Centro Universitrio Feevale Programa de Ps-Graduao em Qualidade Ambiental Mestrado em Qualidade Ambiental

Melissa Vilches

ANLISE GENOTXICA DO RIO CADEIA/RS ATRAVS DO ENSAIO COMETA E TESTE DE MICRONCLEO E ANORMALIDADES NUCLEARES UTILIZANDO PEIXES COMO BIOINDICADORES

Novo Hamburgo, 2009

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Centro Universitrio Feevale Programa de Ps-Graduao em Qualidade Ambiental Mestrado em Qualidade Ambiental

Melissa Vilches

ANLISE GENOTXICA DO RIO CADEIA/RS ATRAVS DO ENSAIO COMETA E TESTE DE MICRONCLEO E ANORMALIDADES NUCLEARES UTILIZANDO PEIXES COMO BIOINDICADORES
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Qualidade Ambiental como requisito para a obteno do ttulo de mestre em Qualidade Ambiental.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Basso da Silva

Novo Hamburgo, 2009

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO NA PUBLICAO (CIP)

Vilches, Melissa Anlise genotxica do rio Cadeia/RS atravs do ensaio cometa e teste de microncleo e anormalidades nucleares utilizando peixes como bioindicadores / Melissa Vilches. 2009. 54 f. : il ; 30 cm. Dissertao (Mestrado em Qualidade Ambiental) Feevale, Novo Hamburgo-RS, 2009. Inclui bibliografia. Orientador: Prof. Dr. Luciano Basso da Silva. 1. Toxicologia gentica - Rio Grande do Sul. 2. Indicadores ambientais. 3. gua - Poluio. I. Ttulo. CDU 628.113

Bibliotecria responsvel: Llian Amorim Pinheiro CRB 10/1574

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Centro Universitrio Feevale Programa de Ps-Graduao em Qualidade Ambiental Mestrado em Qualidade Ambiental

Melissa Vilches

ANLISE GENOTXICA DO RIO CADEIA/RS ATRAVS DO ENSAIO COMETA E TESTE DE MICRONCLEO E ANORMALIDADES NUCLEARES UTILIZANDO PEIXES COMO BIOINDICADORES

Dissertao de mestrado aprovada pela banca examinadora em 28 de fevereiro de 2009, conferindo ao autor o ttulo de mestre em Qualidade Ambiental. Componentes da Banca Examinadora: Prof. Dr. Luciano Basso da Silva (Orientador) Centro Universitrio Feevale Profa. Dra. Patrcia Grolli Ardenghi Centro Universitrio Feevale Prof. Dr. Victor Hugo Valiati Universidade do Vale do Rio dos Sinos

Novo Hamburgo, 2009

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AGRADECIMENTOS Agradeo ao Centro Universitrio Feevale por disponibilizar condies necessrias para a realizao deste trabalho. Agradeo a todos os amigos, colegas de trabalho e de estudo, familiares e pessoas que de alguma forma contriburam no passado ou no presente para que eu ingressasse e conclusse essa etapa em minha vida. Ao meu orientador Prof. Dr. Luciano Basso da Silva pelo auxlio em todas as etapas deste trabalho. Manoela Tressoldini Rodrigues pela colaborao no ensaio cometa. Anna Maria Siebel e Ciliana Rechenmacher pela ajuda nas sadas de campo e no ensaio cometa. Ao Seu Fernando, proprietrio do Balnerio Amizade, o qual permitiu gentilmente a nossa entrada quando necessrio. Ao senhor Eugenio J. Hackbart que forneceu os dados meteorolgicos da rea de estudo. Ao Vincius da Silva por toda a ajuda, apoio e compreenso nesse perodo.

RESUMO Os efluentes domsticos, industriais e agrcolas podem conter substncias txicas, genotxicas e mutagnicas e desencadear processos nocivos aos ambientes aquticos. Programas de biomonitoramento com organismos bioindicadores e testes citogenticos tm sido utilizados com o intuito de detectar corpos dgua contaminados por substncias genotxicas. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial genotxico do rio Cadeia no municpio de Santa Maria do Herval/RS em diferentes perodos utilizando peixes como bioindicadores, concomitantemente com a anlise fsico-qumica e microbiolgica da gua. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio cometa e pelos testes de microncleo e anormalidades nucleares em eritrcitos de peixes. Foram selecionados trs pontos de coleta: o ponto A situa-se na zona rural do municpio, o ponto B localiza-se a montante do ponto A, no incio da rea urbana e o ponto C localiza-se aps o permetro urbano do municpio. Para o ensaio cometa, as amostras de gua foram coletadas nos trs pontos e em trs perodos distintos, levadas ao laboratrio e colocadas em aqurios, nos quais espcimes de Astyanax jacuhiensis ficaram expostos por 48 horas. No ensaio cometa foram avaliados a freqncia de dano, o ndice de dano e a freqncia de cada uma das classes de dano. Nos testes de microncleo e de anormalidades nucleares foram utilizados espcimes de Bryconamericus iheringi coletados em quatro perodos nos pontos B e C. Para o ensaio cometa, no houve diferena significativa na freqncia de clulas com dano entre os pontos em um mesmo perodo de coleta. Entretanto, verificou-se diferena significativa entre as diferentes coletas de um mesmo ponto, onde os pontos B e C apresentaram maior freqncia de clulas com dano em fevereiro/08. As freqncias de cada classe de dano entre os pontos de uma mesma coleta apresentaram diferena significativa em todas as coletas, sendo que em fevereiro/08 a classe de dano 4 foi a mais freqente nos trs pontos de coleta. Quanto ao ndice de dano de DNA apenas fevereiro/08 apresentou diferena significativa entre os pontos dentro de um mesmo perodo de coleta, onde o ponto B apresentou menor ndice do que os pontos A e C. Tambm foram observadas diferenas significativas nos ndices de dano de DNA entre as diferentes coletas de um mesmo ponto, onde fevereiro/08 apresentou maior ndice nos pontos A e C. O nmero mdio de clulas com MN em 2.000 clulas analisadas de Bryconamericus iheringi no apresentou diferenas significativas entre os pontos B e C nas diferentes coletas. Na comparao entre os perodos de coleta, houve diferena significativa entre as amostras do ponto B, sendo que fevereiro/08 apresentou uma freqncia maior de microncleos do que nos outros meses. Na anlise de outras anormalidades nucleares, brotos nucleares e ncleos com alterao morfolgica (blebbed, lobed e notched) apresentaram diferenas significativas entre os pontos em uma mesma coleta e entre os diferentes perodos em um mesmo ponto. Quanto anlise fsico-qumica e microbiolgica da gua foram observadas variaes temporais e espaciais na qualidade da gua em relao aos parmetros DBO5, ferro, fsforo total, alumnio e coliformes fecais. Cromo foi detectado nos pontos A, B e C apenas em fevereiro/08. Todas as amostras de gua apresentaram coliformes fecais. O menor ndice pluviomtrico e as altas temperaturas do ms de fevereiro/08, com a conseqente reduo do nvel do rio e elevao da concentrao de poluentes, podem ter contribudo para a deteco de maior genotoxicidade neste perodo. Entretanto, no pode ser descartada tambm a ocorrncia de variao temporal na quantidade e/ou nas fontes geradoras de compostos genotxicos, podendo ser citado como exemplo a deteco de cromo nos trs pontos de coleta somente neste perodo. De uma forma geral o estudo demonstrou que ocorreram variaes temporais e espaciais tanto do potencial genotxico como dos parmetros fsico-qumicos e microbiolgicos do rio analisado, podendo influenciar direta ou indiretamente a sade humana e a qualidade de vida dos organismos expostos.

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ABSTRACT The domestic, industrial and agricultural wastewater may contain toxic, genotoxic and mutagenic and trigger processes harmful to aquatic environments. Biomonitoring programs using bioindicators and cytogenetic tests have been used in order to detect water bodies contaminated by genotoxic substances. In this context, this work had as main objective to assess the genotoxic potential of the rio Cadeia in Santa Maria of Herval / RS in different periods using fish as bioindicators, concurrently with the physical-chemical analysis and microbiological water. The genotoxicity was evaluated by comet assay and the micronucleus and nuclear abnormalities tests in erythrocytes of fish. We selected three sampling points: point A is located in rural areas of the city, point B is located upstream of point A at the beginning of the urban area and point C is located after the urban perimeter. For the comet assay, samples of water were collected in three points and three different sampling periods, brought to the laboratory and placed in aquariums, in which specimens of Astyanax jacuhiensis were exposed for 48 hours. Comet assay were evaluated as the frequency of damage, DNA damage index and frequency of each class of damage. In tests of micronucleus and nuclear abnormalities were used Bryconamericus iheringi specimens collected in four periods in B and C sampling points. For the comet assay, no significant difference in the frequency of cells with damage was observed between points in the same sampling period. However, there was significant difference between different samples from the same point where the B and C showed a higher frequency of cells with damage in the february/08 sample. Comparisons of the frequency distribution of each class of damage between the points of the same sampling period showed a significant difference in all samples, showing the class of damage 4 as the most frequent in the february/08 sample in the three sampling points. Considering the DNA damage index, only the february/08 sample showed significant difference between points within the same sampling period, where the sampling point B showed a lower index than the sampling points A and C. Significant differences also were observed in the levels of DNA damage between the different sampling periods from the same sampling point, where february/08 sample showed higher values in sampling points A and C. The average number of cells with MN in 2000 cells analyzed of Bryconamericus iheringi showed no significant differences between B and C sampling points in the four different sampling periods. In the comparison between the sampling periods, significant differences were observed in the B sampling point, which february/08 sample showed a higher frequency of micronuclei than in other sampling periods. In the analysis of other nuclear abnormalities, buds and nuclei with morphological changes (blebbed, lobed and notched) showed significant differences between points in the same sampling period and between different periods in the same sampling point. The physical-chemical and microbiological analysis of water showed temporal and spatial variations in water quality parameters for BOD5, iron, total phosphorus, aluminum and fecal coliform. Chromium was detected in A, B and C only in the february/08 sample. All water samples showed fecal coliform. The lowest rainfall and high temperatures in february/08, with consequent reduction in the level of the river and increase of pollutants concentration may have contributed to detection of increased genotoxicity in this period. However, it can not be ruled out the occurrence of temporal variation in the quantity and/or in the generating sources of genotoxic compounds and may be cited as example the detection of chromium in the three sampling points only in that sampling period. In general the study showed that there were both temporal and spatial variations of the genotoxic potential and in the physico-chemical and microbiological analysis of the river, which directly or indirectly can influence human health and quality of life of the exposed organisms.

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LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mapa da Bacia Hidrogrfica do rio Ca...................................................................21 Figura 2 - Mapa da sub-bacia do rio Cadeia com a rea urbana de Santa Maria do Herval em destaque. Adaptado de RODRIGUES e FORMOSO (2005)....................................................24 Figura 3 - Mapa da localizao do municpio de Santa Maria do Herval no estado do Rio Grande do Sul............................................................................................................................25 Figura 4 - Esquema dos pontos de coleta (A, B, C) no rio Cadeia em Santa Maria do Herval. O ponto A localiza-se antes do centro urbano e na rea rural do municpio; o ponto B localizase no centro do municpio no Balnerio Amizade; o ponto C localiza-se aps todo o permetro urbanizado do municpio, na Usina Hidreltrica Herval. .........................................................27 Figura 5 - Classes de danos de DNA utilizadas no ensaio cometa. A - Classe 0 ; B - Classe 1; C- Classe 2; D - Classe 3; E - Classe 4.....................................................................................30 Figura 6 A: MN: Microncleo; BN: Eritrcito binucleado; BRN: Broto nuclear; BL: Ncleo blebbed; LB: Ncleo lobed; NT: Ncleo notched. (BN, BL, LB, NT imagens de JIRAUNGKOORSKUL et al., 2008) ......................................................................................32

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classes de gua doce e seus usos de acordo com a resoluo CONAMA 357/2005....................................................................................................................................19 Tabela 2 - Dados climatolgicos da regio de estudo nos meses de coleta obtidos juntos a METSUL Meteorologia............................................................................................................28 Tabela 3 - Metodologia e procedimentos utilizados nos ensaios laboratoriais para cada parmetro segundo FEPAM......................................................................................................34 Tabela 4 - Valores de referncia para a classificao das amostras de gua analisadas (segundo Resoluo 357/2005 do CONAMA).........................................................................35 Tabela 5 Mdia desvio padro da freqncia de clulas com dano de DNA no ensaio cometa em Astyanax jacuhiensis e nmero de indivduos analisados (entre parnteses) nos pontos A, B e C nas trs coletas do rio Cadeia. Valores de p para as comparaes entre as coletas em um mesmo ponto so apresentados na ltima coluna e na ltima linha para as comparaes entre os pontos em uma mesma coleta................................................................38 Tabela 6 - Freqncia das classes de dano do ensaio cometa em Astyanax jacuhiensis nos pontos A, B e C do rio Cadeia em cada perodo de amostragem..............................................39 Tabela 7 Mdia e desvio padro do ndice de danos de DNA em Astyanax jacuhiensis e nmero de indivduos analisados (N) nos pontos A, B e C do rio Cadeia, nos perodos de coleta novembro/2007, fevereiro/2008 e outubro/2008. Valores de p para as comparaes entre as coletas em um mesmo ponto so apresentados na ltima coluna e na ltima linha para as comparaes entre os pontos em uma mesma coleta............................................................40 Tabela 8 Mdia e desvio padro do nmero de microncleos em 2.000 clulas de Bryconamericus iheringi e nmero de indivduos analisados (N) nos pontos B e C do rio Cadeia em cada perodo de coleta. Valores de p para as comparaes entre as coletas em um mesmo ponto so apresentados na ltima coluna e na ltima linha para as comparaes entre os pontos em uma mesma coleta...............................................................................................41 Tabela 9 - Mdia e desvio padro das alteraes nucleares nos eritrcitos de Bryconamericus iheringi coletados nos pontos B e C do rio Cadeia em quatro perodos de coletas........................................................................................................................................42

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Tabela 10 - Valores dos parmetros analisados nas amostras de gua coletadas nos trs pontos de amostragem do rio Cadeia nos quatro perodos de coleta. PA = Ponto A; PB = Ponto B; PC = Ponto C..................................................................................................................................43 Tabela 11 - Enquadramento das guas dos pontos analisados do rio Cadeia durante o perodo monitorado. PA = Ponto A; PB = Ponto B; PC = Ponto C. Classe 1: ; Classe 2: ; Classe 3:; Classe 4:..........................................................................................................................44

