BIOCHEMIA

Skrypt dla studentw medycyny opracowany na podstawie Biochemii Harpera

Michu Wrocaw 2008 Wersja 1.0

- 2-

SPIS TRECI
Rozdzia I Aminokwasy, peptydy, biaka 1. Aminokwasy a) budowa, b) nazewnictwo i wzory, c) klasyfikacja, d) funkcje, e) waciwoci fizyczne, f) waciwoci chemiczne reakcje aa, g) techniki rozdziau 2. Peptydy a) synteza i waciwoci wizania peptydowego, b) nazewnictwo, podzia i funkcje peptydw, c) przykady peptydw aktywnych biologicznie 3. Biaka a) klasyfikacja, b) identyfikacja, c) poziomy organizacji i fadowanie, d) rozdzia i okrelanie struktury biaek, e) zwizek budowy i funkcji biaek fibrylarnych i globularnych Rozdzia II Struktura i funkcje enzymw 1. Ogle waciwoci enzymw a) klasyfikacja i nazewnictwo, b) centrum katalityczne, c) koenzymy i witaminy bdce ich prekursorami, d) swoisto dziaania enzymw, e) aktywno enzymw, jednostki aktywnoci, f) kompartmentacja komrkowa enzymw, g) izoenzymy, h) izolacja enzymw 2. Mechanizmy dziaania enzymw a) typy reakcji enzymatycznych przy dwch substratach, b) mechanizm dziaania chymotrypsyny, c) mechanizm dziaania fruktozo-2,6-bisfosfatazy, d) mechanizm dziaania transaminaz, e) kataliza kwasowo zasadowa (k-z), f) enzymy wymagajce atomw metali 3. Kinetyka reakcji enzymatycznych a) oglne zasady kinetyki reakcji chemicznych, b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki wpywajce na szybko reakcji enzymatycznej, c) wpyw stenia substratu na szybko reakcji, d) zjawisko kooperatywnoci, e) inhibicja odwracalna i nieodwracalna 4. Regulacja aktywnoci enzymw a) regulacja iloci enzymu, b) regulacja aktywnoci katalitycznej enzymu 5. Znaczenie diagnostyczne pomiarw aktywnoci enzymw a) enzymy indykatorowe, ekskrecyjne i sekrecyjne, b) enzymy najczciej oznaczane w praktyce klinicznej, c) panele enzymatyczne, d) diagnostyka enzymatyczna w onkologii Rozdzia III Transport przez bony i utleniania biologiczne 1. Budowa i funkcje bon biologicznych a) skad bon, b) funkcje bon 2. Transport przez bony biologiczne klasy biaek transportujcych a) kanay jonowe, b) przenoniki transbonowe translokazy, c) pompy jonowe, d) wymienniki 3. Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne a) klasyfikacja oksydoreduktaz, b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszce protony i elektrony 4. Transport atomw wodoru przez bon mitochondrialn 5. acuch oddechowy 6. Fosforylacja oksydacyjna 7. Reaktywne formy tlenu (RFT) 8. Utlenianie mikrosomalne 9. Cykl kwasw trjkarboksylowych (TCA) a) reakcje cyklu, b) bilans energetyczny cyklu, c) powizania z innymi szlakami amfiboliczno cyklu, d) regulacja cyklu 10. Kompleks oksydazy -ketokwasw Rozdzia IV Wglowodany 1. Budowa chemiczna, waciwoci i funkcje cukrw prostych i zoonych a) monosacharydy, b) disacharydy, c) polisacharydy 2. Trawienie wglowodanw i jego zaburzenia 3. Wchanianie i transport wglowodanw a) transport aktywny i bierny, biaka transportujce, b) zrnicowanie tkankowe transportu, c) rola insuliny, d) rola fosforylacji monosacharydw 4. Metabolizm glukozy

- 3-

5. 6. 7. 8.

a) glikoliza (szlak EMP), b) glukoneogeneza, c) szlak pentozofosforanowy (szlak WDH, PPP), d) niektre zaburzenie przemian glukozy Metabolizm glikogenu a) glikogenogeneza, b) glikogenoliza, c) regulacja glikogenogenezy i glikogenolizy, d) glikogenozy Inne szlaki metabolizmu monosacharydw a) szlak kwasu uronowego, b) metabolizm fruktozy, c) metabolizm galaktozy Metabolizm heteroglikanw a) aminocukry heksozoaminy, b) glikoproteiny, c) proteoglikany, d) mukopolisacharydozy Regulacja przemiany wglowodanw a) zrnicowanie tkankowe przemiany wglowodanowej i integracyjna rola wtroby, b) kontrola stenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu wglowodanw

Rozdzia IV Lipidy 1. Budowa chemiczna, podzia i rola tuszczw prostych i zoonych a) funkcje tuszczw, b) podzia lipidw, c) kwasy tuszczowe, d) triglicerydy (TG), e) fosfolipidy, f) glikolipidy, g) steroidy, h) poliprenoidy 2. Trawienie i wchanianie lipidw 3. Transport lipidw w chonce i w osoczu a) budowa lipoprotein, b) transport lipidw w lipoproteinach osocza, c) zaburzenia transportu lipoproteinowego, d) rola wtroby w metabolizmie lipidw 4. Tkanka tuszczowa rola w metabolizmie lipidw a) metabolizm adipocytw, b) regulacja, c) brunatna tkanka tuszczowa 5. Utlenianie kwasw tuszczowych a) lokalizacja komrkowa i tkankowa, b) aktywacja i transport KT do mitochondrium, c) -oksydacja nasyconych KT, d) oksydacja nienasyconych KT, e) ketogeneza, f) zaburzenia oksydacji KT 6. Lipogeneza synteza kwasw tuszczowych a) lokalizacja i transport substratw, b) przebieg lipogenezy, c) synteza nienasyconych KT, d) metabolizm eikozanoidw 7. Synteza trjglicerydw a) lokalizacja tkankowa i komrkowa, b) przebieg syntezy 8. Cholesterol a) biosynteza cholesterolu, b) trawienie i wchanianie cholesterolu, c) rwnowaga cholesterolu i endocytoza LDL, d) wydalanie cholesterolu, e) miadyca 9. Kwasy ciowe 10. Kalcyferole 11. Hormony sterydowe Rozdzia VI Przemiana azotowa: aminokwasy, nukleotydy, porfiryny 1. Trawienie biaek w przewodzie pokarmowym a) enzymy i ich specyficzno, b) transport azotu pomidzy tkankami 2. Oglna przemiana aminokwasw i metabolizm grupy aminowej a) transaminacja, b) dezaminacja, c) transport, d) eliminacja 3. Metabolizm poszczeglnych aminokwasw a) Asp, b) Asn, c) Glu, d) Gln, e) Ala, f) Gly, g) Ser, h) Pro, i) Hyp, j) Arg, k) Orn, l) Cys, m) Phe, n) Tyr, o) Lys, p) Hyl, q) His, r) Thr, s) Met, t) Trp, u) Val, Leu i Ile 4. Przemiana nukleotydw a) trawienie kwasw nukleinowych w przewodzie pokarmowym, b) budowa nukleotydw, c) biosynteza nukleotydw purynowych, d) degradacja puryn, e) odzysk puryn, f) synteza nukleotydw pirymidynowych, g) degradacja pirymidyn, h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydw 5. Metabolizm porfiryn a) synteza hemu, b) rozkad hemu, c) zaburzenia metabolizmu porfiryn Rozdzia VII Biochemia funkcjonalna tkanek 1. Endogenne regulatory procesw metabolicznych a) regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaniki wtrne, b) eikozanoidy budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne 2. Gospodarka wapniowo fosforanowa w organizmie i jej regulacja a) rola wapnia oraz biaek wicych wap, b) regulacja przemiany wapniowej, c) rola fosforanu nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powizania z gospodark wapniow 3. Gospodarka elazem w organizmie wchanianie, regulacja, zaburzenia przemiany

- 4-

4.

5.

6. 7. 8.

9.

Biochemia krwi a) biaka osocza i ich rola, b) struktura i funkcja erytrocytw, c) budowa i metabolizm leukocytw na przykadzie neutrofili, d) budowa i metabolizm trombocytw, e) hemostaza osoczowa Biochemia wtroby a) rola tkanki wtrobowej, b) przemiana wglowodanowa, lipidowa i azotowa w wtrobie, c) wtroba jako gruczo zewntrzwydzielniczy, d) procesy biotransformacji i detoksykacji Biochemia nerek a) funkcje i regulacja, b) skad i waciwoci moczu w normie i w patologii Biochemia mini a) budowa i charakterystyka biaek mini, b) mechanizm skurczu minia Biochemia tkanki cznej a) skadniki tkanki cznej, ich budowa i funkcja, b) synteza kolagenu reakcje i regulacja procesu, c) biochemia koci Biochemia zmysu wzroku a) rola i przemiany karotenoidw w organizmie czowieka, b) reakcje zachodzce w procesie fotorecepcji

Rozdzia VIII Kwasy nukleinowe i biosynteza biaek 1. Budowa i waciwoci kwasw nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny a) elementy skadowe kwasw nukleinowych zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy, b) budowa przestrzenna i waciwoci DNA, c) budowa, waciwoci i klasyfikacja RNA, d) budowa chromatyny, e) chromatyna aktywna i nieaktywna, f) sekwencje powtarzajce; mutacje dynamiczne; konwersja genu, g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych, h) gen i jego ekspresja; genom, i) transpozony; geny przeksztacone, j) motywy funkcjonalne biaek wicych si z DNA 2. Replikacja i naprawa DNA; cykl komrkowy i jego regulacja a) inicjacja, b) elongacja, c) terminacja, d) regulacja replikacji i cykl komrkowy, e) naprawa DNA 3. Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje a) transkrypcja u Procariota, b) rnice w transkrypcji u Eucariota, c) geny podzielone; snRNA; skadanie mRNA, d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA, e) transkrypcja genw tRNA i rRNA 4. Translacja biosynteza biaek a) kod genetyczny, b) budowa tRNA i aktywacja aa, c) budowa i funkcje rybosomw, d) etapy translacji, e) regulacja i inhibitory translacji, f) potranslacyjne modyfikacje biaek 5. Mitochondrialne DNA (mtDNA)

- 5-

- 6-

ROZDZIA I AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAKA

1. a) Aminokwasy budowa

Aminokwasy (ang. aminoacids = aa), jak sama nazwa wskazuje, nale do dwufunkcyjnych pochodnych wglowodorw, zawierajcych w czsteczce grup karboksylow oraz aminow. Oglnie rzecz biorc, wzgldne pooenie obu tych grup moe by dowolne, jednak zdecydowanie najwiksze znaczenie posiadaj -Laminokwasy, ze wzgldu na to, i wchodz w skad peptydw i biaek. Okrelenie -aminokwasy oznacza, i obie gwne grupy funkcyjne przyczone s do tego samego, I-rzdowego atomu wgla; wynika std ich wzr oglny postaci: H2N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla kadego aa i decydujcym o jego waciwociach. Aa mog rwnie ulega w organizmie rozmaitym modyfikacjom, np. hydroksylacji (4-hydroksy-Pro, 5-hydroksy-Lys), karboksylacji (-karboksy-Glu), metylacji, formylacji, acetylacji (N-Ac-Glu), prenylacji, fosforylacji i innym. b) nazewnictwo i wzory Kady aa biakowy posiada nazw systematyczn, wynikajc z jego budowy chemicznej, jak rwnie zwyczajow. W praktyce posuguje si wycznie tymi drugimi, jak rwnie ich skrtami trj- oraz jednoliterowymi. Nazwy zwyczajowe aa biakowych, ich skrty oraz wzory strukturalne przedstawia ponisza tabela. Lp. 1. Nazwa zwyczajowa i skrty glicyna, Gly, G Wzr strukturalny

2.

alanina, Ala, A

3.

walina, Val, V

4.

leucyna, Leu, L

5.

izoleucyna, Ile, I

6.

seryna, Ser, S

7.

treonina, Thr, T

8.

cysteina, Cys, C

- 7-

9.

metionina, Met, M

10.

kwas asparaginowy, Asp, D

11.

asparagina, Asn, N

12.

kwas glutaminowy, Glu, E

13.

glutamina, Gln, Q

14.

arginina, Arg, R

15.

lizyna, Lys, K

16.

histydyna, His, H

17.

fenyloalanina, Phe, F

18.

tyrozyna, Tyr, Y

19.

tryptofan, Trp, W

20.

prolina, Pro,

c)

klasyfikacja Aa klasyfikuje si ze wzgldu na rozmaite kryteria: Ze wzgldu na udzia w syntezie peptydw wyrnia si aa biakowe i niebiakowe. Kady aa biakowy posiada co najmniej jeden kodon kodujcy go ukad 3 nukleotydw w mRNA; list 20 aa biakowych zawiera powysza tabela. Aa niebiakowe nie s zawarte w informacji genetycznej, powstaj za w wyniku modyfikacji aa biakowych. Dalsze kryteria klasyfikacji odnosz si wycznie do aa biakowych.

