CRECIMIENTO MICROBIANO Y EFECTO DE LOS CONTAMINANTES

OBJETIVOS a) Realizar una curva de crecimiento bacteriano utilizando las tcnicas de cuenta total y de cuenta viable. b) Determina la forma en que un compuesto txico, como el sulfato de cobre, afecta el crecimiento radial de los hongos filamentosos. c) Determinar el efecto de un compuesto x en el crecimiento poblacional de bacterias. INFORME a) Trace una grfica de crecimiento de clulas viables (log. del nmero da bacterias por ml contra tiempo en horas). Tabla 7.1 Cintica de crecimiento bacteriano por cuenta viable. Tiempo (h)
Tiempo Incubado (h)

Equipo

Nm. de colonias

Diluci n (10x)

Alcuot a

UFC/ml

log(UFC/ml )

0-09:30 1-10:20 2-11:10 3-12:27 4-13:26 5-14:05 6-15:21 7-16:05 8-17:10 9-18:05

0 .83 1.66 2.95 3.93 4.58 5.85 6.58 7.66 8.58

1 8 4 7 2 6 5 10 3 9

155.5 44 101 157.5 100 196 47 119 9.5 44.5

-4 -5 -5 -5 -5 -5 -6 -6 -7 -8

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

1.5x107 4.4x107 1.01x108 1.6x108 1x108 1.9x108 4.7x108 1.2x109 9.5x108 4.45x1010

7.176 7.643 8.004 8.204 8 8.279 8.672 9.079 8.978 10.648

b)

Considere los valores de la fase logartmica y calcula la ecuacin de la recta, por medio de regresin lineal. Tomando los puntos de inflexin de la curva calcule por medio de la ecuacin los valores iniciales y finales de clulas. Determine el tiempo de generacin.
-Grfica 7.2 log UFC/ml =f (t). -Grfica 7.1 UFC/ml =f (t).

Se sabe que para calcular g=numero de generaciones, solo se toma en cuenta nicamente la fase log que con ayuda del profesor Trinidad Meja Coahuila se consideraron los siguientes datos. Tabla 7.2 Tiempos tomados en cuenta en la fase log u exponencial.
Tiempo Incubado (h) EJE X log (UFC/ml). EJE Y

2.95 4.58 5.85 6.58

8.204 8.279 8.672 9.079

CLCULOS: De la ecuacin de la recta obtenida sabemos que: y=m x + b y=0.2321x+7.4006 Donde: -y=nmero de microorganismos. -m (pendiente)=0.2321 -x=tiempo. -b (ordenada al origen)=7.4006 Con estos valores podemos encontrar el nmero final de microorganismos, sustituyendo el tiempo de incubacin final (8.58). Nm. final de m.o y=0.2321 (8.58)+7.4006 -Grfica 7.3 log UFC/ml.=f (t). (fase log) Nm. final de m.o=9.392 A este ltimo valor es necesario aplicar el anti log ya que la grfica representa el log UFC/ml.

antilog (9.392)=2.466141548x109nmero de organismos finales. Mediante la ecuacin Convirtindola a logaritmos 2gNo=Nf logNf=glog2+logNo

Despejando obtenemos el nmero de generaciones g=logNf-logNolog2 Sustituyendo valores obtenidos: g=9.392-7.4006log (2)= 6.6153 Para calcular el tiempo de generacin (t.g) empleamos la ecuacin: t.g=tiempo de la fase lognumero de generaciones *tiempo de la fase log=6.58-2.95=3.63 h. Sustituyendo valores: t.g=tiempo de la fase lognumero de generaciones =3.63 hora6.6153=0.5487 h x 60 min= 32.9237 minutos. Cabe resaltar que durante el desarrollo de la clase terica se explico del siguiente modo el clculo anterior. t.g=tiempo de la fase lognumero de generaciones =8.58 hora6.6153=1.30 h = 90 minutos. Concentracin 24 0 ppm 0.1 ppm 0.4 ppm 0.7 ppm 1 ppm 3 2.5 1.5 2.5 2 48 14.5 20 20.5 7.5 4.5 Tiempo (h) 72 21.5 24.5 28.5 11.5 6 96 26 29.5 35 13 8 120 29 37.5 39 15 14.5

c) Trace una grfica de crecimiento radial del hongo en mm contra tiempo en horas, incluyendo en la misma grfica todos los tratamientos con sulfato de cobre. Tabla 7.3 Efecto del CuSO4 sobre el crecimiento radial de un hongo filamentoso EQUIPO 4.

