INACTIVACIN DE P53 Y AMPLIFICACIN DE LA CICLINA D1 EN LOS CARCINOMAS EPIDERMOIDES DE CABEZA Y CUELLO

J. P. RODRIGO TAPIA1,2, M. V. GONZLEZ MEANA2, L. A. G ARCA GONZLEZ1, E. COTO3, J. GARCA PEDRERO2, F. NEZ BATALLA1,2, C. SUREZ NIETO1,2
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SERVICIO DE ORL, HOSPITAL CENTRAL DE ASTURIAS. 2INSTITUTO UNIVERSITARIO DE ONCOLOGA, UNIVERSIDAD

DE

OVIEDO. 3LABORATORIO DE GENTICA MOLECULAR. HOSPITAL CENTRAL DE ASTURIAS. OVIEDO. ASTURIAS. INACTIVATION OF P53 AND AMPLIFICATION OF CYCLIN D1 IN SQUAMOUS CELL CARCINOMAS OF THE HEAD AND NECK

RESUMEN
Correspondencia: Juan Pablo Rodrigo Tapia. C/ Fernndez Ladreda, 32-A, 4B. 33011 Oviedo. E-mail: jrodrigot@seorl.org Fecha de recepcin: 28-6-2001 Fecha de aceptacin: 3-1-2002

INVESTIGACIN BSICA

os genes P53 y CCND1 (ciclina D1) juegan un papel clave en el control

del ciclo celular. Las anomalas de dichos genes son frecuentes en diversos tipos de cnceres, incluyendo los de cabeza y cuello. El objetivo de este estudio es investigar s existe una relacin entre la inactivacin del gen P53 (determinada como prdida de heterocigosidad) y la amplificacin del gen CCND1 (determinada mediante PCR diferencial) y si dichas anomalas se correlacionan con el pronstico en una serie de 56 carcinomas epidermoides de cabeza y cuello. Se hall prdida de heterocigosidad del gen P53 en 39 casos (70%) y amplificacin del gen CCND1 en 17 casos (30%). Ambas anomalas fueron encontradas conjuntamente en 11 casos (20%), no habiendo una relacin significativa entre ellas (P=0,83). La inactivacin de P53 no se asoci con ninguno de los parmetros clnicopatolgicos analizados, ni con la evolucin de los pacientes. La amplificacin del CCND1 se relacion con estadios T avanzados (P=0,02), con la presencia de metstasis ganglionares (P=0,01) y con una menor supervivencia (P=0,002). La combinacin de ambas anomalas genticas parece tener un patrn aditivo, pues se asoci con una mayor incidencia de recidivas tumorales y con una peor supervivencia que los casos con una sola de las alteraciones. En conclusin, las anomalas de los genes P53 y CCND1 son frecuentes en los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello. Cuando se consideran conjuntamente son ms informativas que cada una de ellas individualmente y podran tener valor pronstico en estos carcinomas.

53 and CCND1 (cyclin D1) genes play a critical role in the cell

cycle regulation. Abnormalities of these genes are frequent in different types of cancers, including those of the head and neck. The aim of this work is to investigate whether P53 inactivation (determined by loss of heterozygosity analysis) is related to CCND1 gene amplification (determined by differential PCR analysis), and if these alterations are correlated with clinical outcome in a series of 56 patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Loss of heterozygosity of the P53 gene was found in 39 cases (70%) and CCND1 amplification in 17 cases (30%). Both abnormalities together were found in 11 cases (20%), without a significant association between them (P=0.83). No relationship was found between P53 inactivation, the clinico-pathological parameters analyzed and the clinical outcome. CCND1 amplification was associated with advanced T-stages (P=0,02), nodal metastases (P=0,01) and a decreased survival (P=0,002). The combination of both abnormalities shows a pattern that seems to be additive, since it was associated with an increase in tumor recurrences and a decrease in survival that was higher than for either of them individually. In conclusion, P53 and CCND1 abnormalities are frequent in squamous cell carcinomas of the head and neck. The combined analysis of these abnormalities seems to be more informative than either of them individually and may have a prognostic value in these carcinomas.

