Anticoagulant circulant de type lupique ou anti facteur ?

Diagnostic difficile en pr opratoire

Annales de Biologie Clinique. Volume 62, Numro 4, 451-5, Juillet-Aot 2004, Pratique quotidienne Auteur(s) : I. Martin Toutain, T. Vu, Z. Azgui, M.T. Piot, M. Jung, A. Ankri , Laboratoire dhmostase, Service dhmatologie biologique, GH Piti Salptrire, Paris annick.ankripsl.ap hop paris.fr .
ARTICLE

Auteur(s) : I. Martin-Toutain, T. Vu, Z. Azgui, M.T. Piot, M. Jung, A. Ankri Laboratoire dhmostase, Service annick.ankri@psl.ap-hop-paris.fr dhmatologie biologique, GH Piti-Salptrire, Paris

Article reu le 14 fvrier 2004, accept le 27 avril 2004

Lobservation
Madame Y., 75 ans, est suivie pour une maladie de Waldenstrm stabilise pendant 11 ans par des thrapeutiques comportant successivement du chlorambucil, une polychimiothrapie de type CHOP (cyclophosphamide, oncovin, adriamycine, prednisone) et un analogue des purines (fludarabine). Llvation du pic IgM kappa 30 g/L et lapparition dune importante splnomgalie font poser lindication dune splnectomie. Linterrogatoire et lexamen clinique montrent labsence de syndrome hmorragique. Le bilan dhmostase propratoire met en vidence un allongement isol du temps de cphaline active (TCA) 70 secondes (sec) pour un tmoin 34 sec, les autres tests (taux de prothrombine (TP) = 97 %, temps de thrombine (TT) = 22 sec/20 sec, fibrinogne = 3,6 g/L et temps de saignement par la mthode dIvy incision au moyen du dispositif Surgicutt = 7 minutes) sont dans les valeurs de rfrence. Lexploration de lallongement du TCA (tableaux I et II)comporte : 1) la confirmation de lallongement du TCA sur deux prlvements successifs avec deux cphalines diffrentes : lAutomated APTT (BioMrieux) dont lactivateur est la silice micronise, le CK Prest (Diagnostica Stago) dont lactivateur est le kaolin ; 2) la mise en vidence dun effet inhibiteur dmontre par labsence de correction du TCA ralise sur un mlange parties gales du plasma du patient et dun plasma normal aprs 2 minutes (indice de Rosner 59 %, normale < 15 %) et une heure dincubation 37 C ; 3) la mise en vidence dune phospholipide- dpendance de linhibiteur par : la ralisation dun test faible concentration de phospholipides : le temps de thromboplastine dilu (TTD) o la e thromboplastine est dilue au 1/500 . Le ratio retrouv est lev 1,9 (normale < 1,2) ; la ralisation dun test forte concentration en phospholipides : le test au venin de vipre Russel (DRVVT) qui montre un ratio lev 1,6 (normale < 1,2) ; 4) le dosage des facteurs de la voie intrinsque (VI) ncessaire la caractrisation de linhibiteur. Ces dosages sont raliss sur un automate BCS (Dade Behring) avec lAutomated APTT, par des techniques de coagulation chronomtriques selon les recommandations du fabricant. partir des dilutions standards au 1/10e et 1/20e, on met en vidence des dficits artfactuels en facteurs VIII, IX et XI < 5 % et en facteur XII 30 %. Ces dosages contrls sur un autre automate de coagulation, le KC10 (Hamelung) avec le CK Prest et raliss avec des dilutions croissantes pour rvler une ventuelle interfrence de linhibiteur, entranent la normalisation du facteur e IX (avec la dilution 1/640 ) et du facteur XII, mais les facteurs VIII et XI restent diminus (13 % et 23 % e respectivement) malgr une dilution du plasma jusquau 1/1 280 . Tableau I. Rsultats biologiques obtenus en fonction des diffrents ractifs et automates de coagulation utiliss pour lexploration de lallongement du TCA.
Rsultats 70 50 42,9 on Valeurs usuelles 34 34 28 Ractifs Automated APTT (BioMrieux) CK PREST (Diagnostica Stago) Actin FS (Dade Behring) K

