Universidad Tcnica Federico Santa Mara Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

Laboratorio de Microbiologa Practico N 1

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y SIEMBRA DE MICROORGANISMOS Todas las formas de vida, desde los microorganismos a los seres humanos, comparten ciertos requerimientos nutricionales en lo que se refiere a las sustancias qumicas necesarias para su crecimiento y funcionamiento normal. Debemos tener presente que en la naturaleza existe una gran variedad de tipos de requerimientos nutricionales entre las bacterias. Los organismos toman de su ambiente los materiales necesarios para todas las reacciones metablicas, dichos elementos se denominan NUTRIENTES y son los que les permiten a los microorganismos sintetizar su material celular y generar energa. Los nutrientes se pueden clasificar en: 1.- Nutrientes indispensables: sin los que la clula no puede vivir 2. Nutrientes no indispensables: los cuales son utilizados si estn presentes, pero no son esenciales. 3.-Macronutrientes: cuando se requieren en gran cantidad. 4.-Micronutrientes: cuando se requieren en pequeas cantidades. Con frecuencia, son requeridos a tan pequea concentracin que es difcil determinar exactamente la cantidad requerida y otras veces pasa desapercibido el requerimiento de un determinado micronutriente por no ser detectable. 5.-Nutrientes con fines energticos: no son incorporados directamente en el material celular y al ser degradados liberan energa. 6.- Nutrientes con fines estructurales: con los que la clula sintetiza macromolculas y otras estructuras. En general las vas asimiladoras de nutrientes de los microorganismos, reflejan al ambiente natural en el cual viven. De acuerdo a la fuente de energa y a la fuente de carbono, los microorganismos pueden clasificarse: a) Quimiohetertrofo: aquellos que ocupan un compuesto orgnico tanto como fuente de energa, como de carbono. Tambin son llamados Organotrofos. b) Quimiolittrofos: aquellos que ocupan un compuesto inorgnico como fuente de energa y CO2 como fuente de carbono. Tambin son llamados littrofos. c) Fotohetertrofos: aquellos que ocupan luz como fuente de energa y compuestos orgnicos simples como fuente de carbono. d) Fotoauttrofos: aquellos que ocupan luz como fuente de energa y CO2 como fuente de carbono. Tambin son llamados auttrofos.

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Estas dos ltimas categoras son conocidas tambin como Fottrofos. Como puede verse, el conocimiento del hbitat de un organismo es una ayuda prctica para hacer un medio de cultivo especfico para un microorganismo recin aislado. Sin embargo, no debe pensarse que el medio de cultivo es un duplicado del ambiente natural, ya que su objetivo en el laboratorio es obtener, para el trabajo experimental, poblaciones de clulas generalmente muchos mayores que las que se encuentran en la naturaleza.

Ejemplos de organismos que emplean diferentes tipos de produccin de energa y fuentes de carbono: - Quimiohetrtrofos: animales, la mayora de las bacterias, hongos y protozoos. - Quimiolittrofos: bacterias del hidrgeno, bacterias sulfurosas incoloras, bacterias nitrificantes, bacterias frricas. pocas algas, la mayora de las bacterias prpuras y verdes, algunas Cianobacterias.

- Fotohetertrofos:

- Fotoauttrofos: plantas verdes, la mayora de las algas, Cianobacterias, algunas bacterias prpuras y verdes

