Biologa Celular y Gentica II Unidad de Biologa, Departamento Cs.

Bsicas y Comunitarias Facultad de Odontologa, Universidad de Chile

Amplificacin de DNA por PCR

Aplicacin en la determinacin del sexo

Integrantes:

Grupo: Docente: Ayudante:

Braulio Cataln G. Sheyla Cortes G. Mnica De La Fuente S. Camila Faras S. A2 Alejandro Escobar A. Anita Plaza F.

Introduccin:
Replicacini La replicacin del material gentico es un proceso bsico para la prevalencia de cualquier organismo multicelular. Es mediada por enzimas y complejos proteicos que permiten la apertura del DNA bicatenario y la formacin de una hebra complementaria para cada hebra parental, basndose en complementariedad de las bases nitrogenadas que lo conforman (Adenina- Timina y Guanina-Citocina), de manera semiconservativa. Dando como resultados dos DNA bicatenarios de igual informacin. Si se lleva a cabo este proceso repetidamente tendremos una replicacin de DNA exponencial (de una resultan 2 , de 2 resultan 4, de 4 resultan 8 y as sucesivamente)

Para que este proceso se lleve a cabo, son necesarias varias condiciones, dentro de las ms relevantes tenemos: 1) Existencia de una horquilla de replicacin donde las hebras del DNA sean separadas. 2) Presencia de dNTPs (desoxirribonucletidos) en el medio 3) Presencia de DNA Polimerasa (acta de 5 a 3) que una los dNTPs a la hebra molde de DNA parental. 4) Primasas: Enzimas que generan un primer (cebador o partidor) para que la DNA Polimerasa pueda comenzar la elongacin del DNA. 5) Presencia de enzimas helicasas que vayan abriendo la doble hebra de DNA por delante de la horquilla de replicacin A grandes rasgos, podramos relatar la replicacin de la siguiente manera: Para que la hebra de DNA pueda replicarse es necesario que sus hebras se separen, el lugar donde esto ocurre es conocido como origen de replicacin, donde se forma una horquilla de replicacin donde comenzara todo el proceso. 1

Luego es necesario que la enzima primasa genere un cebador en la hebra molde para que as la DNA Polimerasa pueda comenzar a actuar

Estando el primer en la hebra molde la DNA polimerasa puede comenzar la elongacin agregando los dNTPs complementarios de 5 a 3 a la hebra molde, formando de esta manera una nueva doble hlice. Este proceso ocurre en ambas hebras del DNA inicial aunque por ser antisentido, tienen mecanismos un poco distintos en los que no es necesario ahondar en esta oportunidad. Adems, mientras esto ocurre, la helicasa va separando la doble hebra de DNA para que la elongacin pueda continuar

PCRii El descubrimiento de los agentes y procesos asociados a replicacin han permitido que se puedan crear nuevos mtodos de experimentacin cientfica. Tal es el caso del PCR (Polymerase Chain Reaction Reaccin en cadena de Polimerasas) El PCR es una estrategia de replicacin in vitro que utiliza un mtodo similar a la replicacin natural para amplificar un segmento determinado de DNA a travs de ciclos de replicacin. Para llevarlo a cabo es necesario contar con: 1) 2) 3) 4) 5) 6) DNA molde dNTPs Primer sentido y antisentido especficos para el segmento de DNA de inters Enzima DNA Polimerasa termoestable Coactivador de la enzima polimerasa Buffer

Todos estos elementos son puestos juntos en un tubo y regulando las temperaturas es posible producir la replicacin en cuantos ciclos se desee. La primera parte del proceso es la denaturacin de DNA a travs de calor (lo que equivaldra a la horquilla de replicacin, en ambos casos el fin es separar la doble hebra de DNA). Luego es necesario bajar la temperatura para que el primer (especfico para la secuencia que deseamos amplificar) se una a la hebra molde sentido y antisentido(reemplaza la accin de la primasa). Se eleva nuevamente la temperatura hasta alcanzar la temperatura ptima para que trabaje la DNA Polimerasa logrando as la elongacin y replicacin de nuestro segmento de DNA de inters. Se utiliza regularmente una polimerasa termoestable para que no se denatura cada vez que subimos la temperatura al inicio del ciclo