- 8-

Ze wzgldu na polarno rodnika (R) aa biakowe dzieli si na: aa z R niepolarnym: G, A, V, L, I, P, F, aa z R polarnym niejonizujcym: S, T, Y, C, M, Q, N, W, aa z R polarnym jonizujcym: kwane: D, E, zasadowe: K, R, H. Ze wzgldu na budow chemiczn R: aa z R alifatycznym: G, A, V, L, I, aa z R zawierajcym grup hydroksylow: S, T, Y, aa z R zawierajcym atom siarki: C, M, aa z R zawierajcym grupy kwasowe lub ich amidy: D, E, N, Q, aa z R zawierajcym grupy zasadowe: K, R, H, aa z R zawierajcym piercie aromatyczny: F, Y, W, H, aa o charakterze iminokwasw: P. Ze wzgldu na zdolno organizmu ludzkiego do ich syntezy, aa dzieli si na endo- i egzogenne. Aa endogenne s syntetyzowane przez ludzkie hepatocyty i nie wymagaj dostarczania ich z pokarmem. Nale do nich: G, A, P, S, Y, D, E, N, Q. Aa egzogenne (niezbdne, niezastpione) nie s syntetyzowane w ludzkim ustroju, a ich obecno i odpowiednie stenie w biakach spoywczych decyduje o ich wartoci odywczej. S to: V, L, I, F, T, M, W, K, R, H (histydyna jest niezbdna dla dzieci do lat 12, ale nie jest niezbdna dla dorosych). Ze wzgldu na produkty metabolizmu wyrnia si: aa glikogenne, metabolizowane do prekursorw wglowodanw oraz aa ketogenne, metabolizowane do cia ketonowych. (patrz rwnie punkt V-3)

d) funkcje Najwaniejsz funkcj aa jest wzajemne czenie si, w wyniku czego powstaj czsteczki o wyszych poziomach organizacji peptydy, polipeptydy oraz biaka (tworzenie wizania peptydowego omwione jest dalej). Ponadto aa bior udzia w takich procesach fizjologicznych jak: przekanictwo w ukadzie nerwowym (Gly, Glu, Asp, GABA), regulacja procesw wzrostu komrki (Phe i Tyr substraty do syntezy T3/4), biosynteza zasad azotowych, porfiryn i mocznika (Orn, Cyt, Arg-bursztynian) oraz transdukcja sygnaw wewntrzkomrkowych (odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr). e) waciwoci fizyczne

W warunkach naturalnych aa maj posta krystalicznych cia staych; nie absorbuj wiata widzialnego, dlatego s bezbarwne (mona je wybarwi i uwidoczni specjalnymi metodami, o czym pniej). Z wyjtkiem glicyny wszystkie -aa wykazuj czynno optyczna, tzn. ich roztwory skrcaj paszczyzn wiata spolaryzowanego. Wykazuj rwnie izomeri optyczn, tworzc szeregi konfiguracyjne D i L. Skadnikami biaek s wycznie L-aa, co oznacza, i numeracja podstawnikw przy chiralnym atomie wgla (C) wg kryterium masy ronie przeciwnie do ruchu wskazwek zegara. Cho wykazano wystpowanie D-aa (Ser, Asp), w ukadzie nerwowym ssakw, to nie wchodz one w skad peptydw i biaek; ponadto D-aa wystpuj w cianach komrkowych niektrych bakterii (Ala, Glu) oraz w antybiotykach. Wikszo aa jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i tworzy roztwory, w ktrych wykazuje charakter na og obojtny. Dziki obecnoci w czsteczce zarwno grupy karboksylowej o charakterze kwanym, jak i aminowej o charakterze zasadowym, aa mog tworzy wewntrzne sole wystpowa w postaci jonw obojnaczych (H3N+-CH(R)-COO-) i tworzy krysztay jonowe. Tumaczy to polarn i krystaliczn struktur aa, z czego wynikaj wysokie temperatury topnienia (dalsze ogrzewanie prowadzi do rozkadu). Moliwe formy jonowe aa bez bocznych grup hydrolizujcych przedstawione s poniej: R-CH(N(+)H3)-COOH K1 R-CH(N(+)H3)-COO- K2 R-CH(NH2)-COO(I) pH < pI (II) pI (III) pH > pI Krzywa miareczkowania takiego aa skada si z dwch sigmoidalnych czci, rozdzielonych punktem izoelektrycznym: pH = pK1 + log [II]/[I] dla pH < pI pK2 + log [III]/[II] dla pH < pI Przez punkt izoelektryczny (pI) rozumiemy warto pH, w ktrej aa wystpuje niemal w caoci w postaci jonu obojnaczego, nie wdruje w polu elektrycznym i cechuje si minimaln moliw rozpuszczalnoci w wodzie. pI to innymi sowy warto pH w punkcie pomidzy wartociami pK po obydwu stronach form izojonowych (jonu obojnaczego) std dla aa z R niepolarnym pI = x (pK1 + pK2).

- 9-

Jeeli chodzi o aa z rodnikiem polarnym i jonizujcym, sytuacja przedstawia si odmiennie dla kwasw oraz zasad. W przypadku kwasu najpierw tracony jest proton z wasnej reszty karboksylowej, nastpnie z grupy bocznej, a na samym kocu z wasnej grupy aminowej; wobec tego pI oblicza si podobnie jak dla aa z R niepolarnym, czyli: pI = x (pK1 + pK2). Natomiast w przypadku zasady najpierw tracony jest proton z reszty karboksylowej, nastpnie z grupy bocznej, a ostatecznie z wasnej grupy aminowej; wyraenie opisujce pI przyjmuje zatem posta: pI = x (pK2 + pK3). f) waciwoci chemiczne reakcje aa

Aa posiadaj kilka grup funkcyjnych -aminow, -karboksylow oraz reaktywne grupy w obrbie R (niektre aa) dziki czemu mog ulega wielu rozmaitym przemianom. Reakcje grupy karboksylowej: dysocjacja i tworzenie soli (aa + zasada): H2N-CH(R)-COOH OH- H2N-CH(R)-COOH2N-CH(R)-COOH + NaOH H2N-CH(R)-COONa (sl sodowa aa) tworzenie estrw (aa + alkohol): H2N-CH(R)-COOH + R1-OH H2N-CH(R)-CO-O-R1 tworzenie amidw tworzenie bezwodnikw kwasowych dekarboksylacja (pod wpywem ogrzewania lub enzymatycznie): H2N-CH(R)-COOH T, -CO2 R-CH2-NH2 Reakcje grupy aminowej: dysocjacja i tworzenie soli: H2N-CH(R)-COOH H+ H3N+-CH(R)-COOH H2N-CH(R)-COOH + HCl Cl-H3N+-CH(R)-COOH = HCl.H2N-CH(R)-COOH (chlorowodorek aa) estryfikacja, acylacja, N-formylacja dezaminacja (g. enzymatyczna): H2N-CH(R)-COOH R-CO-COOH (ketokwas) Grupa hydroksylowa (Ser, Thr, Tyr) estryfikacja Grupa sulfhydrylowa (Cys): utlenianie do cystyny: 2 Cys-SH -2H Cys-S-S-Cys do kwasu cysteinowego (przez silne utleniacze, np. kwas nadmrwkowy): Cys HCOOOH HO2S-CH2-CH(NH2)-COOH alkalizacja Jeeli grupa aminowa znajduje si w dalekim pooeniu w stosunku do grupy karboksylowej (tj. przy C4-C6), wwczas w wyniku ogrzewania nastpuje wewntrzna cyklizacja i powstaj cykliczne amidy laktamy. Np. kwas 6-aminoheksanowy tworzy kaprolaktam, bdcy surowcem do produkcji poliamidw. Jak wczeniej wspomniano, aa maj posta bezbarwnych cia staych. Mona jej jednak wybarwi poprzez reakcj z ninhydryn. Jest to reakcja charakterystyczna aa, pozwalajca na ich identyfikacj. Jej produktami s aldehydy poch. od aa oraz zoony barwnik, ktrego anion posiada intensywnie purpurow barw.

Reakcja powstawania i charakterystyka wizania peptydowego patrz punkt I-2-a.

- 10

g) techniki rozdziau Skad mieszaniny aa, np. pochodzcej z hydrolizy peptydu, mona okreli za pomoc chromatografii lub elektroforezy. Istot chromatografii jest rozdzia skadnikw midzy faz stacjonarn a ruchom, spowodowany ich silniejszym wizaniem si z jedn z tych faz. Istnieje kilka rodzajw chromatografii. Chromatografia bibuowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdy nie wymaga specjalnego sprztu. Kropl roztworu zawierajc aa nanosi si na pasek bibuy (std nazwa), ktry nastpnie umieszcza si w szczelnym naczyniu, tak i koniec paska styka si z rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wdruje wzdu paska, wcigany przez higroskopijn struktur bibuy. Po przepywie rozpuszczalnika do koca pasek suszy si oraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny powstaj w ten sposb purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwoci chromatograficzn, zaley od jego wzgldnej polarnoci aa z R niepolarnymi i dugimi wdruj na pasku dalej ni aa z R krtszymi lub polarnymi. Dla kadego aa mona wyznaczy jego wzgldn ruchliwo (Rf), definiowan jako stosunek odlegoci przebytej przez dany aa do odlegoci przebytej przez czoo rozpuszczalnika. Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli si na podziaow (partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjn (adsorption TLC = ATLC). W PTLC wykorzystuje si rozdzia skadnikw mieszaniny pomidzy faz stacjonarn oraz ciek ruchom, ktre dodatkowo rni si polarnoci. W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, za rozpuszczalnik zawiera zarwno skadniki polarne, jak i mao polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nonikiem zmienia si skad rozpuszczalnika, gdy jego bardziej polarne skadniki wi si z polarnymi grupami hydroksylowymi celulozy wskutek tego przesuwajce si czoo rozpuszczalnika staje si stopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC sabiej polarne skadniki mieszaniny wdruj wic dalej od polarnych podobnej wielkoci. W PTLC w fazie odwrconej polarno faz oraz szybko wdrwki skadnikw prby s odwrotne ni powyej faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swoj polarno. Dlatego polarne skadniki mieszaniny wdruj z czoem rozpuszczalnika, a mniej polarne pozostaj z tyu. W ATLC wykorzystuje si adsorpcj skadnikw prby na praonym elu krzemionkowym. Faza ruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane skadniki, wspzawodniczce o miejsce wizania na elu skadniki sabiej zwizane wymywane s w pierwszej kolejnoci. Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypenionej ciliwym zoem, w warunkach wykluczajcych stosowanie wysokich cinie; ogranicza to maksymaln szybko przepywu rozpuszczalnika, a tym samym szybko caego procesu chromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej, wypenionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi czsteczkami nieciliwego wymiennika jonowego, sita molekularnego lub zoa stosowanego w chromatografii oddziaywa hydrofobowych. Bywa rwnie okrelana jako wysokocinieniowa, gdy wartoci uywanych cinie osigaj wartoci 5 10 tys. psi. Do jej zalet naley znaczne skrcenie czasu rozdziau, co ogranicza dyfuzj boczn i zapewnia lepszy rozdzia skadnikw prby. Rozdzia aa metod HPLC uwzgldnia ich reakcj z odczynnikiem umoliwiajcych ich identyfikacj i ocen ilociow. Reakcj t przeprowadza si albo przed (precolumn) albo po (post-column) waciwej chromatografii. Przy barwieniu post-column uywa si znanej ju ninhydryny, ktra tworzy barwne zwizki indygowe (pochaniajce promieniowanie z zakresu wiata widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column uywa si odczynnika okrelanego skrtem AQC, ktry wykazuje zdolno fluorescencji aa identyfikuje si wic przez owietlenie lamp UV. Elektroforeza wysokonapiciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) suy do rozdzielania mieszanin amfolitw, czyli czsteczek, ktrych wypadkowy adunek zaley od pH otoczenia. Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Prbki nanosi si na nonik zwilony buforem o odpowiednim pH i nastpnie umieszcza w polu elektrycznym. Wwczas kationy wdruj do katody, a aniony do anody, przy czym szybko wdrwki skadnikw zaley od ich adunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy czsteczkowej (odwrotnie proporcjonalnie). Po zakoczeniu rozdziau produkty uwidacznia (wybarwia) si odpowiednim odczynnikiem. Rozdzia aa prowadzi si na bibule lub cienkowarstwowej pytce pokrytej sproszkowan celuloz, a wybarwia roztworem ninhydryny. Rozdzia polipeptydw i biaek prowadzi si na usieciowanym elu poliakrylamidowym (PAG).

- 11

Do rozdziau oligomerw nukleotydowych uywa si agarozy i PAG, do wybarwiania produktw suy za bromek etydyny (identyfikacja w wietle UV). 2. a) Peptydy synteza i waciwoci wizania peptydowego

