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Evaluacin de medios de induccin, control de la oxidacin y contaminacin en el cultivo in vitro de Junna ( Polylepis microphylla)

JARAMILLO Alfonso1, JADAN Mnica2, SEGOVIA Claudia3


Escuela Politcnica del Ejrcito, Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa, Laboratorio de Cultivo de Tejidos. E-mail: 1 2 pablojaramillobiotec@yahoo.com . monica.jadan@espe.edu.ec ;

RESUMEN.
El gnero Polylepis es la vegetacin leosa dominante del pramo que crece a mayor altura en Sudamrica. Se encuentra ampliamente distribuido a lo largo de los Andes, cumple una funcin fundamental para la captacin de agua. En la ltima dcada el hbitat de este gnero ha sido dramticamente fragmentado, Polylepis microphylla actualmente es una especie vulnerable y en peligro de extincin local. Una tcnica biotecnolgica como medida de conservacin de esta especie es la micropropagacin, la finalidad de este estudio es determinar el mejor medio de establecimiento que es una de las primeras fases de la micropropagacin. En los primeros intentos por establecer explantes de P. microphylla in vitro se observ una alta contaminacin y ennegrecimiento de los tejidos. En el presente trabajo se evalu el mejor tiempo de inmersin (10, 20 y 30 min.) y tres concentraciones de (10, 20 y 30%) de cloro comercial (5,25% de hipoclorito de sodio) en la desinfeccin de explantes de P. microphylla. El tratamiento 10 min. en cloro comercial al 30% mostr el menor porcentaje de contaminacin y la mayor sobrevivencia de los explantes. El mejor mtodo de control de oxidacin fue una modificacin de la concentracin de nutrientes del medio (K ,N, FeSO4 y sacarosa) minimizando la oxidacin fenlica, y permitiendo mayor sobrevivencia de los tejidos. Palabras clave: Polylepis microphylla, micropropagacin, contaminacin, oxidacin, desinfeccin INTRODUCCIN. El gnero Polylepis es la vegetacin leosa dominante del pramo, pertenece a la familia Rosaceae, subfamilia Rosoidea, Tribu Sanguisorbeae. El ecosistema del pramo en el Ecuador est localizado en las 2 montaas ocupando alrededor de 20000 km , extendindose desde los 3000 m hasta la lnea de nieve perpetua a los 4800-5000 m.s.n.m. (Luteyn, 1999 en Segovia-Salcedo, 2001). En el Ecuador han sido identificadas siete especies: Polylepis lanuginosa, P. sericea, P. pauta, P. reticulata, P. weberbaueri, P. microphylla, y P. incana (Romoleroux, 1996). Dos de ellas (P. lanuginosa, P. reticulata) son endmicas y seis son consideradas vulnerables debido a su estado actual de aislamiento y tamao poblacional. Los bosques de Polylepis son importantes por su capacidad de captar neblina y proteger las cuencas que proveen de agua a los habitantes, adems estos bosques proveen refugio para una serie de animales y plantas, en su mayora endmicos de estos bosques como lo son las aves: Anairetes alpinus, Cinclodes aricomae, Poospiza garleppi, Oreomaes fraseri (Fjelds, 1992). La prdida del hbitat est destruyendo rpidamente uno de los tesoros ms valiosos del Ecuador, su diversidad natural. Polyleps microphylla cumple los tres estamentos necesarios para ser considerada de manera