SUMRIO
Resumo.......................................................................................................................................V Abstract.....................................................................................................................................VI Lista de figuras........................................................................................................................VII Lista de tabelas.......................................................................................................................VIII 1. INTRODUO....................................................................................................................1 2. OBJETIVOS.........................................................................................................................3 2.1 Objetivo geral..................................................................................................................3 2.2 Objetivos especficos......................................................................................................3 3. REVISO DA LITERATURA............................................................................................4 3.1 Gentica toxicolgica e biomonitoramento de ecossistemas aquticos..........................4 3.1.1 Ensaio cometa........................................................................................................6 3.1.2 Teste de microncleo e anormalidades nucleares..................................................8 3.1.3 Estudos de genotoxicidade em rios utilizando ensaio cometa e teste de microncleo e anormalidades nucleares em peixes........................................................9 3.2 Anlise fsico-qumica e microbiolgica e classificao das guas superficiais..........11 3.2.1 DBO5 (Demanda bioqumica de oxignio)..........................................................12 3.2.2 Nitrognio (nitrognio amoniacal, nitratos e nitritos)..........................................12 3.2.3 Fsforo total.........................................................................................................13 3.2.4 Alumnio...............................................................................................................13 3.2.5 Chumbo................................................................................................................14 3.2.6 Cromo...................................................................................................................14 3.2.7 Cobre....................................................................................................................14 3.2.8 Nquel...................................................................................................................15 3.2.9 Ferro.....................................................................................................................15 3.2.10 Zinco...................................................................................................................15 3.211 pH........................................................................................................................16 3.2.12Turbidez..............................................................................................................16 3.2.13 Oxignio dissolvido............................................................................................17 3.2.14 Coliformes fecais (Escherichia colli) ................................................................18 3.3 Caractersticas da rea de estudo..................................................................................20 3.3.1 Bacia Hidrogrfica do rio Ca..............................................................................20 3.3.2 Sub-bacia do rio Cadeia.......................................................................................23 3.3.3 Municpio de Santa Maria do Herval...................................................................24 4. MATERIAL E MTODOS..................................................................................................26 4.1 rea de estudo, locais e perodos de coleta..................................................................26 4.2 Metodologia..................................................................................................................28 4.2.1 Ensaio cometa......................................................................................................28 4.2.1.1 Bioensaios..............................................................................................28

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4.2.1.2 Preparao das lminas e anlise microscpica....................................29 4.2.2 Teste de microncleo e anormalidades nucleares................................................31 4.2.2.1 Coleta dos peixes...................................................................................31 4.2.2.2 Preparao das lminas e anlise microscpica....................................31 4.2.3 Anlise fsico-qumica e microbiolgica da gua................................................32 4.2.3.1 Coleta da gua.......................................................................................32 4.2.3.2 Anlise laboratorial...............................................................................33 4.2.4 Anlise estatstica.................................................................................................36 5. RESULTADOS....................................................................................................................37 5.1 Ensaio cometa...............................................................................................................37 5.2 Teste de microncleo e anormalidades nucleares.........................................................40 5.3 Anlise fsico-qumica e microbiolgica da gua.........................................................42 6. DISCUSSO........................................................................................................................45 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................................52

1.INTRODUO A gua utilizada para sanar as necessidades humanas em seus mais variados aspectos em sua maior parte proveniente de corpos hdricos superficiais. Entre as utilizaes dos corpos hdricos superficiais, destaca-se o seu uso no abastecimento das populaes humanas, gerao de energia, irrigao, navegao, aqicultura, alm de importncia paisagstica (SPERLING, 1993). No entanto, o crescimento populacional desordenado juntamente com o desenvolvimento tecnolgico tem gerado impactos graves a estes corpos hdricos principalmente no que diz respeito destinao de efluentes industriais e domsticos (VAN DER WERF, 1996; MORAES, 2000). Em funo de a gua ser um solvente universal e ter a capacidade de dissolver diversas substncias, os ambientes aquticos tm sido utilizados como meio de descarte de diferentes produtos (WHITE e RASMUSSEN, 1998). Segundo a Agncia de Proteo Ambiental Americana (U.S. Environmental Protection Agency - EPA) o termo poluio significa presena de uma substncia no ambiente que, devido sua composio qumica ou quantidade, prejudica o funcionamento dos processos naturais, produzindo efeitos indesejveis sobre a sade e ambientes, sendo considerado como poluente qualquer material que cause poluio. De maneira geral o resultado do grande descaso do homem com o meio ambiente, onde o aumento da populao, a expanso do consumo e a descarga de produtos no meio ambiente so suas principais causas (WRIGHT e NOBEL, 2000). Existem centenas, talvez milhares de poluentes que afetam o meio ambiente aqutico e cujos efeitos so preocupantes (MARTINEZ e CLUS, 2002). Os poluentes aquticos mais freqentes so os patgenos, os resduos orgnicos, os sedimentos, nutrientes e os poluentes qumicos. Tais poluentes podem se espalhar pela superfcie e/ou pela coluna dgua formando solues, que podem resultar em efeitos indesejveis ao ecossistema. Poluentes orgnicos como os pesticidas, compostos qumicos industriais (como o caso das bifenilas policloradas - BPCs), solventes, detergentes e os derivados de petrleo so prejudiciais para o ecossistema aqutico (WRIGHT e NOBEL, 2000). Estudos relatam que diversos rios esto contaminados por substncias txicas, genotxicas, mutagnicas e carcinognicas decorrentes do descarte de efluentes domsticos e industriais (CLAXTON et al., 1998; WHITE e RASMUSSEN, 1998) alm de agrotxicos utilizados em reas adjacentes aos corpos dgua (TOMITA e BEYRUTH, 2002). So considerados agentes genotxicos aqueles que interagem com o DNA e ou com seus componentes celulares (fibras do fuso) e enzimas (topoisomerases). O termo

genotoxicidade inclui formao de adutos no DNA, leses na fita do DNA, sntese de DNA no programada, trocas entre cromtides-irms, enquanto que mutagenicidade especificamente a induo de mutao ao nvel gnico ou cromossmico. Enquanto os efeitos genotxicos podem ser transitrios, os efeitos mutagnicos so persistentes. Portanto, mutagenicidade uma alterao permanente no contedo ou na estrutura do material gentico de um organismo (DEARFIELD et al., 2002). Com o intuito de minimizar as conseqncias da poluio nos ecossistemas aquticos os programas de monitoramento ambiental tm sido aplicados em todo o mundo (CAPELA, 2001). A utilizao de bioindicadores e testes citogenticos ajudam a avaliar o dano causado no apenas integridade fsico-qumica do ambiente, mas sim a resposta dos organismos a mudanas ambientais decorrentes da poluio ambiental (MORAES, 2000). Em ecossistemas aquticos os testes mais utilizados so os testes de microncleo e de anormalidades nucleares e o ensaio cometa utilizando peixes como organismos bioindicadores. Muitos estudos j avaliaram a genotoxicidade de efluentes industriais, enquanto que ainda so raros os que avaliam a ao dos poluentes provenientes de descartes da agricultura (JHA et al., 1997). Juntamente com anlises genotxicas, muitos trabalhos tem utilizado parmetros fsico-qumicos e microbiolgicos como importante ferramenta nos monitoramentos de ecossistemas aquticos. Tais parmetros possibilitam o enquadramento da gua em classes conforme suas condies de uso segundo a resoluo n 357 de 2005 do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA). Neste contexto, o presente trabalho visou realizar uma anlise integrada da ao genotxica em peixes das guas do rio Cadeia, utilizando o ensaio cometa e o teste de microncleo, com os parmetros fsico-qumicos utilizados no enquadramento de classe de gua doce superficial.

2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral: Monitorar o potencial genotxico, atravs do ensaio cometa e teste de microncleo e anormalidades nucleares em peixes, e as caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas das guas do rio Cadeia no municpio de Santa Maria do Herval/RS. 2.2 Objetivos Especficos: Comparar as taxas de danos de DNA dos peixes em diferentes pontos de coleta; Avaliar as taxas de danos de DNA dos peixes periodicamente; Comparar o teste de microncleo e anormalidades nucleares e o ensaio de cometa

quanto sensibilidade aos danos de DNA; gua; Verificar a associao entre as taxas de danos de DNA nos peixes e as Analisar periodicamente as caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas da

caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas da gua;

3. REVISO DA LITERAURA 3.1 Gentica toxicolgica e biomonitoramento de ecossistemas aquticos Em decorrncia da grande urbanizao e crescimento tecnolgico aumentou consideravelmente o interesse da comunidade cientfica e agncias regulatrias em monitorar as conseqncias dos impactos decorrentes da ao antrpica sobre a sade humana e a sustentabilidade dos ecossistemas (BICKHAM et al., 2000). A presena de substncias txicas, genotxicas, mutagnicas e carcinognicas tem sido relatada em diversos estudos de rios que sofrem influncia do descarte de efluentes domsticos e industriais. O descarte de tais substncias se caracteriza em um srio e grave problema que apesar da legislao vigente continua ocorrendo irresponsavelmente (CLAXTON et al., 1998; WHITE e RASMUSSEN, 1998). A situao agravada pelos diversos tipos de agrotxicos utilizados na agricultura, os quais podem alcanar os corpos de gua atravs da aplicao intencional, deriva e escoamento superficial a partir de reas onde ocorreram aplicaes (TOMITA e BEYRUTH, 2002). Substncias genotxicas podem no contaminar apenas os organismos aquticos por si s, mas sim o ecossistema inteiro podendo afetar os humanos atravs da ingesto desses organismos na alimentao (VON BURG e LIU, 1993), como o caso dos metais pesados que apresentam ao genotxica, mutagnica e carcinognica (MATSUMOTO et al., 2006). Os agentes genotxicos interagem quimicamente com o material gentico, formando adutos, alterao oxidativa, ou mesmo quebras da molcula de DNA. Na grande maioria dos casos a leso reparada pelo prprio sistema de reparo da clula ou a mesma eliminada. Caso a leso seja fixada, provocando mutaes, que podem perpetuar nas clulas filhas durante o processo de replicao, o agente considerado mutagnico (MDIO e MARTINS, 2000). Embora as mutaes possam surgir espontaneamente, a maioria delas provocada por agentes fsicos, qumicos ou biolgicos (MATSUMOTO, 2004). Alguns trabalhos relatam que os danos no DNA geram instabilidade gentica, o que pode representar os passos iniciais para o processo carcinognico alm da reduo da viabilidade e fertilidade de gametas (MDIO e MARTINS, 2000; RIBEIRO, 2003). Segundo LEE e STEINERT (2003), compostos qumicos que causam danos no DNA podem ser agrupados em quatro grupos: (1) aqueles que agem diretamente sobre a molcula; (2) os que precisam ser metabolizados para causarem danos; (3) os que promovem a produo de espcies reativas de oxignio e (4) aqueles que causam inibio no reparo e na sntese do DNA.

A gentica toxicolgica aqutica tem a inteno de determinar o efeito de xenobiticos, isto , de substncias de estrutura e origem estranhas encontradas em um organismo, sobre a funo e a estrutura de ecossistemas aquticos, e um de seus objetivos principais o desenvolvimento de tcnicas capazes de medir a contaminao ambiental (BICKHAM et al., 2000; MARTINEZ e CLUS, 2002). Muitos trabalhos foram desenvolvidos buscando a deteco de agentes genotxicos e o entendimento das propriedades desses agentes permite avaliar os efeitos hereditrios, ou mesmo letais, para os organismos (ARNAIZ, 1995). Segundo CAIRNS et al. (1993), preciso buscar uma categorizao da influncia humana sobre os ambientes bem como distinguir os efeitos dessas aes das naturais. Neste contexto, biomonitoramento o uso sistemtico das respostas de organismos vivos, seja ele como um todo ou, atravs de determinado tecido, para avaliar mudanas ocorridas no ambiente, geralmente causadas por atividades antrpicas (SILVA et al., 2003). Desta forma, diversos testes de curta durao tm sido desenvolvidos nas ltimas dcadas utilizando microrganismos, insetos, plantas e animais para identificar agentes que promovem dano gentico (HOUK, 1992). Segundo CAPELA (2001), estes organismos podem ser definidos como bioindicadores, pois respondem biologicamente em nvel de organismo ou ainda em nveis inferiores, como rgos, tecidos e/ou clulas, a um ambiente qumico, atravs de alteraes bioqumicas, fisiolgicas e/ou comportamentais. A seleo do ensaio apropriado para um determinado estudo depende das caractersticas da amostra a ser testada, da validade do sistema-teste e de sua base de dados acumulados, da utilidade do ensaio para amostras ambientais complexas, de seu custo relativo e de sua simplicidade. Bioensaios em procariotos detectam agentes que induzem mutaes gnicas e danos primrios no DNA que o caso da anlise de mutagenicidade em Salmonella, ou teste de Ames. Porm, anlises em eucariotos permitem detectar uma amplitude maior de danos, incluindo mutaes gnicas, danos e reparo do DNA, danos cromossmicos e aneuploidias (HOUK, 1992). Os peixes so considerados importantes bioindicadores de gua poluda (HOFFMAN e RAAT, 1982), pois como vertebrados aquticos, metabolizam poluentes diretamente atravs da gua contaminada ou indiretamente pela ingesto de outros organismos aquticos contaminados (MATSUMOTO et al., 2006) respondendo de forma similar aos vertebrados superiores quando expostos as substncias txicas (AL-SABTI e METCALFE, 1995). Com o objetivo de avaliar os riscos sade de vertebrados superiores, diversos ensaios de genotoxicidade in vivo tm empregado, com freqncia, diferentes espcies de peixes

como bioindicadores (POWERS, 1989). Esses animais podem facilmente ser mantidos em laboratrio e expostos a compostos qumicos. O uso de peixes como bioindicadores de ndices de efeitos de poluio de extrema importncia, pois eles podem permitir uma deteco precoce de problemas ambientais aquticos (VAN DER OOST et al., 2003; FRENZILLI et al., 2004). O uso de exemplares de espcies nativas de peixes para a avaliao da mutagenicidade de xenobiticos relevante, visto que h a necessidade de preservar tais espcies, alm do que, atravs da alimentao, muitos deles so agentes de transferncia de contaminantes ao homem (AL-SABTI e METCALFE, 1995). O mtodo de anlise da ao de compostos mutagnicos e de contaminantes qumicos mais utilizado em peixes o teste de microncleo (MN) (AL-SABTI, 1986; METCALF, 1988) embora o ensaio cometa seja mais sensvel para detectar diferentes danos de DNA (BUCKER et al., 2006). 3.1.1 Ensaio cometa O ensaio cometa tem sido proposto para estudos de toxicologia gentica devido s suas vantagens e peculiaridades quando comparado a outros testes que detectam substncias genotxicas, sendo uma ferramenta fundamental de investigao em estudos de reparo de DNA, biomonitoramento ambiental e teste de genotoxicidade (ROSS et al., 1995). O ensaio cometa (SCGE, Single-Cell Gel Eletrophoresis, eletroforese em gel de clulas individuais) no utilizado para verificar mutaes, mas sim leses genmicas que se no forem corrigidas, podem ser processadas levando s mutaes (GONTIJO e TICE, 2003) o que caracteriza em leses pr-mutagnicas (KAMMANN et al., 2001). O ensaio cometa possui uma ampla utilizao para avaliar agentes genotxicos de efluentes industriais, domsticos e agrcolas, induo de danos e reparo no DNA e biomonitoramento de populaes (WHITE e RASMUSSEN, 1998). A principal vantagem do ensaio de cometa sua alta sensibilidade a vrios tipos de danos de DNA (BUCKER et al., 2006), sendo considerado em alguns casos mais sensvel ao de agentes genotxicos do que o teste de microncleo (MATSUMOTO et al., 2006; BUCKER et al., 2006). Alm de outras vantagens como: (1) mensurao de danos em clulas individuais; (2) o baixo nmero de clulas necessrio para a realizao do teste; (3) pode ser realizado em qualquer tipo de clula eucaritica nucleada (LEE e STEINERT, 2003). Os pioneiros a desenvolverem a tcnica de eletroforese em gel para detectar danos de DNA em clulas individuais foram STLING e JOHANSON (1984). Essa tcnica considerou

