VIII.

-Captulo 4
Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas
del Vas, M.; Distfano, A.J.; Vazquez Rovere, C.; Hopp, H.E. 1 Introduccin Las enfermedades de las plantas causan la prdida de aproximadamente el 15% de la produccin agrcola mundial. En particular, las infecciones virales producen perjuicios econmicos significativos de manera directa, a travs de una disminucin del rendimiento por efecto de la enfermedad e indirecta, a travs de un incremento en los costos debido a la utilizacin de semilla libre de virus (por ejemplo, en plantas de propagacin clonal como papa, ajo y batata). Por otro lado, la exportacin de ciertos productos se ve restringida debido a las limitaciones internacionales impuestas a la exportacin de materiales fuera de la calidad y tolerancia fitosanitaria permitidas. Clsicamente, las enfermedades virales en plantas se controlan mediante distintas estrategias como el mejoramiento gentico, el uso de semillas libres de virus, la rotacin de cultivos y la tcnica de proteccin cruzada (que se describe brevemente ms adelante). A partir de 1983, cuando Fraley y col. obtuvieron plantas de tabaco y petunia transgnicas, se public un gran nmero de trabajos detallando la transferencia de genes forneos a una cantidad creciente de especies de plantas. La ingeniera gentica permite incorporar en las plantas nuevos caracteres de inters agrcola en forma horizontal, evitando as el traspaso de caracteres indeseables. De esta forma, la variedad transgnica adquiere un carcter nuevo al tiempo que mantiene intactos el fondo gentico y el potencial productivo original, lo que permite encarar el mejoramiento rpido de cultivares ya utilizados por el agricultor. Los transgenes introducidos pueden provenir de otras variedades de la misma especie vegetal, de plantas de otras especies

sexualmente incompatibles e incluso de organismos pertenecientes a otros reinos incluyendo animales y microorganismos. En sentido amplio existen dos formas de modificar plantas por ingeniera gentica de manera de conferirles resistencia al virus: desencadenar resistencia mediante la expresin de secuencias genmicas derivadas del propio virus al que se desea combatir (llamada resistencia derivada del patgeno o PDR) o desencadenar resistencia mediante la expresin de genes no-virales que poseen actividad antiviral. 2 Resistencia a virus conferida por genes virales La prevencin del desarrollo de enfermedades virales utilizando genes derivados del patgeno fue propuesta por primera vez a comienzos del siglo XX, cuando se demostr que las plantas de tabaco podan ser protegidas frente a la infeccin con una cepa severa del virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus o TMV) si, previamente, se las haba inoculado con una cepa menos virulenta del mismo virus (McKinney, 1929). Este tipo de estrategia, comnmente denominada proteccin cruzada, ha sido empleada para varios cultivos de importancia econmica, incluyendo tomate, papaya, ctricos, etc. (Gadani y col., 1990). En 1985, Sanford y Johnston propusieron que la expresin de ciertos genes del patgeno en un hospedante alterara el balance normal de los componentes virales y predijeron que esto conducira al impedimento de la replicacin o del movimiento del virus dentro de la planta ms all de la primera clula infectada (Sanford & Johnston, 1985). Las primeras plantas transgnicas con resistencia a virus se obtuvieron en 1986 mediante la expresin del gen que codifica para la cpside del TMV (Abel y col., 1986). Utilizando esta estrategia se logr obtener plantas resistentes a virus pertenecientes a casi todos los gneros de virus de plantas, principalmente en tobamo-, potex- y alfamovirus (Tabla 1). En general, las plantas protegidas muestran un retardo temporal del desarrollo de sntomas, una atenuacin en la sintomatologa caracterstica de cada virus en parti-

