INTRODUCCIN A LA HPLC INTRODUCCI

FUNDAMENTOS DEL ANALISIS CROMATOGRAFICO. Cromatografa Lquida de Alta Resolucin

Dr. JOS ANTONIO FERNNDEZ LPEZ Depto. Ingeniera Qumica Grupo de Investigacin QUIMYTEC UPCT

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Cromatografa = escribir en colores Elementos que participan en una cromatografa
1. Fase estacionaria 2. Fase mvil 3. Muestra

Cmo interaccionan?
En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (eluir) a las molculas en la muestra.
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Inicialmente se refera a: High Pressure Liquid Chromatography En la actualidad hace referencia a: High Performance Liquid Chromatography

La alta presin permite usar relleno de tamao de partcula reducido para lograr la separacin de componentes a flujos razonables.

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HPLC = high performance liquid chromatography cromatografa lquida de alta resolucin

fase mvil (Lquido)

Otras acepciones equivalentes: high pressure liquid chromatography high patient liquid chromatography high priced liquid chromatography

bombas que permiten presiones de hasta 6000 psi (414 atm) hacen pasar la fase mvil por el interior de 4 columnas de acero (2-5 mm x 3-25 cm) que contienen la fase estacionaria con flujos de 0,1 10 ml/min.

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Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anlisis. Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por esta tcnica. El desarrollo instrumental es posterior al de la CG debido a dificultades para lograr un flujo estable en el eluyente.

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Una muestra en estado lquido es arrastrada por una corriente lquida llamada eluyente. Como fase estacionaria acta un slido finamente dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una pelcula lquida a l adherida. Dependiendo de la retencin de los componentes de la muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en el eluyente se provocar su migracin diferencial.

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Caractersticas:
Selectividad Reproducibilidad Sensibilidad Rapidez

Parmetros:
Naturaleza de la fase estacionaria Tamao de partcula Eluyente (composicin y flujo) Detector

Fase Directa:
fase estacionaria polar fase mvil de baja polaridad

Fase Reversa:
fase estacionaria de polaridad baja fase mvil de polaridad alta
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Principales mecanismos cromatografa lquida: Particin Intercambio inico

de

interaccin

en

Adsorcin superficial

Exclusin molecular

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CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

La fase estacionaria es slida. La separacin se logra por las diferencias en solubilidad (en fase mvil) y de retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos.

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CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
Slica (90%) y almina (10%) son las fases estacionarias ms comunes. Tanto las molculas de solutos como de disolvente son atradas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria. Unos solutos sern ms atrados que otros por la fase estacionaria y as se lograr su migracin diferencial. Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo 10 (acetona, cloruro de metilo, etc.).

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CROMATOGRAFA DE PARTICIN

La separacin se basa en el reparto o distribucin de los solutos entre una fase mvil lquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un slido inerte. La discriminacin se produce por diferencias de solubilidad.

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CROMATOGRAFA DE PARTICIN

El mecanismo de actuacin es similar al de un modelo de extraccin en contracorriente. Las especies ms retenidas sern las que presenten mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase mvil (eluyente). La separacin de los solutos se basa en las diferencias en esta solubilidad relativa.

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CROMATOGRAFA DE PARTICIN

Existen dos modos bsicos de operacin:

Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase mvil no polar. Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase mvil polar.

Inicialmente tuvo ms auge la actualidad son ms comunes grficos en fase reversa dada la las muestras de mayor inters alimentos).

fase normal pero en la los mtodos cromatonaturaleza hidroflica de (clnico, contaminacin,

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CROMATOGRAFA DE PARTICIN

Segn empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucin de bandas y el tiempo de anlisis.