Tabla 7.4 Efecto del CuSO4 sobre el crecimiento radial de un hongo filamentoso EQUIPO 5. Tiempo (h) 24 h 48 h 72h 0 0.5mm. 16.5mm . Crecimiento radial en (mm). 0.1 ppm 1mm. 16.5mm . 0.4 ppm 2.5mm. 13.5mm 0.7 ppm 0 10mm. 1.0 ppm 0 5mm.

22.5 21.5mm 16.5 12.5mm 7mm. mm. mm. . Grafico 7.4 Crecimiento radial=f (t) EQUIPO 4

Ilustracin 7.1 Crecimiento final en las placas de hongos (EQUIPO 5)

Trace una grfica de crecimiento total de la bacteria (lecturas Klett contra tiempo en horas), incluya en la misma grfica todos los tratamientos. Grafico 7.5 Crecimiento radial=f (t) EQUIPO 5 a) Proceda de la misma forma que en el punto dos y calcule el tiempo de generacin para cada curva. b) Analice cada una de las grficas y discuta los resultados.
Tabla 7.4 Efecto de los diferentes compuestos en el crecimiento de bacterias, determinado por densidad ptica (unidades Klett). Concentracin Tiempo (horas)

0 E. coli Testigo - naftol Paratin Diazinn Surfactante LAS Surfactante ABS Zn Co 0 0 0 0 15 0 0 38 19

0.83 0 9 7 13 14 0 0 57 34

1.66 0 0 19 11 17 0 11.5 56.5 45.5

2.95 3 9 8 6 12 9 7 44 29

3.93 5 5 6 6 11 9 6 47 27

4.5 8 30 23 15 14 30 21 16. 5 33 38

5.85 45 30 14 14 38 33 21 60 35

6.58 60 47 15 14 45 45 35 80 32

7.66 95 60 13 15 60 47 45 80 27

8.58 106 70 14 13 79 69 65 95 23

5.-Proceda de la misma forma que en el punto dos y calcule el tiempo de generacin para cada curva. Los tiempos tomados en cada grfica expresan nicamente la fase log.

Se tomaron los tiempos 4.58-7.66 Ecuacin de la recta y=o.7194806059 + 0.162476133T g=logNf-logNolog2 g=2.113525827-0.7194806059log2=4.63 T.g=3,084.63=0.67
Grfica 7.7 E.Coli U.K =f (t).

Se tomaron los tiempos 4.587.66 Ecuacin de la recta

Grafico 7.6 Unidades Klett=f (t)

y=0.1420498776T +0.6961819296 g=logNf-logNolog2 g=1.914969879-0.6961819296log2=4.05 T.g=3.084.05=0.7 Se tomaron los tiempos 0.83-1.66 Ecuacin de la recta y=0.5224765794T+0.4114424791 g=logNf-logNolog2 g=4.89429153-0.4114424791log2=14.89 T.g=0.8314.89=0.06
Grfica 7.9 Alfa naftol U.K =f (t). Grfica 7.9 Testigo U.K =f (t). Grfica 7.8 Testigo U.K =f (t).

Se tomaron los tiempos 4.58-7.66 Ecuacin de la recta y=8.91074056210-3T+1.098661849 g=logNf-logNolog2 g=1.175116003-1.098661849log2=0.25 T.g=3.080.25=12.32
Grfica 7.9 Paratin U.K =f (t).

Se utilizaron los tiempos 4.58-7.66 Ecuacin de la recta y=0.09750175481T+1.020725081 g=logNf-logNolog2 g=1.857290137-1.020725081log2=2.78 T.g=3.082.78=1.11
Grfica 7.10 Diazinn U.K =f (t).

Se tomaron los tiempos 4.58-7.66

Ecuacin de la recta y=0.150376264T+0.6405786414 g=logNf-logNolog2 g=1.930806987-0.6405786414log2=4.29 T.g=3.084.29=0.72

Grfica 7.11 Surfactante LAS U.K =f (t).

Se tomaron los tiempos de 4.58-7.66 Ecuacin de la recta y=0.14979761T+0.5103669318 g=logNf-logNolog2 g=1.795630426-0.5103669318log2=4.27 T.g=3.084.27=0.72
Grfica 7.12 Surfactante ABS U.K =f (t).