293

tas estrategias no se detallarn debido a que actualmente hay Gneros de transgn Virus Especies vegetales virus evidencias de que en varios casos su efectiTobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate vidad se debe a la induccin del mecanisPotexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco mo de resistencia Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; mediada por ARN maz MDMV; SMV; WMV II; que se describe a conZYMV tinuacin. Carlavirus CP tabaco; papa PVS En 1992 se demostr, por primera Luteovirus CP PLRV papa vez, que se poda Comovirus CP SLRSV tabaco obtener resistencia a virus mediante la exNepovirus CP ArMV tabaco presin de un ARNm Tobravirus CP TRV tabaco de cpside viral no Ilavirus CP TSV tabaco traducible, es decir, no era necesaria la Geminivirus CP TYLCV tomate expresin de la proTospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco tena codificada por el transgn (Lindbo Los acrnimos utilizados (en orden alfabtico) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: & Dougherty, 1992). Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; A partir de entonces GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize se publicaron numedwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya rosos trabajos proringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato fundizando la caracchlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: terizacin de este Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: tipo de resistencia a Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White virus, llamada en senclover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow tido amplio resismosaic virus. tencia mediada por ARN. Las plantas que muestran este tipo cular, una menor cantidad de sitios de infeccin y un menor ttulo viral. Se demostr que de resistencia presentan un fenotipo de inmunidad que se caracteriza porque no hay hay una correlacin entre la resistencia y el replicacin viral detectable, no hay diseminanivel de expresin de la protena de la cin viral dentro de la planta y no hay sntocpside, que la proteccin acta en el pla- mas debido a la enfermedad, o un fenotipo no celular y es superada por altas dosis de de recuperacin que se caracteriza por una inculo (viriones). En algunos casos es su- infeccin inicial (con produccin de sntomas) perada por inoculacin con ARN viral. que es seguida por un crecimiento posterior La proteccin es ms efectiva para el vi- resistente a la infeccin y asin-tomtico. En rus homlogo al que dio origen al transgn. cualquiera de los dos casos, las plantas son Sin embargo, abarca tambin a virus y cepas solamente resistentes a la infeccin producirelacionadas aunque la eficiencia se va redu- da por virus mucho ms estrechamente relaciendo a medida que la relacin filogentica cionados con el virus que dio origen al transgn que en el caso de proteccin mese hace ms lejana. Adems, se logr obtener resistencia a diada por cpside. El anlisis de estas planvirus mediante la expresin de otras prote- tas en el plano molecular demostr que en nas virales tales como las protenas respon- general contienen copias mltiples del sables de la multiplicacin viral (por ejem- transgn y que si bien presentan un alto niplo ARN polimerasas dependientes de ARN) vel de transcripcin en el ncleo, los niveles y las protenas responsables del movimien- estables del ARNm del transgn en el citoto viral de clula a clula disfuncionales. Es- plasma son muy bajos. Usualmente se ob-

Tabla 1: Ejemplos de resistencia a virus mediante la expresin de la protena de cpside (CP) o nucleocpside (Gen N) viral en plantas transgnicas.

294

serva adems metilacin de la regin codificante del transgn. 2.1 Mecanismo de proteccin debida a la expresin de la protena de cpside viral (CP) Como se mencion, las primeras plantas transgnicas con resistencia a virus se obtuvieron mediante la expresin del gen que codifica para la cpside del TMV. Estas plantas resultaron resistentes a la inoculacin con partculas virales de TMV pero la resistencia era sobrepasada si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se postul entonces que la proteccin se deba a la inhibicin del desnudamiento viral en las clulas infectadas inicialmente. Varias lneas de evidencia apoyan esta hiptesis. Por ejemplo si se inoculan protoplastos derivados de plantas transgnicas que expresan la CP de TMV o plantas no transformadas con pseudoviriones (partculas formadas por la CP viral que contienen en su interior un ARNm no viral) de TMV que contienen ARNm que codifica para la enzima indicadora glucuronidasa (GUS), se observa que hay una marcada disminucin de la actividad GUS en los protoplastos derivados de las plantas transgnicas. Esto se debe probablemente a la falla en el desnudamiento de los viriones (Osbourn y col., 1989). Ms adelante se demostr que las protenas de cpside mutagenizadas para anular la habilidad de autoagregarse no son capaces de conferir proteccin frente a TMV, y que las protenas mutantes capaces de interactuar entre ellas con afinidad ms alta conferan mayor proteccin que la protena de cpside salvaje. Es decir que se estableci una relacin directa entre el nivel de agregacin de la protena de cpside y el nivel de proteccin frente a TMV (Bendahmane y col., 1997). Si bien estos trabajos apoyan la hiptesis de que en las plantas transgnicas para CP hay una inhibicin en una etapa temprana de la infeccin, no se puede descartar que, adems, la expresin de protena de cpside impida o modifique etapas ms tardas de la infeccin. Si se injerta una porcin de planta transgnica que muestra proteccin mediada por cpside entre una base y un pice no transgnicos y se inocula la planta injertada