ABSTRACT
PALABRAS CLAVE: Carcinoma epidermoide. Cabeza y cuello. P53. Ciclina D1. Pronstico. KEY WORDS: Squamous cell carcinoma. Head and neck. P53. Cyclin D1. Prognosis. J. P. RODRIGO TAPIA ET AL. INACTIVACIN DE P53 Y AMPLIFICACIN DE LA CICLINA D1

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La supervivencia de los pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello ha permanecido invariable en los ltimos aos, a pesar de los avances en el diagnstico y el tratamiento. Nuestra capacidad para predecir el pronstico de los pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello es pobre, particularmente en el caso de los tumores avanzados, debido a las variaciones en el comportamiento biolgico de estos tumores. Es por tanto necesario identificar nuevos marcadores (por ejemplo marcadores genticos) que puedan distinguir estas diferencias de comportamiento biolgico. En este sentido, las anomalas que afectan a los genes que participan en el control del ciclo celular, como el P53 y la ciclina D1 (CCND1), son particularmente atractivas. La inactivacin del gen P53 es una de las ms

frecuentes alteraciones genticas en los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello1. Este gen, localizado en la regin cromosmica 17p13, juega un papel crucial en la progresin de lesiones preinvasivas a cncer2. El producto del gen P53 controla funciones esenciales de la clula relacionadas con el ciclo celular y la apoptosis3. Sin embargo, a pesar de la importancia biolgica del gen P53, el significado pronstico de su inactivacin permanece por esclarecer debido a los resultados contradictorios que se hallan en la literatura (revisado por Blobe y Amrein1). El gen CCND1 (PRAD1), localizado en la regin cromosmica 11q13, codifica la ciclina D1, una protena que tiene un papel clave en la regulacin del ciclo celular en la transicin G1/S4. La amplificacin del gen CCND1 (aumento del nmero de copias), con la consiguiente sobreproduccin de la ciclina D1, es una anomala frecuente en los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello. Dicha amplificacin se ha asociado con una mayor agresividad tumoral y un peor pronstico de la enfermedad5,6. Dada la importancia que parecen tener estas anomalas genticas en el desarrollo de los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello, y que ambas participan en la regulacin del mismo punto del ciclo celular (la transicin G1/S), en este trabajo investigamos si existe relacin entre la inactivacin del gen P53 (determinada mediante anlisis de prdida de heterocigosidad o prdida de la regin cromosmica que contiene al gen) y la amplificacin del gen CCND1. Tambin se pretende determinar si dichas anomalas genticas, solas o en combinacin, guardan relacin con el pronstico en nuestra serie de pacientes.

MATERIAL Y MTODOS
Pacientes Se estudian 80 pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello intervenidos entre 1992 y 1995. En todos los casos se trataba de tumores primarios que no haban recibido tratamiento previamente. Todos los pacientes fueron intervenidos

con intencin curativa, y en todos ellos se obtuvieron mrgenes quirrgicos libres de neoplasia (se excluyeron previamente los que tuvieran mrgenes afectos). En 46 casos se administr radioterapia postoperatoria (en general, se administr a los casos localmente avanzados y/o con metstasis ganglionares). Todos los pacientes eran varones, con una media de edad de 58,7 aos (rango entre 38 y 83 aos). Todos ellos, excepto uno, tenan antecedentes de consumo habitual de tabaco, y 74 adems de alcohol. Los pacientes fueron estadificados segn la clasificacin de la Unin Internacional Contra el Cncer (4 Edicin). Obtencin de las muestras y extraccin del ADN Las muestras tumorales fueron obtenidas en el momento de la intervencin quirrgica, congeladas inmediatamente y conservadas a 70 C hasta su procesamiento. Simultneamente se obtuvo sangre perifrica del paciente, mantenindose a 4C hasta la extraccin del ADN de los leucocitos. Anlisis de la amplificacin del gen CCND1 (ciclina D1) El estudio de la amplificacin del oncogen CCND1 se realiz mediante la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) diferencial, tal como se describi previamente6. Brevemente, en cada reaccin de PCR se emplearon simultneamente dos pares de oligonucletidos, uno para amplificar el gen a estudio (CCND1) y el otro para el gen de referencia, localizado en el mismo cromosoma que el primero (en este caso se emple el gen de la tirosinahidroxilasa). De esta manera se evitan los falsos positivos debidos a duplicaciones cromosmicas. Como controles negativos se emple ADN extrado de tejidos normales obtenidos en ciruga no oncolgica (amgdalectomas de nios). Los controles positivos se obtuvieron mezclando ADN de tejidos normales con cantidades conocidas de un fragmento del gen CCND1 previamente amplificado por PCR, de manera que se podan simular diferentes grados de amplificacin. Las mezclas de la PCR contenan 0,2-0,5 g

