Tripanosomiasis Americana: Aspectos tericos

Realizado por: Eva Mary Rodrguez Luis Briceo Miguel Angel Chiurillo Walter Mosca Yelitza Campos Colaboradores: Dayana Turanzas Luis Luis

Definicin de la enfermedad La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es una zoonosis producida por el protozoario flagelado Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, descrito por primera vez en 1909 por Carlos Chagas, en Minas Gerais, Brasil. Es una enfermedad crnica debilitante que afecta la salud, el bienestar y la productividad de un gran nmero de seres humanos y representa un problema da salud pblica en Amrica Latina. Segn datos de la OMS existen entre 16 y 18 millones de personas infectadas, desde Mxico hasta Argentina y Chile y 90 millones de personas en riesgo de infeccin. En Venezuela, la enfermedad de Chagas es endmica en las zonas rurales de la mayor parte del territorio nacional, siendo especialmente importante en los estados Lara, Barinas, Monagas y Portuguesa (Aez y col, 1996). La infestacin ocurre principalmente por el contacto de la piel o las mucosas de los seres humanos o de otros mamferos, con heces u orina de insectos hemipteros hematfagos de la subfamilia Triatominae (Rhodnius, Triatoma y Pastrogylus) infectados con T. cruzi. Agente etiolgico: Trypanosoma cruzi. La clasificacin sistemtica de estos parsitos es la siguiente: Reino: Phylum: Clase: Orden Gnero: Protozoa Euglenozoa Kinetoplastida Tripanosomatida Trypanosoma

Otros esquemas consideran que el Orden es Kinetoplastida y la familia es Trypanosomatidae. Los Kinetoplastida son flagelados con 1 o 2 flagelos que se originan de una abertura conocida como bolsa flagelar, normalmente contienen una estructura prominente y paraflagelar conocida como cinetoplasto que corresponde a una condensacin de DNA localizado en el interior de una nica mitocondria que esta ramificada por todo el cuerpo del parsito. Otras estructuras caractersticas de estos

organismos son organelas especializadas, tipo peroxisomas, conocidos como glicosomas y la presencia de microtubulos subpeliculares. Dentro de la familia Trypanosomatidae, el gnero Trypanosoma es uno de los mas importantes por incluir una serie de especies que ocasionan enfermedades en humanos, como T. cruzi, agentes causal de la enfermedad de Chagas y T. gambiensi y T. rhodesiense, agentes causales de la enfermedad del sueo y en animales, como es el caso de T. brucei, T. equiperdum y T. equinum. En funcin del comportamiento del parsito, principalmente en el vector, el gnero Trypanosoma se ha dividido en dos grupos. El primero, llamado Stercoraria, incluye los Tripanosomas que se desarrollan en el tubo digestivo del vector, progresando en el sentido de la porcin intestinal con liberacin de las formas infectivas con las heces. En este grupo tenemos a T. cruzi y T. lewisi. El segundo grupo, llamado Salivaria, incluye tripanosomas que se desarrollan inicialmente en el tubo digestivo y posteriormente atraviesan el epitelio digestivo y llegan a las glndulas salivales, donde las formas infectivas son inoculadas mecnicamente. En este grupo se encuentran: T. brucei, T. congolense y T. rangeli

Ciclo Evolutivo de T. cruzi. Consideraciones generales El Trypanosoma cruzi es un parsito unicelular que altera su vida entre dos hospedadores multicelulares, uno invertebrado y uno vertebrado, presentando un ciclo de vida digentico. En funcin de la forma general de las clulas (esfrica, piriforme o alargada), la posicin relativa entre el ncleo y el cinetoplasto (anterior, lateral o posterior), la manera de salida del flagelo (central o lateral), se definen las siguientes formas evolutivas para los tripanosomatideos: Epimastigote: (20 - 40 x 2 m) forma elongada en la que el flagelo se origina prximo y por delante del ncleo, emerge por un costado del cuerpo arrastrando la membrana citoplasmtica en un corto trayecto dando la imagen de una membrana ondulante corta y se libera por el extremo anterior. Este estadio se desarrolla en el vector y en cultivos

axnicos y constituye una de las formas proliferativas del T. cruzi. Es tambin la forma de mas fcil cultivo in vitro Amastigote: (2 - 4 m) forma esfrica u ovalada que carece de flagelo libre; estadio de localizacin intracelular y replicativo en el mamfero. Tripomastigote: (20 x 25 m) forma elongada con el cinetoplasto situado por detrs del ncleo; el flagelo nace en su proximidad y emerge por un costado del cuerpo, se libera por el extremo anterior creando la imagen de una membrana ondulante de importante extensin; este estadio est presente en la circulacin del mamfero (tripomastigote circulante) y en la ampolla rectal del vector (tripomastigote metacclico), en cultivo de clulas y en el espacio intracelular del hospedador vertebrado, replicativa Tambin se puede encontrar una forma llamada esferoamastigota (en el estomago del insecto vector y en determinadas situaciones experimentales in vitro). Obviamente, se pueden observar una serie de formas intermedias. Ciclo de transmisin de T. cruzi. La principal va de transmisin del Trypanosoma entre sus hospedadores es la transmisin vectorial (a travs del vector) en la cual se pueden distinguir tres ciclos: el ciclo silvestre, el ciclo domstico y el ciclo peridomstico. El ciclo silvestre o ciclo primitivo de T. cruzi, de naturaleza eminentemente zoontica, donde el protozoario circula entre vectores y reservorios silvestres a lo largo de la mayor parte del continente americano desde hace millones de aos. Los ecotopos (ecosistemas) primitivos de T. cruzi son muy diversos, encontrndose en los desiertos norteamericanos, altiplanos andinos, florestas amaznicas y atlntica. La tripanosomiasis silvestre prefiere ambientes ecolgicamente cerrados o semiabiertos, variando en las proporciones de hospederos a vectores dependiendo de una serie de factores como el clima, altitud, humedad, caractersticas fauno florsticas y disponibilidad de alimentos. En este contexto se encuentra en toda Amrica, albergndose el parsito en mamferos de medio y pequeo tamao y los carece de capacidad