en la base no transgnica, se observa que el virus no puede moverse hacia el pice, es decir que no puede atravesar la zona transgnica protegida (Wisniewski y col., 1990). Sin embargo, la supresin del movimiento vascular involucra tambin el empaquetamiento y desnudamiento viral, y cabe la posibilidad de que la supresin del movimiento vascular sea una consecuencia secundaria de la inhibicin del desnudamiento viral en las plantas expresando protena de cpside. Otro caso muy estudiado es el del virus PVX de la papa. Las plantas transgnicas para la cpside de PVX resultan protegidas ante la inoculacin con virus o con ARN viral (Hemenway y col., 1988). Se postula que la protena de cpside se une al origen de ensamblado localizado en el extremo 5 del ARN viral, suprimiendo de esta manera la traduccin de la replicasa viral (cuyo gen est localizado en el mismo extremo). Tambin es posible que inhiba el movimiento de PVX de clula a clula, ya que la protena de cpside es un cofactor esencial de la traslocacin sistmica (Chapman y col., 1992). Como se desprende de los dos ejemplos descriptos, el mecanismo de proteccin mediado por la protena de cpside no es nico, y es particular para cada sistema virus-planta. 2.2 Mecanismo de proteccin debida al desencadenamiento de resistencia mediada por ARN Es conocido que distintos eventos de transformacin obtenidos con la misma construccin gentica pueden dar lugar a una variada gama de expresin del gen de inters (efecto de posicin). Hay muchos ejemplos en los que la caracterstica que uno desea expresar no se expresa o su expresin desaparece a lo largo de las distintas generaciones. Esta prdida de la caracterstica deseada (pero no del transgn correspondiente) se denomina silenciamiento gnico y el primer ejemplo se describi en petunias para el gen de la chalcona sintetasa (Napoli y col., 1990). Dependiendo del nivel de accin en el cual ocurre el silenciamiento gnico, se pueden distinguir el silenciamiento transcripcional (TGS) y el silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS). El TGS se

295

manifiesta por una falta de expresin del gen en cuestin debido a la metilacin de la regin promotora, lo cual impide la normal transcripcin del gen. Este tipo de silenciamiento se hereda meiticamente y se desencadena por interaccin entre varias copias de un transgn que tienen homologa en sus regiones promotoras. El PTGS se manifiesta por una supresin del efecto del gen en cuestin ocasionado por una degradacin inducible y especfica del ARNm transcripto. Para desencadenar este tipo de mecanismo se requiere de homologa en la regin transcripcional entre los genes que interactan y puede estar acompaado de metilacin de la secuencia de ADN codificante. Este mecanismo de degradacin de ARN especfico de secuencia evolucion como un mecanismo de defensa antiviral en plantas. Si bien se describi por primera vez en plantas, se lo ha encontrado tambin en hon-

gos (donde se denomina quelling) y animales como nematodos, moscas o mamferos (donde se lo denomina interferencia mediada por ARN). El PTGS puede ser desencadenado eficientemente por transgenes nucleares que dan lugar a transcriptos con estructura de ARN de doble cadena (ARNdc) o que expresan altos niveles o niveles aberrantes de transcriptos. En plantas tambin puede ser desencadenado por la replicacin de virus que generalmente produce intermediarios replicativos de ARNdc. Una vez desencadenado el proceso, los intermediarios que contienen ARNdc son reconocidos por una nucleasa especfica de ARNdc que los procesa en fragmentos de ARNs pequeos (llamados pequeos interferentes -small interfering- ARNs o ARNsi) de ambas polaridades y de 21 a 25 nucletidos de longitud (Hamilton & Baulcombe, 1999). A su vez, se postula que

Figura 1: Mecanismo propuesto para la iniciacin, diseminacin de la seal mvil y degradacin del ARNm blanco durante el proceso de silenciamiento gnico postranscipcional (PTGS) dentro de una planta. RdRP: ARN polimerasa dependiente de ARN.