urgente como una especie rara en peligro que son: tamao poblacional reducido, distribucin geogrfica restringida y hbitat restringido. Esta especie presenta dificultades de propagacin vegetativa tradicional y baja viabilidad de semillas, frente a estos problemas una alternativa biotecnolgica, es la micropropagacin, pero para estandarizar y desarrollar esta tcnica hay que enfrentarse a varios problemas, uno es la presencia de microorganismos contaminantes, hongos y bacterias, durante el establecimiento in vitro de explantes procedentes de esta especie leosas, sobretodo de condicin adulta y cuyas muestras son tomadas directamente en el campo. Las plantas perennes leosas son consideradas ricas en substancias derivadas del metabolismo secundario como los polifenoles, los cuales estn involucrados en la defensa ante microorganismos y depredadores. En condiciones in vitro se produce un estrs fisiolgico que de igual manera hace que el tejido biosintetice estos metabolitos y se produzca la oxidacin fenlica siendo esto el principal problema al que nos enfrentamos en la fase de establecimiento y durante el cultivo in vitro. Incluso trabajando en condiciones ptimas y muy poco agresivas, los tejidos que forman el explante sufren siempre en mayor o menor medida situaciones de estrs (desecacin, daos mecnicos, daos en la desinfeccin, cambios en los potenciales hdrico, salino y osmtico al ser incubados en el medio de cultivo, cambios de pH.), y todo esto provoca la estimulacin de estos metabolismo de los compuestos fenlicos (Lpez, 2000). La oxidacin fenlica esta catalizada por la enzima polifenol oxidasa, siendo un producto de esta reaccin un tipo de quinonas, unas substancias de color amarillo, las cuales se ligan a protenas y enzimas de la membrana celular causando alta toxicidad y muerte del tejido vegetal. En general los fenoles son sustancias lbiles y fciles de oxidar, y los productos de esta oxidacin tienen carcter fitotxico, por lo que son capaces de alterar procesos morfogenticos o de crecimiento y desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidacin, ya que tras su

propia oxidacin se convierten en potentes oxidantes (Lpez, 2000). Por esta razn la importancia del control de la oxidacin al trabajar con leosas y unas de las maneras en que se puede minimizar es haciendo una modificacin del medio de cultivo o una reduccin del potencial redox. En la modificacin del medio de cultivo se puede reducir las concentraciones de nitrgeno, potasio, FeSO4 y sacarosa, esto favorece para una menor sntesis de polifenoles y oxidacin fenlica. En la modificacin del potencial redox se puede emplear soluciones antioxidantes como el cido ctrico, cido ascrbico, cistena HCl, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que tras su oxidacin pasan a ser oxidantes muy potentes, invirtindose su efecto positivo en el control de los fenoles Evitar o suavizar los estreses que provocan o estimulan su biosntesis, es el mejor mtodo para impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan efectos txicos e inhibicin del crecimiento. Una prctica adecuada sera cuidar que las condiciones fitosanitarias y fisiolgicas de las plantas madres origen de los explantes fueran idneas en la Fase de toma des muestras y que los mtodos de desinfeccin y aislamiento fueran lo menos agresivos posibles en la fase de establecimiento de los cultivos. Otros mtodos que dan buen resultado si la sntesis de fenoles no puede evitarse son, la dispersin, adsorcin o lavado, con sustancias como el carbn activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la inactivacin de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros sistemas como la incubacin en condiciones de oscuridad, bajo pH, incubacin a temperaturas ms bajas, que persiguen reducir la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos (Lpez, 2000). El objetivo de este trabajo fue evaluar procedimientos de desinfeccin superficial con hipoclorito de sodio y el uso de antioxidantes y modificaciones del medio de cultivo durante el establecimiento in vitro de explantes de P. microphylla, para controlar la contaminacin y el ennegrecimiento de los tejidos.