Tworzenie wizania peptydowego jest najistotniejsz reakcj aa z biologicznego punktu widzenia. Polega ono na kondensacji dwch aa, a dokadniej na reakcji grupy karboksylowej jednego aa z grupa aminow drugiego aa, czemu towarzyszy eliminacja czsteczki wody: ...-COOH + H2N-... -H2O ...-CO-NH-... Staa rwnowagi powyszej reakcji jest przesunita na korzy hydrolizy wizania peptydowego. Jego powstanie musi by zatem poprzedzone aktywacj grupy karboksylowej laboratoryjnie osiga si to przez przeksztacenie aa w chlorek kwasowy, za w organizmach ywych aa ulega kondensacji z ATP, tworzc aktywny aminoacyloadenylan (patrz punkt VIII-4-b). Wizanie peptydowe moe wystpowa w formie ketonowej (-CO-NH-), bd enolowej (-CO(-)=N(+)H-), ktre wzajemnie w siebie przechodz (zjawisko to okrelane jest jako tautomeria keto-enolowa). Stabilizacja rezonansowa wizania peptydowego nadaje mu charakter czciowo (ok. 40%) wizania podwjnego. Ma to daleko idce konsekwencje wie si bowiem ze skrceniem dugoci i usztywnieniem wizania oraz zablokowaniem wok niego rotacji przylegych atomw. Sprawia to, i wszystkie 4 atomy tworzce wizanie (C, O, N, H) znajduj si w jednej paszczynie (tzn. s koplanarne) i pozbawione s moliwoci wzajemnego ruchu. To z kolei umoliwia wystpowanie izomerii geometrycznej wzgldem atomu tlenu: cis (Z) i trans (E), przy czym fizjologicznie wyranie dominuje ta druga. Rotacja moe odbywa si jedynie wok wiza C-C oraz N-C. Charakter tej rotacji opisuj ilociowo tzw. kty torsyjne: (C-C) i (N-C). Maj one okrelone wartoci dla uporzdkowanych struktur II-rzdowych (por. dalej). Wizanie peptydowe nie posiada adunku w adnym istotnym fizjologicznie pH. Pomimo to peptydy s w fizjologicznym pH obdarzone adunkiem elektrycznym dziki adunkom ich grup kocowych (karboksylowej i aminowej) oraz polarnych grup R. Warto tego adunku zaley od wartoci pK i otoczenia grup dysocjujcych oraz od pH otoczenia. Podobnie jak kademu aa mona przyporzdkowa pI, tak kademu peptydowi odpowiada punkt izojonowy warto pH, przy ktrej liczba protonw zwizanych z grupami zasadowymi jest rwna liczbie protonw odszczepionych przez grupy kwasowe (wyrwnanie liczby adunkw). Wasno ta dotyczy czystych peptydw, a warto jest dla danego zwizku staa i charakterystyczna. Wizanie peptydowe nie absorbuje promieniowania z zakresu widzialnego, tote nie nadaje zawierajcym je zwizkom barwy. Pochania natomiast promieniowanie UV z zakresu = 220-230 nm. Obecno wizania peptydowego, poczwszy od trjpeptydw, mona wykaza za pomoc reakcji biuretowej. Nazwa ta pochodzi od biuretu (H2N-CO-NH-CO-NH2) najprostszego zwizku dajcego pozytywny wynik wspomnianej reakcji. Przeprowadza si j dodajc do prby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CuSO4) wynik pozytywny objawia si intensywnie fioletowym zabarwieniem. b) nazewnictwo, podzia i funkcje peptydw W kadym peptydzie wyrniamy dwa koce aminowy (N) oraz karboksylowy (C), zalenie od rodzaju wystpujcej na nim wolnej grupy funkcyjnej. Jeli chodzi o nazewnictwo, obowizuje zasada podawania kolejnoci aa od N-koca do C-koca. Peptydy traktuje si jako acyloaminokwasy, wic kocwk nazwy aa, ktrego grupa karboksylowa jest podstawiona, zmienia si na -ylo. Jedynie aa znajdujcy si na C-kocu z woln grup karboksylow zachowuje niezmienion nazw. Np. Ile-Cys-Gly to izoleucylo-cysteinylo-glicyna. Wiele naturalnych peptydw zawiera zmodyfikowane aa lub nietypowe wizania. Ze wzgldu na ilo reszt aa wchodzcych w skad peptydu, wyrniamy: oligopeptydy (3-10; 3 trjpeptydy, 4 tetrapeptydy itd.), polipeptydy (10-100) oraz biaka (>100). Zgodnie z innym kryterium (masy) peptydy o masie <10 kDa okrelane s jako polipeptydy, za o masach wikszych jako biaka. Peptydy peni rozmaite funkcje biologiczne: hormony, np. TRH, ADH, OT neuroprzekaniki i neuromodulatory, np. enkefaliny, endorfiny, PS, neurotensyna, somatostatyna toksyny, np. mikrocystyny i nodularyny syntetyzowane przez cyjanobakterie antybiotyki, np. walinomycyna, gramicydyna A i S, bleomycyna antyoksydanty, np. GSH

- 12

c)

przykady peptydw aktywnych biologicznie

Nie tylko wielkoczsteczkowe biaka o skomplikowanej i wielorzdowej strukturze, ale proste oligopetydy, zoone ze stosunkowo niewielkiej liczby aa, mog peni w organizmie wane i niezastpione funkcje. Omwione zostan wg liczby reszt aa. Istotnymi biologicznie dwupeptydami s: karnozyna, homokarnozyna i anseryna.

Karnozyna, czyli N-(-alanylo)histydyna, w znacznych ilociach wystpuje w miniach szkieletowych wyszych krgowcw i czowieka. Wzmaga aktywno ATP-azy miozynowej oraz chelatuje jony Cu2+ i pobudza pobieranie zwizkw miedzi. Homokarnozyna, czyli N-(4-aminobutyrylo)histydyna, jest dwupeptydem orodkowego ukadu nerwowego, wystpujcym w tkance mzgowej, ktrego funkcja nie jest znana. Anseryna, czyli -metylokarnozyna lub N-(3-aminopropionylo)--metylohistydyna, wystpuje w miniach szkieletowych wyszych krgowcw, ktre odznaczaj si szybk czynnoci skurczow, np. minie koczyn krlika lub minie piersiowe ptakw. Brak anseryny w miniach czowieka. U niszych krgowcw, np. u ryb kostnoszkieletowych wystpuje ona w znacznych ilociach, w porwnaniu ze ladow iloci karnozyny. Aktywnym trjpeptydem jest tyreoliberyna (TRH) produkowana przez podwzgrze stanowi czynnik uwalniajcy tyreotropin z przedniego pata przysadki. Jej pena nazwa to: piroglutamylohistydyloprolinoamid. Skada si z reszt aminokwasowych Glu, His i Pro, przy czym Nkocowy kwas glutaminowy ulega wewntrznej cyklizacji o kwasu piroglutaminowego, za C-kocowa grupa karboksylowa proliny wystpuje jako amid kwasowy.

Innym aktywnym trjpeptydem, penicym rol biologicznego ukadu redox, jest glutation, czyli glutamylocysteinyloglicyna. Zawiera on reszty Glu, Cys i Gly, przy czym Glu czy si z Cys wizaniem nie--peptydowym wizanie peptydowe tworzy nie grupa karboksylowa przy asymetrycznym C1, lecz przy C3. Glutation wystpuje w komrkach w stosunkowo duych ilociach rzdu 5 mM. Obecny jest w postaci dwch form utlenionej i zredukowanej, przy czym tej drugiej jest zazwyczaj okoo 500 razy wicej. Glutation peni rol buforujc stanowic bufor hydrosulfidowy. Peni rwnie role odtruwajc, poniewa jest przeciwutleniaczem reagujcym z nadtlenkiem wodoru i nadtlenkami organicznymi, unieszkodliwiajc te uboczne i toksyczne produkty metabolizmu.

- 13

Do aktywnych piciopeptydw zaliczamy enkefalin metioninow i leucynow. Pierwsza ma posta: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, druga za: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu rni si zatem jedynie C-kocowym aminokwasem, uwzgldnionym w nazwie. Wraz z endorfinami (, , ) grup polipeptydw o 20-30 resztach aminokwasowych stanowi one naturalne peptydy opioidowe, przeciwblowe, o dziaaniu podobnym do morfiny, lecz silniejszym 18-20 razy. Aktywnym omiopeptydem jest angiotensyna II (hipertensyna), powstajca z osoczowego angiotensynogenu pod wpywem reniny wydzielanej w nerkach, a nastpnie pod wpywem dziaania enzymu konwertujcego. Skutkiem dziaania reniny na angiotensynogen jest powstanie dziesiciopepetydu angiotensyny I, z ktrej pod wpywem wspomnianego enzymu powstaje angiotensyna II. Ma ona struktur: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Angiotensyna zwa naczynia krwionone i jest najsilniejszym czynnikiem podwyszajcym cinienie krwi. Pobudza kor nadnerczy do syntezy aldosteronu, ktry zwiksza resorpcj zwrotn jonu Na+ w nerkach, przeciwdziaajc ich utracie z moczem. Bradykinina to dziewiciopeptyd rozszerzajcy naczynia krwionone i obniajcy cinienie krwi, dziaa zatem antagonistycznie do angiotensyny II. Odpowiedzialna jest rwnie za uczucie blu towarzyszce zranieniu skory. Ma posta: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Bradykinina stanowi typowa kinin powstajc ze specjalnych biaek, kininogenw, nalecych do 2-globulin osocza pod wpywem swoistych enzymw proteolitycznych, zwanych kalikreinami. Dziwiciopeptydami wykazujcymi aktywno klasycznych hormonw s wazopresyna i oksytocyna, produkowane w podwzgrzu, a magazynowane w tylnym pacie przysadki. Maj prawie identyczn sekwencje aminokwasow, rni si jedynie dwoma aminokwasami, dlatego hormony te wywouj pewne wsplne efekty biologiczne. Wazopresyna czyli hormon antydiuretyczny (ADH) zwiksza wchanianie zwrotne wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobr ADH prowadzi do moczwki prostej. Oksytocyna stymuluje skurcze mini gadkich macicy (przez co rozpoczyna akcj porodow) i gruczou sutkowego.

Niektre peptydy wykazuj aktywno biologiczn antybiotykw. Antybiotyki peptydowe maj bardzo charakterystyczn cykliczna struktur i mog zawiera D-aminokwasy.

- 14

Penicylina jest produkowana przez ple Penicillium, gdzie powstaje z Val i Cys, ktre tworz 4czonowy piercie -laktamowy i 5-czonowy piercie tiazolidynowy. Do pierwszego z nich przyczana jest wizaniem peptydowym zmienna grupa kwasowa (R), ktra moe by rna i przez to wyrniamy rne rodzaje penicylin. Penicylina poprzez reaktywny piercie -laktamowy zawierajcy wizanie peptydowe nieodwracalnie hamuje transpeptydaz glikopeptydow kluczowy enzym w syntezie cian komrkowych bakterii. W praktyce najczciej uywa si penicyliny G.

Symbol F G K V X

Nazwa penicyliny pentylopenicylina benzylopenicylina heptylopenicylina fenoksymetylopenicylna hydroksybenzylopenicylina

Wzr R -CH2-CH=CH-CH2-CH3 -CH2-C6H5 -(CH2)6-CH3 -CH2-O-C6H5 -CH2-C6H4-OH

Aktynomycyna D pochodzi ze szczepu Streptomyces. W swej strukturze zawiera grup barwnikow (kwas fenoksazonodikarboksyowy), ktra poczona jest wizaniami peptydowymi z dwoma piciopeptydami. Kocowe grupy karboksylowe obu piciopeptydw tworz makrocykliczne piercienie laktonowe. W piciopeptydach wystpuje D-Val. Aktynomycyna D jest specyficznym inhibitorem syntezy RNA, czyli transkrypcji, zarwno w komrkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych, dlatego czsto jest wykorzystywana w badaniach biochemicznych. Aktynomycyna D wie si specyficznie z 2-niciowym DNA, uniemoliwiajc jego uycie jako matrycy w syntezie RNA. Obnienie stenia mRNA prowadzi do hamowania syntezy biaka. Piercie fenoksazonowy aktynomycyny interkaluje, czyli wlizguje si pomidzy pary zasad CG w 2-niciowym DNA, natomiast cykliczne polipeptydy wystaj jeden ponad, a drugi pod piercieniem fenoksazonowym Symetria aktynomycyny D dokadnie odpowiada symetrii specyficznej sekwencji zasad CG. Ponadto aktynomycyna D ma dziaanie cytostatyczne, czyli hamuje podzia komrek, w tym komrek szybko dzielcych si, dlatego znalaza zastosowanie w leczeniu niektrych nowotworw.

Walinomycyna ma struktur cykliczn, utworzon z aminokwasw i hydroksykwasw poczonych na przemian wizaniami estrowymi i peptydowymi. Skada si z trzykrotnie powtrzonego elementu, w skad ktrego wchodz reszty L-mleczanu (Lac), L-waliny, D-hydroksyizowalerianu (Hiv) i D-waliny. Walinomycyna jest jonoforowym antybiotykiem nonikowym, pod wpywem ktrego bony biologiczne staj si przepuszczalne dla jonu K+. Organizmy znajdujce si pod wpywem

- 15

antybiotykw jonoforowych pozbawione s moliwoci kontroli nad wymian skadnikw z otoczeniem. Walinomycyna koordynacyjnie wie jon K+ z 6 atomami tlenu reszt walin centralnej przestrzeni czsteczki i jako nonik przenosi je na drug stron bony.

Gramicydyna S jest cyklicznym dziesiciopeptydem, w strukturze ktrego wystpuj 2 reszty Dfenyloalaniny.

Gramicydyna A jest rwnie polipepetydowym antybiotykiem jonoforowym, zbudowanym z 15 naprzemiennie wystpujcych reszt L- i D-aminokwasowych, ktry na N-kocu posiada grup formylow. Przyjmuje struktur -helisy. Poprzez N-formylowe koce dwa takie polipeptydy cz si, tworzc dimeryczny, funkcjonalny kana jonowy dla kationw jednowartociowych, np. Na+, lecz nie dla dwuwartociowych. Kana ten spontanicznie otwiera si i zamyka, przepuszczajc w cigu sekundy ponad 107 kationw. Por tego kanau wycielony jest polarnymi grupami karboksylowymi peptydu, a hydrofobowe acuchy boczne ustawione s na obwodzie kanau. Uoenie to umoliwiaj zestawione naprzemiennie reszty L i D-aminokwasowe.

3. a)

Biaka klasyfikacja Ze wzgldu na ksztat czsteczki i rozpuszczalno w wodzie biaka dzieli si na: globularne o wspczynnikach osiowych 3-4, a wic w przyblieniu kuliste, dobrze rozp. w wodzie, fibrylarne o wspczynnikach osiowych > 10 (ksztat wyduony), nierozpuszczalne w wodzie. Ze wzgldu na stan skupienia dzieli si biaka na: stae (kolagen, elastyna), ppynne (cytoplazmatyczne) oraz pynne (biaka osocza). Ze wzgldu na budow czsteczki obecno dodatkowych skadnikw na: biaka proste (proteiny) zbudowane wycznie z aa i nie posiadajce dodatkowych elementw, m. in.: albuminy, globuliny, histony, protaminy, skleroproteiny, biaka zoone (proteidy) zawierajce dodatkowe skadniki niebiakowe, np. czsteczki wglowodanw (glikoproteiny), lipidw (lipoproteiny), reszt kwasu fosforowego (fosfoproteiny), atom metalu (metaloproteiny), czsteczk barwnika (chromoproteiny) lub zwizane z kwasem nukleinowym (nukleoproteiny). Ze wzgldu na penione w organizmie funkcje: enzymatyczne np. dehydrogenaza mleczanowa (LDH), transaminaza asparaginianowa (AspAT), cyklooksygenaza (COX), hormonalne np. hormony przedniego pata przysadki (GH, PRL, ACTH, TSH, FSH, LH), hormony trzustki (insulina, glukagon), parathormon (PTH), strukturalne np. kolagen, elastyna, keratyna, transportowe np. transferryna, hemoglobina (HGB), ceruloplazmina (CER), transkobalamina (TC), zapasowe np. mioglobina, ferrytyna, odpornociowe np. immunoglobuliny, biaka ukadu dopeniacza (C), biaka ostrej fazy, kurczliwe lub porednio biorce udzia w ruchu np. aktyna, miozyna, tropomiozyna, troponina, toksyny np. tcowa (tetanospazmina i tetanolizyna), botulinowa, toksyna cholery. Biaka pokarmowe dzieli si ze wzgldu na przydatno dla organizmu na: penowartociowe zawierajce aa egzogenne oraz niepenowartociowe zoone z aa endogennych.