296

los ARNsi actan como guas para dirigir la maquinaria de degradacin de ARN contra todo aquel ARN con homologa a la secuencia desencadenante. Un aspecto a destacar es que el silenciamiento mediado por ARN es desencadenado localmente y luego transmitido a toda la planta va una seal de silencia-miento mvil (Palauqui y col., 1997, Voinnet & Baulcombe, 1997). Si bien se desconoce por el momento la naturaleza de la seal, se postula que sta contiene un componente de cido nucleico que explicara la especificidad de secuencia del mecanismo de degradacin y un componente proteico. Asimismo, por prospeccin gentica de mutantes de Arabidopsis se han identificado numerosos genes que codifican para una serie de factores que intervienen en el proceso de PTGS, como por ejemplo ARN polimerasas dependientes de ARN que sintetizan ARNdc, protenas que forman parte de los complejos de degradacin del ARN blanco, etc. Las plantas mutantes para estos genes no son capaces de desencadenar PTGS. Recientemente se han publicado numerosas recopilaciones del tema (Vzquez Rovere y col., 2002, Voinnet, 2001, Waterhouse y col., 2001). En la Figura 1 se esquematiza el mecanismo subyacente al PTGS. Dado que el PTGS es un mecanismo de defensa antiviral en plantas, resulta esperable que se haya seleccionado en los virus de plantas la capacidad de contrarrestar a este mecanismo. Congruentemente con esta especulacin, se encontr que varios virus de plantas codifican para protenas supresoras del PTGS (Anandalakshmi y col., 1998, Beclin y col., 1998, Brigneti y col., 1998). Luego de una bsqueda exhaustiva de supresores de silenciamiento en una gran cantidad de virus de plantas, Voinnet y col., concluyeron que prcticamente todos los virus llevan supresores de silenciamiento, que los genes que los codifican tienen secuencias y origen evolutivo diversos, y que los distintos supresores actan inhibiendo el silenciamiento a distintos niveles (Voinnet y col., 1999). Algunos, como la protena HC-Pro codificada por los potyvirus previenen la acumulacin de los ARNsi, pero no eliminan la seal mvil que propaga el silenciamiento (Llave y col., 2000). Otros supresores, como la protena p25 del virus PVX interfieren con la seal de propa-

gacin sistmica (Voinnet y col., 2000), y finalmente otros, como el codificado por el virus del achaparramiento del tomate (Tomato bushy stunt virus o TBSV), suprimen el silenciamiento slo en las nervaduras (Voinnet y col., 1999). Incluso se han encontrado en virus animales supresores de silenciamiento que son funcionales en plantas (Li y col., 2002). Es interesante destacar que varios de los supresores de silenciamiento virales descriptos haban sido previamente caracterizados como protenas responsables de la sintomatologa, del movimiento viral y/ o del fenmeno de sinergismo en la virulencia combinada de dos o ms virus. La posibilidad de la supresin del silenciamiento por parte de un virus que coexista con las plantas transgnicas protegidas por el mecanismo de silenciamiento gnico debe ser tomada en cuenta ya que la infeccin de una planta silenciada con un virus heterlogo que lleva un supresor de silenciamiento puede dar lugar a la reversin del silenciamiento tornndola susceptible a la infeccin viral (Beclin y col., 1998). Resulta importante entonces estudiar qu virus coinfectan un mismo hospedador en condiciones naturales y en lo posible utilizar plantas transgnicas con resistencia a ambos virus. Un aspecto interesante a recalcar es que, debido a que el mecanismo de PTGS implica una muy baja acumulacin del ARN derivado del transgn y una nula acumulacin de protenas, la estrategia de obtener resistencia a virus mediante el desencadenamiento de este fenmeno en plantas transgnicas es ms atractiva desde el punto de vista de la evaluacin de riesgos en cuanto a la bioseguridad de estos organismos genticamente modificados u OGMs, que la sobreexpresin de genes que interfieran con el ciclo de multiplicacin viral, como es el caso de la cpside u otras protenas virales. Esto se debe a que la baja acumulacin de ARN transgnico minimiza las posibilidades de una potencial recombinacin homloga con ARN de origen viral infectante. Por otro lado, la ausencia de la protena codificada por el transgn minimiza drsticamente el anlisis de riesgo alimentario del OGM y evita el riesgo de transcapsidacin (la encapsidacin del material gentico de otros virus) en el caso

297

en que el transgn codifique para la protena de cpside viral funcional. 3 Resistencia a virus conferida por genes no virales Adems de la resistencia derivada del patgeno (PDR), en los ltimos aos se han explorado estrategias alternativas para la obtencin de plantas transgnicas con resistencia a enfermedades virales. Entre ellas se destaca el uso de inhibidores naturales y especficos de la replicacin viral como la protena antiviral pokeweed (PAP), la expresin de anticuerpos en plantas o plantibodies, la expresin antisentido de genes de plantas esenciales para el ciclo de vida viral y la expresin de la enzima 2-5oligoadenilato sintetasa de mamferos en plantas (Truve y col., 1993). A continuacin se describirn brevemente las dos primeras estrategias debido a que son las consideradas ms promisorias. 3.1 Expresin de protenas antivirales de origen vegetal

