Rozdzia drugi produkcja witamin II.1.

. Metody produkcji witamin Punktem odniesienia w produkcji zwizkw zarwno tych nisko- jak i wysokoczsteczkowych jest przebieg hodowli komrek. Komrki, ktre zostay dokadnie wyselekcjonowane i uzyskane przy zastosowaniu typowych technik inynierii, s wykorzystywane do otrzymania danego produktu przy minimalnych kosztach ale z jak najwiksz wydajnoci [8]. Mona wyrni trzy gwne kierunki w ewolucji technik wytwarzania witamin. Gwnie jest to synteza przemysowa, ktrej koszty prbuje si zmniejszy po przez zastpienie poszczeglnych szlakw mikrobiologicznymi fermentacjami, ktre s prowadzone przez zmodyfikowane szczepy drobnoustrojw. Wana jest take inynieria genetyczna, ktrej procesy umoliwiaj zwikszenie koncentracji zwizkw, gwnie w tkankach rolinnych. Powszechnie wykorzystywane s take roliny i mikroorganizmy w postaci bioreaktorw do produkcji okrelonej substancji na skal przemysow [1]. Opracowanie procedury hodowli komrek, niezalenie od zastosowanej metody produkcji, najczciej mona przedstawi w postaci 4 faz, kolejno nastpujcych po sobie [8].

Etap1

Etap2

Etap3

Etap4

skrining komrek

doskonalenie komrek

optymalizacja procesu

zwikszenie skali

Ryc. Zmodyfikowano na podst. [8]. Kropkowane linie zakoczone strzakami odnosz si do powtarzalnych cykli, wynikajcych z wzajemnych uwarunkowa midzy kolejnymi etapami rozwoju procesu. II.1.1. Synteza chemiczna II.1.2. Rolinne bioreaktory Roliny, tak samo jak mikroorganizmy posiadaj predyspozycje do produkcji witamin we wasnych tkankach (tzw. fitofarming). Wzmoenie koncentracji witamin w rolinach powoduje polepszenie jakoci ywnoci lub pasz, co umoliwia dostarczenie odpowiedniej iloci suplementw diety do organizmu. Ponadto produkcja witamin w naturalnym rodowisku jest lepiej postrzegana przez spoeczestwo, produkowane s tylko okrelone stereoizomery a take moe by tasza w porwnaniu do chemicznej syntezy. [3]

Wykorzystanie rolin jako bioreaktorw do syntezy witamin posiada wiele korzyci, co w przyszoci moe skutkowa ograniczeniem metody chemicznej produkcji. W duej iloci przypadkw biochemiczna rola zwizkw i szlakw metabolicznych wystpujcych w rolinach a take biorcych udzia w syntezie witamin jest znana, jednak dowiadczenia jakie zostay przeprowadzone w celu pozyskania wikszej iloci informacji wykazay, e niektre funkcje jedynie teoretycznie mona przypisa danym czsteczkom. Problem jaki si tu pojawia jest zwizany z drog i regulacj biosyntezy w rolinach, ktra na dzie dzisiejszy nie jest do koca okrelona. [1,3] Przykadem witaminy, ktre s produkowana na skal przemysow z wykorzystaniem rolinnych bioreaktorw jest -tokoferol, czyli witamina E oraz. Witamina E jest czsteczk zbudowan z hydrofobowego ogona zatopionego w lipidach bonowych, oraz polarnej gwki wystajcej poza powierzchni membrany. Zawiera ona zesp 8 hydrofobowych pochodnych, obejmujcych tokoferole oraz tokotrienole, rnicych si podstawnikami w pozycji R1 i R2. [2,3]

Rys. artyku 2 Biosynteza tokoferolu w rolinach ma miejsce w plastydach, ktre w swojej otoczce zawieraj odpowiednie enzymy. Ilo witaminy E zwiksza si podczas przeksztacenia chloroplastw w chromoplasty w wyniku starzenia si rolin [4]. Prekursorami do syntezy tokoferolu s kwas homogentyzynowy (HGA) powstajcy podczas metabolizmu aminokwasw aromatycznych oraz difosforan potasu (PDP), pochodzcy z nowo odkrytego szlaku plastidic methylerythritol phosphate. Najczciej proces biosyntezy regulowany jest ju na poziomie pierwszej reakcji, ktra katalizowana jest przez enzym VTE2. W nasionach Arabidopsis thaliana oraz nasionach soi regulacja ta powoduje 1,8 1,4-krotny wzrost poziomu tokoferolu. Natomiast w liciach Arabitobsis wzrost ten jest a 4-krotnie wikszy. W liciach rzodkiewnika dodatkowe dziaanie czynnikw rodowiskowych takich jak promieniowanie soneczne czy skadniki odywcze spowodoway 18-krotne podwyszenie zawartoci witaminy E [7].

