Wydzia Chemiczny Politechniki Gdaskiej Katedra Technologii Lekw i Biochemii Biologia Komrki - laboratorium PORWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMREK

WSTP Aby wyizolowa biaka otrzymane np. w systemach nadekspresji w komrkach drobnoustrojw potrzebne s odpowiednie metody, ktre pozwalaj na uwolnienie danego biaka z komrki z du wydajnoci przy jednoczesnym zachowaniu jego wasnoci np. aktywnoci enzymatycznej, struktury itp. Szczeglnie plenie i dro d e ale rwnie komrki rolinne posiadaj odporn na liz cian komrkow, ktra utrudnia izolacj biaek i innych skadnikw komrkowych. Typowa procedura izolacji biaek z komrki skada si z nastpujcych etapw: przemycia masy komrkowej (z pozostaoci po ywki lub innych komrek w przypadku tkanek np. krwi), liza komrek (w celu uwolnienia frakcji cytozolowej komrek) i oddzielenie frakcji komrkowych od siebie (rozdzia frakcji bon komrkowych, rozpuszczalnych biaek i frakcji nierozpuszczalnej). Do rozdziau tych frakcji u ywa si metod sedymentacyjnych w wirwkach. Ekstrakt komrkowy otrzymany po lizie komrek nazywamy homogenatem. Po oddzieleniu np. skadnikw nierozpuszczalnych przez wirowanie (zwykle od 10 min. przy 15.000 g do 1 godziny przy 100.000 g) otrzymuje si nadscz (surowy ekstrakt) i osad zawierajcy frakcj bon komrkowych. Nadscz mo e by dalej oczyszczany i zawarte w nim biaka rozdzielane np. na kolumnach chromatograficznych w zale noci od specyficznych wasnoci interesujcego nas biaka (ci ar czsteczkowy, punkt izoelektryczny, wizanie si z innymi substancjami itp.) Najwa niejszym z punktu widzenia wydajnoci procesu izolacji biaek jest etap dezintegracji komrek. R ne sposoby lizy r nych rodzajw komrek i tkanek podane s w Tabeli 1. Homogenizacja. Jest to jedna z najczciej u ywanych metod do dezintegracji mikkich tkanek zwierzcych. W zale noci od rodzaju tkanki u ywa si r nych typw homogenizatorw: Potter-Elvehjema (tkanki wtroby, serca, mzgu, mini gadkich), Dounce'a (tkanka mzgu, komrki z hodowli tkankowych), homogenizatora-miksera (Rys. 1). W czasie homogenizacji utrzymuje si obni on temperatur (0-4oC) i dodatek inhibitorw proteaz komrkowych. Postp procesu mo na monitorowa przez obserwacje mikroskopowe lub przez pomiar uwolnionego biaka komrkowego w nadsczu. Sonifikacja. Metoda u ywana do dezintegracji bakterii np. Escherichia. coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae i komrek zwierzcych np. mzgu. W metodzie tej wykorzystuje si wibracje tzw. fale kawitacji wywoywane w roztworze przez ultradwiki, ktre mechanicznie uszkadzaj cian komrkow. Wielko wibracji musi by utrzymywana na takim poziomie aby nie powodowa tworzenia si piany poniewa wywouje to

natlenienie roztworu co z kolei mo e prowadzi do denaturacji biaek. Sonifikator skada si z sondy i ukadu elektronicznego kontrolujcego poziom ultradwikw (patrz Rys. 2). Jednym z ogranicze metody jest ilo komrek, ktra nie mo e przekroczy ok 1 g na cykl. W czasie sonifikacji konieczne jest rwnie chodzenie zawiesiny komrek przez np. zanurzenie naczynia w mieszaninie woda-ld. Tabela 1. Metody dezintegracji komrek (tkanek).
________________________________________________________________________________________________

metoda krojenie

rodzaj komrek (tkanki)

wikszo tkanek rolinnych i zwierzcych mikkie tkanki zwierzce zawiesiny komrek bakterie, dro d e, komrki rolinne bakterie, tkanki rolinne zawiesiny komrek bakterie, dro d e komrki z hodowli tkankowej bakterie, dro d e krwinki (erytrocyty), bakterie wikszo rodzajw komrek

homogenizacja (Dounce'a, Potter-Elvehjem'a) sonifikacja (ultradwiki) Prasa Frencha rozcieranie wytrzsanie z kulkami szklanymi trawienie enzymatyczne liza detergentami liza rozpuszczalnikami organicznymi szok osmotyczny zamra anie/rozmra anie