66 59 76 84

34 6 < 15

40

40

72

34

6 6 5

Automated APTT (BioMrieux)

10 10

TD 102/55 85/55 1,9 1,61 <5 30 300 270 < 1,2 LA1/LA2 (Dade Behring) < 1,20 > 60 > 60 > 60 > 60 Automated APTT, STA-Deficient IX, IX, XII (DS), Hemolab cofac VIII (BioMrieux) Coamatic fVIII (Biogenic) Asserachrom (Diagnostica Stago) Simplastin Excel (BioMrieux)

BCS

M/T (secondes)

M + T/T (secondes)

atio enin de vipre Russell dilu

ST888 BCS STA

atio Recherche/confirme

acteurs VIII, IX, XI (%)

acteur XII (%)

acteur VIII chromogne (%)

acteur Willebrand (%)

M : malade ; T : tmoin ; DS = Diagnostica Stago ; DB = Dade Behring. Tableau II. Taux des facteurs de la voie intrinsque (%) en fonction des dilutions croissantes du plasma dtermins sur le semi-automate de coagulation KC10 avec le CK PREST (Diagnostica Stago).

Ractif dficient III X I II lab cofac VIII (BM) -Dficient IX (DS) -Dficient XI (DS) -Dficient XII (DS)

1/10 8 24 11 70

1/20 13 24 13 68

1/40 10 24 14

1/80 7 24 12

1/160 5,7 30 14

1/320 6 48 21

BM = BioMrieux ; DS = Diagnostica Stago..

Discussion biologique
ce stade, le diagnostic le plus probable tait celui danticoagulant circulant de type lupique (LA) interfrant avec le dosage des facteurs de la VI. Cependant la persistance des dficits en facteurs VIII et XI pouvait aussi faire discuter lassociation des deux types dinhibiteurs : LA dune part qui peut sassocier des complications thromboemboliques, et anti-facteur VIII et/ou anti-facteur XI dautre part qui saccompagnent de manifestations hmorragiques. Pour cette raison, il tait indispensable en propratoire dliminer la prsence dun inhibiteur anti-facteur. La recherche dun anti-facteur VIII ou XI dans ce contexte tait difficile car lvaluation du facteur rsiduel et son titrage raliss dans un systme phospholipides dpendant rendaient les rsultats ininterprtables. Nous retrouvions en effet un taux de facteur VIII rsiduel 2 % et un titrage de linhibiteur 128 units Bethesda. Le dosage du facteur VIII par technique chromognique nous a permis dliminer la prsence dun inhibiteur spcifique et dun dficit en facteur VIII en observant une concentration de facteur VIII 300 %. Le dosage chromognique du facteur VIII ralis avec le ractif Coamatic Factor VIII (Biogenic), utilise des quantits optimales de calcium, de phospholipides et de facteur IXa, plus un excs de facteur X. Ainsi le facteur X est activ en facteur Xa par le facteur IXa. Cette activation est fortement stimule par le facteur VIII qui joue un rle de cofacteur. Il existe une relation linaire entre la vitesse dactivation du facteur X et la quantit de facteur VIII. Le taux de facteur Xa gnr, rvl par un substrat chromogne est proportionnel la concentration de facteur VIII plasmatique. Bien que la technique chromognique contienne des phospholipides, labsence dinterfrence avec les anticorps antiphospholipides lis au LA peut tre explique par la concentration ou la configuration des phospholipides utiliss [1] et la dilution du plasma du patient au 1/80 pour la ralisation du dosage. De plus le test est indpendant de la phase contacte et de la formation du complexe prothrombinase qui sont les cibles principales du LA [1]. Le dficit en facteur VIII ntait donc d qu linterfrence du LA dans la mesure chronomtrique de ce facteur. Ltiologie du dficit en facteur XI a t mise sur le compte du mme mcanisme. Le diagnostic communiqu a t : LA interfrant avec le dosage des facteurs de la voie endogne. La patiente a donc t splnectomise sans complication hmorragique. La recherche danticorps antiphospholipides par technique Elisa est reste ngative. Ce LA tait trs probablement en rapport avec lIgM monoclonale prsente par la patiente, mais cette relation, dj rapporte dans plusieurs observations [2, 3], na pas t explore dans ce cas. Habituellement, le CK Prest qui contient une concentration phospholipidique plus importante que lAutomated APTT est moins sensible aux LA, tout en gardant sa sensibilit aux dficits en facteur de la voie endogne. Cette proprit nous permet dans la plupart des cas en urgence davoir une orientation diagnostique en cas dallongement du TCA, ce qui ntait pas le cas dans notre observation. Cest pourquoi pour complter la caractrisation de ce LA, nous avons pu tester une troisime cphaline, lActin FS (Dade Behring) compose de phospholipides de soja. Cette cphaline peu utilise est la seule cphaline dorigine vgtale disponible sur le march. Avec cette cphaline, le TCA reste allong 42,9 sec/28 sec (tableau I) mais nous avons observ une normalisation des facteurs de la VI bien que linterfrence du LA dans leur dosage persiste : les rsultats obtenus avec lActin FS pour le dosage des facteurs de la VI varient du simple au double suivant lautomate, les ractifs