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CROMATOGRAFA DE PARTICIN
Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografa de adsorcin y particin.
Tipo Slice Slice Slice Slice Nombre comercial Hypersil Lichrospher 100 Partisil Spherosil Tamao Area especfica partcula (m) (m2/g) 5-7 10 5, 10, 20 5, 10, 20 5 200 25 400 600 90
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Almina Spherisorb A5W

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CROMATOGRAFA DE PARTICIN Y ADSORCIN
Principales fases estacionarias en HPLC
Mecanismo Fase Directa Fase Directa Fase Directa Fase Reversa Fase Reversa Fase Reversa -R Slica -(CH2)3-CN -(CH2)n-NH2 -C18H37 -C8H17 -C6H5 Nombre comercial Nucleosil, Kromasil, Inertsil, Partisil, Nucleosil-CN, Micropak-CN, Nucleosil-NH2, Lichrosorb-NH2, Bondpak-NH2, Nucleosil-C18, Lichrosorb RP18, Spherisorb ODS2, Nucleosil-C8, Lichrosorb RP8, Bondpak-Phenyl
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CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Tanto fase estacionaria como fase mvil son de naturaleza inica. La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.

R A+ + R+ A +

B+ B

R B+ + R+ B +

A+ A
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CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

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CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Se emplea para el anlisis de todo tipo de iones (inorgnicos y orgnicos). Las molculas intercambiadoras se ligan a soportes especficos. El material intercambiador de la fase estacionaria es de dimetro de partcula pequeo (1-10 m) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 10-3 meq/g).
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CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Separacin de aniones inorgnicos por cromatografa de intercambio inico.

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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR
La separacin se basa en el tamao molecular. Como fase estacionaria se emplean sustancias de tamao de poro determinado. Tambin se denomina cromatografa de permeabilidad por gel (GPC).

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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacin entre los solutos segn su tamao. Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando con la fase mvil en el frente de la misma. Se muestra especialmente til para determinar el rango molecular de polmeros, protenas, etc.

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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR
Separacin de polmeros de poliestireno por GPC.

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EL EXPERIMENTO CROMATOGRFICO

Ilustracin de un experimento por HPLC.

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EL EXPERIMENTO CROMATOGRFICO

Parmetros de un cromatograma.

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MAGNITUDES CROMATOGRFICAS
MAGNITUD Tiempo de retencin de una sustancia no retenida Tiempo de retencin Tiempo de retencin reducido Retencin relativa Amplitud de bandas a media altura Relacin de capacidad Resolucin
seg.

SMBOLO

tM tR tR= tR tM = tR2/ tR1

W

seg.

seg.

-seg.

---

k= tR/tM
RS = 2 [(tR2- tR1) / (w2 + w1)]
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EQUIPO

Equipo bsico para HPLC.

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FASE MVIL
Alta pureza (calidad HPLC). Inactividad frente a la fase estacionaria. Baja viscosidad. Compatibles con la muestra. Facilitar la recuperacin de la muestra. Compatibilidad con el sistema de deteccin. Segn su composicin vare o no con el tiempo:
Elucin isocrtica Elucin en gradiente
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FASE MVIL
Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC. La desgasificacin reduce el riesgo de formacin de burbujas en la columna o en el detector. Posibilidades:
Desplazamiento con un gas menos soluble (He) Aplicacin de vaco Sonicacin Calentamiento

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BOMBAS

Presin estable hasta 5000 psi 1 atm = 14,696 psi (400 atm) Flujo libre de pulsaciones Amplio rango de flujos (0,1 a 10 mL/min) Control, exactitud y reproducibilidad del flujo Componentes qumicamente inertes y resistentes a la corrosin
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SISTEMAS DE INYECCIN
Se emplean vlvulas inyectoras de volumen (loop) constante Pueden ser manuales o automticas Para variar el volumen de inyeccin se debe cambiar el loop correspondiente Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de inyeccin

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PRECOLUMNAS
Se trata de una pequea columna (0,5 3 cm) colocada entre el inyector y la columna Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la muestra o del eluyente, en la columna analtica Va a permitir alargar la duracin de las columnas Debe ser del mismo relleno que el de la columna analtica

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COLUMNAS
Gran avance en la ltima dcada por el progreso en la tecnologa de rellenos y columnas Rellenos ms uniformes y de menor tamao Fases qumicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucin Mejora en los mtodos de empaquetado
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COLUMNAS
Al disminuir el tamao del relleno aumenta la eficiencia pero tambin la presin de trabajo Las columnas constan de:
Cuerpo normalmente de acero inoxidable Relleno material con i.d. definido