________________________________________________________________________________________________

Prasa Frencha (French Pressure Cell). Metoda polega na poddaniu zawiesiny komrek wysokiemu cinieniu i gwatownym uwolnieniu do cinienia atmosferycznego w specjalnym typie prasy (Rys. 3). Zmiana cinienia powoduje rozpad komrek. Metoda pozwala na dezintegracj z wysok wydajnoci zawiesin komrek o objtoci ok. 10-30 ml ale staje si technicznie trudna dla mniejszych objtoci i zbyt czasochonna dla objtoci wikszych. U ywana jest najczciej do dezintegracji komrek bakteryjnych i dro d owych. Rozcieranie. Tak jak dezintegracja w Prasie Francuskiej ucieranie z substancjami ciernymi u ywane jest do rozbijania komrek organizmw jednokomrkowych. U ywane materiay i sprzt s niekosztowne (modzierz, piasek lub obojtny tlenek glinu) a metoda pozwala na dezintegracj masy komrek do ok. 30 g na cykl.

Wytrzsanie z kulkami szklanymi. Jest ulepszeniem metody ucierania. Mechaniczne uszkadzanie ciany komrkowej powoduj mae kulki szklane wytrzsane w zawiesinie komrek. Metoda ta u ywana jest rwnie w stosunku do organizmw jednokomrkowych, najczciej dro d y. W maej skali (ok. 1 g masy komrek) prowadzi si j w naczyniach laboratoryjnych np. probwkach, przy du ych objtociach zawiesiny komrek wymaga u ycia specjalnej aparatury (patrz np. aparat przedstawiony na Rys. 4). Trawienie enzymatyczne. Polega na degradacji skadnikw ciany komrkowej i otrzymaniu komrek pozbawionych ciany komrkowej tzw. protoplastw, ktre atwo podda lizie przez np. szok osmotyczny. W przypadku bakterii u ywa si lizozymu trawicego bakteryjne peptydoglikany, u dro d y u ywana jest zymoliaza (glukanaza), enzym trawicy glukan bdcy gwnym skadnikiem ciany komrkowej dro d y. Liza detergentami. Metoda ta jest czsto u ywana do dezintegracji komrek utrzymywanych w hodowli tkankowej. Jest bardzo zachowawcza jeli chodzi o wasnoci izolowanych biaek jeli tylko st enie detergentu potrzebnego do lizy komrek jest niewysokie. Najczciej u ywane detergenty to: Triton X-100, NP-40, dodecylan sodowy, siarczan sarkozylu, deoksycholan sodowy i inne. Liza rozpuszczalnikami organicznymi. Metoda u ywana do rozbijania komrek bakterii cho ograniczona gwnie do lizy komrek na sczkach, ktre maj by nastpnie inkubowane z przeciwciaami lub sondami DNA. Szok osmotyczny. Komrki s wra liwe na szok osmotyczny gdy przetrzymywane s w roztworach hypotonicznych (o cinieniu osmotycznym mniejszym ni w cytoplazmie). Metod stosuje si do lizy czerwonych komrek krwi (erytrocytw) i komrek pozbawionych ciany komrkowej np. protoplastw bakterii czy dro d y. Zamra anie/rozmra anie. Wzrost objtoci zamarzajcej w cytoplazmie wody oraz powstajce krysztay lodu powoduj uszkadzanie ciany i bony komrkowej oraz organelli komrkowych. Metod stosuje si podczas izolacji odpornych na denaturacj biaek poniewa zamarzanie powoduj czciow utrat wody hydratacyjnej biaek co prowadzi do zmian ich wasnoci (denaturacja). Ograniczeniem jest rwnie konieczno ochrony biaek przed dziaaniem uwolnionych, gwnie z lizosomw, enzymw proteolitycznych. LITERATURA Fleicher, S., J.O. McIntyre, and J.C. Vital. 1979. Methods in Enzymology. 55: 32-39. Large scale preparation of rat liver mitochondria in high yield. Harlow, E., and D. Lane. 1988. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Bollag, D.H. and S.J. Edelstein. 1992. Protein Methods. Wiley&Liss, New York.

Rys. 3. Prasa Frencha

WYKONANIE WICZENIA - Porwnanie metod dezintegracji komrek

Materiay: Dro d e piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae) Izotoniczny roztwr chlorku sodu buforowany fosforanami (PBS) Odczynniki do oznaczania biaka metod Bradford Standardowy roztwr albuminy woowej (BSA) o st eniu 10 mg/ml 0.5% roztwr SDS (dodecylosiarczan sodu) w PBS Sprzt: Probwki 15 ml oraz 50 ml z polipropylenu typu FALCON, statywy Probwki 1.5 ml typu Eppendorf Pipety automatyczne 200 l, 1000 l, 5000 l, kocwki do pipet Tryskawka z etanolem i wod destylowan Zlewki, lignina Wytrzsarka laboratoryjna (vortex) Spektrofotometr, kuwety Prasa French'a Kulki szklane o rednicy 1-2 mm Modzierz, obojtny tlenek glinu

