Tema 2.

- Microorganismos de importancia industrial

Caractersticas biolgicas: Procariotas, Eucariotas, Caractersticas (deseables) de los microorganismos industriales. Mtodos de aislamiento y seleccin de nuevas cepas de inters industrial. Conservacin de cultivos y mantenimiento de propiedades. Colecciones de microorganismos. Fisiologa de Microorganismos industriales: Procesos metablicos generales: Catabolismo, Anabolismo, Respiracin, Fermentaciones. Regulacin. Crecimiento de microorganismos industriales: Cintica de crecimiento, cultivo discontinuo, cultivo continuo, valoracin del crecimiento, efecto de las condiciones ambientales, control (inhibicin) del crecimiento microbiano. Medios de cultivo.

Lecturas recomendadas:
Waites et al.2001: Chapters 1, 2, 3; pp 7-71. Madigan et al, 2003: Captulos 1 a 6; pp. 21 a 166

Caracter sticas biol gicas

Qu son los microorganismos?. Son seres vivos de estructura habitualmente celular y de tamao individual inapreciable a simple vista. Como seres vivos de naturaleza celular, los elementos vitales estn rodeados de una membrana lipdica, la membrana plasmtica, que sirve al mismo tiempo de elemento delimitador y de superficie de contacto con el medio exterior. Debido al pequeo tamao, la superficie de contacto con el medio es muy grande en relacin al volumen, con lo que la posibilidad de mantener intercambios activos con el medio circundante es muy elevada. Esto permite a los microorganismos mantener tasas metablicas muy elevadas, con toma de nutrientes del medio y liberacin de productos muy rpidas. Y esto es de gran importancia en los procesos industriales, en los que los nutrientes deben ser asimilados rpidamente para lograr un crecimiento rpido. Hay que considerar que existen millones de microorganismos, de los cuales solamente se conocen unos pocos y con detalle fisiolgico todava menos, aquellos que han podido cultivarse en el laboratorio y analizarse detalladamente. La tecnologa microbiolgica bsica de aislamiento y manipulacin de cultivos puros sigue siendo imprescindible. Segn las ideas taxonmicas actuales, que emplean caractersticas moleculares para ordenar a los seres vivos, los microorganismos, entre ellos los de uso industrial, se incluyen en los tres Dominios Bacteria, Archaea y Eukarya. Los dos primeros abarcan organismos de estructura celular de tipo procaritico y el tercero a los de estructura celular de tipo eucaritico. Para nombrarlos adecuadamente se emplea la nomenclatura binomial propuesta por Linneo para todos los seres vivos. Los virus, parsitos intracelulares obligados y sin estructura celular por s mismos, no se incluyen en la estructura taxonmica de los organismos celulares. No obstante, algunos virus son tambin empleados en la industria, siempre dependiendo de organismos celulares que les sirven de soporte vital. Procariotas Los procariotas son organismos normalmente menores de 5 m de dimetro, sus estructuras internas no estn contenidas en orgnulos membranosos, por lo que aparentan tener una cierta desorganizacin interior (slo aparente), donde a veces se encuentran grnulos de materiales orgnicos o inorgnicos. Poseen en general una molcula de DNA circular que contiene la informacin gentica, y no est contenida en un ncleo membranoso (de ah el nombre de procariotas) en lo que constituye el nucleoide. Los ribosomas son del tipo 70S. La mayora de los procariotas poseen una pared celular, externa a la membrana plasmtica, en la que se encuentra en mayor o menor medida un polisacrido, el peptidoglicano, que da resistencia a la pared. La pared sirve de soporte mecnico a la clula y al mismo tiempo sirve de protecin contra agentes externos y de soporte a elementos externos, como los flagelos (estructuras motrices), los pelos (que sirven para establecer contactos con otras clulas propias o ajenas) y las cpsulas (envolturas polisacardicas viscosas que proporcionan proteccin y capacidad adhesiva).