- 16

b) identyfikacja Obecno biaka w rodowisku mona wykaza za pomoc kilku reakcji: Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos ty, proteina biako) polega na dziaaniu na prb stonym kwasem azotowym (HNO3). Jeeli w prbie tej znajduje si biako zawierajce aa aromatyczne, to ulegn one reakcji nitrowania, dajc produkty dysocjujce do to-pomaraczowego anionu, np.: Tyr + HNO3 T, -H2O 3-nitrozotyrozyna Reakcja biuretowa bierze swoj nazw od biuretu (dwumocznika: H2N-CO-NH-CO-NH2) najprostszego zwizku dajcego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecnoci wizania peptydowego, poczwszy od trjpeptydw wzwy. Przeprowadza si j dodajc do prby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CuSO4). Jeeli w prbie znajduje si zwizek zawierajcy dwa ssiadujce wizania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) poczenie kompleksowe o intensywnie fioletowym zabarwieniu. Naley jednak zaznaczy, i pozytywne miano nie potwierdza obecnoci w prbie zwizkw aminokwasowych. Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie biaek zawierajcych wizania dwusiaczkowe (S-S). Przeprowadza si j w rodowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli oowiu, np. octanu. Pod wpywem wysokiego pH nastpuje rozpad wspomnianych wiza z uwolnieniem anionu wodorosiarczkowego: Cys-S-S-Cys + H2O + OH- 2 CH3COCOOH + 2 NH3 + HS- + S , ktry czy si z kationem oowiu, prowadzc do strcenia czarnego osadu siarczku oowiu: Pb(CH3COO)2 + HS- CH3COOH + CH3COO- + PbS . c) poziomy organizacji i fadowanie

Biaka nale do najbardziej zoonych zwizkw chemicznych wystpujcych w przyrodzie. Ich budowa wykazuje pewne poziomy organizacji, std dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojcie struktury I, II, III i IV-rzdowej. Metody laboratoryjne okrelania kolejnych struktur nieznanych biaek opisane zostan dalej. Przez struktur I-rzdow rozumiemy liczb, budow i kolejno (sekwencj) poczonych ze sob reszt aa tworzcych dane biako, wraz ze wskazaniem miejsc wystpowania wiza dwusiarczkowych (S-S). Struktura I-rzdowa opisuje wic konfiguracj peptydu. Przez konfiguracj rozumiemy powizania geometryczne midzy danym zbiorem atomw, ktrych zmiana wie si z zerwaniem i ponownym uformowaniem wiza kowalencyjnych. Struktura II-rzdowa okrela sposb skrcenia acucha polipeptydowego, czyli jego konformacj. Konformacja to trjwymiarowa architektura czsteczki, inaczej przestrzenne powizania midzy atomami; moe ona ulec zmianie przez reorganizacj stabilizujcych j wiza niekowalencyjnych (wizania kowalencyjne zostaj zachowane por. wyej). Czsteczka biaka o okrelonej konfiguracji (strukturze I-rz.), wobec moliwoci swobodnej rotacji wok duej czci (ok. 2/3) wiza gwnego acucha polipeptydowego, moe posiada nieproporcjonalnie du liczb moliwych konformacji, cho zwykle tylko niektre z nich umoliwiaj czsteczce penienie funkcji biologicznych. Liczba ta ograniczona jest czciowo podwjnym charakterem wizania peptydowego, jak rwnie rodzajem i ksztatem grup bocznych (R) aa. Kty rotacji i musz wic przyjmowa takie kombinacje wartoci, aby wykluczy przestrzenne konflikty midzy poszczeglnymi atomami czsteczki, a ich znajomo pozwala na jednoznaczne okrelenie konformacji wszystkich atomw g. acucha polipeptydowego. Dozwolone wartoci obejmuj konformacje regularne -helis, -kartk, zwrot , superhelis kolagenu oraz nieregularne ptle i zwoje. Oglnie rzecz biorc, kada helisa (zwj) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skrcajcy si rwnomiernie wok kadego atomu C. Istniej rne typy helis, rnice si midzy sob rozmiarami i kierunkiem skrtu. Budow helisy opisuje si wic przez podanie: liczby reszt aa przypadajcych na jeden skrt (n) oraz skoku ruby (p) lub odlegoci midzy ssiednimi skrtami. Helisy polipeptydowe zabudowane z aa chiralnych s rwnie chiralne, tzn. prawo- bd lewoskrtne, przy czym w naturalnych biakach wystpuj niemal wycznie te pierwsze. Taki kierunek skrtu zdeterminowany jest przez fakt budowy czsteczki z enancjomerw L: w wyniku przycigania si atomw wizania peptydowego lejsza grupa N-H zblia si w stron ciszej grupy C-O wanie w prawo. -helisa cechuje si korzystnymi wartociami ktw rotacji oraz ukadem stabilizujcych wiza wodorowych. Zawiera zazwyczaj 4 50 (r. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm. Rwnowane atomy z ssiednich reszt acucha gwnego oddalone s o 0,15 nm (mierzone wzdu osi). Grupy R skierowane s na zewntrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. We wntrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dziki maksymalnej liczbie wiza wodorowych jest to konformacja o najniszej energii i tym samym najwikszej stabilnoci, dlatego formuje si ona

- 17

spontanicznie. Wizania wodorowe wystpuj midzy atomem N wizania peptydowego oraz atomem O wchodzcym w skad czwartego kolejnego wizania peptydowego tego samego acucha (wizania wewntrzacuchowe); maj one optymaln odlego 0,28 nm. Dodatkow funkcj peni wizania van der Waalsa (por. dalej), zwaszcza dziaajce poprzecznie do osi helisy, pomidzy ciasno upakowanymi atomami jej rdzenia. Jedynie peptydowy atom N proliny nie moe uformowa wizania wodorowego, dlatego aa ten pasuje jedynie do 1. obrotu helisy w innym miejscu wytwarza on zgicie. -helisy wystpuj zwykle na powierzchni czsteczek biaek, chocia mog by rwnie czciowo lub cakowicie schowane w ich wntrzu. Szczeglny przypadek stanowi helisy amfipatyczne, w ktrych aa polarne i niepolarne zmieniaj si ze sob co 3 4 reszty w ten sposb mog one kontaktowa si ze rodowiskiem polarnym z jednej strony, a z niepolarnym z drugiej. Helisy amfipatyczne wystpuj m. in. w: lipoproteinach osocza, hormonach, toksynach, antybiotykach, glikoproteinach wirusa HIV oraz w kinazie biakowej regulowanej kalmodulin. Struktura nazywana jest inaczej -kartk, -harmonijk lub pofadowanym arkuszem. Nazwy te odnosz si do jej ksztatu, obserwowanego wzdu krawdzi C i zwizane z nimi R wystpuj naprzemiennie nieco powyej i poniej paszczyzny gwnego acucha polipeptydowegom ktry jest niemal w peni rozcignity. -kartka posiada powtarzajce si co do wartoci kty i oraz jest stabilizowana maksymaln iloci wiza wodorowych. Te jednak, w przeciwiestwie do -helisy, maj charakter midzyacuchowy wystpuj midzy atomami N i O wiza peptydowych ssiadujcych pasm acuchw peptydowych; w ich tworzenie zaangaowane s odcinki o dugoci 5 10 aa z rnych regionw struktury I-rz. Struktury mog by rwnolege lub antyrwnolege (przeciwrwnolege, przeciwbiene); w pierwszym przypadku ssiednie acuchy peptydowe biegn w tym samym kierunku, w drugim za w przeciwnym. Z wyjtkiem pasm granicznych tworz si wszystkie moliwe wizania wodorowe. W strukturze antyrwnolegej pary wiza wodorowych wystpuj na przemian raz blisko, a raz daleko od siebie, a zorientowane s mniej wicej prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Z kolei w strukturze rwnolegej wizania wodorowe s rozmieszczone rwnomiernie, ale le wzgldem siebie ukonie i w zmiennych kierunkach. Powszechne s regiony poczenia struktur rwnolegych i antyrwnolegych, wiele acuchw moe te wystpowa w obrbie jednej kartki (chocia struktury rwnolege zoone z < 5 acuchw s nieco mniej stabilne i przez to rzadko spotykane). Niemal wszystkie pasma harmonijki s zwinite prawoskrtnie, tworzc centralny rdze wielu biaek globularnych. Zwrot (zagicie , -skrt) to ukad umoliwiajcy zmian kierunku przebiegu struktury , czsto czcy koce dwch przylegych pasm antyrwnolegych. Zwrot umoliwiajcy zmian kierunku acucha o 180o skada si z 4 aa, z czego pierwszy tworzy wizania wodorowe z czwartym. Ponadto czsto zawiera glicyn z powodu niewielkiego rozmiaru oraz prolin gdy ok. 6 % jej wiza peptydowych posiada konfiguracj cis. Jest to struktura regularna, czsto obecna na powierzchni biaek. W typowym biaku globularnym jedynie ok. poowa aa wchodzi w skad struktur i , podczas gdy reszta wystpuje w postaci struktur nieregularnych, tj. ptli i zwojw. Szczeglnie dotyczy to obu kocw (N i C) oraz reszt R lizyny. Obszary ptli warunkuj gwnie waciwoci powierzchni czsteczek biaek. Bezadna struktura wie si z gitkoci i atwoci dopasowania, przy czym wiele obszarw bezadnych ulega organizacji pod wpywem specyficznych ligandw; z tego powodu regiony nieregularne czsto wystpuj w miejscach interakcji czsteczek biaek z innymi czsteczkami (ligandami), np. w centrach katalitycznych enzymw, czy na powierzchni biaek odpornociowych, gdzie ksztatuj obszary oddziaywania przeciwciaa z antygenem. Ptle o ksztacie spinki do wosw spinaj ssiadujce antyrwnolege struktury . Struktury II-rz. mog tworzy motywy naddrugorzdowe, np. klucz grecki pojedynczy i podwjny, motyw czy -spink (antyrwnolege pasma zespolone krtk ptl). Struktura III-rz. okrela przestrzenne powizania midzy elementami struktury II-rz. (helisami, kartkami, innymi), jak rwnie wzajemne oddziaywania midzy domenami, sposoby fadowania oraz oddziaywania stabilizujce takie uoenie. Struktura III-rz. stabilizowana jest przez rnorodne rodzaje wiza niekowalencyjnych: wizania wodorowe wytwarzane przez polarne R aa oddziaywania hydrofobowe wystpuj pomidzy niepolarnymi R aa oddziaywania elektrostatyczne (mostki solne) tworz si midzy przeciwnie naadowanymi grupami, np. kocami N i C peptydw bd R polarnymi jonizujcymi (np. Lys i Asp) siy van der Waalsa s bardzo sabe i dziaaj jedynie na niewielkie odlegoci, rwne sumie promieni van der Waalsa atomw pomidzy ktrymi wystpuj Biaka mog by dodatkowo stabilizowane kowalencyjnymi wizaniami dwusiarczkowymi (S-S); rozwizanie takie wystpuje w niektrych enzymach (np. rybonukleaza), hormonach (np. insulina) czy biakach strukturalnych (keratyna).

- 18

Struktury II-rz. i motywy naddrugorzdowe, zwaszcza w duych biakach, mog by zorganizowane w poczone ze sob fragmenty, zwane domenami. Domena to lokalna, zwarta, globularna, potencjalnie niezalene jednostka fadowania biaka, zwizana z nim jednak wizaniami kowalencyjnymi. Domena reprezentuje zwarty genetycznie segment, np. domeny w Ig, dehydrogenazach czy globinach; ponadto interesujce jest, i sekwencje aa charakterystyczne dla danej domeny mona spotka w innych, podobnych domenach tego samego biaka lub w innych biakach. Domeny czsto nadaj biakom w ktrych wystpuj zdolno penienia specyficznych funkcji, np. wizania swoistych ligandw (nukleotydw, polisacharydw). Przestrze midzy domenami wyznacza czsto centrum aktywne biaka, a powierzchnia kontaktu midzy nimi jest miejscem przenoszenia mechanizmw allosterycznych. Zaburzenia struktury II/III-rz. biaek stanowi istot chorb prionowych (TSE) zmiany w konformacji biaek powoduj zastpienie -helisy przez -kartk oraz wystpienie opornoci na proteoliz enzymatyczn. Struktura IV-rz. okrelona jest w przypadku biaek oligomerycznych, tj. zoonych z 2 acuchw polipeptydowych zwanych protomerami lub podjednostkami poczonych siami niekowalencyjnymi. Opisuje ona sposb uoenia w przestrzeni kilku wzajemnie ze sob oddziaywujcych acuchw. Cechuje si ponadto najwiksz zoonoci, a zarazem jest najsabiej poznana. Ze wzgldu na liczb podjednostek wyrniamy odpowiednio di-, tri-, tetramery itd. Homooligomery skadaj si z kilku identycznych podjednostek, podczas gdy heterooligomery z rnych; rne protomery biaek heterooligomerycznych peni zazwyczaj specyficzne funkcje, np. katalityczne, regulacyjne czy rozpoznajce ligandy. Waciwoci chemiczno-biologiczne biaek podjednostkowych zale od przestrzennej orientacji ich podjednostek. W odpowiednich warunkach mona pozbawi biako struktur wyszych rzdw. Denaturacja polega na zniszczeniu wiza niekowalencyjnych biaka, a tym samym na trwaej utracie jego struktury II, III i IV-rz. oraz aktywnoci biologicznej. Do denaturacji dochodzi pod wpywem tzw. czynnikw denaturujcych, do ktrych zaliczamy: wysok temperatur, silnie polarne (kwane lub zasadowe) rodowisko oraz okrelone substancje: alkohol, formalina, rozpuszczalne sole metali cikich (gwnie oowiu, rtci i srebra), SDS. W przeciwiestwie do denaturacji, koagulacja (wysolenie) polega na odwracalnej utracie postaci biaka pod wpywem dziaania soli metali lekkich, np. NaCl, NH4Cl. Sole te, dziki waciwociom higroskopijnym, wi i pozbawiaj biako pewnej iloci wody, wskutek czego naturalny ppynny zol biakowy zmienia posta na pstay el. Dodanie do skoagulowanego biaka wody powoduje przywrcenie mu pierwotnej konsystencji, co nazywa si peptyzacj. Natywne biaka nie maj postaci prostych acuchw, lecz s w skomplikowany sposb zwinite lub inaczej mwic sfadowane. Fadowanie biaek nie odbywa si na drodze prb i bdw, o czym wiadczy chociaby paradoks Levinthala czas przypadkowego poszukiwania odpowiedniej struktury sfadowania nawet w przypadku niewielkiego peptydu byby teoretycznie duszy ni szacowany wiek wszechwiata. Oczywiste jest zatem, i fadowanie biaek to nieprzypadkowy i wysoce zorganizowany proces. Proces fadowania skada si z kilku faz: formowania krtkich fragmentw struktury i ich wzrostu uformowania domen (w biakach wielodomenowych poczonych w tzw. stopion globul) zmian konformacyjnych nadajcych struktur III-rz. osignicia natywnej struktury (na tym koczy si fadowanie biaek monomerycznych) ew. czenia podjednostek i formowania oligomerw. acuchy polipeptydowe wielu zdenaturowanych biaek spontanicznie (bez zewntrznej interwencji, same z siebie) zwijaj si powtrnie w warunkach in vitro, cznie z przywrceniem aktywnoci biologicznej, cho trwa to o wiele duej ni w warunkach in vivo; zjawisko to okrela si mianem renaturacji. In vivo procesy fadowania przebiegaj o wiele szybciej i s wyranie ukierunkowane, m. in. dziki obecnoci specyficznych enzymw: izomeraza dwusiarczkowa biaek (ang. protein disulphide isomerase PDI) uatwia przetasowanie wiza dwusiarczkowych (S-S) przez zwikszenie szybkoci wzajemnej wymiany mostkw S-S, izomeraza peptydylo-prolinowa cis-trans (ang. peptidil-proline isomerase PPI) katalizuje izomeryzacj wiza peptydowych X-Pro z formy trans do cis (przeksztaceniu ulega ok. 10 % wiza), chaperony (biaka opiekucze, m. in. tzw. biaka szoku cieplnego ang. heat shock protein = Hsp) przyspieszaj proces fadowania przez zapewnienie biaku ochronnego rodowiska oraz preferencje przemian powstrzymujcych niewaciwe interakcje midzy powierzchniami komplementarnymi i uatwiajcych waciwe interakcje.