Metoda z rozcieraniem: Odwa y 1 g mokrej masy dro d y, przenie do modzierza, doda 1 ml roztworu PBS i dodawa stopniowo 2 g obojtnego tlenku glinu rozcierajc mas komrek. Rozciera mas do uzyskania jednolitej kleistej masy (przez ok 15-20 min.), doda 4 ml PBSu i dokadnie wymiesza. Przenie zawiesin do 15 ml probwki, przepuka dokadnie modzierz 5 ml PBSu i przenie do probwki (kocowa objto zawiesiny komrkowej powinna wynosi 10 ml). Zawiesin komrek odwirowa przy 3000 rpm przez 10 min. Klarowny nadscz zachowa do oznaczenia st enia biaka. Metoda z u yciem szklanych kulek: Odwa y 1 g mokrej masy dro d y, przenie do 50 ml probwki zawierajcej 8 g szklanych kulek o rednicy 2 mm. Doda do probwki 10 ml PBS, wytrzsa na wytrzsarce (vortex) przez 20-30 min przy maksymalnych obrotach. Po dezintegracji, zawiesin komrek przenie pipet do 15 ml probwki (pozostawiajc szklane kulki w probwce 50 ml), odwirowa przy 3000 rpm przez 10 min. Klarowny nadscz zachowa do oznaczenia st enia biaka. Metoda z u yciem Prasy Frencha: Odwa y 1 g mokrej masy dro d y, przenie do 15 ml probwki i doda 10 ml PBS. Dokadnie wymiesza do uzyskania jednolitej zawiesiny komrek. Przenie zawiesin do Prasy Frencha i rozbi komrki. Po dezintegracji, zawiesin komrek przenie do 15 ml probwki, odwirowa przy 3000 rpm przez 10 min. Klarowny nadscz zachowa do oznaczenia st enia biaka.

Metoda z u yciem detergentw: Odwa y 1 g mokrej masy dro d y, przenie do 15 ml probwki i doda 10 ml 0.5% roztworu SDS w PBS. Zawiesin komrek pozostawi na ok. 30 min od czasu do czasu wytrzsajc na wytrzsarce (rednio, co 5 min.). Komrki odwirowa przy 3000 rpm przez 10 min. Klarowny nadscz zachowa do oznaczenia st enia biaka. Jako odnonik przy oznaczaniu biaka u y 0.5% roztworu SDS. Oznaczanie st enia biaka przed dezintegracj: Odwa y 1 g mokrej masy dro d y, przenie do 15 ml probwki i doda 10 ml PBS. Dokadnie wymiesza do uzyskania jednolitej zawiesiny komrek, odwirowa przy 3000 rpm przez 10 min. Nadscz zachowa do oznaczenia st enia biaka.

Przygotowanie krzywej wzorcowej i pomiar st enia uwolnionego biaka komrkowego w procesie dezintegracji: Przygotowa w probwkach roztwory do wyznaczenia krzywej wzorcowej dla standardu biaka BSA (kocowa objto 1 ml) o nastpujcych st eniach: 0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5 mg/ml Z przygotowanych roztworw pobra 100 l pipet automatyczn i przenie do 5 ml odczynnika Bradford. Cao wymiesza na wytrzsarce i pozostawi na 5 min. St enie biaka oznacza przy dugoci fali 595 nm. Wykreli krzyw wzorcow zale noci absorbcja - st enie biaka BSA: A = f(c). Z otrzymanych nadsczw pobra po 100 l supernatantu, zmiesza z 5 ml odczynnika Bradford, wymiesza na wytrzsarce i pozostawi na 5 min. St enie biaka oznacza przy dugoci fali 595 nm, na podstawie krzywej wzorcowej obliczy st enie biaka w nadsczach.

Sprawozdanie
Narysowa wykres st enia biaka wzorcowego (albuminy) w funkcji absorbcji krzywa wzorcowa A = f(cBSA). Przedstawi wyniki w postaci histogramu przedstawiajc wzrost st enia biaka w nadsczu zawiesiny komrek po procesie rozbijania w stosunku do zawiesiny komrek nie poddanych dezintegracji. Przedstawi w postaci histogramu wydajno procesu rozbijania komrek poszczeglnymi metodami. Opisa, jaka z u ywanych metod jest najbardziej odpowiednia do rozbijania komrek dro d y. Opisa przyczyny powstaych rozbie noci podczas wykonywania wiczenia We wstpie teoretycznym, prosz poda jaki jest cel stosowania dezintegracji komrek oraz prosz dokadnie opisa tylko jedn metod dezintegracji komrek (prosz poda literatur, z ktrej si korzystao podczas opisywania metody)