insectos vectores. Entre otros prevalecen aquellos ecosistemas donde los vectores pueden formar sus colonias tales como palmeras, cocos, troncos, pedregales, etc. Se trata de un estado de equilibrio desarrollado a travs de una larga adaptacin que se traduce en la baja o ninguna accin patognica del protozoario sobre sus hospederos naturales. Ciclo Domstico: La enfermedad de Chagas corresponde a una situacin mucho ms reciente en el contexto histrico, definido por factores antroponticos y haciendo del hombre uno de los ltimos reservorios naturales de T. cruzi. La expansin de la enfermedad de Chagas despus de la llegada d e Coln, es el producto de una ocupacin errtica y de una ocupacin desprogramada de Amrica Latina basada entres elementos principales: 1) Profundas acciones sobre el medio natural como quema y tala de grandes extensiones, promoviendo la apertura de espacios naturales y trayendo a ecosistemas artificiales los reservorios y vectores del parsito. 2) Proporcionando la existencia de ranchos y de viviendas de mala calidad como excelente abrigo de los vectores y 3) Induciendo la migracin de los campesinos, transportadores de la infeccin, hacia las grandes ciudades y la existencia de vectores con una alta capacidad de domiciliacin, caso tpico del Triatoma infestans. En el ciclo domstico el hombre sobresale como principal reservorio de la infeccin, llevando al parsito hacia las zonas urbanas y hacia nuevas regiones y pases no endmicos. Ciclo peridomstico: en este ciclo intervienen mamferos (roedores domsticos, marsupiales, gatos, perros) que libremente entran y salen de las residencias y los triatomas silvestres que son atrados por la luz de las casas y por el alimento. Este ciclo sirve de unin a los ciclos silvestre y domstico. Algunos autores lo incluyen en el ciclo domstico. Formas secundarias de transmisin: Adems de la va vectorial (que representa del 80-90 % de transmisin), existen la transmisin transfusional (5-20 %) y la va congnita (0.5-8 %). La s otras vas de transmisin son excepcionales (accidental, transplante de rganos, otros

vectores, lactognica, etc) y no representan una importancia significativa en trminos de salud pblica. Transmisin transfusional: Las dificultades econmicas en Amrica Latina han estimulado la emigracin a zonas urbanas en las seis ltimas dcadas. Actualmente, en la mayora de los pases, las ciudades tienen el 60% de la poblacin. La emigracin de las zonas rurales a urbanas si bien reduce el # de personas expuestas al vector infectado, aumenta la probabilidad de transmisin por transfusin. En cuanto no se descarte la sangre de donadores contaminados, existir la probabilidad de transmitir la enfermedad por esta va, siendo los mas expuestos los individuos poli transfundidos, tales como hemoflicos y los que reciben dilisis. Afortunadamente, solo una parte (12 a 18-25%) de los que reciben transfusin con sangre infectada, contraen la enfermedad. Por otro lado, la infeccin transfusional, se ha convertido en un serio problema en los pases desarrollados (donde no hay transmisin vectorial) debido a las decenas de millones de latino-americanos que emigra a estos pases. Transmisin congnita: Constituye la tercera va mas importante de transmisin dela enfermedad de Chagas. Este tipo de transmisin parece depender de factores ligados al parsito y al hospedador. Ocurre cuando el T. cruzi, al igual que atraviesa las mucosas, penetra el epitelio trofoblstico. Relacin Hospedero-Parsito Insecto-Parsito El ciclo biolgico de T. cruzi con el hospedador invertebrado se inicia cuando la sangre de animales infectados es ingerida por el insecto. Al llegar al estmago, las formas tripomastigotes se transforman a esferomastigotes y epimastigotes, algunas veces las formas esferomastigotes se agregan dando la impresin de masas multinucleadas. Enseguida, los parsitos migran hacia el intestino, donde se multiplican como formas epimastigote (25 horas despus de la infeccin). Una etapa importante de la interaccin de T. cruzi con el hospedador invertebrado es la adhesin de las formas epimastigotes al la superficie del epitelio del intestino medio y posterior, as como a la capa cuticular del epitelio de la

glndula rectal y del saco rectal, lo que puede observarse 8 das despus de la infeccin. Los datos obtenidos por Schaub y col.(1987,1988), sugieren que la adhesin de los epimastigotes ocurre por interacciones hidrofbicas con una capa de cera que cubre la cutcula. Estudios in vitro usando fragmentos de tubo digestivo, muestran que solo las formas epimastigotes son capaces de adherirse y que la adhesin ocurre predominantemente por el flagelo. En la glndula rectal se ha encontrado una unin del tipo hemidesmosoma entre la membrana flagelar y el epitelio. Algunos datos sugieren que algunos componentes de la superficie del parsito como LPG estn involucrados en el proceso de adhesin y que esta ocurre predominantemente con las membranas que cubren la superficie de la clulas intestinales, llamadas membranas perimicrobiliares. En el tubo digestivo ocurre la transformacin hacia las formas tripomastigote (metacclicas). Existen evidencias de que un pptido derivado de la globina es capaz de activar la adenil ciclasas presente en la membrana plasmtica de los epimastigotes, las cuales activan el proceso de metaciclognesis. Tambin se ha considerado que la orina del insecto, descargada en el saco rectal, va tbulos de Malpighi, estimulan la metaciclognesis. El AMPc presente en la orina puede ser uno de los factores de la estimulacin. Mamfero-Parsito El ciclo evolutivo del T. cruzi, en el hospedero vertebrado, comienza cuando las formas tripomastigotes y epimastigotes son eliminadas en las heces y orina del insecto vector y son inoculadas en la piel o mucosas del vertebrado. Las formas tripomastigotes pueden penetrar en cualquier tipo celular que encuentre en el sitio de la inoculacin, menos en eosinfilos y neutrofilos. Por su parte, los epimastigotes son fagocitados por clulas con capacidad fagoctica que se encuentren en el rea y son rpidamente digeridos. Despus de penetrar en la clula hospedera, las formas tripomastigotas pueden ser encontradas en el interior de una vacuola, llamada vacuola parasitofora. Despus de algn tiempo se transforma a la forma amastigota, la cual se encuentra ahora libre en el citoplasma, de la clula hospedera. 35 horas despus de la infeccin, se inicia el proceso de divisin celular binaria, que prosigue