- 19

d) rozdzia i okrelanie struktury biaek Aby mc bada struktur biaek, naley je wpierw wyizolowa w stanie czystym, tzn. pozbawi zanieczyszcze i oddzieli od innych biaek. Do najczciej stosowanych technik oczyszczania i izolacji biaek nale: Chromatografia jonowymienna i HVE stosowane s do aa i polipeptydw; podstaw rozdziau jest adunek elektryczny. Filtracja elowa z uyciem wysokich ste (1-4M) kwasu mrwkowego lub octowego stosowana do wielkoczsteczkowych hydrofobowych peptydw; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie i wymywanie peptydw z porw sita molekularnego (Sephadex). HPLC w odwrconym ukadzie faz (niepolarny nonik + polarny rozpuszczalnik) stosowana j.w., czasem w poczeniu z poprzednio omwiona metod do oczyszczania zoonych mieszanin peptydw, otrzymywanych przez czciowe trawienie biaek. HVE na sitach molekularnych (sczenie molekularne) technicznie przeprowadza si na skrobii, agarozie lub elu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje si do polipeptydw i polinukleotydw. Prbk w buforze nanosi si na pytk lub do rurki, rozdziela elektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje peptydy bkitem brylantowym Coomassie lub solami srebra, za polinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje si odmian tej metody w warunkach denaturujcych (mocznik, SDS) acuch peptydowy ulega wwczas rozprostowaniu, dodatkowo wic na powierzchni adunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkoci (waciwie do iloci wiza peptydowych), wic rozdzia elektroforetyczny opiera si tu porednio na masie czsteczkowej. Metod PAGE-SDS stosuje si wic do okrelania masy czsteczkowe biaek przez porwnanie ich ruchliwoci elektroforetycznej z ruchliwociami wzorcw o znanych masach. Po uzyskaniu czystego biaka mona przystpi do stopniowego okrelania jego struktury. Wiele biaek skada si z 2 acuchw polipeptydowych poczonych wizaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki dwusiarczkowe, ktre musz by rozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwr badanego biaka traktuje si czynnikami denaturujcymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), ktre rozbijaj wizania wodorowe i niektre niekowalencyjne oraz czynnikami redukujcymi lub utleniajcymi, ktre pozbawiaj peptydy mostkw dwusiarczkowych czynniki utleniajce, np. kwas nadmrwkowy (HCOOOH), utleniaj reszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SO3-), natomiast czynniki redukujce, np. 2-merkaptoetanol, redukuj je do cysteiny (Cys-SH). Polipeptydy wielkoczsteczkowe rozbija si, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o dugoci 20-60 aa. Do tego celu uywa si nastpujcych odczynnikw (w nawiasach podano rodzaj rozbijanego wizania): bromocyjan CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X), hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), agodna hydroliza kwana (Asp-Pro). Przed rozpoczciem sekwencjonowania biaka okrela si jego skad aminokwasowy poprzez poddanie go kwanej hydrolizie (6M HCl, 11oC, 1-4 doby), a nastpnie rozdzielenie i identyfikacj wolnych aa metod HPLC, chromatografii jonowymiennej bd elektroforetyczn. Wad takiego postpowania jest zniszczenie struktury wielu aa przez agresywne rodowisko cakowicie niszczone s Trp i Cys, czciowo Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wizania Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazuj oporno na ten rodzaj hydrolizy. Aby tego unikn, wykonuje si kilka zabiegw: Cys utlenia si do kwasu cysteinowego opornego na dziaanie kwanego rodowiska, obecno Trp oznacza si po hydrolizie zasadowej (ktra za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys), okrela si tempo spadku poziomw Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje si do czasu 0, obecno aa rozgazionych oznacza si po 96 h hydrolizy, obecno aa kwanych oraz ich amidw okrela si cznie jako Glx (Glu + Gln) i Asx (Asp + Asn). Po okreleniu procentowego udziau poszczeglnych aa w budowie badanego biaka, mona przystpi do jego sekwencjonowania, czyli okrelenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod: Najstarsze metody sekwencjnowania opieraj si na przeprowadzeniu N-kocowego aa peptydu w okrelon pochodn, hydroliz peptydu oraz identyfikacj powstaej pochodnej aa. Taka jest m. in. idea metody Sangera uywa si w niej odczynnika Sangera DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzenu), ktry reaguje wycznie z N-kocowymi resztami aa, po czym prowadzi si hydroliz i identyfikacj. Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikacj N-kocowych reszt aa peptydw w postaci pochodnych. Wykorzystuje si tu odczynnik Edmana fenyloizotiocyjanian, ktry reagujc z kocem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy, ktry w rodowisku kwanym i obecnoci niehydroksylowych rozpuszczalnikw (np. nitrometanu) rozpada si na fenylotiohydantoinow pochodn aa oraz peptyd skrcony o jeden N-kocowy aa. W przeciwiestwie do metody Sangera, po usuniciu N-kocowego aa peptyd pozostaje niezmieniony.

- 20

Pochodne aa identyfikuje si metod HPLC, po czym opisany cykl powtarza si 30 80 x w jednym cigu operacyjnym. Oznaczenie struktury I-rz. wszystkich peptydw otrzymanych ze wstpnej hydrolizy prbki pozostawia do wyjanienia jedynie kolejno ich uoenia. Dlatego naley otrzyma i zsekwencjonowa dodatkowe peptydy o nakadajcych si resztach N i C-kocowych (techniki rozrywajce polipeptyd w innych miejscach). W celu oznaczenia pooenia wiza dwusiarczkowych rozdziela si zarwno peptydy pochodzce z hydrolizy prbki pierwotnej, jak i zmodyfikowane metodami utleniania / redukcji za pomoc chromatografii dwuwymiarowej lub chromatografii i elektroforezy. Metoda Maxima i Gilberta prezentuje inne podejcie do problemu opiera si na szybkim sekwencjonowaniu DNA genu kodujcego dane biako i okreleniu sekwencji aa na podstawie tabeli kodu genetycznego. Jej wad jest brak ujawniania miejsc wiza dwusiarczkowych oraz obecnoci posttranslacyjnych modyfikacji aa (hydroksylacja, metylacja, fosforylacja, estryfikacja, izoprenylacja). Stosowana jest w identyfikacji labilnych pre- lub prepropeptydw istotnych w katalizie lub w badaniu kierowania peptydw do okrelonych organelli komrkowych. Alternatywnym sposobem sekwencjonowania krtkich (do ok. 25 aa) peptydw jest szybkie bombardowanie atomowe (FAB) ze spektroskopi masow (MS) w dwch poczonych spektrometrach. Szybkie bombardowanie atomami gazw szlachetnych (Ar lub Xe) daje w efekcie kationy peptydw. W pierwszym spektrometrze oddzielane s zanieczyszczenia, po czym jony peptydw zderzaj si w komorze z atomami He, ulegajc fragmentacji do wielu jonw o zmniejszajcych si rozmiarach, ktrych masy czsteczkowe oznaczane s w drugim spektrometrze porwnanie jonw z rosncymi masami pozwala na identyfikacj wszystkich reszt aa i ich kolejnoci. Metoda FAB-MS umoliwia identyfikacj aa zmodyfikowanych posttranslacyjnie oraz w przeciwiestwie do metody Edmana umoliwia sekwencjonowanie peptydw z zablokowanym (np. zacylowanym) kocem aminowym. Trjwymiarow struktur biaek mona bada metodami krystalografii rentgenowskiej oraz MRS. Krystalografia rentgenowska ujawnia statyczny obraz biaka krystalicznego. Wymaga duych, doskonale uporzdkowanych krysztaw biaka, zawierajcych szereg powtarzajcych si regularnie identycznych czsteczek, silnie zaamujcych promienie X. Obraz powstay w wyniku zaamania wizki promieni na krysztale biaka pozwala na odtworzenie struktury pojedynczej czsteczki. Krysztay biaek hoduje si technik wiszcej kropli, po czym eksponuje na monochromatyczne (o jednej, staej i okrelonej dugoci fali) promieniowanie X i obraza w celu uzyskania wszystkich moliwych odwzorowa dyfrakcyjnych. Promienie X s wwczas rozpraszane i tworz obraz zaleny od gstoci elektronowej w rnych czciach biaka. Maksima dyfrakcji s analizowane komputerowo, aby na tej podstawie skonstruowa mapy gstoci elektronowej (amplitudy i fazy). Reprezentuj one seri rwnolegych przekrojw przez biako, co z kolei pozwala na konstrukcj trjwymiarowych map gstoci elektronowej i dalej model fizyczny lub przyblione dopasowanie struktury I-rz. Dokadne wyznaczenie pooe atomw moliwe jest jedynie po zsekwencjonowaniu badanego biaka. Spektroskopia jdrowego rezonansu magnetycznego (ang. magnetic resonance spectroscopy = MRS) jest technik dostarczajc informacji o strukturze biaka w roztworze. Parametrami bezporednio mierzonymi jest otoczenie chemiczne jder atomowych wykazujcych moment magnetyczny albo spin (gwnie 1H), co dostarcza informacji o odlegoci atomw w czsteczce przesuniciach chemicznych. Dwuwymiarowa MRS analizuje skomplikowane widma otrzymywane z biaek zmieniajcych si w czasie, dlatego jest wykorzystywana do badania tworzenia struktur przejciowych w procesie zwijania acuchw biakowych. Do metod badania struktury IV-rz. biaek i oznaczania ich mas czsteczkowych zaliczamy m. in.: Ultrawirowanie analityczne pomiar szybkoci sedymentacji biaka przy wirowaniu z przyspieszeniem ktowym 10 tys. x wikszym ni przyspieszenie ziemskie. Wirowanie w gradiencie gstoci (zwykle 5 20 % roztworu zbuforowanej sacharozy) porwnanie poziomu biaka w prbwce w odniesieniu do poziomw biaek o znanych masach czsteczkowych przy wirowaniu w powyszych warunkach. Filtracja elowa mas czsteczkow nieznanego biaka oblicza si z porwnania jego objtoci elucyjnej z analogicznymi objtociami biaek wzorcowych. PAGE rozdzia biaek w elach o zmiennej porowatoci i wykrywanie bkitem brylantowym lub solami srebra. PAGE-SDS stosowane jest do okrelania rozmiarw podjednostek oligomerw. Mikrofotografia elektronowa obrazowanie kompleksw makromolekularnych wirusw, kompleksw enzymatycznych czy oligomerw.

