5.

Zasada:

KOLORYMETRIA

1. Wyznaczanie widma absorpcyjnego

Absorpcjometria wykorzystuje zdolno substancji chemicznych pozostajcych w roztworze do pochaniania wiata ca sw objtoci. Zwykle rne substancje pochaniaj promieniowanie wietlne o odmiennej dugoci fali. Jeli jednak pochaniaj fale tej samej dugoci, to z rn intensywnoci. Absorpcj wiata w zakresie widzialnym wykazuj zwizki nieorganiczne, przede wszystkim jony majce niecakowicie zapeniony orbital d osonity wyszymi orbitalami zapenionymi elektronami, zwizki kompleksowe wszystkich pierwiastkw przejciowych z niecakowicie zapenionym orbitalem d oraz barwne zwizki organiczne, np. wskaniki pH stosowane w alkacymetrycznej analizie miareczkowej. Absorpcj wiata w zakresie ultrafioletu wykazuj bezbarwne zwizki organiczne, zawierajce np. wizania podwjne. Wielkoci pozwalajc oceni spadek natenia wizki wiata po przejciu przez warstw roztworu substancji pochaniajcej wiato jest absorbancja (A), zwana te ekstynkcj lub gstoci optyczn. Jest ona rwna logarytmowi stosunku natenia promieniowania padajcego (Io) do natenia promieniowania przepuszczonego (I). Podstawowym prawem absorpcjometrii jest prawo Bouguera-Lamberta-Beera, zgodnie z ktrym absorbancja substancji pochaniajcej wiato jest wprost proporcjonalna do stenia i gruboci warstwy roztworu. A = cl gdzie: wspczynnik absorpcji, c stenie, l grubo warstwy roztworu. Krzywa, okrelajca zaleno absorpcji promieniowania od dugoci fali, stanowi widmo absorpcyjne. Widmo absorpcyjne danej substancji pozwala okreli dugoci fal promieniowania, ktre s przez ni absorbowane, oraz dugo

fali, przy ktrej absorbancja ma najwiksz warto (Amax). Nastpnie przy tej dugoci fali mierzy si zarwno absorbancj wzorcowych roztworw danej substancji o znanych steniach (sporzdzajc wykres kalibracyjny) jak rwnie absorbancj roztworu oznaczanego o nieznanym steniu. Wykonanie: Wykonujemy widmo absorpcyjne fenoloftaleiny w rodowisku zasadowym, w zakresie dugoci fal 400600 nm, mierzc absorbancj co 10 nm. Wczy spektrofotometr i nastawi pierwsz dugo fali. Do jednej kuwety wprowadzi roztwr fenoloftaleiny, a do drugiej jej rozpuszczalnik (etanol i 0,1 M NaOH w stosunku 1:40 prba lepa, czyli odczynnikowa). Obie kuwety wstawi do spektrofotometru i aparat wykalibrowa wobec prby lepej, ustawiajc najpierw na transmitancj, ktra powinna wynosi 100%, po czym przeczy na absorbancj, ktra powinna mie warto 0,00. Zmierzy absorbancj roztworu fenoloftaleiny przy danej dugoci fali, zapisa wynik, po czym nastawi dugo fali wiksz o 10 nm. Kadorazowo po zmianie dugoci fali nastawi zero absorbancji wobec prby lepej. Mierzy absorbancj, jak opisano wczeniej, a do dugoci fali 600 nm. Wykreli na papierze milimetrowym widmo absorpcyjne roztworu fenoloftaleiny i poda dugo fali, ktrej odpowiada maksimum absorpcji wiata.