dficients et les dilutions utiliss (tableau III). La moindre sensibilit de lActin FS ce LA (et aux LA en gnral) pourrait sexpliquer par son origine vgtale. Ce ractif serait moins sensible aux anticorps dirigs contre des complexes protines-phospholipides humains [4, 5]. Les diffrences observes sur une mme dilution en fonction des ractifs dficients et des automates utiliss (tableau III)demeurent actuellement inexpliques. La normalisation des dosages des facteurs de la coagulation importants sur le plan dcisionnel (VIII, IX, XI) sur des dilutions croissantes est obtenue prcocement avec lActin FS. Lutilisation de ce ractif pour une mthode chronomtrique de dosage en un temps des facteurs de la VI facilement adaptable sur les automates de coagulation apparat intressante comme alternative au dosage chromognique non usuel dans tous les laboratoires dhmostase mme spcialiss pour le diagnostic diffrentiel entre LA et inhibiteur antifacteur. Son intrt diagnostique pour la confirmation rapide de LA de faible intensit [5] reste confirmer. Tableau III. Taux des facteurs de la voie intrinsque (%) mesurs avec lActin FS en fonction des dilutions croissantes du plasma du patient dtermins sur deux automates diffrents, le BCS (Dade Behring) et le ST888 (Diagnostica Stago).
Automate III BCS (DS) ST888 (DS) BCS ST888 I II BCS ST888 BCS ST888 Dficient Plasma exempt fVIII (DB) Plasma exempt fVIII (DB) STA-Dficient IX (DS) Plasma exempt fIX (DB) STA-Dficient XI (DS) Plasma exempt fXI (DB) STA-Dficient XII (DS) Plasma exempt fXII (DB) 1/10 47 80 55 45 72 29 69 31 1/20 51 80 50 51 70 28 72 30 1/40 48 76 48 53 71 31 67 30 1/80 60 85 47 56 80 39 23 53 13 77 67 93 1/160 93 1/320 108

DB = Dade Behring ; DS = Diagnostica Stago.

Les anticoagulants circulants

Les anticoagulants circulants (ACC), inhibiteurs acquis de la coagulation sont des auto-anticorps faisant partie de la famille des immunoglobulines G et/ou M et plus rarement A. Il existe plusieurs catgories dACC. Leur diagnostic diffrentiel est important (tableau IV). Tableau IV. Diagnostic diffrentiel entre LA, inhibiteur dirig contre un facteur de la voie endogne (VIII, IX, XI ou XII) et dficit vrai en facteur de la voie intrinsque (VI) (daprs Arnoux [6]).
LA Normal ou allong (attention au dficit associ en facteur II) Allong Non corrig > 15 % Positif (> 1,2) Positif Allong Non corrig aprs 1 heure dincubation 37 C Anticorps anti-facteur de la VI Normal Dfic

Ngatif Ngatif

Normaux ou diminution de plusieurs facteurs Correction par dilution du plasma e)

Diminution du facteur cible. Non correction par dilution du plasma

Dim

Les ACC de type lupus anticoagulant (LA), galement appels anticoagulant de type antiprothrombinase font partie de la famille des anticorps antiphospholipides (APL). Ils sont dirigs contre des protines porteuses de phospholipides (PL) parmi lesquelles la 2-glycoprotine 1 et la prothrombine [6-8]. Ces ACC nentranent pas de complications hmorragiques, mais en revanche peuvent sassocier des thromboses. Les ACC dirigs contre un facteur de la coagulation dfinissent les anti-facteurs. Ils neutralisent un facteur synthtis en quantit normale par le patient. Le plus frquent est linhibiteur acquis dirig contre le facteur VIII coagulant mais il existe aussi des inhibiteurs du facteur IX et du facteur XI ou des autres facteurs de la coagulation. Ces ACC saccompagnent de manifestations hmorragiques lexception de lanti-facteur XII.