Los organismos vivos requieren carbono en alguna forma, todos requieren al menos pequeas cantidades de CO 2 , pero la mayora requiere algunos compuestos orgnicos de carbono, tales como azcares y otros carbohidratos. Las plantas utilizan el CO 2 y lo convierten en carbohidratos mediante la fotosntesis. Muchas bacterias requieren tambin slo CO 2 como nica fuente de carbono. Hablando en trminos nutricionales, todos estos organismos son auttrofos. Otras bacterias son nutricionalmente semejantes a los animales, en el sentido de que no pueden utilizar el CO 2 como nica fuente de carbono y dependen de los auttrofos para la produccin de carbohidratos y otros compuestos orgnicos, que luego ellos utilizan como alimentos. Los microorganismos que requieren compuestos orgnicos como fuente de carbono son hetertrofos. Todos los organismos vivos requieren nitrgeno, en alguna forma. Las plantas utilizan el nitrgeno en forma de sales inorgnicas de nitrato de potasio, en tanto que los animales requieren compuestos orgnicos, de nitrgeno tales como las protenas y sus productos de degradacin, es decir pptidos y ciertos aminocidos. Las bacterias son extremadamente verstiles en este aspecto, algunos tipos utilizan nitrgeno atmosfrico, algunas utilizan compuestos inorgnicos de nitrgeno y otras requieren nitrgeno procedente de compuestos orgnicos nitrogenados. El requerimiento animal tpico de azufre se satisface como compuestos orgnicos de azufre mientras que el requerimiento tpico vegetal de azufre se satisface con compuestos inorgnicos de azufre. Algunas bacterias requieren compuestos orgnicos de azufre, algunas son capaces de utilizar azufre elemental. El fsforo lo proporcionan usualmente los fosfatos, por ejemplo sales de cido fosfrico. Los organismos vivos requieren varios elementos metlicos como sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, cobre y cobalto entre otros para su crecimiento normal. Las bacterias

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no son una excepcin. Las cantidades requeridas son usualmente simples vestigios y se miden en partes por milln. Las vitaminas son necesarias para los organismos vivos, la mayora de stas participan en la formacin de sustancias que activan a las enzimas. Los animales, incluidos los seres humanos, deben recibir estas sustancias en la dieta. Las bacterias muestran un patrn variable en este aspecto de la nutricin aunque todas las bacterias requieren vitaminas en sus procesos metablicos normales, algunas son capaces de sintetizar sus requerimientos totales de vitaminas a partir de otros compuestos del medio. Otras no crecern a menos que se les proporcione en el medio, una o ms vitaminas preformadas. Todos los organismos requieren agua para sus funciones metablicas y para su crecimiento. En el caso de las bacterias, todos los nutrientes deben estar en solucin para que puedan penetrar en el organismo. Los nutrientes que se utilizan dependen del tipo de bacteria. El siguiente cuadro presenta un resumen segn sus requerimientos especficos:

Fuentes de: Energa Carbono Nitrgeno

AUTTROFOS luz CO 2 , CO 3

HETERTROFOS Oxidacin, fermentacin glucosa, lactosa, c. pirvico, almidn, celulosa peptonas, extracto de levadura y carne

UTILIZACIN

Azufre Iones inorgnicos Sales

Sntesis de compuestos carbonados N 2 , NH3 , NO 2 , NO 3 Sntesis de compuestos nitrogenados: aminocidos, bases nitrogenadas, etc. SO 4 , S, H2 S aminocidos azufrados: Sntesis de otros aminocidos metionina, cistena y cistina azufrados y CoA iones disueltos: Fe+2 , iones disueltos: Kg+, Mg+, Cofactores enzimticos Fe+3 y Ca+2 Mn+, Na Sulfatos (sntesis de a sulfurados); fosfatos (a Como sustancias fosfatados); carbonatos (a carbonados y tampones); amortiguadoras de pH. cloruros (equilibrio inico de Na K).

CULTIVO
Cultivo es el procedimiento a travs del cual se crean en el laboratorio de microbiologa las condiciones ambientales adecuadas con el fin de promover el crecimiento de los microorganismos. Uno de los procedimientos ms importantes para identificarlos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Este material alimenticio en el cual crecen es el MEDIO DE CULTIVO.

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Conceptos de Medio de Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. Las caractersticas de los microorganismos a tener en cuenta al momento de preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son: Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa. Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos. Temperatura ptima de crecimiento Rango de pH: en general el rango ptimo de pH

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras. La adicin de elementos nutritivos en concentracin adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hbitat natural. La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH y la presin osmtica que se le quiera brindar a los microorganismos. En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio en lquidos, semislidos y slidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma lquida, en cuyo caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega agar. En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de todos los microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacin del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 C, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 C. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

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1.- Nutrientes medio de cultivo

a) Factores orgnicos de crecimiento Los factores orgnicos de crecimiento son compuestos orgnicos especficos que se requieren en muy pequeas cantidades por las bacterias hetertrofas y no pueden ser sintetizadas por las clulas. Estas sustancias normalmente son aportadas al medio de cultivo por el extracto de levadura o por la sangre, e incluyen vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas, Algunos microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, se denominan prototrofos para diferenciarlos de los mutantes auxtrofos que requieren el factor de crecimiento.