2. Wyznaczanie wykresu kalibracyjnego i oznaczanie stenia zwizku barwnego

Zasada: Najwiksz zalet absorbancji jest jej wprost proporcjonalna zaleno od stenia. Wykres zalenoci absorbancji od stenia w dostatecznie szerokim zakresie ma ksztat krzywej logarytmicznej. Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stosuje si tylko do pocztkowego odcinka wykresu, ktry jest prostoliniowy i nazywa si wykresem kalibracyjnym. Mona z niego odczyta szukane stenie roztworu po zmierzeniu wartoci jego absorbancji. W wykresie kalibracyjnym mog zdarza si ujemne lub dodatnie odchylenia od prostoliniowej zalenoci. Odchylenia od prawa Lamberta-Beera mog by spowodowane zbyt wysokim steniem substancji, ktre powoduje, e jedne czsteczki s przesaniane przez inne, co daje efekt zmniejszonego pochaniania wiata. Innymi przyczynami odchyle od tego prawa mog by takie zjawiska, jak: dimeryzacja, dysocjacja lub asocjacja zwizkw chemicznych, ktre wpywaj na ich wasnoci optyczne.
2

Metod kolorymetryczn mona oznacza ilociowo substancje barwne, ktrych stenie w 1 ml roztworu jest rzdu kilkunastu nanomoli. Czuo metody pozwala okreli najnisze stenie roztworu wzorcowego, ktre naley przygotowa do sporzdzenia wykresu kalibracyjnego. Natomiast ustalenie zakresu ste (od najniszego do najwyszego) naley rozpocz od okrelenia stenia maksymalnego, tzn. najmniejszego stenia, ktre przy pomiarze absorbancji powoduje maksymalne wychylenie wskazwki galwanometru lub wywietlenie wartoci maksymalnej na wskaniku cyfrowym. W przypadku roztworu KMnO4, steniem, przyjmowanym jako maksymalne, jest 0,4 mol/ml lub nieznacznie wysze, ostateczna warto zaley od jakoci spektrofotometru i rodzaju substancji barwnej. Wykonanie: Przygotowa 11 ponumerowanych probwek (ostatni opisa jako prb lep). Z wodnego roztworu roboczego KMnO4 o steniu 0,4 mol/ml sporzdzi szereg roztworw wzorcowych o rnych steniach, postpujc zgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli 1. Spektrofotometr nastawi na dugo fali 530 nm. Do jednej kuwety wla prb lep, do drugiej roztwr KMnO4 o najniszym steniu. Aparat wykalibrowa wobec prby lepej, ustawiajc najpierw na transmitancj, ktra powinna wynosi 100%, po czym przeczy na absorbancj, ktra powinna mie warto 0,00. Odczyta absorbancj wszystkich roztworw wzorcowych KMnO4 oraz roztworu o nieznanym steniu. Wykreli na papierze milimetrowym krzyw kalibracyjn, z ktrej odczyta stenie oznaczanego roztworu na podstawie zmierzonej absorbancji.
Tabela 1. Przygotowanie ste wzorcowych roztworu KMnO4 w celu sporzdzenia wykresu kalibracyjnego Nr probwki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ilo roztworu roboczego [ml] 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Ilo wody destylowanej [ml] 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Stenie KMnO4 [mol/ml] 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 Absorbancja przy 530 nm