Algorithme pour le diagnostic dun anticoagulant circulant de type lupique [9]

1) Prparation dun plasma pauvre en plaquettes : double centrifugation 2 500 g pendant 15 minutes 15 C. 2) liminer la prsence dhparine. 3) Dpistage du LA devant un allongement des tests de coagulation phospholipides dpendants, les plus utiliss tant les suivants :

 TCA et temps de Quick (TQ) en routine ; temps de thromboplastine dilu (TTD) : le TTD consiste sensibiliser le TQ (qui sauf exception est insensible aux LA) grce une forte dilution de la thromboplastine (au 1/500e) dans du CaCl2 0,025 M. Il est affect par toute diminution de lun des facteurs explor par le TQ (VII, X, V, II) et est sensible lhparine. La sensibilit du TTD dpend de la nature du ractif utilis ; test au venin de vipre Russel dilu (DRVVT) : le venin de vipre Russel est capable de transformer la prothrombine en thrombine en prsence de facteurs V et X et de phospholipides. Il prsente lavantage de ne pas tre influenc par les dficits touchant les facteurs situs en amont du facteur X (facteurs VII, VIII, IX ou facteurs du systme contact). Il est rendu insensible lhparine jusqu une concentration de 1 U/mL. La sensibilit du DRRVT varie en fonction du ractif utilis ; temps de coagulation en prsence de kaolin (kaolin clotting time ou KCT). 4) mise en vidence dune activit inhibitrice : ralisation de tests de mlange montrant labsence de correction des tests de dpistage aprs adjonction de plasma tmoin. Les critres dinterprtation des preuves de mlange varient selon les tests (tableau V) : pour le TCA, on prend gnralement en compte lindice de Rosner [10] calcul selon la formule : [(TCA Mlange-TCA Tmoin)/TCA Patient] 100. Pour le TTD, on considre le ratio du temps du mlange/temps du tmoin. Le DRVVT peut tre interprt selon le mme critre mais en principe le DRRVT est utilis pour les tests de confirmation (cf ci-dessous) ; 5) confirmation de la dpendance en phospholipides de linhibiteur par la correction de lallongement des tests de dpistage aprs augmentation de la concentration en phospholipides des ractifs, qui neutralisent plus ou moins partiellement lactivit du lupus anticoagulant. Les phospholipides utiliss pour ces tests de confirmation peuvent tre des lysats plaquettaires (test original de Triplett), des phospholipides liposomes ou en phase hexagonale. Actuellement, deux types de ractifs commerciaux sont utiliss, reposant soit sur le principe du TCA avec neutralisation par des phospholipides en phase hexagonale (Staclot LA, Diagnostica Stago), soit sur celui du DRVVT (IL, BioMrieux, Dade Behring). Pour les tests de confirmation utilisant le DRVVT, il est recommand dexprimer leur rsultat sous forme dun ratio normalis qui sobtient en divisant le rapport (DRVVT patient dpistage/ DRVVT patient confirmation) par le rapport calcul de la mme manire avec le tmoin (tableau V) ; 6) absence danomalie des facteurs de la coagulation, excluant une coagulopathie associe. Tableau V. Critres de positivit habituellement retenus pour le diagnostic dun LA (daprs Arnoux [6]).