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La pared es una estructura fundamental que permite distinguir a dos grupos de procariotas importantes, los Gram negativos y los Gram positivos, definidos as por su comportamiento frente a la tincin de Gram. La pared Gram(-) tiene una fina capa de peptidoglicano con amplio espacio periplsmico y una membrana lipopolisacardica externa. La pared Gram(+) posee una gruesa capa de peptidoglicano, con un espacio periplsmico reducido y carece de membrana externa. Esta diferente organizacin de la pared celular es slo la ms aparente de las diferencias entre los Gram(-) y los Gram(+), pues existen otras diferencias (metablicas, de comportamiento, etc.) que no resultan tan inmediatamente aparentes entre estos dos grandes grupos de procariotas. En general, la mayora de los procariotas se dividen por fisin binaria, que da origen a dos clulas aparentemente iguales. La caracterstica ms definitoria de los procariotas es la carencia de ncleo verdadero, ya que otros aspectos pueden ser ms variables (incluso la estructura de la pared celular). As, en los procariotas se distinguen dos grandes grupos: las arqueas y las eubacterias. Las Arqueas (Archaea) son un grupo taxonmico reciente, que contiene procariotas habituales de ambientes extremos: alta presin (profundidades marinas), alta temperatura (zonas volcnicas profundas) o elevada salinidad (salinas naturales o artificiales). Presentan modificaciones estructurales y fisiolgicas que les permiten adaptarse a esas condiciones, y son actualmente un grupo muy interesante para la obtencin de nuevos productos industriales, fundamentalmente enzimas activas a elevadas temperaturas y presiones. Dentro de este grupo se distinguen a su vez otros subgrupos: Las Euryarchaeota (metangenas como Methanobacterium y Methanosarcina y halfilas extremas como Halobacterium y Halococcus). Las Crenarchaeota (barfilas y termfilas como Pyrodictium, Pyrolobus, Sulfolobus o Thermoproteus). Las Korarchaeota (un grupo virtual de arqueas termfilas que todava no se han conseguido cultivar en el laboratorio). Las Eubacterias (Eubacteria), se ajustan ms a las caracteristicas descritas anteriormente, y son tambin un grupo muy diverso, que contiene muchas de las especies de uso habitual en la industria. Los grupos principales de eubacterias son: Las Proteobacteria, que incluyen a las Gram(-) con varias subdivisiones y gran nmero de especies, muchas de las empleadas en la industria como Escherichia coli, Pseudomonas, etc. Las Eubacteria Gram(+) donde se incluyen dos grupos, de bajo G+C en su DNA (Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus) y de alto G+C en su DNA (Streptomyces, Corynebacterium, Mycobacterium). Y otros subgrupos con menos importancia industrial. En general se emplea incorrectamente el trmino bacteria para designar de forma general a todos los procariotas. Eucariotas Los Eucariotas, con ncleo celular verdadero que contiene el material gentico, incluyen a organismos unicelulares mviles (protozoos), plantas, animales y hongos. De ellos, los hongos se consideran microorganismos, muchos de ellos usados industrialmente. Los eucariotas poseen el material gentico encerrado en una estructura membranosa especial que es el ncleo. Son clulas de mayor tamao que las procariticas y pueden formar tejidos, en los que las clulas individuales se especializan y dependen fisiolgicamente unas de otras. Las clulas eucariticas possen orgnulos celulares delimitados por sus respectivas membranas: mitocondrias, lisosomas, aparato de Golgi y retculo endoplsmico. Los fotosintticos poseen cloroplastos. Los ribosomas son del tipo 80S. En ciertos casos (plantas y hongos) poseen tambin pared celular externa a la membrana plasmtica, aunque muy diferente de la de procariotas. En el caso de los hongos la pared celular resulta de gran importancia como estructura diferencial con respecto a las clulas sobre las que pueden actuar como patgenos. Dos grupos de hongos son especialmente importantes en la industria: Las levaduras, hongos unicelulares, que se reproducen por gemacin o fisin binaria. Probablemente la ms importante es Saccharomyces cerevisiae, empleada en la producin de bebidas alcohlicas, pan y derivados, protenas de inters clnico, enzimas industriales o empleada como alimento directo o para la produccin de medios de cultivo. Importantes son tambin Candida utilis, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis, etc. Los hongos filamentosos, forman estructuras fibrilares, las hifas, en las que las nuevas clulas formadas permanecen unidas entre s. Habituales en el suelo y el agua, participan en la descomposicin de materia orgnica. En la industria se emplean para la produccin de antibiticos, alcaloides, enzimas hidrolticas, o se producen en gran cantidad para su consumo directo (setas comestibles). Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Mucor, etc.