- 21

e)

zwizek budowy i funkcji biaek fibrylarnych i globularnych Biaka fibrylarne cechuj si m. in. wyduonym ksztatem i brakiem rozpuszczalnoci w wodzie. Peni one funkcje biaek strukturalnych w skrze, tkance cznej oraz rnego rodzaju wknach (wosy, jedwab, wena). Czsto zawieraj atypowe sekwencje aa lub zmodyfikowane aa, co przekada si na struktur II i III-rz. i konsekwentnie dalej na waciwoci mechaniczne. Przykadami biaek fibrylarnych s: kolagen (patrz punkt VII-9-b), elastyna (VII-8-a), miozyna (VII-7-a), keratyna, fibroina. Keratyna nie jest pojedynczym biakiem, lecz ca rodzin, wrd ktrej mona wyrni tzw. keratyny twarde i mikkie. Oglnie cechuj si one wysok odpornoci na czynniki fizyczne, chemiczne i dziaanie proteaz oraz wysok zawartoci aa zawierajcych siark Cys (17%) i Met (0,5%).Wykazano istnienie ok. 10 izoform keratyn twardych, obecnych w rozmaitych wytworach naskrka zwierzt paznokciach, pirach, rogach, wenie i innych. W ludzkich komrkach nabonkowych zidentyfikowano ok. 20 izoform cytokeratyn (40-70 kDa), nalecych do keratyn mikkich. Cytokeratyny stanowi najwiksz i najbardziej zrnicowan grup filamentw porednich, wchodzc w skad cytoszkieletu komrkowego. Podjednostki keratyn zbudowane s wedug wsplnego planu wyrniamy w nich -helisow domen centraln oraz globularne domeny N i Ckocowe. Ta pierwsza posiada wysoce konserwatywny charakter i skada si z 310-315 reszt aa, za domeny terminalne licz od 15 do 30 reszt. Podjednostki keratyn, asocjujc w struktury wyszego rzdu, tworz kolejno: dimery protofilamenty protofibryle filamenty porednie. W przeciwiestwie do cytokeratyn, keratyny twarde s strukturami dwufazowymi, w ktrych wkna keratyny s zatopione w bezpostaciowej macierzy zbudowanej z biaek o duej zawartoci siarki. Enzymy proteolityczne zdolne do hydrolizy keratyny to wystpujce u krgowcw kaspazy degradujce cytokeratyny (udzia w procesie apoptozy) lub syntetyzowane przez mikroorganizmy keratynazy. Fibroina stanowi gwne biako jedwabiu. 85% jej skadu stanowi Gly, wystpujca na zmian z Ser lub Ala. acuchy polipeptydowe formuj szereg rozcignitych antyrwnolegych pasm , tak i grupy boczne (R) Gly wyaniaj si z jednej powierzchni, za Ser lub Ala z drugiej. W ten sposb ukad stabilizowany jest nie przez wizania wodorowe, lecz przez oddziaywania hydrofobowe. Wtrcone co pewien odcinek aa z duym R (Val, Tyr) zaburzaj regularn struktur i zwikszaj gitko caoci konstrukcji. Jedn z grup globularnych biaek zoonych s chromoproteiny, reprezentowane w ludzkim ustroju g. przez biaka hemowe nazwane tak od doczonego do acucha peptydowego barwnika hemu. Rola biaek hemowych polega na transporcie i magazynowaniu tlenu oraz transporcie elektronw. Ich zdolno wizania tlenu uwarunkowana jest obecnoci jonu Fe2+, zlokalizowanego w centrum grupy hemowej, stanowicej grup prostetyczn hemoglobiny i mioglobiny. Grupa hemowa wystpuje rwnie w wielu enzymach cytochromach, katalazie (CT), syntazie tlenku azotu (NOS), 2,3dioksygenazie tryptofanowej i innych. Hem jest cyklicznym tetrapirolem skada si z 4 grup pirolowych poczonych 4 mostkami metinowymi midzy atomami C (ukad porfiny), za przy atomach C obecne s charakterystyczne podstawniki. Ukad wielu sprzonych wiza podwjnych nadaje czsteczce paski ksztat (piercienie pirolowe, atomy C mostkw metinowych i jon Fe2+ le praktycznie w jednej paszczynie) oraz warunkuje pochanianie wiata w niskim zakresie wiata widzialnego, dziki czemu ma ona a przez to rwnie HGB i krew barw czerwon. Przy atomach C wystpuj grupy: metylowe (M w pozycjach 1, 3, 5, 8), winylowe (V 2 i 4) oraz propionowe (P 6 i 7). Te ostatnie, stanowic jedyne polarne acuchy boczne hemu, s zwrcone w stron powierzchni hemoprotein. Jak wczeniej wspomniano, jon elaza zajmuje centralne miejsce w czsteczce hemu, wic si dwoma wizaniami kowalencyjnymi oraz dwoma koordynacyjnymi z czterema atomami N tetrapirolu. Pozostae (5. i 6.) wizania koordynacyjne jonu elaza le prostopadle do paszczyzny porfiny odpowiednio nad i pod ukadem tetrapirolu. Funkcj mioglobiny (MGB skrt nieformalny) jest magazynowanie tlenu w miniach czerwonych. Jej czsteczka zoona jest z pojedynczego acucha polipeptydowego (masa ok. 17 kDa), zoonego ze 153 reszt aa. Zewntrzna cz czsteczki jest polarna, za wewntrzna niepolarna, co ma zwizek z rozpuszczalnoci w wodzie. Wyjtkowo we wntrzu czsteczki znajduj si dwa aa polarne His wice grup hemow do czci polipeptydowej. Czsteczka mioglobiny ma ksztat w przyblieniu kulisty, pomimo nieregularnej i niesymetrycznej budowy. Poszczeglne -helisy, struktury i ptle okrela si za pomoc liter i cyfr. A ok. 75 % acucha wystpuje w formie 8 prawoskrtnych -helis, o dugociach 7 20 reszt aa, oznaczonych literami od A do H, poczwszy od N-koca. Fragmenty midzyhelikalne oznacza si literami dwch odcinkw helikalnych przez nie poczonych. Pojedyncze

- 22

reszty aa oznacza si podajc liter oznaczajc helis oraz liczb pozycj aa w danej helisie, poczwszy od N-koca. Aa zajmujce odlege miejsca w strukturze I-rz. mog w wyniku skomplikowanego fadowania znale si blisko siebie w strukturze III-rz., np. His F8 i His E7. Informacja zawarta w strukturze I-rz. apomioglobiny jest odpowiedzialna za prawidowe i swoiste upakowanie biaka w obecnoci hemu. Grupa hemowa znajduje si w zagbieniu midzy helisami E i F, jon elaza wie si 5. wizaniem koordynacyjnym z piercieniem imidazolowym His F8 (tzw. His proksymalna). Po przeciwnej stronie paszczyzny hemu (w stosunku do His F8) znajduje si His E7 (tzw. His dystalna), ktra nie zajmuje jednak 6. pozycji koordynacyjnej Fe2+. W odtlenowanej MGB jon Fe2+ jest lekko (0,03 nm) wysunity poza paszczyzn hemu w kierunku His F8, natomiast w MGB utlenowanej gdy czsteczka O2 zajmuje 6. pozycj koordynacyjn wysunicie to jest 3 x mniejsze, wynoszc 0,01 nm. Zwizaniu czsteczki tlenu towarzyszy wic ruch jonu elaza i His F8 w stron paszczyzny porfiryny, co daje zmiany konformacyjne czsteczki biaka. W utlenowanej MGB wizanie Fe2+ O jest prostopade do paszczyzny porfiryny, natomiast 2. atom tlenu przyczony jest pod pewnym ktem (skonie). Z kolei tlenek wgla (CO) preferuje przyczanie si w caoci prostopadle do tej paszczyzny taka orientacja jest jednak moliwa jedynie w wyizolowanym hemie, bowiem fizjologicznie w MGB His dystalna stanowi przestrzenn zawad dla wizania CO pod tym ktem. Zatem otoczenie hemu w MGB zmniejsza powinowactwo CO do elaza hemowego, ktre w przypadku czystego hemu jest a 25 tys. razy wiksze ni powinowactwo O2 do tego elaza. Dziki opisanemu mechanizmowi czsteczka CO zmuszona jest do wizania si w mniej korzystnej konfiguracji, co obnia wzgldne powinowactwo do ok. 200. MGB jest biakiem magazynujcym, a nie transportujcym tlen. Ilo O2 zwizanego przez biako (nasycenie, saturacja) zaley od stenia (cinienia) tego gazu pO2. Nie jest to jednak zaleno liniowa, lecz obrazuje j krzywa dysocjacji tlenowej. Dla MGB krzywa ta ma ksztat hiperboli, co oznacza, i oddaje ona tlen dopiero przy znacznym spadku pO2, co ma miejsce przy duym deficycie tlenowym w warunkach wysokiej aktywnoci fizycznej. MGB nie mogaby peni funkcji transportu tlenu z puc do tkanek, gdy przy granicznych w tych warunkach wartociach pO2 oddaje ona jedynie znikom cz zmagazynowanego O2. Hemoglobina (HGB) spenia funkcj transportu gazw oddechowych O2 z puc do tkanek oraz CO2 i H+ w kierunku przeciwnym. HGB jest tetramerem zoonym z pary dwch typw acuchw polipepydowych, oznaczanych , , , , S itd. acuchy te stanowi podjednostki HGB posiada ona zatem struktur IV-rz., dziki czemu zyskuje nowe waciwoci, ktrych nie prezentuje MGB. acuch skada si ze 141 reszt aa, a ze 146, oba s kodowane przez odmienne geny. Znanych jest wiele typw HGB, jednak do najwaniejszych nale: HbA (22; podstawowa fizjologiczna HGB dorosych), HbA2 (22; fizjologiczna HGB dorosych, stanowi ok. 2,5 %), HbF (22; podowa), HbS (2S2; wystpuje w sierpowatych erytocytach). MGB i podjednostki HbA wykazuj praktycznie identyczn struktur II i III-rz., podobna jest rwnie lokalizacja grup hemowej i odcinkw helikalnych, cho HbA posiada ich tylko 7. Hem kadej podjednostki HGB przycza 1 czsteczk O2, wic caa HGB wie cznie 4 czsteczki tlenu. Co wicej, przyczenie O2 do jednego hemu uatwia wizanie kolejnych O2 przez pozostae grupy hemowe okrela si to jako kooperatywne wizanie O2 z HGB. Zjawisko to pozwala na zwizanie maksymalnej iloci tlenu w pucach oraz uwalnianie moliwie najwikszej iloci tlenu w tkankach. Zjawisko kooperatywnoci powoduje, e krzywa dysocjacji tlenowej HGB ma ksztat sigmoidalny (wygity jak litera S). Wniosek jest taki, i poczenie acuchw polipeptydowych w tetramer pozwala na zwikszenie wydajnoci transportu tlenu. Rne typy HGB cechuj si odmiennym powinowactwem do O2. Jego ilociow miar jest wskanik P50, tj. warto pO2, przy ktrej HGB jest wysycona tlenem w 50 %. P50 dla HbA wynosi 26 mmHg, a dla HbF 20 mmHg oznacza to, i HbF silniej wie O2 (przy danej prnoci jest wysycony w wikszym stopniu) waciwo ta pozwala na przekazywanie tlenu z HbA na HbF w obrbie oyska. Po porodzie odsetek HbF szybko maleje, gdy jego obecno nie jest ju uzasadniona puca pracuj, a wysokie powinowactwo HbF do tlenu utrudnia jego oddawanie w tkankach. Na jego miejsce syntetyzowana jest HbA. Nagy rozpad duych iloci HbF wie si z powstaniem duych iloci bilirubiny (por. punkt VI-5-b/c), co jest przyczyn taczki noworodkw. Przyczeniu O2 towarzyszy rozerwanie wiza poprzecznych (niekowalencyjnych elektrostatycznych) midzy kocami C wszystkich podjednostek HGB, co zmienia jej struktur II, III i IV-rz. Jedna para podjednostek + wykonuje obrt o ok. 15o w stosunku do drugiej pary, w wyniku czego podjednostki zbliaj si do siebie i wzrasta powinowactwo do tlenu. Struktura IVrz. HGB czciowo utlenowanej okrelana jest jako stan naprony (T), za HGB cakowicie

- 23

utlenowanej jako stan rozluniony (R). Podczas utlenowania HGB atomy Fe, lece 0,06 nm poza paszczyzn porfiryny w HGB pozbawionej tlenu, wsuwaj si bliej tej paszczyzny, pocigajc za sob His F8 i ssiadujce z ni reszty aa. Prawdopodobiestwo przejcia TR wzrasta wraz z przyczaniem olejnych czsteczek O2 do HGB, gdy wizanie O2 osabia i rozbija wizania poprzeczne utrzymujce HGB w stanie T. Rwnowaga TR znajduje si pod wpywem takich czynnikw jak: H+, CO2, Cl-, BPG, ktre zwikszaj ilo zwizanego O2 wymaganego do przejcia TR. Po oddaniu O2 HGB wie CO2, transportujc go do puc w ten sposb przenoszonych jest ok. 15% cakowitego CO2 transportowanego przez krew. CO2 wchodzi w reakcj z N-kocami acuchw HGB, dajc karbaminiany: HGB-NH3+ + CO2 HGB-NH-COO- + 2 H+. Powstajce w tej reakcji protony odpowiedzialne s za efekt Bohra. Zmiana adunkw N-kocw HGB umoliwia tworzenie wiza poprzecznych pomidzy podjednoskami tak jak w formie nieutlenowanej. W pucach utlenowaniu HGB towarzyszy odczenie i wydalenie CO2. CO2 docierajcy do krwi przeksztacany jest przez anhydraz wglanow (CA) do H2CO3, ktry samorzutnie dysocjuje do H+ + HCO3-. Protony wi si z HGB (Hb . 2 H+), za aniony wodorowglanowe stanowi gwn form transportu CO2 przez krew. Przez efekt Bohra okrela si zmniejszenie powinowactwa tlenu do HGB wraz ze spadkiem pH dziki temu w tkankach nastpuje bardziej efektywne oddawanie O2, a krzywa dysocjacji tlenowej HGB przesuwa si przez to w prawo. Zjawisko odwrotne, tj. zwikszenie oddawania CO2 pod wpywem wizania O2 nosi nazw efektu Haldena. Efekt Bohra jest charakterystyczny dla tetramerycznej HGB, zaley bowiem od interakcji pomidzy grupami hemowymi, czyli kooperatywnoci wizania O2 nie wykazuje go zatem MGB. Dziki zdolnoci wymiany protonw z otoczeniem, HGB peni funkcj ukadu buforowego krwi. Protony odpowiedzialne za efekt Bohra powstaj w wyniku rozerwania wiza poprzecznych podczas utlenowania formy T, pochodz gwnie z atomw N piercieni imidazolowych Ckocowych reszt His acuchw (HC3; His 146). Z kolei odczenie O2 i zwizane z tym tworzenie wiza poprzecznych wymaga przyczenia H+ do w/w miejsc. Obecno protonw w tkankach uatwia wic tworzenie wiza poprzecznych poprzez protonacj C-kocowych reszt His acuchw , a odtwarzanie tych wiza sprzyja przejciu RT, czyli oddawaniu O2. 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) powstaje w tkankach w wyniku niedoboru O2, jako modyfikacja podstawowego szlaku glikolizy. BPG wie si z HGB w stosunku stechiometrycznym 1:1, w miejscu pomidzy podjednostkami w centrum czsteczki. Rozmiar tej wnki odlego pomidzy helisami H acuchw odpowiada BPG jedynie w formie T. BPG tworzy wizania poprzeczne w obrbie acuchw (z N-kocem ValNA1, Lys EF6 i His H21), przez co stabilizuje i preferuje form T, zwiksza zatem oddawanie O2 przez HGB w tkankach. BPG o wiele sabiej dziaa w przypadku HbF, gdy posiada ona w pozycji H21 Ser zamiast His, w zwizku z czym nie tworzy wiza poprzecznych. Adaptacja organizmu do duych wysokoci polega m. in. na zwikszeniu syntezy BPG, co zmniejsza P50, a zwiksza uwalnianie tlenu do tkanek. Stany patologiczne zwizane z HGB: Hemoglobinopatie s to zaburzenia funkcji biologicznej HGB, bdce nastpstwem mutacji genw kodujcych jej acuchy polipeptydowe ( i ). Znanych jest kilkaset hemoglobinopatii, jednak ogromna wikszo wystpuje rzadko i ma agodny przebieg, tak e wiksze znaczenie posiada zaledwie kilka z nich. HbM: His F8 Tyr Mutacja taka powoduje stabilizacj elaza hemowego w formie Fe3+, gdy tworzy ono trwae poczenie z anionem fenolanowym Tyr. Powoduje to methemoglobinemi podobnie jak sulfonamidy lub stany obnienia aktywnoci reduktazy methemoglobiny i zwizany z tym spadek zdolnoci HGB do wizania i transportu O2. Przy wariantach HbM dotyczcych acuchw wystepuje preferencja formy T, obnienie powinowactwa do tlenu i zniesienie efektu Bohra; natomiast przy wariantach dotyczcych acuchw przejcie RT nie zostaje zakcone, podobnie jak efekt Bohra. HbS: Glu A2(6) Val Mutacja powoduje powstanie na powierzchni HGB lepkich miejsc, komplementarnych do odpowiednich miejsc na powierzchni nieutlenowanej HGB (zarwno A, jak i S). Komplementarno oddziaujcych powierzchni powoduje polimeryzacj nieutlenowanej HbS powstaj w ten sposb helikalne wkna HGB, ktre wytrcaj si i znieksztacaj erytrocyty, ktre przyjmuj ksztat sierpowaty, posiadaj obnion oporno hemolityczn oraz wiksz tendencj do agregacji i zlepiania. Objawy anemii sierpowatokrwinkowej pogbiaj si przy obnieniu pO2 polimeryzuje przecie forma T, czyli nieutlenowana. Barier i zatrzymanie polimeryzacji powoduje przyczenie

