lcool Desidrogenase EC 1.1.1;lcool: NAD oxidoredutase. lcool desidrogenase contm Zn e existe em diferentes formas,dependendo da fonte.

Normalmente, as enzimas de levedura ou de levedura cavalo fgado so utilizados. Eles diferem em sua estrutura e especificidade. A levedura ADH mostra a sua maior atividade com o etanol, uma enzima homotetramrica com uma massa molecular de Mr= 148000;nos mamferos a enzima um dmero com Mr = 79000 e tem uma preferncia para os lcoois superiores. A enzima no estvel em soluo diluda, BSA, por conseguinte, deve ser acrescentado para a estabilizao. A. Reduo dosada A reao do ADH: Acetaldedo + NADH + H+ etanol + NAD+ reversvel e pode ser dosado com outra direo.O equilbrio constante 8 x 10-12 M, a formao do etanol favorvel,assim aquela reao a direo no princpio mais fcil para determinar.Uma severa desvantagem,contudo, a alta volatilidade e toxicidade do acetaldedo. Ensaio de solues 0,1 M fosfato de potssio, pH 7.5 0,1 g BSA em 100 mL 0,1M fosfato de potssio, pH 7.5 (soluo BSA) 0,01 M NADH (71mg em 10 mL H2O) 0.5 M acetaldedo, 2,2 g (2.82 mL) em 100 mL H2O ADH diludo em soluo de BSA: enzimas comercialmente disponveis devem ser diludos de acordo com a sua atividade,e.g., 0,02 IU ADH converte 0,02 mol NADH PR minuto,correspondendo para uma absoro de diferena 0.126, um conveniente valor para a reao a seguir. Para um comercial ADH em 400 IU mg -1, um estoque de soluo de 10 mg mL -1 (4000 IU mL -1) em 0,1 M fosfato de potssio, pH 7.5, podem ser preparados.Para a enzima dosada 20 L deveria ser usado. Ensaio mistura 9.5 mL 0.14 M fosfato potssio, ph 7.5 0.1 mL 10 mM NADH 0.2 mL 0.5 M acetaldedo Concentrao 95 mM 0.1 mM 2.0 mM

Procedimento 0.98 mL ensaio mistura 0.02 mL ADH (0.02 IU) A diminuio da absoro em 340nm seguida a 25 C.Para quantificao um coeficiente de absoro para NADH de 340 = 6.3 x L mol -1 cm -1 usado.

B. Ensaio oxidao Etanol + NAD+ acetaldedo + NADH + H+ Porque o equilbrio favorece a reao frente ao etanol, a reao de volta deve ser apoiada atravs de um pH alcalino e um reagente para capturar acetaldedo, de modo a remover o produto da mistura da reao. Ensaio de solues 75mM glicina/ difosfato sdio, pH 9.0 (10 g Na4P2O7 .10 H2O + 0.5 g glicina em 300 mL H2O,ajustar o pH para 9 com 1 N HCl) 0.1 M fosfato de potssio,pH 7.5 Etanol,p.A. (Mr = 46.1,d = 0.81 g mL-1) 0.1 M NAD (0.663 g em 10 mL 0.1 M fosfato de potssio,ph 7.5) 0.1 M 1,4-ditioeritotritol (DTE, Mr =154.3, 154 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potssio, pH 7.5 ) 0.1 g BSA em 100 mL 0.1 M fosfato de potssio pH 7.5 (soluo BSA) 2.2 M semicarbazida (Mr = 111.5; 2.5 g semicarbazida HCl em 10 mL 2 N NaOH, ajustar ph para 6.3 6.5 com 5 N NaOH) ADH, para a diluio ver acima. Ensaio mistura 8.8 mL 75 mM glicina/difosfato de sdio, pH 9.0 0.3 mL etanol 0.2 mL 0.1 M NAD 0.2 mL 0.1 M DTE 0.3 mL 2.2 M semicarbazida Procedimento 0.98 mL ensaio soluo 0.02 mL ADH diludo O aumento da absoro em 340nm seguida a 25 C.O coeficiente absoro para NADH 340 =6.3 X 103 L mol-1 cm -1. Referncias: Andersson, L., Mosbach, K. (1982) Meth.Enzimol.89, 435 445 Bergmeyer,H.U.(1983) Mtodo de Anlises Enzimas, 3 rd edn., Vol 2, 139-141. Verlag Chemie,Weinheim Dafeldecker,W.P., P.E Pares, X., Valle, B.L.(1981) Biochemistry 20, 6729-6734 Pietruszko, R., (1982) Meth. Enzimol.89, 429-435 Concentrao 66 mM 0.53 M 2.0 mM 2.0 mM 66 mM