o comportamento e organizao do DNA dentro do ncleo. Ao ser compactado, o DNA enovelado com protenas histonas, formando alas, as quais so aderidas a uma rede protica chamada de matriz nuclear. No ensaio, as clulas foram embebidas em agarose, colocadas em uma lmina de microscopia e levadas a uma soluo detergente que lisa suas membranas e protenas nucleares. O DNA, que maior e mais pesado que o restante dos componentes, ocupa o espao do gel anteriormente preenchido por toda a clula, permanecendo retido numa estrutura residual semelhante a um ncleo, denominada nucleide. Caso existam quebras na molcula de DNA a estrutura do nucleide sofre mudanas (COOK e BRAZEL, 1976). As lminas que possuam clulas com alta quebra de DNA mostram, aps eletroforese sob condies neutras, uma migrao crescente de DNA em direo ao nodo, dando uma aparncia ao DNA semelhante cauda de um cometa. As clulas cujo dano de DNA pouco ou inexistente no apresentam cauda. Foi utilizada colorao fluorescente especfico para DNA. Em 1988, SINGH et al. desenvolveram o ensaio cometa sob condies alcalinas (pH>13), o que intensificou a eficincia da tcnica. Essa alterao possibilitou a deteco de quebras de fita simples, quebras de fita dupla, stio lcali-lbeis, stios absicos, exciso de stios incompletos de reparo e ligaes cruzadas (TICE et al., 2000). A tcnica tambm sofreu outra adaptao quando MCNAMEE et al. (2000) propuseram que vrias clulas fossem processadas de uma s vez, aumentando ainda mais a eficincia sem comprometer a sua confiabilidade. O grau de dano no DNA que o teste considera pode ser descrito de vrias maneiras, como a quantidade de DNA na cauda, o comprimento da cauda e a porcentagem de clulas com diferentes classes de danos (TICE, 1995). Trabalhos relatam com sucesso a aplicao do ensaio cometa em eritrcitos de peixes destacando a sensibilidade das clulas sangneas desses animais aos efeitos genotxicos (MITCHELMORE e CHIPMAN, 1998). Dados de estudos usando o ensaio cometa em peixes vm se acumulando nos ltimos anos, tanto no campo (DE FLORA et al., 1993; MINISSI et al., 1996; BELPAEME et al., 1998; HAYASHI et al., 1998; RUSSO et al., 2004) como em laboratrio (PANDRANGI et al., 1995 e BELPAEME et al., 1998).

3.1.2 Teste de microncleo e anormalidades nucleares O teste de microncleo que foi inicialmente desenvolvido por SCHIMID (1975), recomendado para estudos de biomonitoramento ambiental, principalmente por sua capacidade de detectar tanto agentes clastognicos (quebra de cromossomos), como aneugnicos (segregao cromossmica anormal) (FENECH, 2000; RIBEIRO et al., 2003) e tambm por se tratar de um mtodo simples, confivel, sensvel e de baixo custo para analisar impacto biolgico de ambientes aquticos poludos (RUSSO et al., 2004). O microncleo (MN) uma pequena massa nuclear delimitada por uma membrana independente do ncleo principal que aparece nas clulas filhas como conseqncia de danos, no reparados, ocorridos nas clulas mes (WALKER et al., 1996). Os MNs so formados durante a diviso celular quando a membrana nuclear est sendo reconstituda ao redor dos cromossomos das clulas-filhas. So decorrentes de fragmentos cromossmicos acntricos ou de cromossomos inteiros que no foram includos no ncleo principal. Como se trata de material gentico que foi separado do ncleo principal, o MN representa perda de cromatina em conseqncia de dano cromossmico estrutural (fragmento) ou numrico (cromossomo inteiro) ou ainda dano no aparelho mittico. A presena de microncleo um fenmeno natural, porm as exposies a compostos genotxicos aumentam a sua freqncia nas clulas. Os MNs formados por agentes genotxicos s apareceram aps um ciclo de diviso celular (SALVADORI et al., 2003). Danos cromossmicos estruturais esto relacionados exposio direta do agente mutagnico com o DNA ou com defeitos intracelulares na replicao do DNA, recombinao ou mecanismo de reparo (FENECH, 2000). HOOFMAN E RAAT (1982) adaptaram o teste de microncleo para aplicao em peixes. Por apresentarem cromossomos pequenos, em grande quantidade, e com baixo ndice mittico, a aplicao do teste de microncleo na maioria das espcies de peixes tornou-se extremamente vantajoso quando comparado a outros testes mutagnicos (KLIGERMAN, 1982). AL-SABTI e METCALFE (1995) descrevem o quanto apropriado so os eritrcitos de peixes para a aplicao deste teste por formarem microncleos de fcil contagem e pelo fato do sangue perifrico ser de fcil obteno. UDROIU (2006) em uma reviso sobre a aplicabilidade do teste de microncleo em espcies de peixes conclui que este teste aplicado com sucesso em diversos trabalhos que visam estabelecer relaes entre danos de DNA com possveis substncias genotxicas. Mostra ainda que o teste de microncleo quando realizado com sangue perifrico particularmente indicado para avaliar casos de exposio crnica do organismo ao meio contaminado. Alguns estudos demonstraram que, para algumas substncias, a induo de microncleo em eritrcitos de peixes depende da dose (MANNA et

al., 1985; BCKER et al., 2006) e do tempo de exposio dos mesmos s substncias testadas (DAS e NANDA, 1986). A grande limitao do uso de microncleos para a identificao de danos citogenticos que agentes ou substncias que no quebram cromossomos ou no causam a perda destes na anfase, no sero detectados, como por exemplo, as aberraes que envolvem rearranjo cromossmico sem ocorrncia de fragmento acntrico (HEDDLE et al., 1983). Durante as anlises de microncleos, alguns pesquisadores observaram a existncia de outras anormalidades nucleares, sugerindo que estas devam ser reportadas em seus resultados (FENECH et al., 1999). Segundo FENECH (2000) essas anormalidades relacionam-se aos erros que ocorrem durante a mitose ou meiose, com os processos de morte celular (necrose e apoptose) alm da prpria genotoxicidade e mutagenicidade. Entre as anormalidades o autor recomenda que sejam analisadas as clulas com brotos nucleares. Os brotos nucleares, assim como os broken-eggs, seriam o resultado do procedimento de expulso do microncleo do ncleo principal da clula (KIRSCH-VOLDERS et al., 2002). Outra anlise reportada por CARRASCO et al. (1990) considera alteraes da morfologia do ncleo, chamadas de blebbed, lobed e notched, tendo como possvel causa a ao mutagnica, embora o mecanismo de formao ainda no tenha sido esclarecido. Ncleos blebbed apresentam uma pequena invaginao da membrana e da cromatina, enquanto que os lobed apresentam uma invaginao maior da membrana e da cromatina, formando lobos e o ncleo notched apresenta profundas invaginaes ou ainda lacunas que no contm cromatina. 3.1.3 Estudos de genotoxicidade em rios utilizando ensaio cometa e teste de microncleo e anormalidades nucleares em peixes AYLLON e GARCIA-VAZQUEZ (2000) analisaram a freqncia de microncleos e de alteraes nucleares em Poecilia latipinna e Phoxinus phoxinus submetidas a tratamentos com substncias cuja ao genotxica j conhecida. Os peixes tratados com colchicina e mitomicina C apresentaram aumento da freqncia de microncleo e de outras anormalidades nucleares em relao ao controle, enquanto que os peixes tratados com ciclofosfamida apresentaram apenas aumento da freqncia de anormalidades nucleares em relao ao controle. Neste mesmo trabalho a ao genotxica do cdmio e do mercrio tambm foi testada. Os peixes tratados com diferentes dosagens de cdmio apresentaram aumento da freqncia de anormalidades nucleares e no da freqncia de microncleo em relao ao controle, enquanto que no tratamento com mercrio, apenas uma das espcies apresentou aumento da freqncia de anormalidades nucleares em relao ao controle.

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Em um outro estudo, trs espcies de peixes (Tilapia rendalli, Oreochromis niloticus e Cyprinus carpio) foram analisadas em um lago em Braslia sob influncia do descarte de adubos de plantaes adjacentes. Os resultados indicaram que os peixes coletados no ponto de descarte e no ponto abaixo do descarte apresentaram maior freqncia de microncleos do que os peixes coletados acima destes pontos. As anlises fsico-qumicas da gua mostraram que os dois pontos com influncia do descarte de adubo apresentaram maior concentrao de fsforo. Isto indica que existe uma relao entre a eutrofizao das guas e o aumento da freqncia de microncleos dos peixes (GRISOLIA e STARLING, 2001). ANDRADE et al. (2004) avaliaram a ao genotxica dos rios Tramanda e Mampituba, na zona estuarina do Rio Grande do Sul, em duas espcies de peixes (Mugil sp. e Netuma sp.) a partir do teste de microncleo e do ensaio cometa. Verificaram que no vero, estao que apresenta maior nmero de habitantes no local estudado, aumenta significativamente as taxas de danos de DNA de ambas as espcies, nos dois locais de estudo, mostrando a forte associao entre a quantidade de efluentes domsticos descartados nos rios e o aumento das taxas de danos de DNA dos peixes. Ao analisarem a relao entre a concentrao de mercrio e o aumento da freqncia de microncleos em trs espcies de peixes (Prochilodus nigricans, Mylossoma duriventris e Hoplias malabaricus) de um rio da Bacia Amaznica PORTO et al. (2005) verificaram que as freqncias de microncleo aumentam conforme o aumento da concentrao do mercrio nas trs espcies analisadas destacando-se que a espcie de hbito alimentar piscvora apresentou maior taxa de dano de DNA do que as outras espcies, o que demonstra a biomagnificao do mercrio na rede trfica. As guas de um rio em So Paulo, apresentaram aumento de danos de DNA em Oreochromis niloticus tanto no teste de microncleo como no ensaio cometa conforme aumentava a concentrao de metais pesados derivados de resduos de curtume descartados no rio (MATSUMOTO et al., 2006). GUILHERME et al. (2008) avaliaram a ao genotxica de uma rea contaminada por mercrio, Laranjo (Aveiro/Portugal), atravs do teste de anormalidades nucleares em Liza aurata. Neste estudo verificaram um aumento de anormalidades nucleares no local contaminado por mercrio tanto no vero como no outono em relao ao controle. A ao do cido domico, uma toxina sintetizada por algumas espcies de algas marinhas, foi testada em diferentes concentraes e tempos de exposio em Oreochromis niloticus atravs do teste de microncleo e anormalidades nucleares e do ensaio cometa. Neste estudo verificaram que em tempos e concentraes maiores de exposio ocorreu um aumento

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da freqncia de microncleo e anormalidades nucleares assim como altas concentraes de cido domico induziu um aumento no ndice de dano avaliado no ensaio cometa (AVAS e KNEN, 2008). 3.2 Anlise fsico-qumica e microbiolgica e classificao das guas doces superficiais Com o intuito de complementar a anlise genotxica de ecossistemas aquticos, alguns trabalhos tem utilizado a anlise das caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas da gua. ANDRADE et al. (2004), analisaram a associao das taxas de dano de DNA em Mugil sp. e Netuma sp., de dois rios no sul do Brasil. Verificaram haver correlaes positivas entre a taxa de dano de DNA, pH e a temperatura da gua. O pH diminui em estaes mais quentes o que propicia um aumento na dissoluo dos ons de metais e, portanto na sua concentrao, aumentando a taxa de dano de DNA dos organismos expostos. A concentrao de metais encontrada durante as estaes refora essa associao, pois estas foram mais altas no vero e na primavera do que no outono e inverno. Em outro estudo, MATSUMOTO et al. (2006) verificaram uma associao entre o aumento das concentraes de cromo e o aumento das freqncias de anormalidades nucleares entre outros marcadores moleculares em Orechromis niloticus. O conhecimento das caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas s possvel de acordo com um monitoramento seqencial, planejado e sistmico, sendo esta ferramenta essencial para a tomada de decises que possam amenizar impactos ambientais causados pela ocupao do solo e industrializao (NAIME e FAGUNDES, 2005). Os critrios de qualidade da gua tornam especficos as concentraes e limites de determinados parmetros que interferem na vida aqutica e na proteo da sade do homem. Os padres de qualidade dos corpos receptores de efluentes esto inter-relacionados com os padres de lanamento de efluentes, sendo o objetivo de ambos os padres a preservao da qualidade das guas dos corpos hdricos (VON SPERLING, 1998). A anlise fsico-qumica da gua possibilita o enquadramento das guas em classes conforme suas condies de uso segundo resoluo 357 de 2005 do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA). Os principais parmetros fsico-qumicos e microbiolgicos utilizados na determinao da qualidade da gua so (CETESB, 2006):

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3.2.1 DBO5 (Demanda bioqumica de oxignio) A DBO5 de uma gua a quantidade de oxignio necessria para oxidar a matria orgnica por decomposio microbiana aerbia para uma forma inorgnica estvel. A DBO5 normalmente considerada como a quantidade de oxignio consumido durante um determinado perodo de tempo, numa temperatura de incubao especfica. Os maiores aumentos em termos de DBO5, num corpo d'gua, so provocados por despejos de origem predominantemente orgnica. A presena de um alto teor de matria orgnica pode induzir completa extino do oxignio na gua, provocando o desaparecimento de peixes e outras formas de vida aqutica.