por varios das dependiendo de la cepa de T. cruzi y de la clula hospedera. El tiempo de generacin es de aproximadamente 14 horas; despus de 5 das aproximadamente, cuando la clula hospedera contiene alrededor de 500 amastigotes, se inicia un proceso casi sincronizado de transformacin a la forma tripomastigote, pasando por un estado intermedio. Cuando las formas

tripomastigotes tienen un flagelo mas largo, comienzan un movimiento intenso que parece ser el responsable de la ruptura de la clula hospedera, con la liberacin subsiguiente de cientos de tripomastigotes al espacio intercelular. Los datos disponibles sugieren que todas esas formas son capaces de invadir nuevas clulas en el mismo sitio donde fueron liberadas o salir al torrente circulatorio y distribuirse por todo el organismo. Detalladamente, los datos disponibles sugieren que en la primera fase del proceso de interaccin de T. cruzi con la superficie de la clula hospedera, el proceso de adhesin ocurre por un proceso de reconocimiento celular en el que estn involucradas las glicoprotenas y las protenas tipo lectina, presentes tanto en la superficie del parsito, como en la clula hospedera. La participacin del cido silico en el proceso de adhesin de las formas tripomastigotes al las clulas hospederas es evidente. Sin embargo, la presencia del cido silico, dificulta la adhesin de estas formas a los macrfagos. Otras protenas importantes en le proceso de adhesin son las protenas con actividad transialidasa y neuraminidasica presentes en las formas tripomastigote. En cuanto al proceso de invasin, los datos disponibles sugieren que luego de la adhesin ocurren modificaciones importantes a nivel de la membrana del parsito y de la clula hospedera. Todo sugiere que las proteasas del parsito, entre ellas la cruzipana, estn involucradas en el proceso. Los datos disponibles sugieren que la entrada del parsito dentro de la clula puede considerarse como un proceso de endocitosis con algunas caractersticas especiales. En el caso de la interaccin de las formas tripomastigotes con macrfagos, el proceso es fagoctico. Independientemente del proceso usado para la invasin, a medida que el parsito va penetrando en la clula hospedera, va siendo envuelto por una membrana formada inicialmente a partir de la membrana plasmtica de la clula

hospedera, que rpidamente recibir componentes de membranas de organelos del sistema endolisosomal, formando la vacuola parasitofora. Una vez dentro de la vacuola ocurren tres procesos: 1) las organelas del sistema lisosomal de la clula hospedera se aproximan a la vacuola y se funden con ella incorporando sus membranas a la membrana de la vacuola parasitofora y descargando su contenido al interior de la vacuola que se torna cida. En esta fase la vacuola corresponde a un gran fagolisosoma. En el caso de epimastigotes la activacin de la NAD(P)H oxidasa que lleva a la formacin de radicales oxgeno y agua oxigenada que conducen a la lisis del parsito. Esa enzima se mantiene en la membrana de la vacuola, de tal forma que los derivados de oxigeno continan siendo producidos y vertidos en el espacio intravacuolar, llevando ala destruccin y posterior digestin del parsito. 2) El segundo proceso, consiste en el cambio gradual de las formas tripomastigote hacia la forma amastigote, la cual se inicia con el cambio hacia una forma redondeada, que hace que le flagelo quede todo asociado al cuerpo, seguido por el acortamiento del flagelo y cambios en la estructura del cinetoplasto, que adquiere forma de bastn. 3) El tercer proceso se inicia a las dos horas despus del contacto inicial. Consiste en la fragmentacin de la membrana de la vacuola, posiblemente por la accin de enzimas liberadas por el parsito. Este proceso requiere de la presencia de un compartimiento cido que parece favorecer la secrecin, por parte del parsito de una molcula sensible a tripsina conocida como Tc-Tox, que tiene la capacidad en ambientes acdicos de incorporarse a la membrana de la vacuola, llevando a su lisis. Algunas evidencias tambin sugieren que el cido silico puede interferir en este proceso de rompimiento. Con la fragmentacin de la membrana de la vacuola y su posterior desintegracin, las formas amastigotes de T. cruzi pasan a vivir en el citoplasma de la clula hospedera. Una vez en el citoplasma, las formas amastigote permanecen

muchas horas (24-35) en estado de latencia y posteriormente se inicia el proceso de divisin celular. Durante la divisin celular el proceso de citocinesis es relativamente rpido (aprox. 25 min.). Divisiones sucesivas llevan a la formacin de docenas de formas amastigotes que van ocupando todo el citoplasma de la clula hospedera. Despus de sucesivas divisiones, la forma amastigote inicia el proceso de transformacin a la forma tripomastigote que dura algunas horas, aparentemente se inicia con el crecimiento del flagelo acompaado de cambios en la forma de la clula, la cual se alarga y cambios en la estructura del cinetoplasto. El proceso de transformacin es sincronizado para la mayora de los parsitos, pero an no se conocen las seales que disparan el proceso de transformacin, una posibilidad es la falta de nutrientes en el citoplasma.