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Caractersticas (deseables) de los microorganismos industriales 1. Pequeo tamao de la clula microbiana y elevada relacin de superficie/volumen, con rpido uso de nutrientes para la produccin de estructura celular. El crecimiento es as muy rpido (20 minutos por divisin en Escherichia coli). 2. Diversidad fisiolgica. Prcticamente cualquier sustancia qumica, natural o artificial, puede ser asimilada o modificada por algn microorganismo. Casi cualquier ambiente natural puede poseer vida microbiana. Medios de cultivo baratos, poco refinados, pueden soportar buenos crecimientos de los microorganismos industriales. 3. Persistencia en condiciones desfavorables: Muchos microorganismos producen formas de resistencia inactivas en condiciones desfavorables pero capaces de regenerar el microorganismo original cuando las condiciones vuelven a ser favorables. Es deseable que los microorganismos industriales puedan ser estables genticamente para que mantengan sus propiedades y no degeneren con el cultivo. 4. Posibilidad de alterar sus programas metablicos mediante mutacin o manipulacin gentica. 5. Produccin de sustancias de inters. Cuando los microorganismos producen sustancias que han de ser consumidas por el hombre, los animales o las plantas cultivadas el microorganismo productor debe obtener la calificacin GRAS (Generally Regarded As Safe). 6. Facilidad de manejo en el laboratorio y la industria. Es deseable que los microorganismos industriales permitan desarrollar etapas de tratamiento downstream lo ms sencillas posibles: que sedimenten con rapidez (ms los hongos que los procariotas) que no produzcan sustancias viscosas que dificultan la filtrabilidad, etc.

Mtodos de aislamiento y seleccin de nuevas cepas de inters industrial.

La bsqueda de nuevas cepas de microorganismos de inters es un proceso continuo, por una parte para mejorar las caractersticas y rendimientos de procesos ya establecidos y por otra para cubrir nuevas necesidades que vayan apareciendo. El caso tpico es la produccin de antibiticos: tras la primera oleada de produccin de penicilinas en los aos 40-50 del siglo XX comenzaron a detectarse microorganismos resistentes a ellas y hubo que obtener penicilinas nuevas que fuesen efectivas y al mismo tiempo se comenzaron grandes programas para obtener nuevas molculas con capacidad antibitica, con estructura y actividad completamente nuevas. As se descubrieron las estreptomicinas y otras muchas molculas posteriormente, y gran cantidad de microorganismos productores. Actualmente la gran cantidad biolgica acumulada en la literatura cientfica y en los proyectos de secuenciacin de genomas microbianos permite llevar a cabo bsquedas informatizadas de genes de inters, cuyos productos pueden ser analizados de forma virtual mediante modelado en el ordenador antes de ser probado de forma real en el laboratorio. Es lo que se conoce como minera de datos (data mining). Por otro lado, las cepas obtenidas pueden luego ser mejoradas en el laboratorio mediante complejos procedimientos, con el resultado final de cepas superproductoras muy valiosas. Las cepas son normalmente patentadas y mantenidas fuera del alcance de competidores. Incluso los procedimientos empleados para obtener esas nuevas cepas o molculas se mantienen en secreto si han sido realmente productivos. Aislamiento Para obtener nuevos microorganismos de inters industrial (screening, bsqueda o escrutinio) se suele proceder de dos formas fundamentales: al azar y de manera objetiva: 1. Bsqueda al azar (shotgun screening): A partir de muestras tomadas en ambientes naturales o artificiales se intenta aislar el mayor nmero de microorganismos posible, con lo que se obtiene diversidad, para luego someter a cada uno de los microorganismos aislados a pruebas concretas de produccin de sustancias determinadas. Es un procedimiento lento, pero que, al obtener microorganismos muy diferentes fisiolgicamente, permite establecer grandes libreras de cultivos que pueden luego ser sometidos a diversos procedimientos de escrutinio orientado. La librera se establece en forma de clulas del microrganismo y tambin en forma de caldos de cultivo de esos microorganismos en diferentes medios de crecimiento. Se debe procurar que cada elemento de la librera est identificado y analizado lo mejor posible desde el punto de vista biolgico para evitar guardar varias veces el mismo microorganismo, perdiendo por tanto la diversidad. 2. Bsqueda objetiva (objective screening): Se establece desde el principio un criterio de seleccin estricto, de manera que slo se conservan los microrganismos que son capaces de superar esa prueba concreta, por ejemplo, la produccin de molculas inhibidoras del crecimiento de un agente patgeno concreto. Los microorganismos que no pasan la prueba no son detectados o son ignorados. Esta aproximacin puede ser ms rpida en cada caso concreto, pero debe repetirse para cada nueva necesidad o criterio que se considere.