3.2.2 Nitrognio (nitrognio amoniacal, nitrito, nitrato) So diversas as fontes de nitrognio nas guas naturais. Os esgotos sanitrios constituem em geral a principal fonte, lanando nas guas nitrognio orgnico devido presena de protenas e nitrognio amoniacal, devido hidrlise sofrida pela uria na gua. Alguns efluentes industriais tambm concorrem para as descargas de nitrognio orgnico e amoniacal nas guas, como algumas indstrias qumicas, petroqumicas, siderrgicas, farmacuticas, de conservas alimentcias, matadouros, frigorficos e curtumes. Nas reas agrcolas, o escoamento das guas pluviais pelos solos fertilizados tambm contribui para a presena de diversas formas de nitrognio. Tambm nas reas urbanas, as drenagens de guas pluviais associadas s deficincias do sistema de limpeza pblica, constituem fonte difusa de difcil caracterizao. O nitrognio pode ser encontrado nas guas nas formas de nitrognio orgnico, amoniacal, nitrito e nitrato. As duas primeiras chamam-se formas reduzidas e as duas ltimas, formas oxidadas. Quando descarregado nas guas naturais conjuntamente com o fsforo e outros nutrientes presentes nos despejos, provocam o enriquecimento do meio tornando-o mais frtil e possibilitam o crescimento em maior extenso dos seres vivos que os utilizam, especialmente as algas, o que chamado de eutrofizao e que pode trazer prejuzos aos usos que se possam fazer dessas guas, prejudicando seriamente o abastecimento pblico ou causando poluio por morte e decomposio. A amnia um txico bastante restritivo vida dos peixes, sendo que muitas espcies no suportam concentraes acima de 5 mg/L. Alm disso, a amnia provoca consumo de oxignio dissolvido das guas naturais ao ser oxidada biologicamente, a chamada DBO de segundo estgio. Por estes motivos, a concentrao de nitrognio amoniacal importante parmetro de classificao das guas naturais e normalmente utilizado na constituio de ndices de qualidade das guas. Os

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nitratos so txicos, causando uma doena chamada metahemoglobinemia infantil que letal para crianas (o nitrato se reduz a nitrito na corrente sangnea, competindo com o oxignio livre, tornando o sangue azul).

3.2.3 Fsforo total O fsforo aparece em guas naturais devido principalmente s descargas de esgotos sanitrios. Nestes, os detergentes superfosfatados empregados em larga escala domesticamente constituem a principal fonte, alm da prpria matria fecal, que rica em protenas. Alguns efluentes industriais, como os de indstrias de fertilizantes, pesticidas, qumicas em geral, conservas alimentcias, abatedouros, frigorficos e laticnios, apresentam fsforo em quantidades excessivas. As guas drenadas em reas agrcolas e urbanas tambm podem provocar a presena excessiva de fsforo em guas naturais. Assim como o nitrognio, o fsforo constitui-se em um dos principais nutrientes para os processos biolgicos, ou seja, um dos chamados macro-nutrientes, por ser exigido tambm em grandes quantidades pelas clulas. Por ser nutriente em processos biolgicos, o excesso de fsforo em esgotos sanitrios e efluentes industriais, conduz a processos de eutrofizao das guas naturais. 3.2.4 Alumnio O alumnio produzido e consumido em grandes quantidades em muitas naes, sendo o Brasil um dos maiores produtores. o principal constituinte de um grande nmero de componentes atmosfricos, particularmente de poeira derivada de solos e partculas originadas da combusto de carvo. Em reas urbanas, a concentrao de alumnio na poeira das ruas varia de 3,7 a 11,6 g/kg. No ar, a concentrao varia de 0,5 ng/m sobre a Antrtica a mais de 1000 ng/m em reas industrializadas. Na gua, o alumnio complexado e influenciado pelo pH, temperatura e a presena de fluoretos, sulfatos, matria orgnica e outros ligantes. A solubilidade baixa em pH entre 5,5 e 6,0. O alumnio deve apresentar maiores concentraes em profundidade, onde o pH menor e pode ocorrer anaerobiose. Se a estratificao, e conseqente anaerobiose, no for muito forte, o teor de alumnio diminui no corpo de gua como um todo. H considervel evidncia que o alumnio neurotxico. Em experimentos com animais, porm h uma grande variao desse efeito, dependendo da espcie analisada. No h indicao de carcinogenicidade para o alumnio.

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3.2.5 Chumbo O chumbo est presente na gua devido s descargas de efluentes industriais como, por exemplo, os efluentes das indstrias de acumuladores (baterias), bem como devido ao uso indevido de tintas e tubulaes e acessrios a base de chumbo (materiais de construo). O chumbo e seus compostos tambm so utilizados em eletrodeposio e metalurgia. Constitui veneno cumulativo, provocando um envenenamento crnico denominado saturnismo, que consiste em efeito sobre o sistema nervoso central com conseqncias bastante srias. Aos peixes, as doses fatais variam de 0,1 a 0,4 mg/L, embora, em condies experimentais, alguns resistam at 10 mg/L. Outros organismos (moluscos, crustceos, mosquitos quironomdeos e simuldeos, vermes oligoquetos, sanguessugas e insetos tricpteros), desaparecem aps a morte dos peixes, em concentraes superiores a 0,3 mg/L. 3.2.6 Cromo As concentraes de cromo em gua doce so muito baixas, normalmente inferiores a 1 g/L. comumente utilizado em aplicaes industriais e domsticas, como na produo de alumnio anodizado, ao inoxidvel, tintas, pigmentos, explosivos, papel, fotografia. O cromo amplamente utilizado em indstrias de curtume. Na forma trivalente o cromo essencial ao metabolismo humano e, sua carncia, causa doenas. Na forma hexavalente txico e cancergeno. Os limites mximos so estabelecidos basicamente em funo do cromo hexavalente. O cromo exerce efeito prejudicial sobre processos biolgicos, atuando sobre enzimas catalisadoras da sntese de protenas. Microrganismos podem suportar concentraes de apenas miligramas por litro (NAIME E FAGUNDES, 2005). Alguns estudos tm verificado a associao de aumento das taxas de dano de DNA em organismos bioindicadores e altas concentraes de cromo (TAGLIARI et al., 2006; BIANCHI et al., 1983).

3.2.7 Cobre O cobre ocorre geralmente nas guas, naturalmente, em concentraes inferiores a 20 g/L. Para os peixes, muito mais que para o homem, as doses elevadas de cobre so extremamente nocivas. Assim, trutas, carpas, bagres, peixes vermelhos de aqurios ornamentais e outros, morrem em dosagens de 0,5 mg/L. Os peixes morrem pela coagulao do muco das brnquias e conseqente asfixia (ao oligodinmica). Os microrganismos perecem em concentraes superiores a 1,0 mg/L. As fontes de cobre para o meio ambiente

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incluem corroso de tubulaes de lato por guas cidas, efluentes de estaes de tratamento de esgotos, uso de compostos de cobre como algicidas aquticos, escoamento superficial e contaminao da gua subterrnea a partir de usos agrcolas do cobre como fungicida e pesticida no tratamento de solos e efluentes, e precipitao atmosfrica de fontes industriais. As principais fontes industriais incluem indstrias de minerao, fundio e refinao.

3.2.8 Nquel O nquel tambm utilizado em galvanoplastias. Estudos recentes demonstram que carcinognico. No existem muitas referncias bibliogrficas quanto toxicidade do nquel; todavia, assim como para outros ons metlicos, possvel mencionar que, em solues diludas, estes elementos podem precipitar a secreo da mucosa produzida pelas brnquias dos peixes. Assim, o espao inter-lamelar obstrudo e o movimento normal dos filamentos branquiais bloqueado. O peixe, impedido de realizar as trocas gasosas entre a gua e os tecidos branquiais, morre por asfixia. Por outro lado, o nquel complexado (niquelcianeto) txico quando em baixos valores de pH. Concentraes de 1,0 mg/L desse complexo so txicas aos organismos de gua doce. A maior contribuio para o meio ambiente, pela atividade humana, a queima de combustveis fsseis. Como contribuintes principais tm tambm os processos de minerao e fundio do metal, fuso e modelagem de ligas, indstrias de eletrodeposio e, como fontes secundrias, temos fabricao de alimentos, artigos de panificadoras, refrigerantes e sorvetes aromatizados. Doses elevadas de nquel podem causar dermatites nos indivduos mais sensveis e afetar nervos cardacos e respiratrios.

3.2.9 Ferro O ferro faz parte da composio da maioria dos sedimentos lmnicos, por serem elementos muito freqentes na superfcie da Terra e, conseqentemente, so encontrados nos corpos dgua mesmo em pequenas concentraes. Dependendo principalmente do potencial de oxi-reduo, do pH e da temperatura, podem encontrar-se sob as formas reduzidas ou oxidadas. importante na ciclagem de outros elementos como o fsforo, alm de ter relevncia no metabolismo de certas bactrias na reduo energtica do CO2 (ESTEVES, 1998). O nvel de ferro nas guas superficiais aumenta nas estaes chuvosas devido ao carreamento de solos e a ocorrncia de processos de eroso das margens. Deve-se considerar

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tambm a contribuio de efluentes industriais, pois muitas indstrias metalrgicas desenvolvem atividades de remoo da camada oxidada (ferrugem) das peas antes de seu uso, processo conhecido por decapagem, que normalmente procedida atravs da passagem da pea em banho cido. O ferro, apesar de no se constituir em um txico, traz diversos problemas para o abastecimento pblico de gua. Confere cor e sabor gua, provocando manchas em roupas e utenslios sanitrios.

3.2.10 Zinco A presena de zinco comum nas guas naturais, porm, em concentraes acima de 5,0 mg/L, confere gua uma aparncia leitosa e produz um sabor metlico ou adstringente quando aquecida. Os efeitos txicos do zinco sobre os peixes so muito conhecidos, assim como sobre as algas. A ao desse on metlico sobre o sistema respiratrio dos peixes semelhante do nquel, anteriormente citada. As experincias com outros organismos aquticos so escassas. largamente utilizado na indstria e pode entrar no meio ambiente atravs de processos naturais e antropognicos, entre os quais se destacam a produo de zinco primrio, combusto de madeira, incinerao de resduos, produo de ferro e ao e efluentes domsticos. O zinco tambm bastante utilizado em galvanoplastias na forma metlica e de sais tais como cloreto, sulfato, cianeto, etc.

3.2.11 pH O termo pH (potencial hidrogeninico) usado universalmente para expressar o grau de acidez ou basicidade de uma soluo, ou seja, o modo de expressar a concentrao de ons de hidrognio nessa soluo. A escala de pH constituda de uma srie de nmeros variando de 0 a 14, os quais denotam vrios graus de acidez ou alcalinidade. Valores abaixo de 7 e prximos de 0 (zero) indicam aumento de acidez, enquanto valores de 7 a 14 indicam aumento da basicidade. Por influir em diversos equilbrios qumicos que ocorrem naturalmente ou em processos unitrios de tratamento de guas, o pH um parmetro importante em muitos estudos no campo do saneamento bsico. A influncia do pH sobre os ecossistemas aquticos naturais d-se diretamente devido a seus efeitos sobre a fisiologia das diversas espcies. Tambm o efeito indireto muito importante, pois determinadas condies de pH podem contribuir para a precipitao de elementos qumicos txicos como metais

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pesados; outras condies podem exercer efeitos sobre as solubilidades de nutrientes. Os critrios de proteo vida aqutica variam entre 6 a 9.

3.2.12 Turbidez A turbidez de uma amostra de gua o grau de atenuao de intensidade que um feixe de luz sofre ao atravess-la (e esta reduo se d por absoro e espalhamento, uma vez que as partculas que provocam turbidez nas guas so maiores que o comprimento de onda da luz branca), devido presena de slidos em suspenso, tais como partculas inorgnicas (areia, silte, argila) e de detritos orgnicos, algas e bactrias alm do plncton em geral. A eroso das margens dos rios em estaes chuvosas um exemplo de fenmeno que resulta em aumento da turbidez das guas e que exigem manobras operacionais, como alteraes nas dosagens de coagulantes e auxiliares, nas estaes de tratamento de guas. A eroso pode decorrer do mau uso do solo em que se impede a fixao da vegetao. Este exemplo mostra tambm o carter sistmico da poluio, ocorrendo inter-relaes ou transferncia de problemas de um ambiente (gua, ar ou solo) para outro. Os esgotos sanitrios e diversos efluentes industriais tambm provocam elevaes na turbidez das guas. Um exemplo tpico deste fato ocorre em conseqncia das atividades de minerao, onde os aumentos excessivos de turbidez tm provocado formao de grandes bancos de lodo em rios e alteraes nos ecossistemas aquticos. Alta turbidez reduz a fotossntese de vegetao enraizada submersa e algas. Esse desenvolvimento reduzido de plantas pode, por sua vez, suprimir a produtividade de peixes. Logo, a turbidez pode influenciar nas comunidades biolgicas aquticas. Alm disso, afeta adversamente os usos domstico, industrial e recreacional de uma gua.

3.2.13 Oxignio dissolvido O oxignio proveniente da atmosfera se dissolve nas guas naturais, devido diferena de presso parcial. A taxa de reintroduo de oxignio dissolvido em guas naturais atravs da superfcie depende das caractersticas hidrulicas e proporcional velocidade, sendo que a taxa de reaerao superficial em uma cascata maior do que a de um rio de velocidade normal, que por sua vez apresenta taxa superior de uma represa, onde a velocidade muito baixa. Outra fonte importante de oxignio nas guas a fotossntese de algas. Este fenmeno ocorre em guas poludas ou, mais propriamente, em guas eutrofizadas, ou seja, aquelas em que a decomposio dos compostos orgnicos lanados levou liberao de sais minerais no

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meio, especialmente os de nitrognio e fsforo, que so utilizados como nutrientes pelas algas. Esta fonte no muito significativa nos trechos iniciais de rios jusante de fortes lanamentos de esgotos. A turbidez e a cor elevadas dificultam a penetrao dos raios solares e apenas poucas espcies resistentes s condies severas de poluio conseguem sobreviver. A contribuio fotossinttica de oxignio s expressiva aps grande parte da atividade bacteriana na decomposio de matria orgnica ter ocorrido, bem como aps terem se desenvolvidos tambm os protozorios que, alm de decompositores, consomem bactrias clarificando as guas e permitindo a penetrao de luz. Uma adequada proviso de oxignio dissolvido essencial para a manuteno de processos de autodepurao em sistemas aquticos naturais. Os nveis de oxignio dissolvido tambm indicam a capacidade de um corpo d'gua natural manter a vida aqutica.

3.2.14 Coliformes fecais (Escherichia coli) As bactrias do grupo coliforme so consideradas os principais indicadores de contaminao fecal. O grupo coliforme formado por um nmero de bactrias que inclui os gneros Klebsiella, Escherichia, Serratia, Erwenia e enterobactrias. Escherichia coli uma bactria pertencente famlia Enterobacteriaceae caracterizada pela atividade da enzima glicuronidase que produz indol a partir do aminocido triptofano. a nica espcie do grupo dos coliformes termotolerantes cujo habitat exclusivo o intestino humano e de animais homeotrmicos, onde ocorre em densidades elevadas. A determinao da concentrao dos coliformes assume importncia como parmetro indicador da possibilidade da existncia de microorganismos patognicos, responsveis pela transmisso de doenas de veiculao hdrica, tais como febre tifide, febre paratifide, desinteria bacilar e clera.

Entre os parmetros acima descritos os metais pesados se caracterizam em um grave problema, pois mesmo aps tratamento convencional a gua pode ainda estar contaminada (MACHADO et al., 2005). Os metais pesados possuem ao genotxica, mutagnica e carcinognica em animais incluindo a espcie humana (VON BURG e LIU, 1993; STOHS e BAGCHI 1995; MOUNT e HOCKETT, 2000). Segundo resoluo do CONSEMA n 128, de 2006, o valor mximo permitido em lanamentos de efluentes industriais para os parmetros de cromo total, chumbo e nquel 0,5 mg/L, 0,2 mg/L e 1,0 mg/L, respectivamente.