Las protenas antivirales de la planta Phytolacca Tabla 2: Plantas transgnicas con resistencia a virus autorizadas para su comercializacin. americana (lla- (fuente AGBios: http://www.agbios.com/dbase.php) mada pokeweed en ingls) (PAP) conforman uno de los grupos ms importantes de protenas usadas como inhibidores naturales de la replicacin viral. Las protenas PAP inactivan los ribosomas (pertenecen a la familia de las RIP o protenas inactivadoras de ribosomas) y su aplicacin exgena protege a plantas

heterlogas de infecciones virales. Se demostr que la expresin de esta protena en plantas de papa y tabaco transgnicas las protega frente a una variedad de viruses, sea que stos fueran inoculados mecnicamente o por fidos vectores (Lodge y col., 1993). El estudio de esta resistencia demostr que la protena PAP inhiba un paso temprano de la infeccin. Estas protenas son potencialmente txicas para la planta husped (Wang & Tumer, 2000). En los ltimos aos se encontraron o redisearon variantes menos txicas o no txicas de estas protenas las que, expresadas en plantas transgnicas, confieren resistencia a virus sin producir el efecto de la inactivacin de los ribosomas (Wang y col., 1998, Zoubenko y col., 2000). Por otro lado, se estudi la actividad antiviral de la protena IRIP (protena RIP obtenida de bulbos de iris) en plantas transgnicas de tabaco. Esta protena es una ARN-N-glicosidasa y su expresin en plantas transgnicas no produjo cambios fenotpicos observndose una reduccin significativa de las lesiones producidas por el virus TMV con respecto a las plantas control (Desmyter y col., 2003).

298

Tabla 3: Plantas transgnicas con resistencia a virus en etapas avanzadas de experimentacin en laboratorio (e) o de pruebas piloto a campo (c) en pases en vas de desarrollo (fuente: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/ inventory_admin/dep/default.asp).

Cultivo

Virus

Pas

moscada

Los acrnimos utilizados fueron: BGMV: Bean golden yellow mosaic virus; BYDV: Barley yellow dwarf virus; CLCV: Cotton leaf curl virus; CMV: Cucumber mosaic cucumovirus; CPsV: Citrus psorosis virus; CVBMV: Chilli vein-banding mottle virus; MSV: Maize streak virus; PAMV: Potato aucuba mosaic virus; PLRV: Potato leafroll luteovirus; PMV: Papaya mosaic virus; PRSV: Papaya ringspot virus; PStV: Peanut stripe virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; RDV: Rice dwarf virus; RRSV: Rice ragged stunt virus; SCMV: Sugarcane mosaic virus; SMV2: Soybean mosaic virus; SPMFV: Sweet potato feathery mottle virus; TMV: Tabaco mosaic virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TuMV: Turnip mosaic virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; ZAMV: Zantedeschia mosaic potyvirus. ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.

299

La ventaja de expresar protenas de tipo PAP en plantas transgnicas es que se logra resistencia a un amplio espectro de virus mediante la expresin de un nico gen a diferencia de los mtodos descriptos previamente que son especficos para un tipo de virus o virus cercanamente relacionados. 3.2 Expresin de anticuerpos en plantas transgnicas Una estrategia alternativa que se comenz a utilizar en los ltimos aos es la expresin de anticuerpos completos o fragmentos de los mismos en plantas transg-nicas para obtener resistencia a virus. En 1993 se demostr que la expresin constitutiva de un anticuerpo de cadena nica (scFv) dirigido contra la protena de cpside del virus del moteado crujiente de la achicoria (Artichoke mottled crinkle virus) causaba una reduccin en la susceptibilidad al virus, que se pona de manifiesto por una baja en la incidencia de la infeccin y un retraso en la aparicin de los sntomas (Tavladoraki y col., 1993). En 1996 se expres un anticuerpo monoclonal de cadena nica (scFv) contra la protena de cpside del virus de la vena necrtica amarillenta de la remolacha (Beet necrotic yellow vein virus) en Nicotiana benthamiana (Fecker y col., 1996) y en el 2000, Schillberg y col. mostraron que la expresin de la cadena Fv contra la protena de cpside del virus TMV en la membrana plasmtica de plantas de tabaco transgnicas confera resistencia al virus (Schillberg y col., 2000). Hasta el momento se desconoce el mecanismo por el cual la expresin de anticuerpos o fragmentos de los mismos confiere resistencia a virus, pero se demostr que para que la estrategia sea efectiva es indispensable lograr altos niveles de expresin y que los anticuerpos se expresen en el compartimento celular donde ocurre la replicacin viral para que sta sea inhibida en forma efectiva. Por ltimo, los anticuerpos deben seleccionarse correctamente para que bloqueen los pasos cruciales en la replicacin o transmisin del virus. En los ltimos aos se han desarrollado protocolos sencillos para mejorar los anticuerpos a utilizar, que incluyen la seleccin de anticuerpos monoclonales usando las tec-