Algunas casas comerciales permiten la renovacin del relleno sin tener que comprar la columna completa Existen columnas de compresin radial, cuyo cuerpo puede ser presurizado para aumentar su eficiencia
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COLUMNAS
Fase Normal
Slica Almina Amino (-NH2) Ciano (-CN) Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)

Fase Reversa
C-2 o RP-2 C-8 o RP-8 C-18 o RP-18 (-SiCH2CH3) (-Si-(CH2)7-CH3) (Si-(CH2)17-CH3)
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COLUMNAS

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COLUMNAS
Influencia de la longitud de la columna y del tamao de partcula en la duracin del cromatograma

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COLUMNAS

Ventajas de la High Speed HPLC con columnas cortas

Tiempo de anlisis reducido Menor consumo de disolventes Menor dispersin de los solutos a analizar Ahorro de costes Mayor sensibilidad

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DETECTORES
Cualquier propiedad fsica o qumica que se pueda medir en la disolucin podra usarse como mtodo de deteccin Los detectores en HPLC no son destructivos Se pueden clasificar en:
Detectores que miden propiedad de la fase mvil Detectores que miden propiedad de los solutos una una
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Rapidez Reproducibilidad Sensibilidad Linealidad Estabilidad

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DETECTOR

Principales detectores empleados en HPLC:

UV/Vis Fotodiodos ndice de refraccin Fluorescencia Conductividad Dispersin de luz Espectrometra de masas
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DETECTOR
Comparacin de detectores usados en HPLC
Detector UV/VIS ndice de refraccin Dispersin de luz Fluoresecencia Conductividad Espectrometra de masas Lmite deteccin 0,1 1 ng 100 1000 ng 0,1 1 ng 0,001 0,01 ng 0,5 1 0,1 1 ng Permite Gradiente S No S S No S

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DETECTOR UV/VIS
Para sustancias que absorben radiacin UV/VIS El ms usado Con lmparas de deuterio, xenon o wolframio Desde 190 a 900 nm

Camino ptico de la microcelda de un detector UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cm de camino ptico y contienen 8 L de lquido

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DETECTOR UV/VIS
Longitudes de onda de corte en el UV de disolventes usados en HPLC
Disolvente Acetona Acetonitrilo Agua Cloroformo ter Dietlico n-Hexano Metanol Tetrahidrofurano Tolueno Longitud de onda 330 nm 190 nm 190 nm 245 nm 215 nm 195 nm 205 nm 212 nm 284 nm
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DETECTOR FOTODIODOS
Permite registrar la absorbancia simultnea en todo el rango UV/VIS. La muestra es atravesada por luz blanca (todas las ) y el policromador dispersa la luz en las diversas que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada diodo incide una diferente, que manda la informacin al sistema de anlisis de datos.

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DETECTOR FOTODIODOS
0,60

0,55 0,50

0,45

0,40

Posibilidades de un detector de fotodiodos.

250,00 30 0,00 350,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 Minutes 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

0,35

0,30 0,25 AU 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05

0,60

300,00 280,00

0,40

Cafena - 5,357

AU

0,20

0,00 1,00 2,00 3,00 M inutes 4,00 5,00

nm

260,00 240,00 220,00 1,00 2,00

6,00

7,00

3,00 4,00 M inutes

5,00

6,00

7,00

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DETECTOR DE NDICE DE REFRACCIN

Van a medir variaciones en el ndice de refraccin del eluato con respecto al del disolvente puro. Slo se pueden usar si la elucin es isocrtica. Responden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad. Son muy sensibles a las variaciones de temperatura. Deben estar termostatizados.

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DETECTOR DE FLUORESCENCIA

Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes. Se seleccionar la exc y la em. Son de alta sensibilidad. No se ven interferidos por los disolventes al no tener stos naturaleza fluorescente.

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DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta. Empleados fundamentalmente en cromatografa de intercambio inico. Inconvenientes:
Baja sensibilidad Sensibles a impurezas de la fase mvil.

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DETECTOR DE DISPERSIN DE LUZ
Vlido para aquellos solutos que sean claramente menos voltiles que la fase mvil. El eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partculas slidas que entran en la zona de deteccin. Las partculas se detectan por la luz que procede de un diodo lser y llega al fotodetector por dispersin. Slo tampones voltiles en la fase mvil.
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APLICACIONES

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