Figura 1. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. Ver detalles en el texto

Caractersticas poblacionales: El Trypanosoma cruzi es una especie compuesta de poblaciones

heterogneas, a veces muy diferentes en su constitucin, que circulan por la naturaleza entre el hombre, vectores, animales domsticos y reservorios salvajes (Fernandes y col 1997). Para poder sobrevivir como especie, el parsito durante su proceso evolutivo ha acumulado una gran plasticidad, que independientemente del proceso por el cual se haya generado tal diversidad, las poblaciones que lo conforman, presentan una gran complejidad. La gran variabilidad observada entre cepas de T.cruzi respecto a morfologa, enzimas especificas, patrones de infectividad y patogenicidad, ha llevado a algunos autores a pensar que ms que una especie, es un complejo cruzi (Coura y col, 1966). Miles en 1997, sugiri que T. cruzi podra ser considerado como un complejo heterogneo de organismos. Devera y col (2003), platea que el termino complejo T.cruzi, debe ser revitalizado no tanto como un termino taxonmico, sino como una forma de poder explicar la diversidad encontrada en el taxon T. cruzi Las primeras evidencias que demuestran la complejidad de la estructura de T. cruzi, provienen de estudios fenotpicos, por medio de mtodos bioqumicos que permiten analizar los productos de expresin gnica, a travs del anlisis de La electroforesis de

enzimas que funcionan como marcadoras (Isoenzimas).

isoenzimas es uno de los mtodos empleados para detectar diferencias entre enzimas con propiedades catalticas similares. En nuestro contexto, cada aislado produce un patrn particular como consecuencia de las enzimas que expresa., permitiendo as su asignacin entre los diferentes esquizodemos. Entre estos estudios, destacan los realizados por Miles y col (1977 y 1978), con seis locis, en diferentes aislados del continente americanos. Los resultados obtenidos le llevaron a sugerir la existencia de tres esquizodemos, denominados por el como zimodemos 1, 2 y 3 (Z1, Z2 y Z3). El Z1, es de origen selvtico y circula entre animales y triatominos selvticos. El Z2, se asocia con un ciclo domestico, obtenido de pacientes y animales domsticos. Por ultimo, el Z3 esta conformado por aislados de casos humanos autctonos de Brasil y comparte ciclo selvtico. La extensin de este

tipo de estudio con un nmero mayor de locus y de aislados fue llevada a cabo por Tibayrenc y col en 1986, quienes al analizar 121 aislados de T. cruzi, provenientes de diferentes reas geogrficas, observaron que el 93 % de los 15 diferentes locis estudiados fueron polimorfos, con un promedio de 5,14 alelos por locus. De los 43 genotipos identificados, solo 16 fueron detectados ms de una vez, existiendo una gran representacin de relativamente pocos multilocus. A partir de estos resultados, se realizaron clculos de distancia gentica, encontrando que la distancia promedio entre pares de cepas era elevada, sugiriendo que ellas estaban evolucionando aisladamente. El conjunto de estos hallazgos, los llevaron a proponer que las poblaciones de T. cruzi, tienen una estructura clonal. El modelo propuesto, no implica que la recombinacin gentica este ausente, sino que su frecuencia es tan baja que no altera significativamente la propagacin uniparental del parsito (aspecto en debate), lo que trae como consecuencia que las poblaciones hayan presentado una evolucin tipo clonal. Esto presupone que los clones son estables en el tiempo y espacio, permitiendo estudiarlos como marcadores epidemiolgicos. Dadas las enormes implicaciones de la estructura clonal y el gran polimorfismo exhibido por T. cruzi, se realizaron enormes esfuerzos para estudiar estos aspectos, con las nuevas tcnicas desarrolladas en el rea de la biologa molecular. Los datos obtenidos han servido para analizar un amplio rango de preguntas referidas a la epidemiologa molecular de T. cruzi y proporcionar claras evidencias sobre la estructura poblacional. Entre estos trabajos destacan los trabajos pioneros de Morel y col (1980), por anlisis de RFLPs (Restriction fragmrnt length polymorphism) de ADN de cinetoplasto, definiendo los esquizodemos al describir los grupos de aislados que comparten el mismo patrn de fragmentos de ADN, digeridos con enzimas de restriccin. Los trabajos de Avila y col (1990), con las secuencias de 330 pb de la regin de minicrculos del ADN del Cinetoplasto, Macedo y col 1992, con la tcnica de ADN Fingerprint, Tibayrenc y col, 1993 y Gomes y col 1998, Random amplified polymorphic DNA (R.A.P.D), Oliveira y col 1997 y 1999 y Gomes y col 1998; Simple sequence repeat anchored (PCR, SSRPCR), Vago y col 1996, low- stringency single specific primer (PCR, LSSP-PCR),

y Souto y col (1993, 1996) y Fernandes y col (1998); anlisis de locus de genes para RNA ribosomales y mini exones. Oliveira y col (1998), Micro y minisatlites, trabajos cuyos resultados resumimos a continuacin: 1- Todas las evidencias apoyan la existencia de una estructura clonal. 2- La gran diversidad de aislados de T. cruzi, fue reagrupada en dos grandes divisiones las cuales podran representar subespecies, denominadas tipo I (Z1, isoenzimas 1-25) y II ( Z2, Z3, isoenzimas 26-43), tal como se acord en una reunin satlite realizada en Ro de Janeiro, Brasil en 1999. Estudios posteriores realizados por Brisse y col (2000) Barnab y col (2001), sugieren que el grupo II, debe ser subdividido en cinco linajes (II a- IIe) o DTUs ( discrete typing units). 3- Existe discusin respecto al aporte que podra haber suministrado la actividad sexual en el polimorfismo de T. cruzi. Hasta el ao 2001, la mayor parte de los trabajos realizados sugeran que el intercambio sexual, si es que existe, pareciera despreciable su influencia en la estructura gentica y evolutiva del parsito. Sin embargo, las evidencias recientes apuntan al mantenimiento de la estructura clonal entre las poblaciones de T. cruzi, pero el aporte del intercambio sexual en la constitucin gentica de T. cruzi fue suficiente para introducir cambios en la diversidad de poblaciones. Entre los que soportan un impacto mayor del intercambio sexual, sugieren que el intercambio gentico es ms fcil de ser detectado entre cepas

separadas por pequeas distancias genticas y entre ciclos selvticos no intervenidos.