- 24

prawidowej HbA zarwno w formie R i T, gdy pomimo istnienia miejsc komplementarnych, nie posiada ona lepkich kocw. Talasemie s to choroby, ktrych istot jest zmniejszona synteza acuchw HGB ( lub ), co jest przyczyn anemii. HGB glikowana (HbA1c) jest to HGB poddana procesowi glikacji. Glikacja jest procesem nieenzymatycznej glikozylacji biaek w tym przypadku HGB zachodzcym w warunkach podwyszonego poziomu glukozy w rodowisku, np. cukrzycy. Anomeryczna grupa hydroksylowa glukozy reaguje z grup aminow Lys oraz aa N-kocowych. HbA i HbA1c mona rozdzieli stosujc chromatografi jonowymienn lub elektroforez. HbA1c stanowi fizjologicznie < 5 % HGB i jest proporcjonalne do redniego stenia glukozy we krwi w okresie 1,5 3 miesicy poprzedzajcych badanie (dugofalowa kontrola terapii cukrzycy). Mioglobinuria jest stanem wydalania z moczem MGB pochodzcej z rozlegego uszkodzenia mini szkieletowych (w mniejszym stopniu serca), przez co mocz ma barw ciemnoczerwn. Stan taki moe prowadzi do ostrej niewydolnoci nerek (ONN).

- 25

ROZDZIA II STRUKTURA I FUNKCJE ENZYMW

1. a) Ogle waciwoci enzymw klasyfikacja i nazewnictwo

Podstaw klasyfikacji enzymw jest typ i mechanizm katalizowanej przez nie reakcji. Kady enzym posiada swj kod o postaci: EC xx.xx.xx.xx, gdzie litery x oznaczaj cyfry arabskie. Symbol EC zaznacza, e dalsza cz kodu to numer w midzynarodowym katalogu enzymw (ang. Enzyme Commission, fr. Enzyme Catalogue). Sam numer skada si z 4 czonw: pierwszy okrela gwn klas, charakteryzujc typ katalizowanej reakcji; system zawiera 6 klas enzymw i katalizowanych przez nie reakcji: 1 oksydoreduktazy katalizuj reakcje utleniania i redukcji (redox; patrz punkt III-3) 2 transferazy katalizuj reakcje przenoszenia grup funkcyjnych 3 hydrolazy katalizuj reakcje rozpadu pod wpywem wody (hydrolizy) 4 liazy katalizuj reakcje rozpadu bez udziau czsteczek wody 5 izomerazy katalizuj reakcje zmian pooenia grup chemicznych z zachowaniem szkieletu 6 ligazy katalizuj reakcje tworzenia wiza kowalnecyjnych drugi okrela podklas, charakteryzujc zazwyczaj rodzaj wizania lub grupy, ktrej dotyczy reakcja trzeci okrela podpodklas, ktra moe zawiera: dokadniejsz specyfikacj wizania, grup zwizkw do ktrej naley substrat, nazw donora lub akceptora czwarty wskazuje na okrelony enzym przez podanie nazwy substratu reakcji. Nazwa enzymu jest dwuczciowa cz pierwsza, zakoczona przyrostkiem -aza, okrela typ katalizowanej reakcji, druga substrat(y) reakcji. b) centrum katalityczne Enzymy posiadaj zdolno przyczania substratw i miejscowego zwikszania ich stenia, przez co przyspieszaj przebieg katalizowanej reakcji. Zazwyczaj czsteczka biaka enzymatycznego jest wielokrotnie wiksza (nawet o kilka rzdw wielkoci) od czsteczki substratu, co sugeruje istnienie ograniczonego obszaru centrum katalitycznego bezporednio wicego substrat. Model miejsca katalitycznego wg Fishera przedstawia je jako sztywn konstrukcj, a interakcj z substratem jako przestrzenne uoenie dopasowanych do siebie geometrycznie (niczym klucz do zamka) czsteczek. Koncepcja ta wyjania specyficzno pocze E-S, nie tumaczy jednak dynamicznych zmian towarzyszcych procesom katalitycznym. W przeciwiestwie do w/w, model indukowanego dopasowania, zaproponowany przez Koshlanda, zakada i blisko substratu indukuje zmiany konformacyjne w czsteczce enzymu, tak e moe nastpi poczenie pasujcych do siebie powierzchni. Z chemicznego punktu widzenia polega to na przyjciu odpowiedniej konformacji przez grupy funkcyjne czsteczki enzymu, co umoliwia interakcj z czsteczk substratu i waciw kataliz. Reszty aa znajdujce si w miejscu katalitycznym mog by od siebie znacznie oddalone w strukturze I-rzdowej, lecz przestrzennie zblione w strukturze III-rzdowej. Miejsca aktywne (katalityczne) enzymw zoonych z pojedynczej podjednostki s czsto zlokalizowane w bruzdach czsteczki enzymu, natomiast w oligomerach znajduj si zazwyczaj przy powierzchniach midzy podjednostkami. Wykazano, i w skad miejsca katalitycznego wchodzi wiele reszt aa, a gwn rol w katalizie odgrywaj pewne okrelone reszty w szczeglnoci aa z boczn grup sulfhydrylow (Cys) lub hydroksylow (Ser, Thr, Tyr) oraz kwane (Asp, Glu) i zasadowe (Lys, His, Arg), poniewa ich acuchy boczne stanowi czynniki nukleofilowe katalizatory kwane lub zasadowe bd akceptory grupy ulegajcej przeniesieniu. Wszystkie formy enzymu, katalizujce okrelon reakcj (lub typ reakcji), posiadaj jednakowy i uniwersalny mechanizm, wystpujcy w caej przyrodzie. Zwizany jest z tym fakt, i reszty aa istotne w procesie katalitycznym, jak rwnie ich najblisze otoczenie w czsteczce enzymu, wykazuj wysok konserwatywno, zachowan i utrwalon w procesie ewolucji. Poniewa jednak dany motyw struktury III-rz. moe by utworzony przez rne kombinacje struktur I-rz., tote ta pierwsza wykazuje zdecydowanie wiksz konserwatywno. c) koenzymy i witaminy bdce ich prekursorami

Wiele enzymw do przeprowadzenia reakcji wymaga, poza substratem, obecnoci dodatkowej substancji niebiakowej, okrelanej jako koenzym. Wwczas sam biakow cz enzymu nazywamy apoenzymem, a poczenie apoenzym z koenzymem holoenzymem. Koenzymy zwikszaj moliwoci katalityczne enzymw

- 26

poza te wynikajce z obecnoci grup funkcyjnych reszt aa. Koenzymy cile zwizane z enzymami okrela si mianem grup prostetycznych. Obecnoci koenzymw wymagaj generalnie enzymy katalizujce reakcje redox, przenoszenia grup, izomeryzacji i tworzenia wiza kowalencyjnych (klasy EC 1, 2, 5 i 6), nie potrzebuj ich natomiast enzymy lityczne hydrolazy i liazy (EC 3 i 4). Czsto koenzym bywa rozpatrywany jako kolejny substrat reakcji po pierwsze poniewa zmienia si wraz z podstawowym substratem, po drugie gdy czsto to wanie jego przemiany s fizjologicznie istotne. Prekursorami wielu koenzymw s witaminy, g. z grupy B (por. niej). W zalenoci od przenoszonej grupy, koenzymy dzieli si na: przenoszce protony: NAD(P)+, FMN, FAD, CoQ, kwas liponowy, przenoszce inne grupy: fosforany sacharydw, CoA, DPT, PLP, koenzymy folianowe, biotyna, koenzymy kobalaminowe, kwas liponowy. W tabeli poniej przedstawiono najwaniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, witaminy bdce ich prekursorami oraz przykady zawierajcych je enzymw. Lp. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. nukleotydy adeninowe grupa koenzym pena nazwa dinukleotyd nikotynamidoadeninowy fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego mononukleotyd flawinowy dinukleotyd flawinoadeninowy kwas liponowy (lipoinowy) koenzym A koenzym Q, ubichinon cytochrom biotyna witaminy przykad enzymu dehydrogenaza mleczanowa dehydrogenaza glukozo-6fosforanow dehydrogenaza NADH oksydaza aminokwasw oksydaza ketokwasw syntetaza kwasw tuszczowych -2 -3 odnoniki

skrt(y) NAD+, NADH NADP+, NADPH FMN FAD CoA1 CoQ b, c, c1, a, a3 -

PP

III-3

nukleotydy flawinowe cytochromy -

B2 (ryboflawina) kwas pantotenowy H

III-10 III-9 i 10, V-5 i 6 III-5 III-3, III-5

karboksylaza IV-4-b pirogronianowa dekarboksylaza 10. DPT difosfotiamina B1 (tiamina) III-10 pirogronianowa B6 transaminaza 11. PLP fosforan pirydoksalu VI-2-a (pirydoksal) alaninowa hydroksymetyloTHF, 12. tetrahydrofolian kwas foliowy transferaza VI-4-h FH4 serynowa mutaza B12 13. kobalamina metylomalonyloIV-4-b (kobalamina) CoA 1 CoA = {P} + ryboza + adenina + 2 {P} + kwas pantotenowy + merkaptoetanoloamina kwas pantotenowy = kwas pantoinowy + -alanina 2 CoQ peni funkcj przenonika elektronw midzy metaloflawoproteinami a cytochromami w acuchu oddechowym 3 cytochromy s przenonikami elektronw w acuchu oddechowym d) swoisto dziaania enzymw W przeciwiestwie do katalizatorw nieorganicznych czy prostych katalizatorw organicznych, enzymy charakteryzuje wysoka swoisto substratowa i aktywno katalityczna, bdce wynikiem wyksztacenia miejsc katalitycznych dostosowanych do szybkiej i selektywnej katalizy indywidualnych reakcji. Jedn z najwaniejszych cech enzymw jest ich zdolno do swoistej katalizy tylko jednej reakcji (ew. jednego typu reakcji), dziki czemu szybko procesw metabolicznych moe by regulowana przez modyfikacj aktywnoci odpowiednich enzymw (por. punkt II-4).

