH 10.01

33
 Gráfica Nº 3.1.1
Comparación del crecimiento del hongo a las 24 horas

cm
2,5 2,35

2
1,59
1,5
Crecimiento del
1 hongo

0,5

0
0
10 23 37 ºC

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de

medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

Gráfica Nº 3.1.2
Comparación del crecimiento del hongo a las 48 horas

cm
3
2,685
2,5

2
1,71
1,5 Crecimiento del
hongo
1

0,5
0
0
10 23 37 ºC

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de

medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

34
 Gráfica Nº 3.1.3
Comparación del crecimiento del hongo a las 24 horas

cm
2,5 2,375 2,355

1,5
Crecimiento del
hongo
1

0,5

0
0
4,01 7,01 10,01 pH

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de

medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

Gráfica Nº 3.1.4
Comparación del crecimiento del hongo a las 48 horas

cm
3
2,61 2,545
2,5

1,5 Crecimiento del

hongo
1

0,5
0
0
4,01 7,01 10,01 pH

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de

medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

35
3.3. Discusión de Resultados

 A la temperatura de 10ºC no se observó crecimiento en las placas con el

hongo en estudio. En cambio, a 23ºC se observó crecimiento del hongo en
todas las placas, ocurriendo algo similar en las placas sometidas a 37ºC, pero
en este caso en menor cantidad; inclusive en algunas placas no hubo desarrollo
del hongo.

 El hongo creció a 23ºC y 37ºC, pero se observó que en la segunda

temperatura la bacteria se desarrolló mejor que el hongo. En cambio a 23ºC
hubo un crecimiento mayor del hongo, compitiendo por espacio y nutrientes a la
bacteria.

 Con respecto al pH, se observó que el hongo tolera pH ácido (4,01) y neutro
(7,01), porque hubo un crecimiento en ambos grupos, sin embargo, hay una
diferencia en el promedio del diámetro de crecimiento pasado las 48 horas de
0.065 cm.

 En las placas con pH alcalino (10,01) se observó que no hubo crecimiento

del hongo, ni de la bacteria.

36
 Capítulo IV

Conclusiones y
Recomendaciones

37
4. Conclusiones y recomendaciones

4.1. Conclusiones

 A partir de la hipótesis de que el hongo tiene un efecto sobre la

bacteria a una temperatura óptima de 23ºC, los resultados confirman
que es cierta. El hongo se desarrolló pasada las 48 horas con un
diámetro de crecimiento promedio de 2,685cm a 23ºC a diferencia de
1,71cm a 37ºC, por lo que la temperatura óptima fue de 23ºC, esto
debido a que el Penicillium es un hongo ambiental. Sin embargo se
observa una competencia por sobrevivir entre el hongo Penicillium
notatum y la bacteria Staphylococcus aureus, porque a 23ºC el hongo
ganó mayor espacio y por lo tanto nutrientes a la bacteria, al aumentar
más su diámetro de crecimiento. A 37ºC el hongo no creció con la
misma intensidad como a 23ºC porque la bacteria se desarrolla
óptimante a esta temperatura, mientras que el hongo no.

 A partir de la hipótesis de que el hongo se desarrolla a un pH ácido,

después de experimentar se confirma que es cierto. Su promedio de
crecimiento en las placas con pH ácido fue de 2,61cm, siendo éste el
mayor. Se observó que el hongo también se puede desarrollar a un pH
neutro porque hubo un crecimiento promedio de 2,545cm. Ninguna de
las dos especies tolera un pH alcalino (10,01).

 El hongo Penicillium notatum puede desarrollarse si se encuentra en

condiciones óptimas de temperatura y pH, y de esta forma es capaz de
crecer y eliminar bacterias como el Staphylococcus aureus que son
dañinas al ser humano.

38
4.2. Limitaciones

 Debido a que no se contaba con el equipo adecuado en el

laboratorio, en el proceso de este experimento no se tomó en cuenta el
factor de la humedad ni el tiempo de exposición a la luz

 Por no contar con el material adecuado, no se realizó un proceso

cuantitativo en la siembra del hongo y de la bacteria.

 Debido a que las placas fueron expuestas al medio ambiente al

momento de ser sembradas puede que se hayan contaminado con
algún organismo externo, lo cual puede que haya producido la muerte
del hongo y por lo tanto no creció en algunas placas.