del ADN a estudio, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,2 mM de cada dNTP, 1 M de cada cebador, y 1 U de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim) en un volumen total de 50 l. Los ciclos de la PCR consistieron en 1 minuto a cada temperatura (desnaturalizacin a 94C, anillamiento a 56C, y elongacin a 72C), por un total de 30 ciclos, y un ciclo final de 7 minutos a 72C. Los cebadores para el gen CCND1 fueron 5-CGTACCCCGATGCCAACC y 5-ATGGACGGCAGGACCTCC, amplificando un fragmento de 121 pares de bases (bp). Los cebadores del gen de la tirosina-hidroxilasa fueron 5-GCCCCAGCTGCATCCTAC y 5CTTGGCAGACACCTGGGG, amplificando un fragmento de 188 bp. Los cebadores fueron obtenidos de MWG-Biotech. De cada reaccin de PCR, 10 l fueron sometidos a electroforesis en geles de Agarosa al 3%. Las bandas correspondientes a los productos de la PCR fueron visualizadas por tincin con bromuro de etidio en un transiluminador de luz ultravioleta, fotografiadas con una cmara digital, y cuantificadas mediante tcnicas de anlisis de imagen (Kodak Digital Science, Eastman Software). Anlisis de la prdida de heterocigosidad del gen P53 Las prdidas allicas o prdidas de heterocigosidad (LOH, del ingls Loss Of Heterozygosity) del gen P53 fueron estudiadas mediante el anlisis de marcadores microsatlites (un dinucletido y una repeticin en tandem variable VTR) intragnicos al locus P53, tambin tal como se describi previamente7. Los microsatlites fueron amplificados mediante PCR. Las mezclas de la reaccin contenan 50 ng del ADN a estudio, 10 mM TrisHCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 200 M de cada dNTP (aadiendose dCTP marcado con
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P), 10 pM de cada cebador, y 1 U de Taq polimerasa

(Boehringer Mannheim) en un volumen total de 25 l. Los ciclos de la PCR consistieron en 1 minuto a cada temperatura (desnaturalizacin a 98C, anillamiento a 55C, y elongacin a 75C),

por un total de 30 ciclos, y un ciclo final de 7 minutos a 75C. Los cebadores para el marcador dinucletido (P53-AC/GT) fueron 5-CGACTTTCCTCAACTCTACA y 5-AACAGCTCCTTTAATGGCAG. Los cebadores del marcador P53-VTR fueron 5ACTCCAGCCTGGGCAATAAGAGCT y 5-ACAAAACATCCCCTACCAAACAGC. Los productos de la PCR fueron separados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 6%. Los geles fueron secados y autorradiografiados. Los patrones autorradiogrficos fueron analizados mediante densitometra, y se consider como prdida de heterocigosidad una reduccin en la seal de ms del 80% en uno de los alelos de la muestra tumoral. Anlisis estadstico Para el anlisis estadstico se emple el test de chi-cuadrado, con la correccin de Yates cuando era preciso, con la ayuda del programa informtico SPSS 8.0. Las curvas de supervivencia fueron calculadas con el mtodo de Kaplan-Meier. Las muertes que no fuesen debidas al tumor primario o sus metstasis no fueron consideradas fracaso del tratamiento, siendo dichos casos censurados en el anlisis de la supervivencia especfica para la enfermedad. Las diferencias entre las curvas de supervivencia fueron analizadas con el mtodo logrank. Los pacientes fueron seguidos un mnimo de 36 meses. Los valores de P 0,05 fueron considerados estadsticamente significativos.