Estos ciclos de aumento-disminucin-aumento de temperatura pueden ser realizados cuantas veces se desee, teniendo como resultado la replicacin de manera exponencial de nuestro segmento Los productos de la PCR comnmente son sometidos a electroforesis para ser analizados. La presencia de una banda en el gel de agarosa nos revela que la PCR a resultado de la manera esperada y se ha amplificado un solo segmento del DNA. Qu es el DNA? Es un largo polmero no ramificado helicoidal, es en s la molcula de la herencia. Compuesto por 4 tipos de subunidades, que son los desoxirribonucletidos que contienen las bases: Adenina(A), Timina (T), Citocina(C) y Guanina (G). Los nucletidos se unen por enlaces fosfodister entre el carbono 5 de una desoxirribosa y el 3 de la siguiente. Las bases son complementarias quedando as: A-T y C-G.

El DNA es una molcula de dos hebras complementarias antiparalelas de nucletidos entrelazadas por enlaces que terminan formando una doble hlice. La importancia de esta molcula radica en que la informacin gentica se encuentra en la secuencia lineal de estos nucletidos, adems la informacin se almacena de forma estable pues existen tipos de enzimas de reparacin que vigilan continuamente el DNA y reparan los nucletidos daados. Por otro lado el ADN del genoma de un organismo puede dividirse conceptualmente en dos: el que codifica las protenas (los genes) y el que no codifica. En muchas especies, slo una pequea fraccin del genoma codifica protenas. Por ejemplo, slo alrededor del 1,5% del genoma humano consiste en exones que codifican protenas (20.000 a 25.000 genes), mientras que ms del 90% consiste en ADN no codificante (intrones). En nuestro trabajo prctico donde llevamos a cabo la tcnica de la reaccin polimerasa en cadena (PCR) utilizamos una muestra de DNA genmico como unos de los constituyentes, la tcnica nos permiti poder establecer el sexo del individuo, adems se sabe que tambin esta tcnica se aplica en la medicina forense y en el diagnstico de enfermedades genticas o infecciones de origen viral. La electroforesis La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz de polmeros. La seleccin se realiza de acuerdo a la concentracin de ellos, si son muy concentrados generan un poro ms pequeo por donde pasaran molculas de un tamao menor.

Los polmeros utilizados para la electroforesis con agarosa son el RNA y el DNA y para la acrilamida son las protenas. En nuestro trabajo prctico realizamos la electroforesis con agarosa para el DNA, y el equipo consta de un contenedor para el buffer de corrida con los dos electrodos para la corriente elctrica, un molde para la formacin del gel y peines con varios grosores donde se depositaran las muestras. El ADN genmico que utilizamos es dirigido por una enzima de restriccin cuya funcin es fragmentar el DNA, la enzima reconoce secuencias especificas en el DNA y lo hidroliza, de esta manera abre la doble hlice y se generan bandas que se separan por electroforesis de acuerdo al tamao de dicho fragmento. Cada uno de ellos tiene una medida en particular y esta se establece calibrando un gel con un peso molecular. La migracin del marcador define la relacin entre la longitud del fragmento y la distancia en que este se mueve. Como el DNA tiene carga total negativa, en la electroforesis migrara hacia el polo positivo de la cmara. Luego se visualizaran las bandas que son los fragmentos de DNA que se pueden pasar a un soporte de papel, para posteriormente identificarlos por el mtodo de hibridacin con una sonda molecular. La migracin de un segmento de DNA en los geles de agarosa va a depender de: el tamao del fragmento, la concentracin de la agarosa, la conformacin del DNA y la corriente elctrica aplicada.