Carrasco y col (1996), analizando 36 cepas, aisladas de marsupiales y vectores de la selva amaznica del Brasil, empleando tcnicas isoenzimticas y patrones de RAPD, reportaron la existencia dentro del esquizodemo 1, dos diferentes fenotipos homocigos y el correspondiente heterocigos, para la isoenzima fosfoglucomutasa, con una frecuencia idntica a la esperada segn la distribucin propuesta para las poblaciones en equilibrio de Hardy- Weinberg .

En este mismo orden de ideas Higo y col (2000) al evaluar 82 aislados de Guatemala, donde los movimientos de personas infectadas o de los reservorios son ideales para estudiar los aportes de la actividad sexual (pas pequeo y poco movimiento migratorio), lograron conseguir pruebas de intercambio gentico, luego de analizar con tres isoenzimas los niveles esperados de heterocigos, sugiriendo que el intercambio gentico existe, a bajos niveles, pero suficiente para introducir cambios en diversidad. Machado, C y Ayala, F (2001), para cuestionar la existencia o no de eventos importantes de recombinacin, plantean que en condiciones de estricta clonalidad, todos los genes deberan evolucionar compartiendo la misma historia de

divergencia, ya que el genoma es transmitido intacto de una generacin a otra, mientras que los genes de organismos que se reproducen sexualmente, tienden a tener diferentes historias, porque el genoma es recombinado en cada generacin. Por lo tanto, una genealoga incongruente de genes bajo la ptica asexual, implicara el intercambio gentico. Para analizar estas hiptesis, se evaluaron una gran cantidad de secuencias nucleotdicas de genes nucleares y una porcin de genes mitocondriales. Los estudios indicaron la existencia de eventos de recombinacin, fundamentalmente en los genes mitocondriales, y sugiere la existencia de cuatro linajes, los cuales no necesariamente coinciden con los dos reportados en prrafos anteriores. Para tratar de comprobar el aporte del intercambio gentico, el grupo de Miles (Gaunt y col, 2003), transfect dos diferentes clones, con marcadores de resistencia a drogas. Los parsitos fueron pasados juntos a travs de los ciclos biolgicos y recuperados luego para su anlisis. Se obtuvo una progenie con seis dobles resistentes, presentando fusin de genotipos parentales, perdida de alelos, recombinacin homologa y herencia no parental de maxicrculos del cinetoplasto, demostrando que en este sistema, los eventos de recombinacin son posibles durante el ciclo biolgico de T. cruzi Finalmente, Evidencias recientes aportadas por Brisse y col (2003), al

evaluar el polimorfismo presente en la secuencias nucleotdicas de dos genes, en seis cepas representativas de cada uno de los 6 linajes propuestos (I y II a- IIe)

encontraron que

la distribucin a seis era adecuada, pero no como ha sido

propuesta, con dos tipos y cinco subgrupos de uno de los tipos. Sturm y col (2003) estudiando un nmero mayor de sitios secuenciados, pero en cepas tipo I o II, reportan que los mltiples polimorfismos correlacionan con la clasificacin tipo I y II. Sin embargo, el anlisis tambin revela que los nicos grupos puros, son el Tipo I y el subgrupo IIb, mientras que los otros IIa / IIc y IId/ IIe, son hbridas, consistente con la hiptesis que plantea la recombinacin gentica ha ocurrido entre las diferentes lneas de T. cruzi. El aporte de las nuevas herramientas sin duda nos ha ayudado a comprender mejor los procesos por los cuales se ha establecido la estructura poblacional de T. cruzi. Pero mucho nos falta por conocer. Obviamente nuestra poca comprensin de los procesos genticos de T. cruzi, nos impide entender como esta variabilidad se asocia con el desarrollo de las diferentes manifestaciones clnicas de la enfermedad. Manifestaciones clnicas: La enfermedad transcurre inicialmente con una elevada parasitemia (fase aguda), la cual es limitada por la respuesta inmune del hospedero. Una vez superada la etapa aguda los individuos infectados pasan por un perodo sin sintomatologa clnica, llamada fase indeterminada o asintomtica. Los pacientes en esta fase crnica presentan niveles subpatentes de parasitemia, lo que dificulta en gran medida el diagnstico parasitolgico. Aproximadamente el 70 % de los pacientes asintomticos permanece as durante toda su vida. Sin embargo, un 30 % de ellos despus de permanecer por aos asintomticos, desarrollan lenta pero progresivamente una mocardiopata, que es la patologa que se observa en nuestro pas. Al sur de nuestro continente adems de las alteraciones cardiolgicas se puede observar un sndrome de dilatacin de vsceras siendo las ms frecuentes las dilataciones de colon y/o esfago, conocidas por el desarrollo de megaesfago o megacolon. Las manifestaciones clnicas de la enfermedad varan segn la etapa de la infeccin. La fase aguda puede presentarse con o sin sintomatologa. Cuando la

sintomatologa se hace evidente, puede ser muy variada, con signos de entrada como el de mazza-romaa, o Chagoma de inoculacin, adems de manifestaciones

sistmicas comunes a otras enfermedades (Aez y col 2001). En esta etapa, las manifestaciones clnicas son ms frecuentemente observadas en nios, donde la enfermedad puede ser mortal. En el adulto se pueden observar casos de mortalidad, pero con mayor frecuencia puede pasar desapercibida o presentarse en forma moderada. En esta fase, las formas tripomastigotes pueden ser detectados en sangre debido a los elevados niveles de parasitemia que se presentan, los cuales son controlados posteriormente por la respuesta inmune. Esta respuesta no erradica completamente al parsito, mantenindose una parasitemia subpatente durante toda la vida del hospedador. Una vez superada la etapa aguda los individuos infectados pasan por un perodo sin sintomatologa clnica, llamada fase indeterminada o asintomtica.