Se tomaron los tiempos de 4.58-7.66

Ecuacin de la recta y=0.1295526257T+0.9766954722 g=logNf-logNolog2 g=2.088257001-0.9766954722log2=3.69 T.g=3.083.69=0.83

Grfica 7.13 Zn U.K =f (t).

Se tomaron los tiempos 0.83-1.66 Ecuacin de la recta y=0.1524487706T+1.404946437 g=logNf-logNolog2 g=2.712956889-1.404946437log2=4.35 T.g=0.834.35=0.2
Grfica 7.13 Zn U.K =f (t).

Discusin: Segn los datos obtenidos en el experimento la cintica de crecimiento de E.Coli fue solo hasta la fase log, debido a que el experimento no se llevo a cabo en los tiempos necesarios para poder observar la fase estacionaria y de muerte. Por el comportamiento en los datos se cree que el microorganismo no tardo en acoplarse al medio demasiado tiempo, esto significa que la fase lag fue de muy corta duracin aproximadamente 20- 30 min. Por lo que la fase log o exponencial se dio de forma casi inmediata, esto se observa en los datos de la tabla ya que siempre existi un crecimiento poblacional del microorganismo. En los datos obtenidos para empezar a calcular las graficas de fase log se omiti un punto (tiempo 4) el cual se cree errneo ya que a ese tiempo el nmero de UFC disminuyo lo que no es posible ya que el siguiente dato volvi a aumentar el nmero de UFC. Al linealizar el comportamiento de la fase log se observa que el valor de R es de .83 lo cual indica que el comportamiento obtenido de forma experimental se ajusta a un modelo lineal en un 83%. Se encontr una discrepancia en el mtodo para calcular el valor del tiempo de generacin ya que en clase terica se tuvieron ciertos inconvenientes respecto a la obtencin de la formula y de las incgnitas y se realizo de la siguiente forma Se toma como tiempo de la fase log el valor 8.58 lo cual creemos es incorrecto ya que este valor es el tiempo total de incubacin ms no representa el tiempo especfico de la fase log tomada en cuenta para obtener la ecuacin de la recta, por tanto el resultado obtenido fue de 90 minutos. Por lo tanto el valor encontrado con un anlisis grfico resulta de 32 min aproximadamente lo cual nos indica un valor ms cercano al esperado segn la bibliografa en condiciones normales, el dato de 32 minutos de tiempo de generacin se puede deber al trato del matraz en donde se encontraban los microorganismos ya que se sacaban y metan del autoclave para poder tomar la alcuota lo cual esas pequeas modificaciones de temperatura ocasiono que el tiempo de generacin fuese un poco mayor al consultado en bibliografa (Bioqumica de los microorganismos, Pares Ramn, Jurez Antonio, Ed. Revert, Espaa, Ao 1997, pg. consultadas: 7.) Respecto al crecimiento radial de hongos, para el desarrollo en el equipo 4 se logro inocular al hongo, sin embargo el efecto del contaminante CuSO4 sobre el crecimiento radial del hongo no es evidente ya que el hongo logro desarrollarse de mejor modo en la placa de 0.4 ppm lo cual nos indica que tal microorganismo se ve beneficiado en presencia de cobre. El equipo 5 realizo por duplicado tal tratamiento pero se tomaron los datos de crecimiento radial nicamente en una placa ya que se crey la primera siembra haba sido errnea en el desarrollo tcnico, lo cual no es correcto ya que el hongo escogido presentaba un lento crecimiento porque despus de 15 das se observ el crecimiento como se muestra en la ilustracin 7.1 , al segundo inoculo se observo un crecimiento como lo que se esperaba a mayor concentracin de CuSO4 menor crecimiento radial, cabe resaltar que de este ltimo solo se pudo medir el crecimiento del hongo 3 das ya que se sembr el Mircoles 21 de Septiembre y el Viernes 23 de Septiembre se midi por ltima vez. En el experimento de densidad ptica se logra observar que el crecimiento poblacional del microorganismo se ve afectado por la adicin de un contaminante, en el caso de alfa naftol, nitrato de cobalto y paratin el crecimiento se ve muy reducido ya que en presencia de estos contaminantes el microorganismo no logro crecer ya que no logro adaptarse al efecto del contaminante. En todos los casos el crecimiento es menor al obtenido en el testigo por lo que se difiere que ninguno de estos contaminantes ayuda al crecimiento del microorganismo, el nico efecto que tiene sobre el es negativo ya que disminuye su crecimiento poblacional y se ve reflejado en las