Materiales:
Buffer PCR 10X (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) dNTP 10mM (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Partidor Y1 10 pmol/uL (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Partidor Y2 10 pmol/uL(Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Partidor Alu1 10 pmol/uL (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Partidor Alu2 10 pmol/uL(Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) DNA muestra 50 ng/uL (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Taq polimerasa 50 ng/uL (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Agua estril (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Termociclador (Marca: Scientific) Tubo eppendorff de 0,5 ml (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Soporte de tubos eppendorff (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Agarosa (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Buffer TAE 1X (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) SYBER-SAFE (Laboratorio Facultad odontologa Universidad de Chile) Cmara de electroforesis horizontal (Marca: Scientific) Peineta para cmara de electroforesis (Marca: Scientific) Micropipetas: p10 (Marca: Sorenson) p100 (Marca: Sorenson) 5

 Guantes Mascarillas Delantal

p200 (Marca: Sorenson) Con respectivas puntas dependiendo de la micropipeta

Mtodos:
A) Preparacin del PCR: Se tienen todos los materiales e implementos necesarios, mencionados anteriormente. Se deben utilizar guantes y mascarilla en todo momento para no contaminar las muestras con otro DNA. Se debe trabajar con el mximo orden y cuidado por la fragilidad de este mtodo. 1) Rotular 5 tubos eppendorff de 0,5 ml y ordenarlos a conveniencia en un soporte. 2) Con las micropipetas agregar a cada tubo distintos componentes segn lo especificado a continuacin: Tubo 1: - Agua estril 26 uL - Buffer 10X 5 uL - dNTPs 1 uL - Partidor Y1 5 uL - Partidor Y2 5 uL - Partidor Alu1 0 uL - Partidor Alu2 0 uL - DNA 1 10 uL - Taq Polimerasa 1 uL Volumen total 53 uL Tubo 2: - Agua estril - Buffer 10X - dNTPs - Partidor Y1 - Partidor Y2 - Partidor Alu1 - Partidor Alu2 - DNA 1 - Taq Polimerasa Volumen total

26 uL 5 uL 1 uL 0 uL 0 uL 5 uL 5 uL 6 uL 1 uL 49 uL

Tubo 3: - Agua estril - Buffer 10X - dNTPs - Partidor Y1 - Partidor Y2 - Partidor Alu1 - Partidor Alu2 - DNA 1 - Taq Polimerasa Volumen total Tubo 4: - Agua estril - Buffer 10X - dNTPs - Partidor Y1 - Partidor Y2 - Partidor Alu1 - Partidor Alu2 - DNA 1 - Taq Polimerasa Volumen total Tubo 5: - Agua estril - Buffer 10X - dNTPs - Partidor Y1 - Partidor Y2 - Partidor Alu1 - Partidor Alu2 - DNA 1 - Taq Polimerasa Volumen total

26 uL 5 uL 1 uL 5 uL 5 uL 0 uL 0 uL 7 uL 1 uL 47 uL

26 uL 5 uL 1 uL 0 uL 0 uL 5 uL 5 uL 7 uL 1 uL 47 uL

33 uL 5 uL 1 uL 0 uL 0 uL 5 uL 5 uL 0 uL 1 uL 50 uL

Se llevaron todos los tubos al termociclador y se ejecut el siguiente programa:

Luego se prepar un gel de agarosa con el fin de realizar una electroforesis de los tubos anteriormente realizados La preparacin del gel de agarosa se realiz de la siguiente manera Se prepar una solucin de agarosa 1% p/v en buffer TAE 1X con SYBR-SAF Se hirvi la agarosa en microondas para alimentos, se entibi y prepar la cmara de electroforesis horizontal Se puso la peineta en el gel y dej gelificar Se retir la peineta y llen la cmara con buffer TAE 1X Se cargaron los bolsillos del gel, de izquierda a derecha, con 20 uL de: o Estndar peso molecular o Tubo 1 o Tubo 2 o Tubo 3 o Tubo 4 o Tubo 5

Luego al gel se le aplic una electroforesis para que migren los distintos segmentos de DNA generados en el PCR para ver si es hombre o mujer. El gel resultante fue sometido a una luz ultravioleta para ver los resultados obtenidos.

Resultados:
Luego de realizar la electroforesis se obtuvo la siguiente imagen: Tubo1- Tubo2- Tubo3- Tubo4- Tubo5 Marcador

Imagen 1

Discusin:
Esta foto esta sacada de otras muestras cargadas en el mismo gel que las nuestras. Gracias a esto podemos descartar cualquier problema con el gel y con la electroforesis, ya que en esta imagen se ve que si aparecieron distintas bandas en las primeras muestras cargadas.