nologas de hibridoma y construccin de genotecas utilizando la tcnica de exhibicin de epitopes en bacterifagos o phage display (Schillberg y col., 2001). Es importante destacar que los anticuerpos monoclonales que reconocen a la polimerasa viral o alguna otra protena viral con actividad cataltica, son ms promisorios que los que reconocen protenas estructurales como es el caso de la cpside viral. Por lo tanto, la expresin de anticuerpos dirigidos contra protenas virales esenciales podra proveer una alternativa interesante para obtener resistencia a virus. 4 Plantas transgnicas con resistencia a virus cultivadas comercialmente o en etapas avanzadas de experimentacin En los ltimos aos se ha autorizado el cultivo comercial y consumo de una variedad de plantas transgnicas con resistencia a virus basada en alguno de los mecanismos descriptos (Tabla 2). Existe otro grupo muy importante de plantas transgnicas con resistencia a virus que se encuentran en etapas avanzadas de experimentacin o de pruebas piloto a campo. Es interesante constatar que los pases en vas de desarrollo han adoptado esta tecnologa y trabajan activamente en la obtencin de plantas de cultivos de inters local con resistencia a virus (Tabla 3). 5 Lecturas Recomendadas
ABEL, P. P., NELSON, R. S., DE, B., HOFFMANN, N., ROGERS, S. G., FRALEY, R. T. & BEACHY, R. N. (1986). Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science 232, 738-43. ANANDALAKSHMI, R., PRUSS, G. J., GE, X., MARATHE, R., MALLORY, A. C., SMITH, T. H. & VANCE, V. B. (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13079-84. BECLIN, C., BERTHOME, R., PALAUQUI, J. C., TEPFER, M. & VAUCHERET, H. (1998). Infection of tobacco or Arabidopsis plants by CMV counteracts systemic posttranscriptional silencing of nonviral (trans)genes. Virology 252, 313-7. BENDAHMANE, M., FITCHEN, J. H., ZHANG, G. & BEACHY, R. N. (1997). Studies of coat protein-mediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. J Virol 71, 7942-50.

300

BRIGNETI, G., VOINNET, O., LI, W. X., JI, L. H., DING, S. W. & BAULCOMBE, D. C. (1998). Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. Embo J 17, 6739-46. CHAPMAN, S., HILLS, G., WATTS, J. & BAULCOMBE, D. (1992). Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology 191, 223-30. DESMYTER, S., VANDENBUSSCHE, F., HAO, Q., PROOST, P., PEUMANS, W. J. & VAN DAMME, E. J. (2003). Type-1 ribosome-inactivating protein from iris bulbs: a useful agronomic tool to engineer virus resistance? Plant Mol Biol 51, 567-76. FECKER, L. F., KAUFMANN, A., COMMANDEUR, U., COMMANDEUR, J., KOENIG, R. & BURGERMEISTER, W. (1996). Expression of single-chain antibody fragments (scFv) specific for beet necrotic yellow vein virus coat protein or 25 kDa protein in Escherichia coli and Nicotiana benthamiana. Plant Mol Biol 32, 979-86. FRALEY, R. T., ROGERS, S. G., HORSCH, R. B., SANDERS, P. R., FLICK, J. S., ADAMS, S. P., BITTNER, M. L., BRAND, L. A., FINK, C. L., FRY, J. S., GALLUPPI, G. R., GOLDBERG, S. B., HOFFMANN, N. L. & WOO, S. C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A 80, 4803-7. GADANI, F., MANSKY, L. M., MEDICI, R., MILLER, W. A. & HILL, J. H. (1990). Genetic engineering of plants for virus resistance. Arch Virol 115, 1-21. HAMILTON, A. J. & BAULCOMBE, D. C. (1999). A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-2. HEMENWAY, C. L., FANG, R. X., KANIEWSKI, W. K., CHUA, N.-H. & TUMER, N. E. (1988). Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA. Embo J 7, 1273-1280. LI, H., LI, W. X. & DING, S. W. (2002). Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus. Science 296, 1319-21. LINDBO, J. A. & DOUGHERTY, W. G. (1992). Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 189, 72533. LLAVE, C., KASSCHAU, K. D. & CARRINGTON, J. C. (2000). Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13401-6. LODGE, J. K., KANIEWSKI, W. K. & TUMER, N. E. (1993). Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7089-93. McKINNEY, H. (1929). Mosaic diseases in Canary Islands, West Africa, and Gibraltar. J Agric Res 39, 557.