10 Prba lepa

2,0

2,0

0,40

3. Wyznaczanie wykresu kalibracyjnego i oznaczanie stenia zwizku bezbarwnego

Zasada: Kolorymetrycznie mona oznacza rwnie zwizki bezbarwne, lecz po przeprowadzeniu ich w barwne pochodne, na drodze stechiometrycznej reakcji chemicznej. Czuo tych metod jest rwna lub wiksza od czuoci oznaczania zwizkw barwnych. Postpowanie przy ustalaniu zakresu ste substancji bezbarwnej i przy sporzdzaniu wykresu kalibracyjnego jest podobne, jak w przypadku roztworw barwnych, poszerzone jednak o reakcj chemiczn z odczynnikiem wybarwiajcym, po ktrej dopiero mona mierzy absorbancj roztworu wobec prby lepej. Skad prby lepej rni si od jej skadu w metodach oznaczania substancji barwnych, poniewa poza rozpuszczalnikiem musi zawiera odczynnik wybarwiajcy. Metod t mona oznacza zarwno zwizki nieorganiczne, jak i organiczne. Przykadem zwizku nieorganicznego, ktry mona oznacza ilociowo metodami kolorymetrycznymi, s ortofosforany (PO43). Reaguj z odczynnikiem wybarwiajcym, ktrym jest molibdenian amonowy w rodowisku kwanym. Powstae fosfomolibdeniany w obecnoci zwizkw redukujcych (eikonogenu, czyli kwasu 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowego lub chlorku cyny (II) lub amidoli i hydrochinonu) przechodz w niebieskie poczenia zwane bkitem molibdenianowym (mieszanina niszych tlenkw molibdenu), ktrego absorbancj mona mierzy przy 660 nm. Bkit molibdenianowy jest podstaw kolorymetrycznego oznaczania nieorganicznych ortofosforanw w metodzie Fiske-Subbarowa. Przykadem bezbarwnych zwizkw organicznych, ktre mog by oznaczane ilociowo metodami kolorymetrycznymi s biaka. Istnieje wiele metod kolorymetrycznych sucych do ich ilociowego oznaczania, rnicych si czuoci i specyficznoci reakcji. Podstawow wrd nich jest metoda biuretowa, ktrej zasada sprowadza si do reakcji barwnej pomidzy atomami azotu wiza peptydowych a jonami miedzi w rodowisku zasadowym:
R1 CH N C O R3 HC C O N CH R2 C N HC R1 O Cu
2+

R2 CH N C CH R3 O

Reakcj t daj wszystkie zwizki, majce co najmniej dwa wizania peptydowe w tym rwnie biuret i std nazwa metody. rodowisko zasadowe, ktre jest konieczne dla reakcji wybarwiajcej, sprzyja wytrcaniu jonw miedzi w postaci wodorotlenku miedziowego. Aby tego unikn, do mieszaniny reakcyjnej wprowadza si winian sodowo-potasowy, ktry kompleksuje jony miedzi. Intensywno powstaego zabarwienia jest proporcjonalna do liczby wiza peptydowych w czsteczkach biakowych obecnych w analizowanym roztworze, a zatem do stenia biaka.
Tabela 2. Przygotowanie ste wzorcowych roztworu biaka w celu sporzdzenia wykresu kalibracyjnego do metody biuretowej Nr probwki 1 2 3 4 5 P. lepa Ilo roztworu wzorcowego [ml] 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Ilo soli fizjologicznej [ml] 0,8 0,6 0,4 0,2 1,0 Stenie biaka [mg/ml] 2 4 6 8 10 Absorbancja przy 540 nm

Wykonanie: Przygotowa 6 ponumerowanych probwek (ostatni opisa jako prba lepa). Z roboczego 1% roztworu wzorcowego biaka w soli fizjologicznej przygotowa szereg roztworw wzorcowych o rnych steniach, postpujc zgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli 2. Do wszystkich probwek doda po 4 ml odczynnika biuretowego. Do 1 ml prby o nieznanym steniu biaka wprowadzi 4 ml odczynnika biuretowego. Wszystkie prby wymiesza i pozostawi na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zmierzy absorbancj wobec prby lepej przy 540 nm. Sporzdzi krzyw kalibracyjn do metody biuretowej. Ze sporzdzonej krzywej kalibracyjnej odczyta stenie biaka w prbie o nieznanym steniu na podstawie jej wartoci absorbancji. ODCZYNNIKI 0,1% roztwr fenoloftaleiny w etanolu rozcieczony 40-krotnie 0,1 M NaOH, sporzdzi tu przed wyznaczaniem widma (ostateczne stenie 0,0025%); 0,1 M roztwr NaOH; etanol; 0,4 mol/ml wodny roztwr KMnO4; 1% roztwr
5

biaka w soli fizjologicznej; sl fizjologiczna (0,9% roztwr NaCl); odczynnik biuretowy: 1,5 g CuSO45H2O i 6 g winianu sodowo-potasowego (czterowodnego) rozpuci w 500 ml H2O destylowanej, po czym mieszajc doda 300 ml 10% roztworu NaOH wolnego od wglanw i uzupeni wod do 1000 ml, naley przechowywa w ciemnej butelce (jest trway przez kilka miesicy, dopki nie pojawi si osad).

NOTATKI