RESULTADOS
Alteraciones genticas De los 80 pacientes inicialmente seleccionados, slo 56 (70%) eran informativos para el gen P53 (heterocigotos para los polimorfismos analizados en la sangre). Estos 56 pacientes contituyen la poblacin a estudio y sus caractersticas clnico-patolgicas se muestran en la Tabla 1. Se hall LOH del gen P53 en 39 de los 56 casos (70%). La amplificacin del gen CCND1 se observ en el 30% de los casos (17/56). En la Figura 1 se muestran ejemplos representativos de la deteccin de estas alteraciones. Ambas anomalas fueron halladas conjuntamente en 11 casos (20%). No se encontr

una asociacin significativa entre ambas alteraciones (P=0,83; Tabla 2). Asociacin de las alteraciones del P53 y el CCND1 con las caractersticas clnico-patolgicas No se observ ninguna asociacin entre la LOH del P53 y la localizacin del tumor, el tamao local del mismo, la presencia de metstasis ganglionares, ni el grado histolgico (Tabla 1). La amplificacin del CCND1 se asoci estadsticamente con estadios locales avanzados (P=0,02) y con la presencia de metstasis ganglioACTA OTORRINOLARINGOLGICA ESPAOLA Acta Otorrinolaringol Esp 2002; 53: 225-232 227

nares (P=0,01), pero no con el grado histolgico ni la localizacin del tumor, aunque se observ una mayor incidencia de amplificacin en los tumores supraglticos y en los de hipofaringe (Tabla 1). Los pacientes con ambas alteraciones simultneamente presentaban tumores en estadios locales ms avanzados y con mayor incidencia de metstasis ganglionares, comparado con los pacientes que no mostraban ninguna de las dos alteraciones. Los pacientes con una sola de las dos alteraciones tenan caractersticas intermedias, pero se puede apreciar que la amplificacin aislada de la ciclina D1 se segua asociando con estadios locales avanzados y la presencia de metstasis ganglionares (Tabla 3). Asociacin de las alteraciones del P53 y el CCND1 con el curso clnico Nueve de los pacientes fallecieron por causas no relacionadas con el tumor o fueron perdidos, por lo que no se incluyeron en el anlisis del curso clnico. De los restantes 47 pacientes, 27 (57%) tuvieron recidiva tumoral (recidiva local, regional o metstasis a distancia) durante el seguimiento. El seguimiento medio fue de 24,5 meses para la poblacin total, de 41,5 meses para los pacientes vivos, y de 15 meses para los pacientes muertos por el tumor. La frecuencia de recidivas tumorales no fue significativamente mayor en los casos con LOH del
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Tabla 1: Caractersticas clnico-patolgicas de la poblacin a estudio y la asociacin de la prdida de heterocigosidad (LOH) del P53 y la amplificacin del CCND1 con estos parmetros
Caracterstica Total LOH de P* Amplificacin de P* P53 (%) CCND1 (%) Edad media 58,7a 59,1a 0,89 57,9a 0,91 Localizacin Orofaringe 12 8 (67) 0,91 3 (25) 0,34 Supraglotis 14 10 (71) 6 (43) Glotis 10 7 (70) 1 (10) Hipofarnge 20 14 (70) 7 (35) Estadio T T1-T2 14 10 (71) 0,91 3 (21) 0,02 T3 18 12 (67) 2 (11) T4 24 17 (71) 12 (50) Estadio N N0 16 12 (75) 0,11 1 (6) 0,01 N+ 40 27 (68) 16 (40) N1 13 11 (85) 4 (31) N2 17 12 (71) 7 (41) N3 10 4 (40) 5 (50) Grado histolgico Bien diferenciado 26 21 (81) 0,083 6 (23) 0,53 Moderadamente diferenciado 27 17 (63) 10 (37) Pobremente diferenciado 3 1 (33) 1 (33) Estadio de la enfermedad I-II 7 7 (100) 0,25 0 0,12 III 15 11 (73) 4 (27) IV 34 21 (61) 13 (38) * Test de Chi-cuadrado. Test de t de student