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A resoluo CONAMA n357, de 2005, define como cinco as classes possveis para as guas doces superficiais, tendo como critrio para esta classificao os parmetros mximos ou mnimos, quando for o caso, permitidos para cada classe (Tabela 1).

Tabela 1 - Classes de gua doce e seus usos de acordo com a resoluo CONAMA 357/2005. Classificao Classe especial Usos Abastecimento para consumo humano, com desinfeco; preservao do equilbrio natural das comunidades aquticas e preservao dos ambientes aquticos em unidades de conservao de proteo integral. Abastecimento para consumo humano, aps tratamento simplificado; proteo das comunidades aquticas; recreao de contato primrio, tais como natao, esqui aqutico e mergulho, conforme a resoluo CONAMA n 274, de 2000; irrigao de hortalias que so consumidas cruas e de frutas que se desenvolvam rentes ao solo e que sejam ingeridas cruas sem remoo de pelcula e proteo das comunidades aquticas em Terras Indgenas. Abastecimento para consumo humano, aps tratamento convencional; proteo das comunidades aquticas; recreao de contato primrio, tais como natao, esqui aqutico e mergulho, conforme resoluo CONAMA n 274, de 2000; irrigao de hortalias, plantas frutferas e de parques, jardins, campos de esporte e lazer, com os quais o pblico possa vir a ter contato direto e aqicultura e atividade de pesca. Abastecimento para consumo humano, aps tratamento convencional ou avanado; irrigao de culturas arbreas, cerealferas e forrageiras; pesca amadora; recreao de contato secundrio e dessedentao de animais. Navegao e harmonia paisagstica.

Classe 1

Classe 2

Classe 3 Classe 4

Alm dos parmetros estabelecidos pela resoluo 357 do CONAMA, a Fundao Estadual de Proteo Ambiental (FEPAM) utiliza tambm o ndice de Qualidade de gua (IQA) que adota as faixas de qualidade de gua. Este ndice utiliza parmetros (variveis) considerados mais representativos para a caracterizao da qualidade das guas: oxignio dissolvido, nitrato, fsforo total, temperatura da gua, turbidez, e slidos totais. A cada varivel atribudo um peso, de acordo com a sua importncia relativa no clculo do IQA, e traadas curvas mdias de variao da qualidade das guas em funo da concentrao do

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mesmo. Os valores variam de 0 a 100 (muito ruim a excelente). Desta forma o IQA reflete a interferncia por esgotos sanitrios e outros materiais orgnicos, nutrientes e slidos. 3.3 Caractersticas da rea de estudo 3.3.1 Bacia Hidrogrfica do rio Ca A Bacia Hidrogrfica do rio Ca (Figura 1) possui uma rea de 5.057,25 Km, correspondendo a 1,79 % da rea do Estado do Rio Grande do Sul, localizada ao norte de Porto Alegre, entre o planalto brasileiro e a depresso central. Seu curso dgua tem uma extenso de 285 Km. Ao todo 41 municpios, com toda ou com parte de sua rea, compem a bacia. A populao total da bacia de 383.929 habitantes, sendo em torno de 25 % moradores da rea rural e 75 % da rea urbana (FEPAM/GTZ - 1997).

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Figura 1 Mapa da Bacia Hidrogrfica do rio Ca.

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A atividade econmica predominante da bacia a agricultura, embora a indstria e o comrcio sejam as atividades que geram mais divisas. Entre os municpios com atividade industrial bastante desenvolvida destacam-se os municpios de Caxias do Sul e Farroupilha, localizados na serra, com indstrias de alto potencial poluidor, principalmente do ramo de metalurgia e metal-mecnica. Na regio mais plana da bacia, principalmente na sub-bacia do rio Cadeia, os curtumes so as indstrias de maior potencial poluidor hdrico. Segundo FEPAM/GTZ (1997), as guas do rio Ca e seus afluentes tm usos bastante diversificados sendo que todo o rio pode ser utilizado para a proteo das comunidades aquticas e harmonia paisagstica. Cada trecho do rio possui um potencial diferenciado o que gera usos tambm diferenciados: Curso Superior: Energia eltrica, recreao, abastecimento pblico e diluio de esgoto. Curso Mdio: Irrigao, recreao (este trecho do rio o que apresenta maior concentrao de balnerios, localizados principalmente nos afluentes do rio Ca), diluio de despejos domsticos e industriais (a maioria dos despejos domsticos dos municpios lanada em esgotos pluviais e depois nos recursos hdricos, sem tratamento), minerao (principalmente, argila, areia, cascalho, arenito e basalto) e abastecimento domstico e industrial. Curso Inferior: Irrigao, navegao, recreao, abastecimento pblico e industrial, minerao (argila, areia e cascalho) e diluio de despejos domsticos e industriais. Nenhum municpio, neste trecho, trata seus esgotos cloacais. Quanto s indstrias, destacam-se os curtumes localizados ao longo do rio Cadeia/Feitoria e o Plo Petroqumico. Segundo a FEPAM, o rio Ca em geral apresenta boa qualidade das guas, mas alguns arroios drenam reas poludas causando reflexos na foz destes arroios. Destaca-se o rio Cadeia, cujo afluente arroio Feitoria drena alguns curtumes dos municpios de Ivoti e Linfolfo Collor, e tambm o arroio Pinhal que drena a rea sul de Caxias do Sul. Alguns fatores topogrficos favorecem a qualidade das guas do rio Ca, dos quais se destacam: a ausncia de grandes municpios prximos de suas margens, presena de corredeiras especialmente no trecho superior e baixas temperaturas. Os grandes municpios da bacia hidrogrfica como Caxias do Sul e Farroupilha esto afastados do rio Ca e o trabalho

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de depurao realizado nos arroios e rios que drenam parte destes municpios, como arroio Pinhal (rea sul de Caxias do Sul), rio Cadeia (curtumes de Ivoti e Lindolfo Collor), arroio Forromeco (rea sul de Farroupilha). 3.3.2 Sub-bacia do rio Cadeia O rio Cadeia, pertencente Bacia Hidrogrfica do rio Ca, um dos formadores da Bacia do rio Guaba, s margens do qual se situa Porto Alegre, capital do estado do Rio Grande do Sul. O rio Cadeia o principal afluente do rio Ca, drenando cerca de 19% da rea da bacia, nos quais se encontram vrios municpios importantes, destacando-se Nova Petrpolis, Gramado, Dois Irmos, Morro Reuter, Santa Maria do Herval, Ivoti e Porto. A sub-bacia do rio Cadeia (Figura 2) possui uma rea de mata nativa/reflorestamento de 495.41 Km, o que representa 55,24 % de toda a sub-bacia, enquanto que a rea urbana corresponde a 15,07 Km e a rea ocupada pela agricultura de 248,34 Km, referente a 27,69 % do total da sub-bacia. As principais culturas so o milho (9.700 ha), laranja (7.800 ha), mandioca (4.200 ha), e batata inglesa (3.700 ha), estimando-se preliminarmente em 70.000 litros o volume de agrotxicos lanado no ambiente por ano. Conforme monitoramento executado pela FEPAM trimestralmente na Bacia Hidrogrfica do rio Ca, no perodo de 1992 a 2007, com base nas mdias anuais, as guas da foz do rio Cadeia (S 29 37 48,6 W 51 22 45,5) enquadraram-se na faixa regular no evidenciando tendncias. Os dados mostraram que a foz do rio Cadeia apresentou freqncia igual a 85% na classe 1 no parmetro oxignio dissolvido e 100% de freqncia na classe 1 quanto a DBO5. Quanto ao parmetro coliformes termotolerantes em 66% enquadrou-se na classe 3. Em um estudo realizado por VARGAS et al. (2007), as guas do rio Cadeia apresentaram potencial citotxico e mutagnico no ensaio Salmonella/microssoma, porm, o trecho avaliado encontra-se no municpio a jusante da rea de estudo do presente trabalho. TAGLIARI et al. (2006) analisaram no inverno de 2000 e no vero de 2002 o mesmo trecho do rio Cadeia aqui estudado encontrando indcios de mutagenicidade utilizando TA102, na ausncia e presena de S9mix, em amostras de vero.

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rea urbana de Santa Maria do Herval reas urbanas Limites dos municpios Principais corpos dgua

Figura 2 Mapa da sub-bacia do rio Cadeia com a rea urbana de Santa Maria do Herval em destaque. Adaptado de RODRIGUES e FORMOSO (2005).

3.3.3 Municpio de Santa Maria do Herval O trecho do rio Cadeia estudado no presente trabalho situa-se no trecho intermedirio da Bacia do rio Ca, considerado como Alto Cadeia, no municpio de Santa Maria do Herval/RS (Figura 3). Santa Maria do Herval localiza-se a uma latitude 2929'53" sul e a uma longitude 5059'34" oeste, estando a uma altitude de 371 metros. O clima do tipo Cfa Subtropical mido (Kppen). A precipitao varia entre 1200 a 2100 mm/ano. A rea total do municpio de 134,53 Km, sendo que 97,55% dessa rea e 100% da rea urbana localizam-se dentro da sub-bacia do rio Cadeia. A rea urbana corresponde a 20 Km enquanto que a rural a 114,53 Km. A populao total em 2004 era de 6.152 habitantes sendo que o nmero de habitantes na rea urbana era de 1.582 e na rea rural de 4.507. O municpio possui 1059,03 ha de rea de preservao das quais 37,58% encontra-se em estado de desmatamento e 62,41% ainda apresenta mata. A economia de Santa Maria do Herval est baseada na indstria caladista e na agricultura, alm de um frigorfico e do setor de servios.

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As atividades rurais so uma das principais fontes potenciais de poluio. Estima-se que a produo de milho no municpio corresponda a 1.000 ha, a de mandioca a 150 ha e a de batata a 2.100 ha. Santa Maria do Herval possui tambm 192.550 ha de produo de animais de pequeno porte e 6.100 ha de grande porte. Quanto vazo industrial o setor de couro, peles e similares lana 15m/dia de efluentes no rio Cadeia (KOTLHAR e DE LUCA, 1997).

Figura 3 - Mapa da localizao do municpio de Santa Maria do Herval no estado do Rio Grande do Sul.

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4. MATERIAL E MTODOS 4.1 rea de estudo, locais e perodos de coleta Foram demarcados trs pontos (A, B, C,) ao longo do trecho escolhido do rio Cadeia no municpio de Santa Maria do Herval/RS (Figura 4). O ponto A (S 293101,6, W 505452,6) situa-se na zona rural do municpio, onde em alguns locais visualizam-se plantaes prximas a beira do rio. Entretanto, a jusante deste ponto pode existir outras fontes de contaminao, alm da agropecuria, a partir de municpios mais prximos nascente do rio (Igrejinha, por exemplo). O ponto B (S 293010,8, W505826) localiza-se a montante do ponto A, dentro do Balnerio Amizade, no incio da rea urbana. E o ponto C (S 293004,9, W 510005,9) localiza-se a montante do ponto B na represa da Usina Hidreltrica do Herval, aps todo o permetro urbano do municpio. Os pontos A e B, por apresentarem alta declividade, o que gera movimentao das guas, so considerados corpos dgua lticos, e o ponto C considerado lntico por apresentar guas com movimentos lentos ou estagnado.

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A B

Figura 4 - Esquema dos pontos de coleta (A, B, C) no rio Cadeia em Santa Maria do Herval. O ponto A localiza-se antes do centro urbano e na rea rural do municpio; o ponto B localizase no centro do municpio no Balnerio Amizade; o ponto C localiza-se aps todo o permetro urbanizado do municpio, na Usina Hidreltrica Herval.

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Em cada ponto foram coletadas amostras de gua que foram encaminhadas Feevale, para o Laboratrio de Gentica e Biologia Molecular para a realizao dos bioensaios com peixes e para a Central Analtica para a realizao das anlises fsico-qumicas e microbiolgicas da gua. Em um perodo diferente (sempre que possvel, em intervalos de aproximadamente sete dias em relao s coletas de amostras de gua), foram realizadas coletas de peixes apenas nos pontos B e C. Foram realizadas vrias tentativas de coleta de peixes no ponto A, mas sem sucesso, possivelmente devido baixa profundidade daquele trecho do rio. As amostragens ocorreram periodicamente visando detectar possveis variaes durante o perodo de 12 meses, compreendidos entre novembro de 2007 e outubro de 2008. Dados climatolgicos da regio referentes aos meses de coleta foram obtidos junto a METSUL meteorologia do municpio de So Leopoldo/RS (Tabela 2). Outubro, agosto e setembro de 2008 foram os meses que apresentaram maiores ndices pluviomtricos enquanto que junho de 2008, novembro de 2007 e fevereiro de 2008 apresentaram os menores ndices pluviomtricos em ordem decrescente. Tabela 2 - Dados climatolgicos da regio de estudo nos meses de coleta obtidos juntos a METSUL Meteorologia.
Precipitao total (mm) Novembro/07 Fevereiro/08 Junho/08 Agosto/08 Setembro/08 Outubro/08 100,2 84,9 133,4 185,3 162,2 217,9 Umidade relativa do ar (mdia) 70% 74% 82% 77% 76% 74% Dias chuvosos 8 9 14 11 10 15 Temperatura mdia (C) 21,9 24,5 15,0 15,8 16,8 19,9 Temperatura mnima absoluta (C) 9,9 14 1,9 5,1 6,2 7,8 Temperatura mxima absoluta (C) 36,1 35,4 24,2 31,0 33,9 35,1

4.2 Metodologia 4.2.1 Ensaio cometa 4.2.1.1 Bioensaios Foram realizadas trs coletas de gua nos pontos A, B e C do rio Cadeia: novembro de 2007, fevereiro de 2008 e outubro de 2008. Para cada coleta, exemplares de Astyanax jacuhiensis (Lambari) provenientes de piscicultura foram transferidos para o Laboratrio de Biologia Molecular do Centro Universitrio FEEVALE, onde ocorreu a aclimatao por

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aproximadamente 24 horas em aqurios de 9 litros, contendo gua de poo artesiano com aerao e a temperatura ambiente. Aps o perodo de aclimatao os animais foram ento expostos s amostras de guas no mesmo dia em que foram realizadas as coletas. Para cada ponto de coleta foi utilizado um aqurio, o qual continha 9 litros de gua do rio. Em cada aqurio, cerca de 10 exemplares de Astyanax jacuhiensis, medindo aproximadamente 5 cm, ficaram expostos durante 48 horas at a realizao do ensaio cometa. 4.2.1.2 Preparao das lminas e anlise microscpica Aps o perodo de exposio os animais foram ento retirados dos aqurios individualmente e com um corte na regio caudal foi coletada uma amostra de 5 l de sangue. A realizao do ensaio cometa seguiu a metodologia descrita por TICE et al. (2000), utilizando a colorao com nitrato de prata. A amostra de 5 l de sangue coletada de cada peixe foi mistura a 95 l de agarose low-melting. Aps homogeneizao, a suspenso de clulas foi colocada em uma lmina previamente coberta com agarose regular, sobre a qual foi colocada uma lamnula. As lminas foram deixadas em cmara mida a 4C por cerca de 7 minutos, posteriormente, as lamnulas foram retiradas e as lminas foram colocadas em soluo de lise (NaCl 2.5M, EDTA 100mM, Tris 10mM, 1% de Triton X-100, 10% de DMSO) com altos nveis de sais e detergente por no mnimo 6 horas e no mximo 96 horas. Quando retiradas da lise, as lminas foram acondicionadas em uma cuba de eletroforese contendo soluo tampo alcalina (NaOH 300mM, EDTA 1mM, pH > 13) por 20 minutos. Aps este perodo, foi realizada a eletroforese a 25V e 300mA, tambm por 20 minutos. Ao trmino do processo de eletroforese, as lminas foram retiradas da cuba e imersas em tampo de neutralizao (Tris 0.4M com pH 7,5). Para a colorao, as lminas foram imersas em soluo fixadora (15% cido tricloroactico, 5% sulfato de zinco, 5% glicerol e 75% gua destilada), lavadas em gua destilada, secas e ento acomodadas em cubeta contendo nitrato de prata. Aps 35 minutos, foram retiradas da cubeta, lavadas em gua corrente, e colocadas para secar novamente, para ento serem analisadas. Para medir o dano de DNA atravs do ensaio cometa, 100 clulas de cada lmina foram observadas em microscpio ptico de luz (Nikon) utilizando aumento de 400X. As lminas foram codificadas e sempre analisadas pela mesma pessoa. As clulas foram classificadas de acordo com o tamanho da cauda em (Figura 5): Classe 0: nenhum dano, ou seja, nucleides intactos, sem cauda. Classe 1: dano pequeno, os nucleides apresentam um tamanho de cauda inferior ao dimetro da cabea;

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Classe 2: dano intermedirio, os nucleides apresentam caudas com tamanhos equivalentes a uma vez o tamanho do dimetro da cabea; Classe 3: dano elevado, os nucleides apresentam caudas com tamanho equivalente a duas vezes o dimetro da cabea; Classe 4: dano mximo, os nucleides apresentaram caudas com tamanho superior a duas vezes o dimetro da cabea.