a.1) Vitaminas Fueron los primeros factores de crecimiento descubiertos. En los organismos vivos, muchas vitaminas funcionan en forma de coenzimas por ejemplo el cido nicotnico que es parte del coenzima NAD. Algunos microorganismos tienen requerimientos vitamnicos muy complejos, mientras que otros slo necesitan algunas vitaminas. Las bacterias del cido lctico Streptococcus y Lactobacillus, tienen unos requerimientos vitamnicos muy complejos que incluso pueden superar a los del hombre. La cobalamina (vitamina B12 ) es requerida por algas y bacterias acuticas. Sin embargo, los hongos no requieren nunca vitamina B12 . a.2) Aminocidos Muchos microorganismos requieren aminocidos especficos. La incapacidad para sintetizar un aminocido est relacionada con la falta de enzimas necesarias para su sntesis. Los aminocidos requeridos pueden ser suministrados como aminocidos libres o incorporados en otros elementos. La determinacin de los requerimientos para un aminocido en particular es complicada por el hecho de que en ocasiones la presencia de un aminocido en exceso disminuye la absorcin de otros que se requieren para el crecimiento. Este fenmeno se denomina aminoacid imbalance. a.3) Purinas y pirimidinas Las purinas y pirimidinas, que son componentes estructurales de los cidos nucleicos y coenzimas, son factores de crecimiento para muchos microorganismos. Es imposible conocer la forma en que deben ser suministrados a la clula. Si se suministran como bases libres, deben convertirse en el interior de la clula en nucletidos antes de poder ser utilizadas. Normalmente los nucletidos no pueden ser utilizados como factores de crecimiento ya que la presencia del grupo fosfato, produce la ionizacin de la molcula y se disminuye la capacidad de penetracin en la clula. a.4) Anillo porfirinico La clorofila, citocromo y hemoglobina, todos contienen el anillo porfirnico. El requerimiento de este anillo, explica porqu hay microorganismos patgenos como Haemophilus influenzae que requieren cultivarse sobre medios que contengan hemates (grupo hemo). Las bacterias que requieren el grupo hemo carecen de la capacidad de sintetizar porfirinas y su crecimiento queda restringido a ambientes donde existe sangre. Como este anillo es necesario para la sntesis de citocromo, el aparato respiratorio de estas clulas se encuentra alterado en ausencia del grupo hemo.
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a.5) cidos grasos Las bacterias del rumen requieren ciertos factores de crecimiento presentes en el rumen. Estos factores de crecimiento fueron identificados como cidos grasos de 4- 6 tomos de carbono lineal o ramificado y que son solo factores de crecimiento para las bacterias del rumen.

b) Suplementos Algunos microorganismos son muy difciles de cultivar y deben agregarse a los medios elementos que son denominados como suplementos como por ejemplo; Extracto de levadura, peptonas y extracto de carne. b.1) Extracto de levadura. Es un extracto de la hidrlisis cida o enzimtica de las clulas de levadura, que han sido lisadas previamente por calor. Es una fuente rica en vitamina B, contiene adems nitrgeno orgnico y compuestos carbonados. Se puede adquirir comercialmente en forma de polvo. b.2) Peptonas. Productos que resultan de la digestin de materiales proteicos, por ejemplo carne, casena y gelatina. Existen disponibles en el comercio muchos tipos diferentes de peptonas (dependiendo de la protena utilizada y del mtodo de digestin) para su utilizacin en medios bacteriolgicos; las peptonas difieren en cuanto a su capacidad de soportar el crecimiento de las bacterias. Las peptonas son la principal fuente de nitrgeno orgnico; pueden contener adems algunas vitaminas y a veces carbohidratos, dependiendo del material proteico digerido. b.3) Extracto de carne. Es un extracto concentrado de los productos hidrosolubles de la carne de buey. Es la fuente principal de carbohidratos, compuestos orgnicos de nitrgeno, vitaminas hidrosolubles y sales.

c) Otros Requerimientos Otros elementos necesarios para el crecimiento y que deben encontrarse presentes en los medios de cultivos son: NaCl en cantidades del 0,5% para evitar fenmenos de lisis en la clula bacteriana. Todos los medios de cultivo deben ser hidratados con agua la cual debe ser destilada para evitar la formacin de carbonato de calcio que enturbie el medio e impida el crecimiento bacteriano.