MATERIALES Y MTODOS Se tomaron muestras de yemas apicales extrado de plantas ubicadas en la Provincia del Chimborazo, cantn Alaus, parroquia Achupallas a los 3800 m.s.n.m, mediante una seleccin in situ de plantas proveedoras de ramas, las cuales tuvieron las mejores caractersticas fenotpicas, como nmero renuevo de yemas apicales, follaje perenne y denso, libres de enfermedades y hongos. Una vez recolectadas las muestras, se colocaron en bolsas plsticas de polietileno, se colocar unos 100 ml de agua destilada y estril a fin de evitar la prdida de humedad y reducir el proceso de deterioro fisiolgico del material vegetal; las bolsas se empacan en un cooler para evitar daos mecnicos durante su transporte al laboratorio. Las yemas fueron lavadas inicialmente con detergente por 15 minutos, luego fueron sumergidas en Alcohol 70% por un minuto, despus en una solucin de cloro comercial (5,25% de hipoclorito de sodio) en tres concentraciones (10, 20 y 30%), durante tres perodos de inmersin (10, 20 y 30 minutos) y finalmente se lavaron tres veces con agua destilada estril dentro de las cmaras de flujo laminar. Las yemas fueron sembraron en tubos de ensayo con 8 ml del medio nutritivo de Chu 1975 (N6) con la vitaminas de Kao y Michayluk (1975), 50g/L de sacarosa y como reguladores de crecimiento 1 mg/L de Bencilamino purina (BAP), 1mg/L de cido giberlico y 0,5 mg/L de cido indol butrico (AIB), pH 5,6-5,7. El diseo experimental para desinfeccin fue un DCA con 3 tratamientos y 15 repeticiones. Para evaluar el control de oxidacin mediante la modificacin del medio de cultivo, las yemas fueron sembraron en tubos de ensayo con 8 ml del medio nutritivo de Chu 1975 (N6) con la concentracin de Nitrgeno, Potasio, FeSO4 y sacarosa a la mitad, con la vitaminas de Kao y Michayluk (1975), 25g/L de sacarosa y como reguladores de crecimiento 1 mg/L de Bencilamino purina (BAP), 1mg/L de cido giberlico y 0,5 mg/L de cido indol butrico (AIB). Este medio se evalu frente un control con las concentraciones normales de medio Chu 1975 (N6) con las mismas vitaminas y reguladores de crecimiento.

Otro evaluacin a la par para control de oxidacin mediante modificacin del potencial Redox fue el realizar 4 lavados con soluciones antioxidantes despus de la fase de desinfeccin, con cido ctrico 300mg/L, cido ascrbico 300 mg/L, cistena HCl 4g/L y en combinacin cido ctrico y cido ascrbico 300 mg/L. En todos los medios se trabaj a pH 5,6-5,7. El diseo experimental fue un DCA con 4 tratamientos y 10 repeticiones. La evaluacin de los porcentajes de contaminacin, sobrevivencia y oxidacin se realiz a los 25 das despus del establecimiento del ensayo. RESULTADOS Y DISCUSIONES. Los menores porcentajes de contaminacin se obtuvieron al trabajar al 30% por 10 min. y al 20 % por 20 min. (Grfico 1), pero el que permiti mayor sobrevivencia del tejido fue al 30% por 10 min. puede ser debido al menor tiempo de inmersin.. Concentraciones muy elevadas o tiempos de inmersin muy prolongados aumentan los daos en los tejidos vegetales y provocan la necrosis y muerte celular, por esta razn para determinar el mejor mtodo de desinfeccin se debe tomar no solo en cuenta el que menos contaminacin tiene, sino el que permite mayor sobrevivencia con menor contaminacin. Otro factor a tomar en cuenta es la pubescencia del tejido (Villalobos y Prez (1979) en Snchez et al,. 2004) sealaron que, si el tejido es pubescente, debe hacerse un prelavado con detergente o etanol 70% durante 30s para romper la tensin superficial y hacer la superficie ms accesible a la accin de los agentes desinfectantes, por esta razn despus del lavado con el detergente se sumergi el tejido en alcohol 70% por un minuto para los explantes de P. microphylla. Al respecto, (Jimnez (1999) en Vega et al., 2006) menciona que los mtodos de desinfeccin utilizados no siempre eliminan las poblaciones de bacterias asociadas a los tejidos de las plantas in vivo; muchas son capaces de permanecer latentes en el interior de las clulas, en los espacios intercelulares o en los haces conductores quedando protegidas, de esta manera, de los agentes qumicos. Esto podra explicar los resultados

obtenidos en cuanto a la dificultad de eliminar por completo la contaminacin. Para el control de oxidacin mediante una modificacin del potencial redox, se evaluaron 4 tratamientos con soluciones antioxidantes, los niveles ms bajos de oxidacin se los pudo obtener con cisterna 4g/l, permitiendo tambin la mayor sobrevivencia del tejido vegetal.