Figura 5 - Classes de danos de DNA utilizadas no ensaio cometa. A- Classe 0 ; B Classe 1; C- Classe 2; D - Classe 3; E - Classe 4. A avaliao do dano de DNA entre os pontos de uma coleta e entre as coletas de um mesmo ponto foi realizada com base em trs parmetros de genotoxicidade fornecidos pelo ensaio cometa: 1) a freqncia de clulas com dano (freqncia de dano) onde foram somados os nmeros de clulas pertencentes s classes 1, 2, 3 e 4; 2) a freqncia de cada classe de dano; 3) o ndice de dano, estimado com base na multiplicao do nmero de clulas obtidas em cada classe pelo valor de cada classe, obtendo-se assim o escore, de acordo com a frmula: ndice de dano: (0 x A) + (1 x B) + (2 x C) + (3 x D) + (4 x E) Onde, A, B, C, D e E so os nmeros de clulas encontradas para cada categoria analisada. Assim, o ndice de dano poderia variar de 0 a 400.

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4.2.2

Teste de microncleo e anormalidades nucleares 4.2.2.1 Coleta dos peixes

As coletas foram realizadas em 2008, nos meses de fevereiro, junho, agosto e outubro. Foram coletados, com auxlio de pu, exemplares pertencentes espcie Bryconamericus iheringi (Lambari) medindo cerca de 7 cm nos pontos B e C do rio Cadeia. Os exemplares foram transportados em recipientes contendo gua do rio ao laboratrio de Gentica e Biologia Molecular da Feevale para a realizao do teste de microncleo e anormalidades nucleares. 4.2.2.2 Preparao das lminas e anlise microscpica O sangue foi coletado a partir de um corte na regio caudal e diretamente gotejado em uma lmina limpa e seca e com auxlio de uma outra lmina encostada em ngulo de 45, o sangue foi espalhado uniformemente, formando uma camada delgada. Aps 10 minutos de secagem a temperatura ambiente as lminas ento foram fixadas com metanol absoluto por 10 minutos. Aps 10 minutos de secagem, as lminas foram ento coradas com Giemsa 5% diludo em tampo fosfato pH 6,8 (4,0827g KH PO ; 7,099g Na HPO para 1L de gua)
2 4 2 4

tambm por 10 minutos. Aps este perodo as lminas foram lavadas com gua destilada e armazenadas em caixas em temperatura ambiente para posterior anlise. Foi preparada uma lmina para cada peixe. A anlise citolgica foi realizada em microscpio ptico de luz (Nikon) com lente de imerso (1000X). Foram analisados 2000 eritrcitos intactos por lmina, o que significa 2000 eritrcitos por peixe amostrado. Foram considerados como microncleos os corpsculos de massa de cromatina que em relao ao ncleo apresentaram aproximadamente 1/3 do seu tamanho, estando nitidamente separados, com bordas distinguveis, mesma cor e refringncia (AL-SABTI e METCALFE, 1995) (Figura 6 MN). As anormalidades nucleares foram analisadas segundo critrios de CARRASCO et al. (1990). Os brotos nucleares caracterizam-se pela ligao do microncleo ao ncleo (Figura 6 BRN) e os eritrcitos binucleados pela presena de dois ou mais ncleos (Figura 6 - BN). Ncleos com morfologia anormal foram considerados como: blebbed, apresentam uma pequena invaginao da membrana e da cromatina (Figura 6 - BL ); lobed, apresentam uma invaginao maior da membrana e da cromatina, formando lobos (Figura 6 - LB) e notched,

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apresentam profundas invaginaes ou ainda lacunas que no contm cromatina (Figura 6 NT). MN

BRN

Figura 6 A: MN: Microncleo; BN: Eritrcito binucleado; BRN: Broto nuclear; BL: Ncleo blebbed; LB: Ncleo lobed; NT: Ncleo notched. (BN, BL, LB, NT imagens de JIRAUNGKOORSKUL et al., 2008). 4.2.3 Anlise fsico-qumica e microbiolgica da gua 4.2.3.1 Coleta de gua Foram coletadas amostras de gua nos trs pontos selecionados no rio Cadeia em novembro de 2007, fevereiro de 2008, junho de 2008 e setembro de 2008. As amostras de gua foram coletadas em frascos de polietileno, com capacidade de 5L para os parmetros de pH, turbidez, DBO5 (demanda bioqumica de oxignio), nitrognio amoniacal total nitrito e nitrato. Para a determinao dos parmetros de fsforo total foi utilizado um frasco separado de 250 mL. Para os metais como alumnio, chumbo, cromo, cobre, nquel, ferro e zinco foram utilizados frascos com capacidade de 1 L, previamente preparados para tal finalidade. Para a amostra de coliformes fecais foram utilizadas embalagens prprias para tal uso, previamente esterilizadas e a coleta se deu de forma direta. As amostras para determinao de oxignio dissolvido foram coletadas diretamente, em frascos adequados, preservadas no momento da coleta com 1 mL de soluo de sulfato manganoso e 1 mL de soluo de iodeto de potssio alcalino.

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Todas as amostras foram acondicionadas em recipiente trmico preservadas com gelo e transportadas at a Central Analtica do Centro Universitrio Feevale em at trs horas, para ento serem analisadas.

4.2.3.2 Anlise laboratorial Especificamente foram analisados os parmetros de qualidade de gua: DBO5, nitrognio amoniacal, fsforo total, alumnio, chumbo, cromo, cobre, nquel, ferro, zinco, pH, nitrato, nitrito, turbidez, oxignio dissolvido e coliformes fecais (Escherichia coli). As anlises foram realizadas pela Central Analtica da Feevale, segundo metodologia e procedimento conforme credenciamento a Fundao Estadual de Proteo de Meio Ambiente (FEPAM) (Tabela 3). As anlises fsico-qumicas foram realizadas em duplicata, tendo como referncia o Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 21 th Ed, 2005.

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Tabela 3 - Metodologia e procedimentos utilizados nos ensaios laboratoriais para cada parmetro segundo FEPAM. Parmetro DBO5 Nitrognio amoniacal total Fsforo total Alumnio Chumbo Cromo Cobre Nquel Ferro Zinco pH Nitrato Nitrito Turbidez Oxignio dissolvido Coliformes fecais (Escherichia coli) Metodologia Manometria Titulometria Espectroscopia UV/VIS Absoro atmica Absoro atmica Absoro atmica Absoro atmica Absoro atmica Absoro atmica Absoro atmica Potenciometria Espectroscopia UV/VIS Espectroscopia UV/VIS Nefelometria Winkler/Azida Substrato enzimtico Procedimento PT.PA.004 PT.PA.011 PT.PA.008 PT.AA.001 PT.AA.001 PT.AA.001 PT.AA.001 PT.AA.001 PT.AA.001 PT.AA.001 PT.PA.028 PT.PA.009 PT.PA.010 PT.PA.031 PT.PA.035 PT.MB.005

A anlise desses parmetros junto com a sua comparao com os valores de referncia da Resoluo 357/2005 do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA), foi utilizada para a determinao da classe de qualidade da gua de cada coleta em cada ponto de amostragem do rio Cadeia. Os valores de referncia para a classificao das guas coletadas nos diferentes pontos do rio Cadeia esto apresentados na Tabela 4.

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Tabela 4 - Valores de referncia para a classificao das amostras de gua analisadas (segundo Resoluo 357/2005 do CONAMA).
Parmetro DBO5 Nitrognio amoniacal total Unidade mg O2 L -1 mg L-1 N 3,7 2,0 1,0 0,5 Fsforo total mg L
-1

Classe 1 3 pH 7,5 >7,58,0 >8,08,5 >8,5

Ambiente Lntico Intermed. Ltico

Classe 2 5 N 3,7 2,0 1,0 0,5 F 0,020 0,025 0,1 0,1 0,01 0,05 0,009 0,025 0,3 0,18 6a9 10 1,0 100 **5 1000 pH 7,5 >7,58,0 >8,08,5 >8,5
Ambiente Lntico Intermed. Ltico

Classe 3 10 N 13,3 5,6 2,2 1,0 0,15 0,05 0,075 0,15 0,2 0,033 0,05 0,013 0,025 5,0 5 6a9 10 1,0 100 **4 2500 pH 7,5 >7,58,0 >8,08,5 >8,5
Ambiente Lntico Intermed. Ltico

Classe 4 NE NE

Fora de classe -----

F 0,020 0,025 0,1

NE

---

Alumnio Chumbo Cromo Cobre Nquel Ferro Zinco pH Nitratos Nitrito Turbidez Oxignio dissolvido Coliformes fecais (E. coli)

mg L

-1

0,1 0,01 0,05 0,009 0,025 0,3 0,18 6a9 10 1,0 40

-1

NE NE NE NE NE NE NE 6a9 NE NE NE **2 NE

--------------<6>9 ------<2 >1,7x105

mg L-1 mg L
-1

mg L-1 mg L
-1

mgL-1 mg L
-1

Unidades de pH mg L-1 mg L
-1

NTU Mg O2 L

**6 200

NMP/100 mL

Valores antecedidos por ** correspondem a valores mnimos; os demais so valores mximos.

36

4.2.4

Anlise estatstica

A comparao entre os ndices de danos de DNA do ensaio cometa e freqncia de microncleos e anormalidades nucleares entre os diferentes pontos e perodos de coleta foram realizadas com base na Anlise de Varincia - ANOVA (p<0,05) e teste de Tuckey a posteriori, ou teste T Student quando a anlise envolvia duas amostras. A comparao das freqncias de clulas com dano, assim como das classes de dano do ensaio cometa entre os pontos e perodos foram realizadas atravs do teste do Qui-quadrado (2). Todas as anlises foram feitas no programa SPSS 10.0.

37

5. RESULTADOS 5.1 Ensaio cometa Neste estudo, foram analisados 44 exemplares de Astyanax jacuhiensis atravs do ensaio cometa, em trs perodos de coleta distintos, totalizando 8 amostras do rio Cadeia (o ponto B no foi avaliado na coleta de novembro de 2007). A comparao da freqncia de clulas que apresentavam dano de DNA (freqncia de dano, isto , o somatrio das classes 1, 2, 3 e 4) entre os pontos em uma mesma coleta no apresentou diferenas significativas (Tabela 5), sendo que a maior diferena neste parmetro de genotoxicidade em um mesmo perodo de coleta foi observada em outubro/08 (66% no ponto A e 79% no ponto C). Considerando todas as amostras analisadas, a freqncia de dano variou de 66% (ponto A, coleta outubro/08) a 92% (ponto A, coleta fevereiro/08). Ao comparar as freqncias de dano entre perodos de coleta dentro de um mesmo ponto, os pontos A (p=0,001) e C (p=0,019) apresentaram diferena significativa. O ponto A apresentou maior mdia de freqncia de dano (92%) em fevereiro de 2008 diferindo significativamente de outubro de 2008 (66%). O ponto C apresentou maior mdia tambm em fevereiro de 2008 (91%) diferindo significativamente de novembro de 2007 (70%) (Tabela 5).

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Tabela 5 Mdia desvio padro da freqncia de clulas com dano de DNA no ensaio cometa em Astyanax jacuhiensis e nmero de indivduos analisados (entre parnteses) nos pontos A, B e C nas trs coletas do rio Cadeia. Valores de p para as comparaes entre as coletas em um mesmo ponto so apresentados na ltima coluna e na ltima linha para as comparaes entre os pontos em uma mesma coleta. Coletas Pontos de coleta A B C p
(entre pontos) Meses de coleta com a mesma letra no diferem significativamente dentro do mesmo ponto (Teste ANOVA, Tuckey a posteriori).

p
(entre coletas)

Novembro/07 0,81 0,04a, b (5) 0,70 0,18a (4) p = 0,20

Fevereiro/08 0,92 0,10b (6) 0,80 0,13 (4) 0,91 0,08b (8) p = 0,14

Outubro/08 0,66 0,13a (6) 0,76 0,04 (5) 0,79 0,09a, b (6) p = 0,08 p=0,001 p=0,07 p=0,019

As comparaes da distribuio das freqncias de cada classe de dano do ensaio cometa entre os pontos de uma mesma coleta apresentaram diferena significativa em todas as coletas (Tabela 6). No ms de novembro de 2007 no ponto A, a classe de dano com maior freqncia foi a 3 (24,20%) e a com menor freqncia foi 1 (15,40%) enquanto que no ponto C a classe 0 apresentou a maior freqncia (29,75%) e a classe 1 a menor (16,00%). Em fevereiro de 2008, a classe de dano mais freqente foi a 4 nos trs pontos de coleta (30,00% no ponto A; 22,25% no ponto B e 45,25% no ponto C), entretanto a distribuio das freqncias de cada classe foi significativamente heterognea entre os pontos. Na ltima coleta, do ms de outubro/08, o ponto A apresentou maior freqncia da classe 0 (33,70%) e a menor da classe 4 (2,5%). No ponto B, a maior freqncia foi encontrada na classe 2 (27,80%) e a menor na classe 4 (6,20%). E no ponto C, a maior freqncia obtida foi na classe 2 (27,30%) e a menor na classe 3 (18,70%).