2.-Estado medio de cultivo a) Slidos: permiten visualizar las caractersticas macroscpicas de la(s) colonia(s) y cuantificar su desarrollo. Fueron introducidos por R. Koch (1881) y han representado un valioso aporte en bacteriologa, para obtener cepas puras de microorganismos, lo cual facilita la clasificacin y tipificacin bacteriana.

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b) Lquidos: son de mayor sensibilidad en el desarrollo de los microorganismos, sin embargo se contaminan con mayor frecuencia. fueron los primeros medios de cultivo usados y fueron ideados por L.Pasteur. En ellos el crecimiento microbiano est uniformemente disperso por todo el lquido. c) Semislidos: permiten observar la movilidad de algunos microorganismos.

3.-Presentacin medio de cultivo a) En placa: se usa slo para medios slidos. Su principal utilidad est en el aislamiento primario, es decir la siembra de la muestra con obtencin de colonias separadas (aisladas) para su posterior identificacin y sensibilidad. En tubo: puede contener medio lquido, slido o semi-slido.

b)

4.- Agentes Solificantes. a) Agar-Agar. Es un carbohidrato complejo (polisacrido) que se obtiene de ciertas algas marinas y que se encuentra constituido por agarosa y agaropectina. El agar es insoluble en agua fra y soluble en agua caliente a una temperatura por sobre los 45C. Funde a una temperatura entre 80 y 100C. Una vez fundido se mantiene lquido hasta una temperatura de 44-45C. El agar es muy poco txico. Tiene el inconveniente de que a pH cido no solidifica, por lo cual es muy importante ajustar el pH del medio al cual se le ha agregado agar a un pH = 7. b) Gelatina. Se obtiene por hidrlisis del colgeno. Es insoluble en agua fra y soluble en agua caliente. No es muy transparente. Lica a 28C y tiene el inconveniente de que es fcilmente atacada por los microorganismos. No se emplea generalmente como agente solidificante. Es empleada de preferencia en las pruebas de identificacin bioqumica para las bacterias. Silico gel. Es un gel inorgnico que se prepara con HCl y silicato de sodio. Tiene la ventaja de solidificar a pH cido. Sirve para estudios de nutricin y para cultivar microorganismos que degradan los otros agentes solidificantes. Se utiliza para aislar microorganismos del suelo.
c)

5.- Clasificacin de medios de cultivo a) Segn la fuente de nutrientes: a.1. Natural: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, papa, huevos, leche, tierra, etc.

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a.2. Artificial: Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio.

b) Segn su composicin: b.1. Medios sintticos o definidos: se le conoce su composicin qumica exacta. Se usan para microorganismos a los que se les conoce sus requerimientos nutricionales. Generalmente contienen: fuentes de carbono, como la glucosa; de nitrgeno, usualmente de cloruro, sulfato o fosfato de amonio; y varias sales inorgnicas incluidas trazas de metales. Ejemplo: agar-almidn: Almidn NaCl Agar Agua Dest. 12,5 gr. 5,0 gr. 15,0 gr. 1,0 lt.

b.2. Medios complejos o no definidos: es aquel que tiene ingredientes de composicin qumica desconocida o parcialmente conocida. Se usan para hacer crecer microorganismos de difcil cultivo. Ejemplos: agar sangre, agar yema de huevo, caldo lactosado, medio marino, agar nutritivo. Caldo nutritivo: Extracto de carne 3 gr. Peptona 5 gr. Agua Destilada 1 lt.
c)

Segn su consistencia: c.1. Medios lquidos: Ejemplos caldo nutritivo c.2. Semislido: Ejemplo caldo nutritivo, de la composicin descrita anteriormente, ms 0,8 gr. de agar-agar por cada 100 ml de medio. c.3. Slido: Ejemplos Agar nutritivo.

d) Segn su utilizacin: d.1. Medios Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de determinados microorganismos. Es un medio que ha sido modificado para incluir uno o ms agentes inhibitorios, restringiendo el crecimiento de ciertas especies de organismos. Las sustancias inhibitorias usadas son por lo general: antibiticos, colorantes, sales biliares para enriquecer enterobacterias, cristal violeta que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite el crecimiento de las Gram negativas, medio con 25% de NaCl para enriquecer halfilas. Otros ejemplos de medios selectivos son: - Brillant green bile broth. - Chapman, para desarrollo de Staphylococcus.