Aproximadamente el 70 % de los pacientes infectados permanece as durante toda su vida, conviviendo con el parsito, sin desarrollar daos importantes en sus tejidos. La seroreactividad para T. cruzi es lo nico que diferencia clnicamente a un paciente asintomtico de un individuo normal, ante la falta de evidencias de daos importantes en tejido cardaco y/o digestivo. De estos pacientes aproximadamente un 30 % de ellos, despus de permanecer por un tiempo asintomtico, desarrollan la fase sintomtica o mocardiomiopata chagsica. Esta fase es de evolucin lenta, generalmente entre 10 y 20 aos, entre el final de la fase aguda y el establecimiento de las lesiones cardacas. Este perodo se caracteriza por la lenta evolucin y por el predominio del dao cardiaco (en nuestro pas), lo que origina la llamada mocardiopata chagsica crnica. En aquellos pacientes que van a desarrollar la mocardiopata, usualmente mueren a causa de una insuficiencia cardiaca, por arritmias graves, o trastornos de conduccin avanzados.

Diagnstico clnico y epidemiolgico: Debido a que la mayor parte de los pacientes en la fase crnica son asintomticos, la mayora llegan a consulta, por referencia de la serologa, que posiblemente se realiz en un banco de sangre, cuando el paciente pensaba donar. Sin embargo, debido a los mltiples problemas que presenta la serologa en esta

enfermedad, el diagnstico debe complementarse con los

antecedentes

epidemiolgicos y clnicos. Es importante conocer la procedencia actual y pasada del paciente, el tipo de vivienda donde habita, el hecho que haya sido picado o de conocer el vector. Adicionalmente, debe averiguarse si existen antecedentes de transfusin sangunea o padres con la enfermedad. En el examen fsico, durante la fase aguda, son importantes los hallazgos referentes a edema, fiebre, hepatoesplenomegalia, adenopatas, taquicardia, arritmias y signos de insuficiencia cardiaca. En la fase crnica: alteraciones del ritmo y trastornos de conduccin del msculo cardaco (cardiopata chagsica crnica) con o sin signos de insuficiencia cardiaca congestiva. DIAGNSTICO DE LABORATORIO: Generales: La va ms especfica para el diagnstico es la deteccin o visualizacin del parsito en sangre, a travs de examen directo. Sin embargo como hemos explicado, el diagnstico parasitolgico es difcil, por lo que de rutina se realiza el diagnstico serolgico. A continuacin voy a presentar brevemente las tcnicas empleadas para el diagnstico parsitologico (directos e indirectos) y los mtodos serolgicos. Al final realizaremos una discusin de las ventajas y desventajas de los mtodos serolgicos y la problemtica del diagnstico de la enfermedad, particularmente en Venezuela. MTODOS PARASITOLGICOS: MTODOS DIRECTOS: Las tcnicas que se describirn a continuacin, presenta niveles de sensibilidad variables que dependen del nivel de parasitemia que presenten los pacientes durante la fase aguda de la enfermedad. Con elevados niveles de parasitemia, los mtodos directos presentan suficiente sensibilidad para garantizar el diagnstico parasitolgico. Sin embargo, el paciente durante la fase aguda puede presentar niveles de parasitemia no tan elevados al estudiarlo, por lo que se recomienda el empleo de mtodos que concentran la muestra de manera de tratar de incrementar el chance de observar el parsito en sangre (Woo PTK, 1971).

Estos mtodos pierden considerablemente la sensibilidad cuando se ensayan en pacientes que se encuentran en la fase crnica, por lo que se recomienda el uso de mtodos parasitolgicos indirectos para poder realizar el diagnostico (MoraesSouza, 1996). A continuacin algunas de las tcnicas empleadas para el diagnstico parasitolgico directo o indirectos. Examen de sangre al fresco: Este mtodo se realiza cuando se sospecha de un paciente que se encuentra en fase aguda. Con esta tcnica se pretende visualizar la presencia de parsitos mtiles circulantes en la sangre del paciente. La sensibilidad durante el pico de parasitemia, en la fase aguda, es menor al 50%, para un slo examen y debe ser repetido varias veces para diferentes muestras de sangre de un mismo paciente, para aumentar su sensibilidad (Moraes-Souza, 1996). Extendido coloreado: Con este mtodo se pretende identificar morfolgicamente la especie de Trypanosoma. Se realiza cuando el examen al fresco resulta positivo. Gota gruesa: Con este mtodo se pretende concentrar un mayor nmero de parsitos en un rea reducida. Durante la fase aguda la sensibilidad puede alcanzar el 66% y la probabilidad de xito se incrementa en funcin de nmero de veces que se repita. Mtodos de concentracin: Anlisis del extendido de la capa blanca: Consiste en centrifugar la sangre heparinizada del paciente y observar al microscopio una fraccin leucocitaria enriquecida. Este mtodo aumenta la sensibilidad del examen al fresco en la fase aguda. Triple centrifugacin: Consiste en remover paulatinamente los eritrocitos de la sangre heparinizada, mediante centrifugaciones a baja velocidad. Luego se centrifugar el plasma recolectado a mayor velocidad para buscar los parsitos en el sedimento. La sensibilidad puede alcanzar hasta un 70% en fase aguda.

Centrifugacin con silicn lquido: Consiste en adicionar silicn lquido a la sangre heparinizada. Al centrifugar se obtienen los eritrocitos en el sedimento y los leucocitos y parsitos en el plasma por encima de la capa de silicn. Este mtodo aumenta la sensibilidad del examen al fresco.

Tcnica de Stout: Una vez retrado el cogulo, el suero recolectado se centrifuga para ver al microscopio el sedimento.