NAPOLI, C., LEMIEUX, C. & JORGENSEN, R. (1990). Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2, 279-289. OSBOURN, J. K., WATTS, J. W., BEACHY, R. N. & WILSON, T. M. (1989). Evidence that nucleocapsid disassembly and a later step in virus replication are inhibited in transgenic tobacco protoplasts expressing TMV coat protein. Virology 172, 370-3. PALAUQUI, J. C., ELMAYAN, T., POLLIEN, J. M. & VAUCHERET, H. (1997). Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to nonsilenced scions. Embo J 16, 4738-45. SANFORD, J. C. & JOHNSTON, S. A. (1985). The concept of parasite-derived resistance: deriving resistance genes from the parasites own genome. J Theor Biol 113, 395405. SCHILLBERG, S., ZIMMERMANN, S., FINDLAY, K. & FISCHER, R. (2000). Plasma membrane display of antiviral single chain Fv fragments confers resistance to tobacco mosaic virus. Mol. Breeding 6, 317-326. SCHILLBERG, S., ZIMMERMANN, S., ZHANG, M. Y. & FISCHER, R. (2001). Antibody-based resistance to plant pathogens. Transgenic Res 10, 1-12. TAVLADORAKI, P., BENVENUTO, E., TRINCA, S., DE MARTINIS, D., CATTANEO, A. & GALEFFI, P. (1993). Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack. Nature 366, 469-72. TRUVE, E., AASPOLLU, A., HONKANEN, J., PUSKA, R., MEHTO, M., HASSI, A., TEERI, T. H., KELVE, M., SEPPANEN, P. & SAARMA, M. (1993). Transgenic potato plants expressing mammalian 2'-5' oligoadenylate synthetase are protected from potato virus X infection under field conditions. Biotechnology (N Y) 11, 1048-52. VAZQUEZ ROVERE, C., DEL VAS, M. & HOPP, H. E. (2002). RNA-mediated virus resistance. Curr Opin Biotechnol 13, 167-72. VOINNET, O. (2001). RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet 17, 449-59. VOINNET, O. & BAULCOMBE, D. C. (1997). Systemic signalling in gene silencing. Nature 389, 553. VOINNET, O., LEDERER, C. & BAULCOMBE, D. C. (2000). A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell 103, 15767. VOINNET, O., PINTO, Y. M. & BAULCOMBE, D. C. (1999). Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14147-52. WANG, P. & TUMER, N. E. (2000). Virus resistance mediated by ribosome inactivating proteins. Adv Virus Res 55, 325-55.

301

WANG, P., ZOUBENKO, O. & TUMER, N. E. (1998). Reduced toxicity and broad spectrum resistance to viral and fungal infection in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein II. Plant Mol Biol 38, 957-64. WATERHOUSE, P. M., WANG, M. B. & LOUGH, T. (2001). Gene silencing as an adaptive defence against viruses. Nature 411, 834-42. WISNIEWSKI, L. A., POWELL, P. A., NELSON, R. S. & BEACHY, R. N. (1990). Local and systemic spread of tobacco mosaic virus in transgenic tobacco. Plant Cell 2, 559-67. ZOUBENKO, O., HUDAK, K. & TUMER, N. E. (2000). A non-toxic pokeweed antiviral protein mutant inhibits pathogen infection via a novel salicylic acid-independent pathway. Plant Mol Biol 44, 219-29.