- MacConkey - Baird-Parker medium.

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d.2. Medios de diagnstico o diferencial: Contienen reactivos que diferencian entre los distintos tipos de bacterias, sirven para una identificacin presuntiva o preliminar. Se usan para determinar propiedades fisiolgicas y bioqumicas. Ejemplos de este tipo de medio: - Agar sangre. - Agar leche. - Agar yema de huevo.

- Agar citrato Simmons - Agar gelatina. - Agar almidn.

d.3. Medios de crecimiento o mantencin: Tienen como objetivo preservar un stock de cultivo, con lo cual se tiene en el laboratorio una cantidad de microorganismos viables. Ejemplos de este tipo de medio: - Agar nutritivo. - Caldo peptonado. - Medios de congelacin (se baja a la mitad los componentes nutritivos del medio y se agrega glicerol para impedir la formacin de cristales).

d.4. Medios mejorados: Se obtienen aadiendo al medio corriente sustancias de mayor valor nutritivo que tiene el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de microorganismos exigentes, por ejemplo: caldo cerebro corazn, agar sangre, etc. El medio mejorado de uso ms corriente es el agar sangre. Agar sangre. Puede utilizarse sangre recin extrada, desfibrinada o citratada. La sangre no puede ser esterilizada, por lo que ha de ser extrada y aadida a los medios, guardando las ms rigurosas condiciones de esterilidad. Se extrae la sangre aspticamente, ya sea humana o de animal (cuy, conejo, etc.). Se recibe en matraces estriles que contengan oxalato o citrato para que no se coagule, o bien se desfibrina, agitndola con perlas de vidrio estriles. Se mezcla la sangre con agar corriente previamente esterilizado y fundido y enfriado a 50C, en proporcin a un tercio de sangre y dos tercios de agar nutritivo. Se reparte en tubo o placas de Petri. Todas estas operaciones deben efectuarse al lado del mechero Bunsen y alejadas de la corriente de aire para evitar contaminaciones.

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6.- Medios de cultivo para microorganismos anaerobios. Los microorganismos anaerobios se pueden definir como bacterias que viven y se reproducen slo en medios privados de oxgeno libre. Los medios de cultivo para microorganismos anaerobios se componen de las mismas sustancias nutritivas que utilizan los aerobios, pero es necesario privarlos de oxgeno libre. Para esto se utilizan varios procedimientos que pueden agruparse en procedimientos fsicos, qumicos y biolgicos. Procedimientos fsicos. medios.) Expulsin del aire por ebullicin (regeneracin de los

Procedimientos qumicos. Se basan fundamentalmente en la utilizacin de sustancias que poseen poder reductor por ser muy oxidables. Ejemplo Agar de Brewer en el cual la sustancia reductora es el tioglicolato de sodio. Procedimientos biolgicos. Estos procedimientos aprovechan la convivencia de un microorganismo aerobio con un anaerobio estricto. Entre los medios de cultivo especiales para anaerobios podemos citar: Agar de Brewer, Caldo tioglicolato con agar (medio semislido), Caldo tioglicolato.

7.- Medios de cultivo para microorganismos marinos. Para estudiar los microorganismos que forman la flora del agua de mar, la espuma, las bacterias de peces, mariscos, etc., es conveniente utilizar medios de cultivo similares en todo a los ya estudiados, pero preparados en base a agua de mar esterilizada (reemplaza al agua destilada) y en el caso de medios a base de albminas animales, slidos o lquidos, la carne o sus productos se reemplazan por carne de pescado o sus derivados (harina, etc.). Conviene estudiar la salinidad necesaria para el crecimiento de estos microorganismos, el pH adecuado y la tensin de oxgeno y anhdrido carbnico u otros gases para obtener el mejor desarrollo. Existen medios de cultivo para microorganismos mariscos preparados como el agar de Zobell.