Ngatif CA1 Indice de Rosner < 12 < 1,1 < 1,1 < 1,1

Douteux 12-15 1,1-1,2 1,1-1,2 1,1-1,2

neutralisation)

1 Interprtation du test de correction du TCA : calcul de lindice de Rosner. [(TCA Mlange TCA Tmoin)/TCA 2 Patient] 100 ; TTD (temps de thromboplastine dilue). Interprtation du rapport temps mlange (patient + tmoin)/temps tmoin. Chez les patients sous anticoagulants oraux avec un INR > 3, le seuil de positivit peut tre relev 1,3 ;3 Interprtation du rapport temps patient/temps tmoin (ou mlange/tmoin en cas de dficit en facteur X, V, II) ; 4 DRVVT (test au venin de vipre Russel dilu) mesur aprs ajout de phospholipides. Interprtation du rapport normalis : (DRVVT dpistage patient/DRVVT confirmation patient)/(DRVVT dpistage tmoin/DRVVT confirmation tmoin).

Conclusion
Lobservation prsente montre que le diagnostic diffrentiel entre LA et inhibiteur anti-facteur peut savrer difficile et est indispensable lattitude thrapeutique puisque les complications cliniques associes sont opposes et bnficient de thrapeutiques trs diffrentes. Il est important dutiliser plusieurs ractifs et automates pour la caractrisation des LA. En effet, il existe de nombreuses cphalines (ractifs phospholipidiques) commercialises, dorigines animale ou vgtale qui ont des sensibilits variables vis--vis des LA. Leur sensibilit peut mme changer dun lot un autre. Cette diffrence de sensibilit peut tre accentue par lutilisation dautomates diffrents. Seuls le dosage du facteur VIII par technique chromognique et lutilisation dune troisime cphaline dorigine vgtale nous ont permis dexclure la prsence dun anti-facteur et doprer la patiente sans prcautions particulires par rapport au risque hmorragique. Remerciements. Nous remercions le docteur Marie-Dominique Dautzenberg (laboratoire dhmostase, service dhmatologie biologique, Hpital Necker, Paris) et le docteur Valrie Eschwge (service dimmunologie et hmatologie biologiques, Hpital Saint-Antoine, Paris) pour leur collaboration.

Rfrences
1. De Maistre E, Wahl D, Perret-Guillaume C, et al. A chromogenic assay allows reliable measurement of factor

VIII levels in the presence of strong lupus anticoagulant.Thromb Haemost 1998 ; 79 : 237-8. 2. Thiagarajan P, Shapiro SS, De Marco L. Monoclonal immunoglobulin M lambda coagulation inhibitor with phospoholipid specificity. Mechanism of a lupus anticoagulant. J Clin Invest 1980 ; 66 : 397-405. 3. Wisloff F, Michaelsen TE, Godal HC. Monoclonal IgM with lupus anticoagulant activity in a case of Waldenstrms macroglobulinemia. Eur J Haematol 1987 ; 38 : 456-60. 4. Brancaccio V, Ames PRJ, Glynn J, Iannaccone L, Mackie IJ. A rapid screen for lupus anticoagulant (LA) by comparing a sensitive and insensitive aPTT reagent provides also good discrimination from oral anticoagulants, congenital factor deficiency and heparin. Blood Coagul Fibrinolysis1997 ; 8 : 155-60. 5. Ames PRJ, Iannaccone L, De Lasio R, Brancaccio V. Improved confirmation of weak lupus anticoagulants by employing sensitive and insensitive reagents to the lupus anticoagulant.Blood Coagul Fibrinolysis 2001 ; 12 : 5637. 6. Arnoux D, Boutire B, Sanmarco M. Les anticorps anti-phospholipides : intrt clinique et diagnostic biologique. Ann Biol Clin 2000 ; 58 : 557-74. 7. Oosting JD, Derken R, Entjes HT, Bouma BN, De Groot PG. Lupus anticoagulant activity is frequently dependent on the presence of the 2 glycoprotein I. Thromb Haemost1992 ; 67 : 499-502. 8. Bevers EM. Lupus anticoagulant IgGs (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipidbound human prothrombin. Thromb Haemost 1991 ; 66 : 629-32. 9. Arnout J. Antiphospholipid syndrome : diagnostic aspects of lupus anticoagulants. Thromb Haemost2001 ; 86 : 83-91. 10. Rosner E, Pauzner R, Lusky A, Modan M, Many A. Detection and quantitative evaluation of lupus circulating anticoagulant activity. Thromb Haemost 1987 ; 57 : 144-7.