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Tabela 6 - Freqncia das classes de dano do ensaio cometa em Astyanax jacuhiensis nos pontos A, B e C do rio Cadeia em cada perodo de amostragem. Coleta Ponto de coleta (N) 0 Novembro/07 A (5) C (4) 2= 14,8; p=0,005a Fevereiro/08 A (6) B (4) C (8) 2= 120,3; p=0,001a Outubro/08 A (6) B (5) C (6) 2= 79,1; p=0,002a
a

Classes 1 2 3 4

(19,40%) (15,40%) (21,60%) (24,20%) 19,40%) (29,75%) (16,00%) (16,50%) (21,00%) (16,75%)

(8,20%)

(12,80%) (22,50%) (26,50%) (30,00%)

(20,50%) (16,75%) (20,25%) (20,25%) (22,25%) (9,40%) (15,00%) (11,75%) (18,60%) (45,25%)

(33,70%) (26,30%) (22,70%) (14,80%) (23,60%) (22,20%) (27,80%) (20,20%)

(2,50%) (6,20%)

(21,00%) (20,20%) (27,30%) (18,70%) (12,80%)

Teste de homogeneidade da distribuio das classes de dano entre os pontos na mesma coleta (Teste do Qui-

quadrado 2).

Os resultados da anlise do ndice de dano de DNA do ensaio cometa entre os pontos de uma mesma coleta so apresentados na Tabela 7. Na coleta de novembro/07 no houve diferena significativa (p=0,53) entre os pontos A (ndice mdio = 208,80) e C (ndice mdio = 179,00). O ms de fevereiro de 2008 apresentou diferena significativa (p=0,02) quanto a este parmetro de genotoxicidade, no qual o ponto B apresentou ndice de dano significativamente menor (207,00) do que os pontos A (257,16) e C (275,37). Em outubro/08, foi observada uma tendncia de aumento do ndice de dano do ponto A em direo ao ponto C, porm no foram observadas diferenas significativas entre os pontos (ndice mdio = 126,16; 163,00 e 182,00 para os pontos A, B e C, respectivamente). Ao comparar as variaes entre os ndices de dano de DNA de um mesmo ponto entre as diferentes coletas (Tabela 7) foi observado que no ponto A o ms de fevereiro de 2008 foi

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significativamente maior (p=0,0001) do que a coleta de outubro de 2008. O ponto B no apresentou diferena significativa entre as coletas de fevereiro e outubro de 2008 (p=0,17). O ponto C apresentou resultados semelhantes ao ponto A, o maior ndice de dano de DNA ocorreu em fevereiro de 2008 diferindo significativamente com todos os outros meses de amostragem (p=0,0001).

Tabela 7 Mdia e desvio padro do ndice de danos de DNA em Astyanax jacuhiensis e nmero de indivduos analisados (N) nos pontos A, B e C do rio Cadeia, nos perodos de coleta novembro/2007, fevereiro/2008 e outubro/2008. Valores de p para as comparaes entre as coletas em um mesmo ponto so apresentados na ltima coluna e na ltima linha para as comparaes entre os pontos em uma mesma coleta. Coletas Pontos A B C p Novembro/07 208,80 21,50a, b (5) 179,00 78,70a (4) p=0,53 Fevereiro/08 257,16 42,90b (6) 207,00 44,2* (4) 275,37 28,72b (8) p=0,02 Outubro/08 126,16 43,60a (6) 163,00 41,81 (5) 182,00 32,90a (6) p=0,07 p=0,0001 p=0,17 p=0,0001 p

Perodos de coleta com a mesma letra no diferem significativamente dentro do mesmo ponto. * Dano no ponto B difere significativamente dos demais pontos na coleta de Fev/08. (Teste ANOVA, Tuckey a posteriori).

5.2 Teste de microncleo e anormalidades nucleares Os resultados do teste de microncleos (MN) so apresentados na Tabela 8. O nmero mdio de clulas com MN em 2.000 clulas analisadas de Bryconamericus iheringi no apresentou diferenas significativas entre os pontos B e C do rio Cadeia nas coletas de fevereiro de 2008 (p=0,23), junho de 2008 (p=0,55), agosto de 2008 (p=1,0) e outubro de 2008 (p=0,23). Quando a taxa de MN foi comparada entre os perodos de coleta, o ponto C no apresentou diferenas significativas (p=0,07). No entanto, houve diferena significativa (p=0,01) entre as amostras do ponto B, sendo que os peixes analisados no ms de fevereiro/08 apresentaram uma freqncia maior de microncleos do que nos outros meses.

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Tabela 8 Mdia e desvio padro do nmero de microncleos em 2.000 clulas de Bryconamericus iheringi e nmero de indivduos analisados (N) nos pontos B e C do rio Cadeia em cada perodo de coleta. Valores de p para as comparaes entre as coletas em um mesmo ponto so apresentados na ltima coluna e na ltima linha para as comparaes entre os pontos em uma mesma coleta.
Pontos B C p (entre os pontos da mesma coleta) Coletas Fevereiro/08 1,331,50* (6) 0,570,53 (7) p=0,23 Junho/08 0,10,31 (10) 0,20,42 (10) p=0,55 Agosto/08 0,10,31 (10) 0,10,31 (10) P=1,0 Outubro/08 0,40,69 (10) 0,10,31 (10) p=0,23 p (entre as coletas no mesmo ponto) p=0,01 p=0,07

*A coleta de fevereiro/08 difere significativamente das demais coletas do ponto B. (Teste ANOVA, Tuckey a posteriori).

Alm de MN, foram observados outros tipos de anormalidades nucleares nos eritrcitos de Bryconamericus iheringi coletados no rio Cadeia. Foram encontrados eritrcitos binucleados, brotos nucleares e ncleos com alterao morfolgica (blebbed, lobed e notched). Os resultados desta anlise so apresentados na Tabela 9. Eritrcitos binucleados foram observados somente na coleta de agosto de 2008, no ponto B, porm no houve diferena significativa (p>0,05) quando comparado ao ponto C. Entretanto, observou-se que as mdias de outras anormalidades nucleares diferiram significativamente entre os pontos B e C em uma mesma coleta. Houve diferena significativa (p=0,03) para broto nuclear apenas no ms de fevereiro de 2008 onde o ponto B apresentou maior mdia em relao ao ponto C. Quanto s anormalidades nucleares blebbed+lobed+notched verificou-se que tanto em junho como em outubro de 2008 o ponto C apresentou maior mdia diferindo significativamente (p=0,01) do ponto B. Em agosto de 2008, apesar do ponto B ter apresentado maior mdia do que o ponto C no houve diferena significativa (p>0,05). Ao comparar as anormalidades nucleares entre as diferentes coletas em um mesmo ponto, a freqncia de ncleos blebbed+lobed+notched apresentou diferenas significativas (p=0,001) onde o ponto B apresentou maior mdia em agosto diferindo de fevereiro e junho de 2008 e o ponto C apresentou maior mdia na coleta de outubro, diferindo significativamente (p=0,0001) de fevereiro e junho de 2008. No se verificou presena de anormalidades nucleares blebbed+lobed+notched em fevereiro de 2008. Para brotos

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nucleares, os pontos B e C no apresentaram diferenas significativas entre os meses de amostragens (p>0,05). No houve diferena significativa (p>0,05) entre perodos de coleta para ambos os pontos em relao a eritrcitos binucleados sendo que estes foram observados apenas no ponto B em agosto de 2008.

Tabela 9 - Mdia e desvio padro das alteraes nucleares nos eritrcitos de Bryconamericus iheringi coletados nos pontos B e C do rio Cadeia em quatro perodos de coletas.
Fevereiro/08 Anormalidades nucleares Eritrcitos binucleados Broto nuclear Ncleos Blebbed + lobed + notched N 00a 00a 0,10,3a, * 0,8 0,8a, * 3,74,6b 1,7 1,8a, b 1,11,0a, b* 3,1 1,9b* Ponto B 00 0,50,6* Ponto C 00 00* Junho/08 Ponto B 00 0,10,3 Ponto C 00 00 Agosto/08 Ponto B 0,20,4 0,10,3 Ponto C 00 0,1 0,3 Outubro/08 Ponto B 00 0,10,3 Ponto C 00 0,20,6

10

10

10

10

10

10

Perodos de coleta com a mesma letra no diferem significativamente dentro do mesmo ponto. *Diferena significativa (p<0,05) entre os pontos no mesmo perodo de coleta. (Teste ANOVA, Tuckey a posteriori).

5.3 Anlise fsico-qumica e microbiolgica da gua Os valores para cada parmetro analisado nas amostras de gua dos pontos A, B e C do rio Cadeia e nos diferentes perodos de coleta so apresentados na Tabela 10. O parmetro DBO5 no foi detectado apenas em novembro de 2007 no ponto A. O parmetro fsforo total foi detectado apenas em junho de 2008, nos pontos B e C, enquanto que o alumnio foi detectado apenas em junho e em setembro de 2008 nos pontos A, B e C. Concentraes de cromo foram verificadas nos pontos A, B e C, apenas em fevereiro de 2008. Todas as amostragens apresentaram presena de coliformes fecais.

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Tabela 10 - Valores dos parmetros analisados nas amostras de gua coletadas nos trs pontos de amostragem do rio Cadeia nos quatro perodos de coleta. PA = Ponto A; PB = Ponto B; PC = Ponto C.
Parmetro DBO5 Nitrognio amoniacal Fsforo total Alumnio Chumbo Cromo Cobre Nquel Ferro Zinco pH Nitrato Unidade mg O2 L -1 mg L-1 mg L-1 mg L mg L mg L
-1 -1 -1

Novembro/07* PA PC n.d. <0,5 n.d. n.d. 0,01 n.d. n.d. 0,02 0,40 0,01 7,26 0,30 5 <0,5 n.d. 0,06 0,01 n.d. n.d. 0,02 0,58 0,01 6,98 0,34

PA 3 <0, 5 n.d. n.d.

Fevereiro/08 PB PC 3 <0,5 n.d. n.d. 5 <0,5 n.d. n.d. n.d. 0,018 n.d. n.d. 0,54 0,009 6,95 0,58 0,01 2,83 8,13 200

PA <1 <0,5 n.d. 0,20 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,22 0,01 7,06 n.d. n.d. 0,02 8,33 86

Junho/08 PB PC <1 <0,5 0,012 0,18 n.d. n.d. 0,002 n.d. 0,24 0,01 6,90 0,55 n.d. 0,45 9,14 122 <1 <0,5 0,069 0,24 n.d. n.d. 0,002 n.d. 0,20 0,01 7,18 0,60 n.d. 0,60 9,25 173

Setembro/08 PA PB PC <1 <0,5 n.d. 0,38 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,25 0,002 7,18 1,06 0,003 2,00 7,31 441 <1 <0,5 n.d. 0,44 n.d. n.d. 0,002 n.d. 0,30 n.d. 7,41 0,95 n.d. 1,40 7,93 238 <1 <0,5 n.d. 0,26 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,19 n.d. 7,38 0,80 n.d. 0,02 7,93 279

mg L-1 mg L mg L
-1 -1 -1

n.d. n.d. 0,00 0.012 7 n.d. n.d. n.d. 0,42 n.d. 0,51

mg L --mg L-1

0,01 0,009 7,54 7,39 0,26 0,34 0,01 2,15 8,13 410 0,01 1,77 7,72 200

Nitrito mg L-1 0,003 0,10 Turbidez NTU 1,40 1,80 Oxignio -1 mg L 7,73 7,56 dissolvido Coliformes NMP/100mL 310 100 fecais (E. coli) * No h coleta no ponto B em novembro/07. n.d = no detectado

As amostras de gua coletadas em diferentes pontos do rio Cadeia foram enquadradas em classes de acordo com a resoluo 357 do CONAMA/05 (Tabela 11).

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Tabela 11 - Enquadramento das guas dos pontos analisados do rio Cadeia durante o perodo monitorado. PA = Ponto A; PB = Ponto B; PC = Ponto C. Classe 1: ; Classe 2: ; Classe 3:; Classe 4:
Novembro/2007 Fevereiro/2008 PA PC PA PB PC Junho/2008 PA PB PC Setembro/2008 PA PB PC

Parmetro DBO5 Nitrognio amoniacal Fsforo total Alumnio Chumbo Cromo Cobre Nquel Ferro Zinco pH Nitrato Nitrito Turbidez Oxignio dissolvido Coliformes fecais (Escherichia coli)

Os dados apresentados mostram que as guas do rio Cadeia no trecho e perodo analisado se encontram, segundo a maioria dos parmetros, na classe 1. O parmetro DBO5 apresentou valores que enquadraram o ponto C tanto na coleta de novembro de 2007 como na coleta de fevereiro de 2008 na classe 2. Assim como coliformes fecais, que enquadrou o ponto A nas coletas de novembro de 2007, fevereiro de 2008 e setembro de 2008 e pontos B e C na coleta de setembro de 2008 na classe 2. Quanto aos metais, os nveis de alumnio na coleta de junho de 2008 nos pontos A e C e na de setembro de 2008 nos pontos A, B e C enquadram as guas na classe 3, enquanto que os nveis de ferro na coleta de novembro de 2007 nos pontos A e C e na coleta de fevereiro de 2008 nos pontos A, B e C enquadram as guas na classe 2. Somente a amostra do ponto C de junho de 2008 apresentou o parmetro fsforo total dentro dos padres de classe 4.

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6. DISCUSSO A proteo dos ecossistemas depende da capacidade de distinguir os efeitos das aes humanas das variaes naturais, buscando categorizar a influncia antrpica sobre os sistemas biolgicos (CAIRNS et al., 1993). A definio de biomonitoramento mais aceita o uso sistemtico das respostas de organismos vivos, seja ele como um todo ou, atravs de um determinado tecido, para avaliar mudanas ocorridas no ambiente, geralmente causadas por aes humanas (SILVA et al., 2003). Testes genticos, utilizando peixes como bioindicadores, so bastante teis para monitorar o meio aqutico, constituindo uma ferramenta complementar s formas tradicionais de avaliao, que utilizam mtodos fsicoqumicos e microbiolgicos. Neste contexto o objetivo principal deste trabalho foi o de analisar o potencial genotxico de trs pontos do rio Cadeia no municpio de Santa Maria do Herval/RS utilizando o ensaio cometa e o teste de microncleo e anormalidades nucleares em peixes alm de analisar as propriedades fsico-qumicas e microbiolgicas dos referidos pontos. O rio Cadeia banha diversos municpios como Nova Petrpolis, Gramado, Dois Irmos, Morro Reuter, Santa Maria do Herval, Ivoti e Porto. O municpio de Santa Maria do Herval recebe destaque em funo de 97,55% dos seus 134,53 Km de rea, localizar-se dentro da sub-bacia do rio Cadeia, sendo que 100% da zona urbana esto inseridas nela. O rio Cadeia atravessa o municpio recebendo influncia antrpica de diversas origens. A partir de um levantamento junto a Prefeitura Municipal de Santa Maria do Herval, as principais fontes em potencial de poluio do rio Cadeia so: a drenagem pluvial urbana e rural, atividades de criao de animais de pequeno e grande porte, resduos slidos urbanos, efluentes domsticos no tratados e industriais tratados, alm dos agrotxicos. Portanto, o presente estudo no teve o intuito de identificar um poluente especfico ou uma fonte de poluio como genotxicos e sim verificar se as misturas de poluentes de diversas origens encontradas em cada ponto de coleta apresentam diferenas quanto ao genotxica. O trecho do rio Cadeia escolhido para o presente estudo compreende a zona rural, antes de qualquer influncia urbana do municpio de Santa Maria do Herval (ponto A), um ponto intermedirio, aps a zona rural e incio da zona urbana localizado no Balnerio Amizade (ponto B) e um ponto aps a rea urbana localizado na represa da Usina Hidreltrica Herval (ponto C). O ponto A sofre influncia de fontes poluidoras tanto locais (agropecuria) como de municpios a jusante deste ponto, e, portanto, no pode ser considerado como local controle ou de referncia.