unidades Klett de forma intuitiva ya que la turbidez del medio indica solo la presencia de microorganismos ya sean vivos o muertos. Conclusin: En la prctica se logro observar la tendencia de las fases de crecimiento as mismo el efecto de los contaminantes en el crecimiento radial de los hongos y en bacterias. Por lo cual se logro cumplir con los objetivos para esta prctica. Estos comportamientos son importantes conocer para poder determinar el efecto de un contaminante en cierta zona o su posible degradacin ocupando microorganismos.

CUESTIONARIO
a) Cul es el efecto de cada uno de los contaminantes sobre el microorganismos que afectan su tiempo de generacin? Contaminante Alfa naftol Efecto

Desnaturaliza a las protenas de las bacterias, daando a la membrana de las clulas.

Paratin

Plaguicida organofosforado que rompe membrana lpidica de las clulas bacterianas, altamente toxico a bajas concentraciones

Diazinn

Interfiere con la fertilidad femenina; produce efectos cancergenos.

Surfactante LAS

Es un detergente que puede ser biodegradado por lo cual no afecta demasiado el crecimiento poblacional Al tratarse de un detergente ramificado su degradacin es muy lenta, afectando el crecimiento del microorganismo, rompe la membrana

Surfactante ABS

lipidica de las bacterias con mayor facilidad al no ser degradado Cloruro de zinc (ZnCl2) Nitrato de cobalto Co(NO3)2 El Cl es un halgeno altamente oxidante, inactiva enzimas proteicas El metal pesado Ni destruye sitios activos de los microorganismos

b) Cul es la aplicacin prctica que usted podra darle al crecimiento bacteriano o micelial en estudios de contaminacin? La aplicacin de esto es que la presencia de algunos microorganismos en determinado sitio, son indicadores de contaminacin por lo que tener el conocimiento de los procesos biolgicos es muy importante para poder aplicarlo por ejemplo en el tratamiento de aguas residuales, para optimizar su operacin; desarrollar procesos especializados, con base en microorganismos, para el tratamiento; desarrollar mtodos modernos para detectar microorganismos patgenos en aguas tratadas; uso de la biodiversidad para aislar y aplicar microorganismos capaces de degradar contaminantes especficos, acelerando las cinticas de los procesos y trabajando en condiciones extremas; desarrollar y adaptar tecnologa biolgica que asegure alcanzar los requerimientos de tratamiento que marca la normatividad mexicana. Diagnstico y seguimiento del tratamiento de suelos contaminados; identificacin y modificacin de las especies participantes en los consorcios responsables de la biorremediacin de suelos; para modificar/degradar contaminantes, en particular compuestos aromticos y azufrados, mutagnicos, derivados del petrleo (combustibles) y de pesticidas; desarrollo de procesos biolgicos para eliminar iones metlicos pesados. El problema de la contaminacin de los sistemas marinos es cada vez mayor y amenaza seriamente el equilibrio de estos ecosistemas. La modificacin de bioprocesos, entre los que destacan: las fermentaciones industriales con microorganismos modificados mediante ingeniera de vas metablicas; las fermentaciones o procesos de biocatlisis que derivan del uso de la biodiversidad gentica, resultado de la bsqueda, seleccin y mejora de microorganismos y genes en el medio ambiente. Existe la necesidad de aplicar la biotecnologa para resolver muchos de los problemas que aquejan al pas, y que se reflejan en la necesidad de modernizacin de los sectores industriales, es necesario conocer en qu fase de crecimiento se encuentran los microorganismos para optimizar los costos por tiempo de produccin por ejemplo la produccin de biomasa ya que este se mejorara si los microorganismos fueran utilizados en su fase log de crecimiento. BIBLIOGRAFA -Bioqumica de los microorganismos, Pares Ramn, Jurez Antonio, Ed. Revert, Espaa, Ao 1997, pg. consultadas: 5-13. http://www.reuters.com/article/2011/06/06/us-ecoli-beansprouts-idUSTRE7552N720110606