4.3. Recomendaciones

 Para realizar un trabajo más detallado se recomienda tomar en

cuenta el factor de la humedad midiéndola con un higrómetro. El
tiempo de exposición a la luz también se debería cronometrar para
determinar la influencia de estos factores sobre el moho Penicillium
notatum.

 Sería recomendable realizar el conteo de las bacterias que hay en la

colonia por lo cual se necesitarían discos de papel filtro que contienen
reactivos que determinan la población de la colonia para realizar un
debido conteo. Se haría el mismo procedimiento con el hongo.

 Se recomienda para estudios posteriores utilizar distintas bacterias

como el Streptococcus para realizar comparaciones bajo el efecto del
hongo. Así mismo comparar con distintos tipos de Penicillium como el
Penicillium chrysogenum, también utilizado en la industria farmacéutica.

39
 Bibliografía

Bibliografía consultada en libros:

1. ALEXOPOULOS, J. Introducción a la Micología. Editorial Eudeba. Buenos Aires 1966.

2. AUDESIRK, T., AUDESIRK, G. BYERS, B. Biología la Vida en la Tierra. Editorial

Pearson. México, 2003.

3. BASUALDO, J. COTO, C. DE TORRE, R. Microbiología Biomédica. Editorial

Atlante. Buenos Aires 1996.

4. BILAI, V. Antibiotic- Producing Microscopio fungi. Editorial Elsevier Publishing Company.

Washington D.C, 1963.

5. BOLD, ALEXOPOULOS, DEVELORYAS. Morfología de las plantas y los hongos.

Editorial Omega. Barcelona 1989.

6. CHRISTENSEN, Martin. Los Hongos y el Hombre. Editorial Limusa. México D.F,

1965.

7. DEACON, J. Introducción a la Micología Moderna. Editorial Limusa. México D.F, 1993.

8. HENDERSON, B., WILSON, M., MACNAB, R., LAX, A. Cellular Microbiology, Bacteria-
host interaction in health and disease. Editorial John Willey & Sons. England 1999. p. 4

9. KINGSBURY, D. WAGNER, G. SEGAL, G. Microbiología médica. Editorial Limusa,

México D.F, 1989. p.127

40
10. MADIGAN, T., MARTINKO, J., PARKER, J. Brock Biología de los Microorganismos.
Editorial Prentice Hall Iberia. Madrid, 1999.

11. SACSAQUISPE, R. Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad

antimicrobiana por el método de Disco Difusión. Instituto Nacional de Salud. Lima, 2002.

12. SMITH, George. Introducción a la Micología Industrial. Editorial Acribia. Zaragoza

1963.

Bibliografía consultada en internet y en enciclopedia virtual:

13. Biblioteca de Consulta Microsoft Encarta 2005. Artículo penicillium notatum.

14. Estafilococo, en
Internet:http://translate.google.com/translate?hl=es&sl=en&u=http://textbookofbacterio
logy.net/staph.html&prev=/search%3Fq%3Dstaphylococcus%2Baureus%2B%26hl%3
Des%26lr%3D%26sa%3DN (14 de agosto 2005)

15. La penicilina, en internet: http://www.educar.org/inventos/Penicilina.asp (14 de

agosto de 2005)

16. Monografías, en Internet:

http://www.monografias.com/trabajos15/micrococcaceae/micrococcaceae.shtml (14
de agosto de 2005)

17. Penicilina, en Internet http://members.tripod.com/fotografia/textos/penicilina.htm (14 de

agosto de 2005)

18. Penicillium notatum, en

Internet:http://www.schoolscience.co.uk/content/4/biology/sgm/images/penicillin.jpg(14
de agosto de 2005)

41
 Anexos

Anexo 1

Preparación de la suspensión del hongo

Anexo 2

Inoculación de la bacteria en el medio de cultivo

42
 Anexo 3

Inoculación del hongo en los discos de papel filtro

Anexo 4

Inoculación del hongo en los discos de papel filtro

43
 Anexo 5

Placas en la refrigeradora a 10ºC

Anexo 6

Placas sometidas a 37ºC en la estufa

44
 Anexo 7

Placas al medio ambiente a 23ºC

Anexo 8

Medición del diámetro de crecimiento del hongo

45
46
47