II.2. Mikroorganizmy w produkcji witamin rodowisko naturalne jest niezwykle zrnicowane pod wzgldem wystpujcych w nim drobnoustrojw. Okoo 99% mikroorganizmw wystpujcych naturalnie, po ich izolacji oraz hodowli w warunkach laboratoryjnych, nie wykorzystuje maksymalnie swoich zdolnoci. Biotechnolodzy mog t przeszkod pokona, po przez czenie rnych technologii umoliwiajcych zuytkowanie caego metabolicznego potencjay mikroorganizmw [13]. Take inynieria genetyczna staa si drog do modyfikacji drobnoustrojw, wprowadzenia do ich organizmw nowych komrek, a take zwikszenia ich metabolicznych moliwoci [11]. Produkty mikrobiologiczne s powszechnie wykorzystywane w przemyle chemicznym do produkcji aminokwasw, kwasw tuszczowych i organicznych, biokatalizatorw, detergentw, a take do produkcji witamin [13]. II.2.1. Pozyskiwanie odpowiednich drobnoustrojw Badanie przesiewowe czyli tzw. screening przeprowadza si w celu pozyskania najbardziej wydajnego mikroorganizmu, produkujcego dany zwizek, ktry umoliwia zwikszenie efektywnoci procesu [8,9]. Komrki mog pochodzi z wasnych bibliotek bd z bankw komrek. Powszechnie dostpne s take bazy danych, zawierajce wiadomoci na temat szlakw metabolicznych, ktre umoliwiaj wybr odpowiednich linii komrkowych, mogcych przeprowadzi syntez okrelonego zwizku. Komrki mog by take pobierane z naturalnego rodowiska np. z gleby lub z powietrza. Wad selekcji drobnoustrojw ze rodowiska, jest zbyt dua ilo linii komrkowych, ktr naley podda wstpnemu skriningowi [8]. Zwizane jest to z tym, e w naturalnym rodowisku czyste kultury drobnoustrojw wystpuj bardzo rzadko i najczciej s to warunki ekstremalne, w ktrych przeywaj tylko nieliczne mikroorganizmy. Dlatego proces ten jest bardzo czasochonny oraz wymaga ogromnej wiedzy z dziau mikrobiologii [10]. Bardzo wany jest wybr odpowiedniej metody analitycznej. Naley wybra tak procedur, ktra w jak najkrtszym czasie umoliwi uzyskanie nie budzcego wtpliwoci wyniku. W pierwszym etapie naley przeprowadzi izolacje odpowiedniej kolonii a nastpnie jej namnoenie jej na pytce Petriego [8,10]. Aby zwikszy ilo badanych komrek w nastpnym etapie hodowla prowadzona jest w mikropytkach lub kolbach Erlenmeyera. Mikropytki zapewniaj jaowe warunki hodowli oraz minimalizuj szybko wysychania poywki hodowle czsto prowadzone s w wysokiej temperaturze przez stosunkowo dugotrway okres czasu. Kolby s powszechnie wykorzystywane do zapocztkowania procesu produkcyjnego. Istniej jednak pewne problemy zwizane z napowietrzaniem i mieszaniem, dlatego stosuje si rnego rodzaju modyfikacje kolb aby polepszy efektywno mieszanie a przez to atwiejsze wnikanie tlenu do podoa. Nastpnie hodowla przenoszona jest do bioreaktorw, w ktrych nastpuj produkcja na skale przemysow [8].

II.2.2. Zwikszenie wydajnoci biosyntezy Metody zwikszajce wydajno mikroorganizmw mona podzieli na metody nowoczesne oraz klasyczne. Te pierwsze posuguj si technologi rekombinacji DNA, natomiast klasyczne procedury obejmuj mutacje i selekcje, fuzje protoplastw a take hybrydyzacj naturaln [10]. II.2.2.1. Genetycznie modyfikowane bakterie i grzyby Pojcie genetycznej modyfikacji mikroorganizmw, oznacza takie zmiany w materiale genetycznym, ktre nie zaszy w sposb naturalny, np. podczas rozmnaania lub rekombinacji naturalnej, ale powstay na skutek stosowania odpowiednich technik. Do przeprowadzenia modyfikacji genetycznych mona stosowa nastpujce metody: Z uyciem plazmidw, wprowadzajcych nowe czsteczki kwasw nukleinowych do organizmu gospodarza, w ktrym naturalnie nie wystpuj; Mikroiniekcji, makroiniekcji oraz mikrokapsukowania, czyli bezporednie wprowadzenie materiau genetycznego do mikroorganizmu; Hybrydyzacji, w wyniku ktrej nastpuje czenie dwch lub wicej komrek, przez co materia genetyczny ulega rekombinacji [18].