Ahora bien los bolsillos pertenecientes a estas bandas fueron cargados con una mayor cantidad de muestra que todos los cargados posteriormente. Entonces no podemos descartar: 9

1. La cantidad de muestra cargada en el bolsillo fue insuficiente para generar bandas claras que migraran 2. La cantidad de muestra cargada en el bolsillo no era suficiente para ver la marca provocada por el syber safe, y esta puede ser una de las causas del porque no es tan usado, puede que el bromuro de etidio es ms sensible marcando pequeas cantidades, y por eso se usa a pesar de su peligrosidad. Tampoco podemos descartar problemas en la manipulacin al momento de generar las muestras, con esto aparecen nuevas hiptesis como son: 1. Por error de la Taq, que no amplific la secuencia de DNA por lo cual no existe DNA teido, recordando que la Taq es muy sensible y pudimos haberla manipulado de mala manera 2. Las concentraciones de reactivos utilizados en las soluciones no fueron los adecuados producindose errores en la replicacin Debido a la alta sensibilidad del experimento cualquier pequea variacin en los aspectos antes mencionados, puede provocar notorias alteraciones en los resultados. Los resultados esperados segn el margen terico deberan ser los siguientes:

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De los resultados podemos interpretar que la muestra 1 y 2 corresponden a un DNA femenino, ya que no presentan las bandas de 154 pb que representan el segmento producido por el partidor Y. Las muestras 3 y 4 corresponden a DNA masculino ya que si posee las bandas de 154 pb por lo cual el gen Y si est presente en esta muestra. La presencia en las 4 muestras de las bandas de 130 pb correspondientes al segmento producido por el partidor Alu, demuestra que las muestras si son de DNA humano, ya que esta secuencia es comn en nuestro genoma en ambos gneros. Adems demuestra que la tcnica de PCR se llev acabo de manera exitosa. Al no haber bandas visibles en el control negativo, podemos corroborar que las muestras no estn contaminadas con DNA forneo

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Preguntas:
1. En la mayora de los laboratorios se utiliza Bromuro de Etidio para visualizar los cidos nucleicos. Explique cul es el mecanismo por el cual el Bromuro de Etidio permite visualizar las bandas de DNA. Describa cual es la mayor desventaja del uso de este compuesto. El bromuro de etidio es un colorante que se intercala entre las bases del DNA y emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta. La mayor desventaja de este colorante es que es altamente mutagnico, por lo que presenta un alto riesgo para la persona que lo manipula. 2. Cul es el origen de la Taq Polimerasa y por qu se usa esta enzima? La Taq polimerasa proviene de una bacteria termfila, estas bacterias son capaces de vivir en un ambiente extremo de muy alta temperatura, por lo tanto se usa esta enzima para que no se desnaturalice al momento de llevar los tubos al termociclador, donde se trabaja a una temperatura muy elevada para lograr separar las hebras de DNA. 3. Qu otras matrices, adems de la agarosa, existen para resolver las bandas de DNA y cul es el criterio para decidir con cual ellas trabajar? Tambin se puede trabajar con geles de acrilamida, el criterio para elegir cul de los dos usar es el tamao de la muestra a estudiar la acrilamida es mucho ms concentrado creando redes ms pequeas dando solo paso las molculas ms chicas. La acrilamida da muchas ms garantas que la agarosa a hora de ver las bandas pero no es tan usada debido al alto costo que tiene y al difcil manejo

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Bibliografa:
Gua de Actividades Prcticas, Curso de Gentica Humana Universidad de Chile, Ao 2009.
Biologa celular de la clula, Alberts, Bray, Lewis, Raff. Roberts, Watson. 3 Edicin. Ediciones Omega, 2002 Genomas, Brown T. 3 Edicin. Editorial Mdica Panamericana, 2008.

Manual de tcnicas bsicas de biologa molecular, Jorge Zavala Castro, Ediciones de la universidad autnoma de Yucatn 2005.

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