La cistena, de acuerdo con (George y Sherrington (1984) en Snchez et al,. 2004), no previene la oxidacin, sino que acta en la rpida remocin de cualquier quinona que se forma. Adems, como es un aminocido, pudo haber inducido un rpido desarrollo de los explantes al ofrecer nitrgeno orgnico rpidamente disponible para suplir sus requerimientos.

50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

46,67%

30% 26,67% 20% 13,33% 10% 6,67% 0% 30 20 10 minutos 6,67% Tejido vivo Concentracion ( Cloro 5,25%) Contaminados

Grfico 1. Evaluacin de los tratamientos de desinfeccin a diferentes concentraciones y tiempos de inmersin, sobrevivencia y contaminacin a los 25 das.

Foto 1. Resultados del lavado con Cisterna HCl 4g/L.

Oxidacin de los medios de cultivo


70 60 50 40 30 20 10 0 Cisteina Ac. ascrbico Ac. ctricio Ac. ctrico y ascrbico

61,165 45,925

61,165 51,695

Cisteina Ac. ascrbico Ac. ctricio Ac. ctrico y ascrbico

Tratamientos

Grfico 2. Nivel de oxidacin Modificacin del potencial redox.

Para el control de la oxidacin mediante la modificacin de la concentracin de nutrientes, al disminuir el nitrgeno, potasio, FeSO4 y sacarosa, se logr minimizar la sntesis de polifenoles y oxidacin fenlica,

permitiendo una mayor sobrevivencia de los tejidos y formacin de brotes. Con esta modificacin se pudo obtener una sobrevivencia del 51,02 % versus el control que solo permiti una sobrevivencia del 24%.

Promedio de Oxidacin en el medio


60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Control M2 Medio M2

51,02 Control M2 24,40 Medio M2

Tratamientos

Grfica 3. Control de oxidacin mediante modificacin del medio cultivo versus un control.

Foto 2. Resultados del control de oxidacin mediante modificacin de nutrientes del medio de cultivo versus un control.

CONCLUSIONES: El mejor mtodo de desinfeccin fue al 30% de cloro comercial por 10 min. con una sobrevivencia del tejido del 26,67 % y una contaminacin solo del 6.67%. Tiempos muy prolongados de inmersin en cloro causan la necrosis del tejido. Para control de oxidacin mediante modificacin del potencial redox el mejor resultado fue una solucin de lavado de cisterna HCl 4g/L, y para el control de oxidacin mediante modificacin de los nutrientes del medio, una disminucin a la mitad de las concentraciones de K, N, FeSO4 permiti una mayor sobrevivencia de los tejidos, formacin de brotes y reduccin de la oxidacin fenlica, con una sobrevivencia del 51,02%

Lpez C, 2000, Reacciones de hipersensibilidad en plantas cultivadas in Vitro,http://www.ciencias.uma.es/publicacione s/encuentros/ENCUENTROS26/26reaccione s.html Romoleroux K., Rosaceae Flora of Ecuador., 56 (1996). Snchez C., Salaverra J.. Control of oxidation and contamination of strawberry (Fragaria X ananassa Duch.) cultivated in vitro. Revista UDO Agrcola 4 (1): 21-26. 2004 Segovia-Salcedo M.C., Anlisis Fenticos del Gnero Polylepis (Rosaceae) en Tres reas de Diversificacin en el Ecuador. Tesis de Maestra, Ohio University (2001).

BIBLIOGRAFA. Fjeldsa J. The avifauna of the Polylepis woodlands of the Andean highlands: the effiiciency of basing conservation priorities on patterns of endemism, Bird Conservation International., 3, 37--55 (1993). Vega C, Bermejo J., Villegas G., Quezada J., Aguilar M., Conde E., 2006, Massive propagation of Polylepis tomentella Weddell ssp. nana by techniques of in vitro culture destined to the reforestation and exsitu conservation of threatened populations, Paz-Bolivia.

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