P53 que en los casos sin ella (Tabla 4). Por el contrario la amplificacin de la ciclina D1 (CCND1) s se asoci con una mayor frecuencia de recidivas tumorales (Tabla 4), aunque las diferencias no fueron significativas, probablemente por el pequeo nmero de casos con amplificacin. Los casos con ambas alteraciones mostraron la mayor frecuencia de recidivas tumorales, aunque las diferencias tampoco fueron significativas, probablemente tambin por un insuficiente nmero de casos (Tabla 4). El valor pronstico de estas alteraciones genticas parece menor que el de los parmetros clnico-patolgicos clsicos, como el estadio N (agrupando N0-N1 frente a N2-N3), el estadio de la enfermedad (agrupando los estadios I-III frente al estadio IV) y la localizacin tumoral (agrupando los casos de faringe frente a los de laringe) (Tabla 4). De forma similar, no se apreci una asociacin

entre la LOH del P53 y la supervivencia especfica de la enfermedad (log-rank P=0,25; Figura 2). Los casos con amplificacin de la ciclina D1 s mostraron una menor supervivencia que los casos sin amplificacin, siendo las diferencias significativas (log-rank P=0,002; Figura 2). La supervivencia de los casos con ambas alteraciones fue inferior a la de los casos con ninguna o con una sola de las alteraciones, siendo los casos con LOH de P53 aislada los que tenan la mayor supervivencia (log-rank P=0,006; Figura 2).
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Tabla 3: Caractersticas clnico-patolgicas de los casos con ninguna, una y dos anomalas genticas (P53 y/o CCND1)
Caracterstica Ninguna CCND1 CCND1 Las dos P* anomala (%) normal/P53 anormal/P53 anomalas (%) anormal (%) normal (%) Estadio T T1-T3 8 (73) 19 (68) 2 (33) 3 (27) 0,05 T4 3 (27) 9 (32) 4 (67) 8 (73) Estadio N N0 (36) 4 (36) 11 (39) 0 1 (9) 0,09 N1-N3 7 (64) 17 (61) 6 (100) 10 (91) Grado histolgico Bien diferenciado 4 (36) 16 (57) 1 (17) 5 (45) 0,27 Mod. y pobre diferenciado 7 (64) 12 (43) 5 (83) 6 (55) * Test de Chi-cuadrado. Mod: moderadamente. Pobre: pobremente. P53 normal LOH de P53 Total CCND1 Normal (%) 11 (65) 28 (72) 39 CCND1 Amplificado (%) 6 (35) 11 (28) 17 Total 17 39 56

Tabla 2: Prdida de heterocigosidad (LOH) del P53 y amplificacin del CCND1 en los pacientes estudiados
Figura 1. (A) Electroforesis en gel de agarosa de los productos de la PCR diferencial de dos casos con amplificacin del gen CCND1; N indica el control con tejido normal , C+ el control positivo, y TH la tirosina-hidroxilasa. (B) Autorradiografa de un caso con prdida de heterocigosidad del gen P53 con el marcador VTR; se aprecia (flecha) una disminucin de la intensidad de la banda correspondiente a uno de los alelos en el tumor (T) comparado con la sangre (S).

DISCUSIN
En el presente estudio hallamos una frecuencia de inactivacin del gen P53 (estimada mediante la determinacin de la prdida de uno de los alelos del gen) y de amplificacin del gen CCND1 concordantes con los estudios previos. As, se ha descrito que aproximadamente el 50% de los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello presentan prdida allica del P538-12, y un tercio tienen amplificacin del gen CCND15,6,12-14.