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No ensaio cometa aplicado em eritrcitos de Astyanax jacuhiensis a freqncia das diferentes classes de dano apresentou diferenas significativas entre as amostragens. Em fevereiro de 2008 todos os pontos apresentaram maior freqncia de clulas na classe 4. A classe 4 representa o grau mximo de quebras que a molcula de DNA pode sofrer, e, portanto os resultados sugerem que a ao genotxica dos poluentes foi mais intensa no ms de fevereiro. Ainda no ensaio cometa, no houve diferena significativa entre os pontos A, B e C para freqncia de clulas com dano em todos os meses amostrados. Porm, a anlise do ndice de dano apresentou variao entre os pontos, onde B apresentou menor ndice do que A e C no ms de fevereiro de 2008. Diferenas na genotoxicidade entre pontos de coleta em um rio podem estar relacionadas ao volume de gua (variao na concentrao dos agentes genotxicos) e/ou ao efeito cumulativo de diferentes fontes (MATSUMOTO et al., 2006). O ponto A, localizado na zona rural, recebe influncia principalmente de agrotxicos do municpio, mas no pode ser descartada a contribuio de outras fontes de contaminao a jusante, inclusive de origem industrial, pois na coleta de fevereiro de 2008 foi detectado cromo neste ponto. O fato de o ponto B apresentar menor ndice de dano sugere que houve diluio dos agentes genotxicos presentes no ponto A e tambm ausncia de novas fontes geradoras de genotoxicidade, as quais parecem estar presentes novamente entre os pontos B e C. O ponto C, localizado aps toda a zona rural e urbana do municpio, provavelmente recebe maior carga de poluentes e de origens mais diversificadas, e apesar de possuir grande volume de gua, apresenta caractersticas de ambiente lntico, o que pode contribuir para o acmulo de poluentes intensificando a ao genotxica. Tambm no ensaio cometa, foi observado diferenas significativas entre os perodos de coleta dentro de um mesmo ponto. Os pontos A e C apresentaram maior freqncia de clulas com dano e ndices de dano de DNA mais elevados em fevereiro de 2008. Tanto fatores abiticos como biticos podem variar no tempo e no espao influenciando a reposta dos biomarcadores (HANDY et al., 2003). O grau de poluio de um rio pode sofrer influncia de condies hidrolgicas e climticas. Variaes sazonais desses fatores tm um grande efeito na concentrao de poluentes no meio aqutico (VEGA et al., 1998, FERREIRA et al., 1994). Quando as chuvas so escassas, o volume de gua do rio tende a diminuir, fator que provavelmente contribui para uma maior concentrao dos poluentes genotxicos acarretando em maiores danos de DNA. Tambm devem ser considerados os plantios de culturas vegetais ao longo do ano. Milho, batata inglesa, laranja e mandioca, que

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so as principais culturas da sub-bacia do rio Cadeia, so cultivados em diferentes pocas do ano utilizando diferentes tratamentos de agrotxicos. Estima-se que na sub-bacia do rio Cadeia so utilizados cerca de 70.000 litros de agrotxicos ao ano (KOTLHAR e DE LUCA, 1997). Portanto, o menor ndice pluviomtrico e as altas temperaturas do ms de fevereiro de 2008, com a conseqente reduo do nvel do rio e elevao da concentrao de poluentes, podem ter contribudo para a deteco de maior genotoxicidade neste perodo. A influncia do ndice pluviomtrico tambm foi reportada na avaliao da qualidade do rio Ca, Rio Grande do Sul, numa rea influenciada por um Complexo Petroqumico atravs do teste do microncleo em cultura de linfcitos humanos (LEMOS e ERDTMANN, 2000). Entretanto, no pode ser descartada tambm a ocorrncia de variao temporal na quantidade e/ou nas fontes geradoras de compostos genotxicos, podendo ser citado como exemplo a deteco de cromo nos trs pontos de coleta somente neste perodo. O cromo um composto txico, genotxico, mutagnico e carcinognico tanto para o homem como para outros animais (VON BURG e LIU, 1993; STOHS e BAGCHI, 1995; MOUNT e HOCKET, 2000). Diversos estudos retratam a correlao entre o aumento das taxas de dano de DNA e presena de cromo na gua. RUSSO et al. (2004) analisaram o potencial genotxico do rio Sarno, na Itlia, em relao a um rio considerado controle. O rio Sarno impactado por diversas fontes de poluio como efluentes domsticos, industriais e de agricultura. Ao analisar as propriedades fsico-qumicas da gua observaram altas concentraes de cromo e mangans e baixas concentraes de cdmio e chumbo. Verificaram que houve maior ndice de dano de DNA no ensaio cometa e maior freqncia de microncleos nos peixes do rio Sarno do que do grupo controle. O presente estudo confirma a utilizao do ensaio cometa em eritrcitos de peixes como uma ferramenta bastante sensvel para a deteco de genotoxicidade nos ecossistemas aquticos, corroborando com resultados obtidos em outros trabalhos como PANDRANGI et al. (1995) e RUSSO et al. (2004). A anlise de microncleo em eritrcitos de Bryconamericus iheringi no apresentou diferena significativa entre os pontos B e C em todos os meses amostrados. Porm, apenas o ponto B apresentou variao ao longo do perodo de estudo, com um maior nmero de microncleos em fevereiro de 2008 do que nos demais meses. Os resultados do teste do microncleo corroboram aqueles obtidos com o ensaio cometa para o ms de fevereiro e indicam ao crnica de agentes genotxicos, os quais podem estar comprometendo a qualidade da gua no trecho estudado do rio Cadeia de modo mais significativo em perodos

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especficos do ano. Isto sugere que, exposies crnicas a essas guas podem afetar a biota presente neste ecossistema, bem como a sade da populao, j que o ponto B um balnerio. A no deteco de maior genotoxicidade no ponto B no ms de fevereiro atravs do ensaio cometa pode indicar que a ao dos compostos presentes neste local depende de um maior tempo de exposio (descartando-se possveis diferenas de resposta entre as espcies utilizadas em cada anlise). Alm dos microncleos, outras anormalidades nucleares foram analisadas. Foi verificada a presena de brotos nucleares em quase todas as coletas analisadas, porm em fevereiro de 2008 houve diferena entre os pontos onde apenas o ponto B apresentou broto nuclear diferindo significativamente do ponto C. SERRANO-GARCIA e MONTEROMONTAYA (2001) demonstraram que os brotos nucleares e os microncleos possuem a mesma origem, seguindo a exposio de compostos mutagnicos (clastognicos e aneugnicos). Em junho e outubro de 2008 o ponto C apresentou maior freqncia de ncleos blebbed+lobed+notched do que o ponto B. Ao analisar as anormalidades nucleares dentro de um mesmo ponto entre perodos de coleta, o ponto B apresentou maior freqncia de ncleos blebbed+lobed+notched em agosto diferindo de fevereiro e de junho de 2008, enquanto que o ponto C apresentou maior freqncia de ncleos blebbed+lobed+notched em outubro diferindo de fevereiro e junho de 2008. Um nmero considervel de trabalhos publicados tem reportado associao entre a freqncia de anormalidades nucleares e exposio a compostos genotxicos (PACHECO e SANTOS, 1997; 2002; AYLLON e GARCIA-VAZQUEZ, 2000; FERRARO et al., 2004). Outros estudos encontraram freqncias elevadas de tais anormalidades em peixes que habitam locais poludos (BOMBAIL et al., 2001), na avaliao de efluentes industriais (AVAS & ERGENEGZKARA, 2003) ou que so expostos a diferentes qumicos. MATSUMOTO et al. (2006) verificaram um aumento nas anormalidades nucleares de Oreochromis niloticus em um lugar influenciado por efluentes de curtumes e, portanto contaminado por cromo, em relao a um local controle. Entretanto, em alguns estudos no h uma correlao entre aumento de microncleos, que consiste em um marcador de genotoxicidade reconhecido, e aumento de anormalidades nucleares (AYLLON e GARCIA-VAZQUEZ, 2000) o que sugere a existncia de diferenas (em relao natureza qumica da substncia, dose, tempo de exposio) no surgimento destes marcadores, pelo menos para alguns compostos. No presente estudo o teste de anormalidades nucleares tambm indicou diferenas temporais na genotoxicidade do rio

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Cadeia. Entretanto, diferentemente dos resultados discutidos anteriormente, estes marcadores no evidenciaram maior genotoxicidade nas coletas de fevereiro de 2008. Na ausncia de informaes mais aprofundadas na literatura sobre a origem destas anormalidades, pode-se apenas especular que no presente estudo, os compostos que provocam tais alteraes so diferentes e/ou apresentam variao temporal diferente das substncias que aumentam as freqncias dos outros marcadores de genotoxicidade. A anlise fsico-qumica e microbiolgica demonstrou que as amostras de gua dos trs pontos estudados do rio Cadeia so de boa qualidade, com a maioria dos parmetros enquadrando-se na classe 1. As guas de classe 1 podem ser utilizadas no abastecimento para consumo humano aps tratamento simplificado, proteo das comunidades aquticas, recreao de contato primrio, tais como natao, esqui aqutico e mergulho (CONAMA, resoluo n357/05), irrigao de hortalias que so consumidas cruas e de frutas que se desenvolvam rentes ao solo e que sejam ingeridas cruas sem remoo de pelcula e proteo das comunidades aquticas em Terras Indgenas (CONAMA n 274/2000). Porm, alguns parmetros apresentaram qualidade reduzida em algumas amostras, demonstrando variao tanto temporal como espacial. O parmetro DBO5 no foi detectado em apenas uma amostra, sendo que em 18,2% das amostragens foi classificado como classe 2. Os parmetros coliformes fecais e ferro foram detectados em todas as amostragens, e 45,5% destas foram de classe 2. As guas de classe 2 podem ser utilizadas no abastecimento para consumo humano aps tratamento convencional, proteo das comunidades aquticas, recreao de contato primrio, tais como natao, esqui aqutico e mergulho, irrigao de hortalias, plantas frutferas e de parques, jardins, campos de esporte e lazer, com os quais o pblico possa vir a ter contato direto e aqicultura e atividade de pesca (CONAMA, resoluo n357/05). Aumentos de DBO5 num corpo dgua esto relacionados com despejos de origem predominantemente orgnica. A presena de um alto teor de matria orgnica pode induzir completa extino do oxignio na gua, provocando o desaparecimento de peixes e outras formas de vida aqutica. J o aumento dos nveis de coliformes fecais pode indicar a presena de microrganismos patgenos pela transmisso de doenas de veiculao hdrica, tais como febre tifide, febre paratifide, desinteria bacilar e clera (CETESB, 2006). O aumento da DBO5 e de coliformes fecais so indicativos de poluio por esgoto domstico no trecho estudado. Conforme levantamento junto a Prefeitura Municipal de Santa Maria do Herval, no existe tratamento de efluentes domsticos, sendo que a maioria das casas possui fossa sptica com filtro anaerbico.

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O alumnio, detectado em 63,6% das coletas, apresentou em 45,5% dos casos concentraes que ultrapassaram os limites estabelecidos para classe 2. As guas classificadas na classe 3 podem ser utilizadas no abastecimento para consumo humano, aps tratamento convencional ou avanado; irrigao de culturas arbreas, cerealferas e forrageiras; pesca amadora; recreao de contato secundrio e dessedentao de animais. Recreao de contato secundrio refere-se quela associada a atividades em que o contato com a gua espordico ou acidental e a possibilidade de ingerir gua pequena, como na pesca e na navegao (tais como iatismo) (CONAMA, resoluo n357/05). Existem evidncias de que o alumnio neurotxico (CETESB, 2006), e considerando que o ponto B refere-se a um balnerio onde as pessoas esto expostas ao contato primrio, evidencia-se o risco a sade da populao local exposta. O parmetro fsforo foi detectado somente no ms de junho de 2008 nos pontos B e C, sendo que neste ltimo apresentou valores elevados, enquadrando-se na classe 4, o que restringi seu uso somente para navegao e harmonia paisagstica (CONAMA, resoluo n357/05). A presena elevada de fsforo na gua superficial est relacionada contaminao por esgoto sanitrio. O fsforo encontrado na composio de detergentes superfosfatados e na prpria matria fecal. As guas drenadas em reas agrcolas e urbanas tambm podem provocar a presena excessiva de fsforo em guas naturais. O excesso de fsforo conduz a processos de eutrofizao das guas naturais (CETESB, 2006). Ao longo do trecho analisado existem criadouros de animais de pequeno porte, plantaes alm de um frigorfico muito prximo ao ponto C que podem estar colaborando para o aumento da concentrao de fsforo em determinadas pocas do ano. Uma desvantagem da anlise fsico-qumica que ela registra apenas o momento em que as amostras de guas foram coletadas, como uma fotografia do rio, necessitando assim de um grande nmero de anlises para a realizao de um monitoramento temporal eficiente. Outro problema que se forem feitas longe da fonte poluente, as medies qumicas no sero capazes de detectar perturbaes sutis sobre o ecossistema (PRATT e COLER, 1976) enquanto que os peixes metabolizam poluentes diretamente atravs da gua contaminada ou indiretamente pela ingesto de outros organismos aquticos contaminados (MATSUMOTO et al., 2006). Portanto, mesmo estando dentro das normas, alguns parmetros pode estar degradando as inter-relaes biolgicas, gerando problemas de qualidade de vida para as populaes daquele ecossistema (BUSS et al., 2003), o que ficou demonstrado nas anlises de genotoxicidade do presente estudo.

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De maneira geral, os resultados significativos de danos de DNA observados neste estudo, tanto pelo ensaio cometa em Astyanax jacuhiensis, quanto pelo teste de microncleo e anormalidades nucleares em Bryconamericus iheringi, demonstram variao tanto temporal como espacial da genotoxicidade e de alguns parmetros de qualidade da gua do rio Cadeia no municpio de Santa Maria do Herval/RS, os quais podem estar sendo influenciados tambm por municpios a jusante.

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