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En la prctica, ambos tipos de bsquedas se suelen combinar, de manera que microrganismos que no superan un determinado escrutinio en una bsqueda objetiva son, no obstante, archivados en una librera de cultivos para posteriores anlisis con criterios diferentes. La bsqueda al azar puede denominarse como escrutinio primario y la bsqueda objetiva como escrutinio secundario. La toma de muestras para obtener nuevas cepas puede llevarse a cabo en ambientes muy variados, ya que los microrganismos pueden estar presentes en casi cualquier sitio. De nuevo es importante evitar el reaislamiento continuo de un mismo microorganismo, es decir, mantener la diversidad de la coleccin. El suelo procedente de muy diversas zonas geogrficas es siempre una buena fuente de diversidad microbiana. Los fondos marinos, las grandes altitudes, las zonas muy contaminadas, las aguas termales, etc, son tambin una buena fuente de nuevas especies. En casos en los que se buscan microorganismos capaces de degradar determinadas molculas contaminantes se toman muestras de esas zonas con la esperanza de encontrarlos all. Tambin es posible aislar nuevas cepas partiendo de procsos ya establecidos en los que se generan mutantes espontneos o donde existe una diversidad natural que no ha sido caracterizada suficientemente. La tecnologa necesaria para obtener estas cepas es muy variada, pero casi siempre derivada de la tcnica microbiolgica bsica: aislamiento en cultivo puro, crecimiento en medios selectivos o no selectivos, cultivos de enriquecimiento, etc. La gran variedad de procesos industriales en los que se emplean microorganismos hace que existan multitud de mtodos especficos de aislamiento para cada aplicacin. Cuando se describan procesos concretos se aludir a los mtodos de screening empleados para obtener los microorganismos correspondientes.

Conservacin de cultivos y mantenimiento de propiedades

Los microorganismos utilizados en procesos indutriales o los aislados en procesos de screening deben conservarse de manera adecuada para que permanezcan siempre disponibles para ser utilizados. En general se trata de reducir el metabolismo de esos microrganismos al mnimo, incluso pararlo completamente, sin producir la muerte del microorganismo (al menos de una parte representativa de la poblacin). Los cultivos deben mantenerse puros, viables, estables genticamente y accesibles de forma lo ms sencilla posible. Para uso inmediato o en cortos periodos de tiempo, se suele emplear el cultivo en serie o resiembra peridica. En este caso no suelen mantenerse durante tiempos mayores de una o dos semanas, dependiendo de los casos. Mantener los cultivos o resiembras a baja temperatura (0-4C) tambin permite una accesibilidad inmediata durante un corto periodo de tiempo, variable segn los casos. Cultivos que se han mantenido en resiembra peridica o a baja temperatura durante mucho tiempo suelen degenerar progresivamente, por lo que es conveniente buscar alternativas de conservacin a largo plazo. Existen diversas opciones, no todas adecuadas para cada microorganismo concreto. Se citan algunos a continuacin: Para la conservacin durante largos periodos de tiempo (hasta aos) otros procedimientos resultan ms adecuados: 1. Inmersin en aceite mineral: Los cultivos de hongos filamentosos no esporulantes pueden conservarse cubiertos con aceite mineral estril. Esto reduce la evaporacin del agua del organismo, y detiene el metabolismo al reducir el intercambio de gases. Los cultivos cubiertos con aceite mineral se mantienen a unos 10 C durante meses, incluso aos. 2. Liofilizacin: El mtodo ms habitual para la conservacin a largo plazo (aos). Los cultivos en crecimiento activo se mezclan con leche descremada estril (15-20%) o sacarosa estril (12%), se introducen en ampollas de vidro adecuadas y se congelan rpidamente. Los viales as formados se conectan a una fuente de vaco, lo que produce la sublimacin del agua. Posteriormente, y sin romper el vaco, las ampollas se sellan a la llama. Pueden mantenerse a temperatura ambiente. 3. Congelacin: Mtodo muy sencillo y empleado en los laboratorios de Microbiologa. Diferente eficacia en cuanto a viabilidad dependiendo de la temperatura empleada. En general conviene mezclar los cultivos con glicerol a concentraciones finales de 12-25%. El glicerol impide la formacin de cristales de hielo en el agua celular, que romperan las estructuras internas. A 20/-30 C suelen plantearse grandes problemas de viabilidad al producirse una enorme heterogeneidad de temperatura en la muestra. A 70 C, en ultracongeladores especiales, la conservacin en presencia de glicerol es muy apropiada para bacterias, levaduras y cualquier tipo de esporas (de hongos o de bacterias). El acceso al cultivo conservado es fcil e inmediato. A 193 C en nitrgeno lquido, la conservacin es excelente en la mayora de los casos, para virus, bacterias, hongos, clulas vegetales y animales, etc. El mantenimiento del nitrgeno lquido puede ser complicado por su continua evaporacin y el acceso puede ser al menos incmodo. 4. Desecacin: Ciertas formas celulares como esporas de actinomicetos y hongos pueden conservarse a largo plazo desecadas junto a silica, perlas de vidrio o incluso en presencia de suelo. No todos los procedimientos son adecuados para todos los casos y la viabilidad debe ser comprobada antes de decidir el mtodo adecuado.

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