Pocos estudios han analizado simultneamente ambas alteraciones, siendo los resultados contradictorios. Mineta y cols.15 hallan una asociacin significativa entre la inactivacin del gen P53 y la amplificacin del gen CCND1, sugiriendo que la primera precedera a la segunda, de forma que la amplificacin del CCND1 sera favorecida por la inestabilidad gentica provocada por la inactivacin del P53. Sin embargo, otros autores, de acuerdo con nuestros resultados, no encuentran ninguna relacin entre ambas alteraciones, lo cual sugiere que las dos son igualmente importantes en la carcinognesis de cabeza y cuello, y suficientes para alterar el control del ciclo celular12,16. La falta de correlacin que hallamos en este estudio entre la inactivacin del P53 y los parmetros clnico-patolgicos analizados (estadio T, estadio N, grado histolgico, localizacin) es comn en los estudios previos9,10,12, y concordante con la hiptesis de que la inactivacin del P53 es un evento precoz en la carcinognesis de cabeza y cuello1. La asociacin entre la amplificacin del
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Parmetro Nmero de Recidiva P* pacientes P53 Anormal 32 17 (53) 0,57 Normal 15 10 (67) CCND1 Amplificado 16 12 (75) 0,15 No amplificado 31 15 (48) Anomalas de P53/CCND1 Ninguna anomala 9 6 (67) 0,09 P53 anormal solo 22 8 (36) CCND1 anormal solo 6 4 (67) Ambas anomalas 10 8 (80) Estadio T T1-T3 28 14 (46,5) 0,12 T4 19 14 (74) Estadio N N0-N1 22 7 (32) 0,002 N2-N3 25 20 (80) Estadio global I-III 18 5 (28) 0,003 IV 29 22 (76) Localizacin Faringe 24 18 (75)

Laringe 23 9 (39) 0,028 * Test de Chi-cuadrado

Tabla 4: Evolucin de los pacientes segn diferentes parmetros clnico-patolgicos y las anomalas en P53 y CCND1
Figura 2. Curvas de supervivencia obtenidas segn el mtodo de Kaplan-Meier de: (A) los pacientes con y sin prdida de heterocigosidad del gen P53, (B) los pacientes con y sin amplificacin del gen CCND1, y (C) los pacientes con ninguna, una de las dos, o las dos anomalas.

CCND1 y los tumores en estadios locales avanzados y con metstasis ganglionares tambin es concordante con los estudios previos14,17. Esto sugiere que la amplificacin de este gen es una alteracin ms tarda que la inactivacin del P53. En cuanto al valor pronstico de estas alteraciones, nuestros resultados nuevamente confirman lo previamente descrito. Ninguno de los estudios que han analizado las prdidas allicas del gen P53 han hallado una significacin pronstica a esta alteracin9,10,12. Por el contrario, muchos de los estudios que han analizado la amplificacin de la ciclina D1 han hallado una asociacin con tumores ms agresivos y con una menor supervivencia5,12,18. El hecho de que la combinacin de ambas alteraciones tenga mayor poder predictivo que cada una de ellas aisladamente es tambin concordante con otro estudio similar al nuestro12, y con varios trabajos previos que muestran que la acumulacin de varias alteraciones genticas tiene un significado pronstico negativo10,11,19. No es sorprendente que la combinacin de varias alteraciones genticas tenga mayor valor pronstico que cada una de ellas aisladamente (incluso, como en nuestro estudio, en el caso de que alguna de ellas no tenga valor pronstico por s misma). La carcinognesis es un proceso complejo, con mltiples alteraciones genticas e interacciones entre productos de diferentes genes. Por tanto, si queremos incrementar nuestra precisin pronstica para cada individuo con cncer probablemente deberemos analizar el patron de alteraciones genticas de cada tumor ms que una alteracin concreta. Lgicamente, previamente deberemos profundizar en nuestro conocimiento sobre las alteraciones genticas existentes, su secuencia en la progresin tumoral, y

las interacciones entre las diferentes alteraciones. En conclusin, nuestros resultados sugieren que el anlisis combinado de los genes P53 y CCND1 puede tener un valor predictivo y ayudar a identificar a los pacientes con mayor riesgo de recidivas (los cuales tal vez podran beneficiarse de un tratamiento ms agresivo). Para que estos marcadores puedan aplicarse en la clnica deben confirmarse en estudios ms amplios, incluyendo mayor nmero de pacientes en estadios iniciales de la enfermedad.

AGRADECIMIENTOS
Los autores quieren agradecer al Dr. Enrique F. Bustillo su ayuda en el anlisis estadstico. Trabajo financiado por el FIS (ayudas a la investigacin 97/1092 y 97/1062). Las Dras. M.V. Gonzlez Meana y J. Garca Pedrero estn financiadas por una ayuda al Instituto Universitario de Oncologa de la Obra Social de CajAstur.