8.- Indicadores de ph: Los indicadores de PH son incorporados en algunos medios de cultivo y dan evidencia visual de los cambios de PH que ocurren durante el crecimiento de las bacterias. Los indicadores para este objetivo no debern ser txicos en la concentracin empleada.

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9.-Preparacion de medios de cultivo: La preparacin de medios cultivos en microbiologa pasos: 1.Pesar una cantidad especfica del medio de cultivo sobre papel aluminio, teniendo la precaucin de no ensuciar la balanza, debido a que algunos compuestos son muy higroscpicos los cuales se adhieren con gran facilidad a la superficie. 2.Posteriormente debe colocar el contenido pesado en un matraz erlenmeyer, donde le aadir el volumen requerido segn las indicaciones y disuelva. Determine el pH del medio lquido y ajuste al valor que sea ptimo para el tipo de bacterias que se va a cultivar, generalmente se ajusta a pH=7. 3.Lugo caliente el medio al mechero hasta que hierva, teniendo la precaucin de que no se adhiera o se pegue en el fondo del matraz. Hierva lentamente, ya que as evitar perdidas del medio por derrame. 4.Si es necesario dosifique en tubos, cuidando de que estos estn correctamente rotulados y cerrados (pueden ser tapas o algodn hidrfobo). 5.Finalmente esterilice el medio en el autoclave a 121 C, durante 15 minutos. implica los siguientes

En base a lo ya estudiado en el prctico, complete el siguiente recuadro, clasificando el medio de Cultivo.

Uso Nombre del medio de cultivo Componentes General Selectivo Diferencial Complejo definido Agar nutritivo

Agar MacConkey

Caldo cerebro- corazn

Agar Bair-Parker

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Siembra de microorganismos
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando asa en punta o loop, hisopo o pipeta estril.

Cultivo en medio lquido Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formacin de velo o pelcula, o por sedimento. Cultivo en medio slido Puede ser en tubos o placas. a) Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el agar. b) Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. Tambin se llama siembra por picadura. c) Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada. En superficie

1) Se colocan 0.1 mL de la dilucin de la muestra con pipeta estril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estril. 2) Se siembra con un ansa para aislar, como se explica ms adelante. 3) Se siembra con un hisopo.

Incorporada

Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estril vaca, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45C; luego se agita la placa.

Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentracin de agua en el medio puede provocar condensacin durante la incubacin y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente. En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino adems para contar y aislar.

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1) Siembra de material slido a medio lquido Placa Petri o Tubo ensayo Tubo de ensayo (con asa loop) Matraz (con asa loop)

2) Siembra de material lquido a medio slido Tubo de ensayo o Matraz Tubo de ensayo (con asa loop) Placa Petri ( con asa loop) 3) Siembra de material slido a medio slido Tubo de ensayo o placa Petri Tubo de ensayo (con asa loop) Placa Petri (con asa loop) 4) Siembra de material liquido a medio lquido Tubo ensayo o matraz Tubo ensayo (con asa loop o pipeta) Matraz (con asa loop o pipeta)

Para realizar los procedimientos anteriormente sealados, siga correctamente las instrucciones dadas por el profesor o el ayudante de la asignatura, quienes le explicaran como proceder correctamente en este practico de siembra. Siembra en anaerobiosis. Se utilizan los medios para anaerobiosis que se han descrito en la gua de prctico de medios de cultivos. En medios slidos. Es necesario efectuar previamente la regeneracin de los medios, calentndolos a la temperatura de ebullicin. La siembra debe efectuarse cuando la temperatura haya descendido entre 45 y 50C antes que se solidifique el agar. Se utilizan tubos largos para anaerobiosis los cuales se siembran conforme a las tcnicas estudiadas para siembras en medios lquidos, pues el agar est lquido. Una vez efectuada esta operacin se agita el tubo de agar entre ambas manos por rotacin y se deja en posicin vertical dentro de un recipiente con agua fra para que se solidifique rpidamente impidiendo que penetre oxgeno en l. En medios lquidos. Esta siembra se efecta en la misma forma que hemos efectuado para los aerobios. En medios semislidos. Si la muestra es slida se utiliza es asa depositando el inoculo en el fondo del tubo. Estos medios semislidos necesitan tambin ser regenerados, aunque en su composicin lleven un reductor.

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