METODOS PARASITOLGICOS INDIRECTOS: Xenodiagnstico: Consiste en la demostracin de T. cruzi en el hospedador intermediario, previamente alimentado con sangre del paciente sospechoso. Este mtodo permite amplificar el nmero de parsitos que se encontraban presentes en la sangre, debido a la fcil multiplicacin del parsito dentro del vector. Para realizarlo, se usan ninfas de triatominos no infectados. Con el fin de constatar la presencia del protozoario dentro del vector, se analiza el contenido intestinal de los triatominos alimentados con la sangre del paciente.(Chiari, E 1992). El anlisis debe realizarse entre 30 y 45 das despus de la ingestin. En las mejores condiciones se ha reportado que la sensibilidad del mtodo, durante la fase crnica podra alcanzar el 60% (Portela-Lindoso y col 2003). Hemocultivo: Consiste en colocar muestras de sangre del paciente, en tubos con medio de cultivo. Las muestras son revisadas a los 20, 30 y 45 das, buscando formas epimastigotes (Chiari, E 1992). En la fase aguda, su sensibilidad podra alcanzar el 100%. Durante la fase crnica, presenta niveles de sensibilidad inferiores al xenodiagstico, pero permite aislar mas fcilmente cepas del parsito. Inoculacin en animales sensibles: Se usa principalmente el ratn o el cobayo, a los cuales se les inocula sangre del paciente tratada con anticoagulantes o con una porcin de la capa blanca. El perodo de observacin es variable, desde 3-4 semanas. Se buscan los parsitos en sangre de animales por el mtodo del examen al fresco y se colorean en extendidos.

Diagnstico Parasitolgico Molecular: El desarrollo de una prueba de amplificacin de ADN, podra llenar los requisitos para tener una prueba de diagnstico parasitolgico. En trminos generales, si los primers son especficos y son empleados a la temperatura de reconocimiento adecuada, el producto de amplificacin debera ser especfico. Como todos los Eucariotes, T. cruzi presenta dos genomas distintos, situados en dos compartimientos celulares bien definidos como el ncleo y la mitocondria. El genoma de T. cruzi es relativamente superior (100-200 106 pares de base (pb)) al de otros parsitos tales como el de Leishmania (45-65 106 pb), o T. brucei (25 106 pb). La cantidad de ADN, varia entre diferentes aislados y entre clones de un mismo aislado. El T. cruzi, se caracteriza por la presencia de una estructura llamada cinetoplasto, el cual se ubica en la base del flagelo y que le otorga su clasificacin dentro del orden kinetoplastidae. El cinetoplasto es una red de maxicrculos y minicrculos, dentro del mitocondrin. El ADN-k, representa el 10-20% del ADN total. Los maxicrculos, son molculas de ADN circular homogneos, mientras que los minicrculos son heterogneos y estn organizados dentro de cuatro regiones bien conservadas de 120 pb y separadas por cuatro regiones muy variables. Dadas las caractersticas y abundancia, tanto las regiones conservadas como las variables, la mayora de las pruebas de amplificacin para el diagnostic y clasificacin de aislados de T. cruzi, son basadas en secuencias provenientes del ADN-cinetoplasto. Mltiples adaptaciones le han realizado a esta tcnica, entre la que destaca la de Wincker, P y col (1997), reportando un 100% de sensibilidad, con 10 ml de sangre. Sin embargo, Gomes, M y col (1999), plantean que esa sensibilidad es debida a las elevadas parasitemias que se observan con los pacientes de las zonas evaluadas en Bolivia y Brasil. La prueba de PCR, ha funcionado con xito durante la fase aguda de la enfermedad (Antas, P 1999), para seguir casos de infeccin congnita (Russomando G; 1998), transplantes (Schijman A 2000) etc. En la fase crnica de la enfermedad la tcnica ha funcionado con un 100% de especificidad. Sin embargo, la sensibilidad ha presentado resultados variables y se requieren elevados volmenes de sangre,

debido a los niveles subpatentes de parasitemia presentes en

los pacientes

(Junqueira, A 1996). Actualmente se han realizado mejoras y se ha estado empleando en estudios de seguimiento de pacientes tratados (Britto, C 2001; LauriaPires L 2000) y estudios epidemiolgicos en poblaciones humanas (Breniere S, 2000; Aez N, 2001) y en perros, como marcadores de erradicacin (Machado E, 2001; Araujo F, 2002), pero sin alcanzar el 100 %. Resulta obvio que una aproximacin diferente debe emplearse para poder alcanzar el 100 de sensibilidad. Para ello quizs habra que emplear una prueba con

mltiples primers y/o mejorar las tcnicas de aislamiento del ADN, con un volumen de al menos 5-10 ml de sangre. MTODOS SEROLGICOS: Desde hace ms de 50 aos se han diseado una serie de reacciones serolgicas que detectan anticuerpos circulantes anti-T.cruzi tales como: la reaccin de fijacin de complemento o prueba Machado Guerreiro, tcnica difcil de estandarizar, razn por la cual ha sido reemplazada por tcnicas ms sencillas y reproducibles (Camargo y col 1973) (Ferreira y col, 1992) tales como la reaccin de Hemaglutinacin (HA). Algunas de estas tcnicas aun son usadas ampliamente, por razones econmicas y no requiere de equipos especiales (Camargo y col, 1992). A continuacin algunas de estas tcnicas. Reaccin de fijacin del complemento: Un anticuerpo especfico en presencia de antgenos de T. cruzi es capaz de unirse formando la unin antgeno-anticuerpo, la cual es capaz de fijar complemento, por la fraccin Fc de la inmunoglobulina. Esta unin no visible, es puesta en evidencia por un sistema indirecto a travs del empleo de glbulos rojos de carnero, sensibilizados con antgenos del parsito. La sensibilidad est alrededor del 87%. Es de hacer notar que en nuestro pas hace poco ms de 10 aos, esta era la prueba que se realizaba de rutina en nuestros Bancos de sangre. Hemoaglutinacin indirecta: Consiste en la adherencia de antgenos especficos sobre la superficie de glbulos rojos, que luego aglutinarn al producirse la reaccin entre el antgeno y el anticuerpo homlogo existente en el suero inactivado del paciente. Esta reaccin

tiene una sensibilidad comparable a la reaccin de fijacin del complemento, pero es ms sencillo su desarrollo e interpretacin y no requiere de equipos especiales para su implementacin. Reaccin de anticuerpos lticos: Consiste en incubar el suero de paciente con tripomastigotes sanguneos purificados y vivos. La reaccin se revela por la adicin de complemento y se determina la lsis de los parsitos por recuento en cmara de Neubauer. La existencia de anticuerpos lticos se ha asociado a un efecto inmunoprotector , al postularse que cuando el paciente est curado, los ttulos de este tipo de anticuerpos desaparecen (Krettli y col 1984). Esta reaccin se hace negativa en ausencia de parsitos (esterilidad parasitaria), de ah que se proponga como criterio de curacin despus del tratamiento. Esta tcnica consume mucho tiempo, esfuerzo y recursos econmicos Acoplamientos a los anticuerpos: Dada la necesidad de incrementar la sensibilidad de las tcnicas de deteccin, se desarrollaron una serie de cambios que amplifican las seales obtenidas. Fundamentalmente estos cambios ocurren en el segundo anticuerpo que a su vez reconoce al anticuerpo primario que es el que confiere la especificidad. Entre las ms relevantes y en orden creciente de sensibilidad se encuentran: IFI, anticuerpo acoplado con molcula de fluoresceina; ELISA, una enzima acoplada al anticuerpo, o si se requiere de ms sensibilidad, anticuerpo Biotinado y amplificado con avidina, la cual a su vez posee acoplada varias molculas de la enzima. A continuacin algunas de estas tcnicas, desarrolladas para detectar anticuerpos de pacientes chagsicos: Reaccin de inmunofluorescencia Indirecta (IFI): Esta tcnica posee ms sensibilidad que las pruebas serolgicos descritas. La reaccin detecta la existencia de anticuerpos dirigidos a T. cruzi, frecuentemente formas epimastigotes de cultivo, que son reconocidos por los anticuerpos de las personas infectadas. Un segundo anticuerpo marcado con un fluorocromo que reconoce al anticuerpo especifico que ha reconocido al parsito, nos permite detectarlos, cuando son observados en un microscopio para fluorescencia, equipado

con luz ultravioleta. El fluorocromo se excita, permitiendo la identificacin visual de las reacciones positivas. Los principales problemas que presenta esta tcnica son: 1) la posible subjetividad en la interpretacin de los resultados. 2) requiere el uso de equipos especializados. 3) requiere un personal entrenado. 4) Los resultados son cualitativos. Alvares y col (1968). Reacciones inmunoenzimticas: Esta tcnica conocida bajo el nombre ELISA (enzyme linked inmunosorbent assay) se basa (en trminos generales) en la posibilidad de inmovilizar el antgeno a una fase slida, sobre la cual se permite en una primera etapa la unin del anticuerpo. En una segunda etapa de la reaccin, se aade un segundo anticuerpo acoplado a una enzima, permitindose la visualizacin de la reaccin cuando se agrega el sustrato correspondiente. La reaccin, luego de detenida con los reactivos adecuados, se puede leer por un cambio de color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos que han reconocido el antgeno fijado. Entre las ventajas que ofrece esta tcnica se encuentran: la gran capacidad para procesar un nmero importante de muestras, sus resultados son cuantitativos, evitando la subjetividad a la hora de interpretar los resultados, fcil manejo y un bajo costo. Esta reaccin es considerada como la de ms alta sensibilidad, parmetro que vara dependiendo de la calidad y caractersticas de los antgenos empleados. Por ejemplo, los antgenos completos presentan altos niveles de sensibilidad, pero confieren baja especificidad (Carbonetto y col 1989; Katzin y col (1989); Snary y col 1991; Godsel y col (1995) Los pptidos o protenas recombinantes pueden ser muy especficos, pero disminuyen la sensibilidad, pudiendo diagnosticarse falsos negativos. Obviamente, la solucin debera ser intermedia, sugirindose el empleo de varias protenas recombinantes (Umezawa y col (1999); Saez-Alquezar (2000); da Silveira y col (2001); Ferreira y col (2001), pero aun as, se recomienda el empleo de varias pruebas para tener un diagnstico certero.

An cuando esta tcnica podra alcanzar un 100 % de sensibilidad, la prueba con anticuerpos de pacientes Chagsicos presenta serios problemas de reactividad cruzada con otras enfermedades, tal como explicamos en los antecedentes. Problemtica del diagnstico serolgico: Un problema comn para todos estos ensayos, a pesar de los niveles de sensibilidad de las tcnicas empleadas, es la persistencia de resultados falsos, como consecuencia de la gran capacidad que presentan los anticuerpos de pacientes que padecen otras enfermedades, tales como Leishmaniasis, Sfilis, Fiebre Reumtica, Malaria, Toxoplasmosis, o con infeccin con T. rangeli, de reaccionar con los antgenos de T. cruzi. (De Andrade y col 1992; Ferrereira y col 1993; Brito y col 1999; Monteon-Padilla, 1999). En este contexto, en un rea endmica, se pueden presentar en los Bancos de sangre problemas importantes de falsos positivos, que conducen a un descarte substancial de unidades de sangre, en sitios donde el problema econmico es casi siempre una constante. Adems del problema de especificidad, el inconveniente ms importante es la existencia de donantes con diagnsticos falsos negativos, los cuales son los casos ms peligrosos, debido a la posibilidad de transmitir la enfermedad por una transfusin de sangre. Talleres realizados por diferentes laboratorios

Latinoamericanos han demostrado que el empleo de una sola prueba no garantiza un diagnstico certero independientemente de la preparacin antignica (Mott y col, 1976; Zicker y col, 1989; OMS/OPS, 1992; De Andrade y col, 1992; Carvalho y col, 1993). Por ello, para que el diagnstico de laboratorio sea certero, se recomienda emplear por lo menos tres reacciones serolgicas. Sin embargo, debido a que la mayora de los pases donde la enfermedad es endmica, poseen pocos recursos econmicos, se sugiere el empleo de al menos dos metodologas diferentes, con antgenos diferentes. Si ambas pruebas resultan positivas, se considera al individuo infectado. En el caso que exista disparidad entre ambas pruebas es necesario realizar una tercera tcnica o repetir alguna de las pruebas, para que se pueda definir el status del paciente (Moraes-Souza, 1996).

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