- 27

 e)

Enzymy s stereoswoistymi katalizatorami; wikszo substratw tworzy z nimi 3 wizania, przez co czsteczki symetryczne pod wzgldem budowy chemicznej mog nabywa cech asymetrii (por. punkt V-1-d kwasy tuszczowe w pozycjach 1 i 3 glicerolu). Enzymy wykazuj absolutn swoisto optyczn dla przynajmniej jednej czsteczki substratu gwnie dla form D wglowodanw i form L aa. Wyjtkiem s epimerazy racemazy. Enzymy (poza pewnymi wyjtkami) wykazuj rwnie swoisto wobec okrelonego koenzymu, nawet jeli przenoszenie danej grupy moe si odbywa z udziaem innego (por. wyej). aktywno enzymw, jednostki aktywnoci

Z powodu zazwyczaj bardzo maej iloci enzymw w materiale biologicznym czsto okrela si nie ilo samego biaka enzymatycznego, lecz jego aktywno katalityczn. Zakada si przy tym, e w warunkach badania szybko reakcji katalizowanej przez enzym zaley proporcjonalnie od iloci tego enzymu. Wobec tego ilo enzymu w prbce mona okreli na podstawie tempa ubytku substratw lub pojawiania si produktw w rodowisku reakcji. Wyniki podaje si odpowiednich jednostkach: IU midzynarodowa jednostka aktywnoci enzymu, oznaczajca tak jego ilo, ktra przemienia 1 mol reagentu w cigu 1 min. Katal (kat) jednostka SI aktywnoci enzymw i innych katalizatorw, oznacza ilo konwertujc 1 mol reagentu w czasie 1 s. Zwizek midzy katalem a IU przestawia si nastpujco: 1 kat = 60 mln U). Katal jest zatem jednostk wzgldnie du, dlatego w praktyce uywa si kat i nkat. Liczba obrotw enzymu ilo czsteczek substratu, ktre mog zosta przeksztacone przez enzym w produkt w cigu 1 sekundy. Zwykle wynosi ona od kilku tysicy do kilku milionw. Aktywno specyficzna jest to wyraenie aktywnoci enzymu, jak posiada jednostkowa masa biaka enzymatycznego, np. 1 U/mg oznacza, e 1 mg biaka posiada aktywno 1 IU. Aktywno cakowita jest to wyraenie aktywnoci enzymu, jak posiada jednostkowa masa lub objto materiau biologicznego, z ktrego ten enzym jest izolowany, np. 1 U/ml oznacza, e 1 ml pynu ustrojowego posiada dan aktywno enzymatyczn o wartoci 1 IU. Wyjtkowo w przypadku pewnych enzymw oznacza si ich bezwzgldn ilo metodami immunochemicznymi (por. punkt II-5-c CK-MB mass). f) kompartmentacja komrkowa enzymw

Enzymy, ich substraty i koenzymy nie wystpuj zazwyczaj jednorodnie w obrbie komrki, lecz w jej okrelonych przestrzeniach, zwanych kompartmentami. Rozmieszczenie to mona bada metodami histochemicznymi. Kompartmetacja komrki umoliwia wzajemn izolacj jej przedziaw i zachodzenie w nich przeciwstawnych procesw biochemicznych, np. syntezy i degradacji tej samej grupy zwizkw. Rozmieszczanie w komrce przykadowych, kluczowych dla jej funkcjonowania, enzymw: cytoplazma: aldolaza, izomeraza fosfoheksozowa, dehydrogenza mleczanowa, aminotransferaza alaninowa, dehydrogenaza sorbitolowa, mitochondria: enzymy cyklu Krebsa, oksydazy, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza asparaginianowa, ER: esterazy, reduktazy, acetylazy, GGTP, rybosomy: enzymy syntezy biaek, ceruloplazmina, cholinesteraza, lizosomy: proteazy, fosfatazy, kolagenazy g) izoenzymy Izoenzymy (izozymy) s to fizycznie odmienne formy tej samej aktywnoci katalitycznej, innymi sowy biaka o odmiennej strukturze, lecz katalizujce przebieg tej samej reakcji. Poszczeglne izoenzymy pojedynczej aktywnoci mog wystpowa w rnych kompartmentach subkomrkowych lub nawet w odmiennych typach komrek (tkankach std te czsto pochodz ich nazwy), rnic si dodatkowo powinowactwem do substratw (por. punkt IV-4-a aldolaza A i B). Izoenzymy s produktami ekspresji blisko spokrewnionych genw. Enzymy oligomeryczne z rnymi protomerami mog wystpowa w kilku postaciach, ponadto jedna tkanka moe produkowa jeden rodzaj protomeru, druga za inny. Jeli protomery mog czy si w rny sposb, aby utworzy aktywny enzym, tworz si wwczas tzw. izoenzymy rzekome danej aktywnoci. Okrela si je jako rzekome, gdy s to produkty asocjacji mniejszej liczby rodzajw protomerw. Np. dla LDH z 2 produktw translacji (posiadajcych odmienne mRNA) powstaje 5 izoenzymw rzekomych (patrz punkt II-5-b). Izoenzymy prawdziwe rni si natomiast tym, e kady z nich jest produktem translacji innego mRNA.

- 28

Znane s izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, transaminaz, fosfataz i proteaz. Rozdzia i identyfikacja izoenzymw okrelonych aktywnoci ma istotne znaczenie diagnostyczne (por. punkt II-5). h) izolacja enzymw Enzymy mog by otrzymywane przez oczyszczanie z komrek ywych organizmw, w ktrych naturalnie wystpuj, bd metodami rekombinacji DNA z komrek, gdzie fizjologicznie ich brak. Ze wzgldu na szybki wzrost uywa si do tych celw komrek drody i bakterii. Ponadto techniki ukierunkowanej mutagenezy pozwalaj na manipulacj skadem aa rekombinowanego enzymu, np. w celu okrelenia roli strukturalno funkcjonalnej pewnych jego regionw (czy nawet pojedynczych reszt aa). Do technik oczyszczania enzymw z materiau biologicznego zaliczamy: strcanie solami o rnych steniach ((NH4)2SO4, Na2SO4) lub rozpuszczalnikami (aceton, etanol), rnicow denaturacj ciepln, denaturacj spowodowan zmianami pH, wirowanie rnicowe, elektroforez, filtracj elow, chromatografi jonowymienn (jonity: A DEAE/C, K CMC), sczenie na sitach molekularnych oraz chromatografi powinowactwa (z uyciem substratw, pochodnych koenzymw lub barwnikw organicznych, ligandw hydrofobowych). Homogenno biaka (tu enzymu) potwierdza si technik PAGE SDS lub elektroforez dwuwymiarow. Technologii rekombinacji DNA skada si z kilku etapw: sklonowanie genu kodujcego enzym zsekwencjonowanie genu wprowadzenie do wektorw plazmidowych lub fagowych umieszczenie w docelowym genomie. Ostatecznie gen enzymu powinien znale si pod kontrol silnego promotora, najlepiej z moliwoci jego kontroli przez specyficznie chemicznie induktor wwczas podanie tego ostatniego do poywki wzrostowej spowoduje produkcje enzymu w ilociach wielokrotnie wikszych ni naturalnie. Technologia ta moe by stosowana do otrzymywania zmodyfikowanych tzw. fuzyjnych biaek. W tym celu do oryginalnego genu docza si tak sekwencj, aby powstay biakowy produkt by odpowiednim ligandem dla specyficznego nonika w chromatografii powinowactwa, po czym po rozdzieleniu usuwa si dodany fragment (tzw. domen fuzyjn). 2. a) Mechanizmy dziaania enzymw typy reakcji enzymatycznych przy dwch substratach

Cho rozwaania dotyczce reakcji enzymatycznych najprociej jest przedstawi i zrozumie w sytuacji pojedynczy substrat : pojedynczy produkt, to w rzeczywistoci wikszo reakcji obejmuje dwa lub wicej substratw i produktw. Ich liczb okrela si terminami: uni-, bi-, ter-, quad- itd., za rodzaj reakcji ze wzgldu na liczb reagentw przez podanie terminw okrelajcych ilo substratw i produktw. Bardzo czsto spotykane s reakcje typu BiBi, tzn. posiadajce 2 S i 2 P. Mog one zachodzi na kilka sposobw: reakcje cige wszystkie substraty musz poczy si z enzymem, aby uwolniony zosta produkt; inaczej okrela si je jako reakcje pojedynczego zastpienia, gdy grupa ulegajca przeniesieniu przechodzi bezporednio z donora (substratu) na akceptor (produkt) reakcje przypadkowego przyczenia nie ma znaczenia, w jakiej kolejnoci substraty pocz si z enzymem; w ten sposb funkcjonuj pewne dehydrogenazy i kinazy E + S1/2 E-S1/2 + S2/1 E-S1-S2 E-P1-P2 E-P1/2 + P2/1 E + P 1/2 reakcje uporzdkowanego (sekwencyjnego) przyczenia tylko jeden z substratw moe poczy si z enzymem, drugi natomiast czy si z powstaym kompleksem; przyczenie pierwszego substratu indukuje w czsteczce enzymu zmiany konformacyjne, umoliwiajce przyczenie drugiego substraty dziki adekwatnemu ustawieniu grup aktywnych; jako przykad mona poda wiele oksydoreduktaz zalenych od NAD(P)+ E + S1 E-S1 + S2 E-S1-S2 E-P1-P2 E-P1 + P2 E + P1 reakcje typu ping-pong jeden lub wicej produktw uwalnia si od enzymu, zanim jeszcze zostan przyczone wszystkie substraty; s to inaczej reakcje podwjnego zastpienia, poniewa przenoszona grupa ulega wpierw przeniesieniu na enzym (czsto na koenzym), nastpnie odcza si pierwszy produkt, wtedy dopiero przycza si drugi substrat i po doczeniu do przenoszonej grupy powstaje i uwalniany jest drugi produkt; taki mechanizm wystpuje m. in. w transaminazach i chymotrypsynie E + S1 E-S1 E*-P1 E* + P1 E* + S2 E*-S2 E-P2 E + P2 b) mechanizm dziaania chymotrypsyny Chymotrypsyna (CT) jest dobrym przykadem enzymu do opisania oglnych cech katalizy enzymatycznej, poniewa cechuje si stosunkowo prost budow, a take nie wymaga obecnoci koenzymu, grupy prostetycznej ani atomu metalu.

- 29

Chymotrypsyna katalizuje hydroliz wiza peptydowych, w ktrych cz karboksylowa pochodzi od aa aromatycznego (Phe, Tyr, Trp) bd posiadajcego duy niepolarny acuch boczny (Met). Ponadto katalizuje hydroliz niektrych estrw, co nie ma wprawdzie znaczenia biologicznego, lecz pozwala na prowadzenie nad ni bada. Uywanym w eksperymentach substratem jest octan p-nitrofenylu (PNPA), hydrolizowany przez CT do kwasu octowego i p-nitrofenolu ten drugi w zasadowym pH dysocjuje do anionu p-nitrofenolanowego, ktrego poziom moe by oznaczany kolorymetrycznie. Uwalnianie anionu p-nitrofenolanowego jest dwufazowe najpierw ma miejsce faza szybka, a nastpnie powolna, co jest konsekwencj mechanizmu katalizy. W pierwszym etapie CT czy si z PNPA w kompleks, z ktrego jako pierwszy odcza si anion PNP-, za reszta octanowa pozostaje zwizana z enzymem. Oba te etapy zachodz stosunkowo szybko, natomiast hydroliza kompleksu CT-Ac przebiega o wiele wolniej. Szybka faza uwalniania PNP- odpowiada wic przeksztaceniu caej dostpnej CT w kompleks CT-Ac z rwnoczesnym maksymalnym uwolnieniem PNP-, natomiast faza wolna zaley od powolnego rozpadu kompleksu CT-Ac regeneracji wolnej CT, ktra odzyskuje zdolno reagowania z PNPA. Szybko reakcji w pierwszej fazie jest uwarunkowana i proporcjonalna do liczby moli CT w momencie rozpoczcia reakcji. Gwn rol w omawianej katalizie odgrywa reszta Ser 195 z ni wanie poczona jest grupa acetylowa w kompleksie CT-Ac. Chocia CT zawiera a 28 reszt Ser, to jedynie ta w pozycji 195 cechuje si tak wysok reaktywnoci i szczegln funkcj. wiadczy o tym m. in. wynik reakcji z diizopropylofluorofosforanem (DIPP) reszt Ser 195 zostaje wwczas zablokowana, co pozbawia ca czsteczk CT aktywnoci enzymatycznej. Ze wzgldu na szczegln rol wanie reszty Ser w katalizie, CT zaliczana jest do grupy proteaz serynowych. W reakcji o ktrej mowa szczeglne znaczenie maj 3 reszty aa, znajdujce si we wzajemnej bliskoci w sensie przestrzennym, cho zajmuj odlege pozycje w strukturze I-rz. S to: Asp 102, His 57 i wspomniana Ser 195. Znajduj si one w otoczeniu niepolarnego wntrza czsteczki CT. Podczas reakcji Ser 195 ulega acetylacji: zblienie Ac- do grupy hydroksylowej Ser 195 powoduje przeniesienie protonu z Ser 195, poprzez His 57 na Asp 102 przejcie to zwiksza aktywno atomu tlenu grupy hydroksylowej Ser, co konsekwentnie zwiksza szybko reakcji. Z kolei podczas rozpadu CT-Ac protony przekazywane s w przeciwnym kierunku, co pozwala na uwolnienie Ac- i odtworzenie pierwotnej postaci Ser 195. Podobna sekwencja zdarze zachodzi podczas hydrolizy peptydw, stanowicych fizjologiczny substrat CT patrz poniszy rysunek.

Chymomypsyna, podobnie jak wiele innych enzymw, syntetyzowana jest w postaci nieaktywnego prekursora (proenzymu, zymogenu). Przeksztacenie do formy aktywnej nastpuje przez kilkustopniow proteoliz, w trakcie ktrej powstaje miejsce katalityczne oraz ukad przekazywania protonu (por. punkt VI-1-a).

- 30

c)

mechanizm dziaania fruktozo-2,6-bisfosfatazy

W przypadku fruktozo-2,6-bisfosfatazy (grupa fosfohydrolaz) wystpuje nieco bardziej skomplikowany ukad. Miejsce katalityczne obejmuje tu 7 reszt aa triada katalityczna skada si z: His 258, His 392 i Glu 327, natomiast zasadowe (dodatnio naadowane) reszty Arg 257, Arg 307, Arg 352 i Lys 356 stabilizuj ujemnie naadowany substrat. Etapy katalizy: Poczwrny ujemny adunek zwizanego substratu stabilizowany jest przez oddziaywania elektrostatyczne z czterem dodatnio naadowanymi w/w resztami aa. Reszta Glu 327 stabilizuje dodatni adunek reszty His 392. Nukleofilowa reszta His 392 atakuje wizanie C2-{P} reszta fosforanowa zostaje przeniesiona na His 258, fosforylujc enzym oraz powstaje fruktozo-6-fosforan. Czsteczka H2O, z pomoc Glu 327, przeprowadza nukleofilowy atak, rozbijajc wizanie pomidzy reszt fosforanow a enzymem, w wyniku czego uwalnia si fosforan nieorganiczny (Pi), oddziaujcy elektrostatycznie z Arg 257 i Arg 307, a ostatecznie uwalniany. d) mechanizm dziaania transaminaz Transaminazy (aminotransferazy = AT) to enzymy katalizujce przeniesienie grup -aminowych aa na grupy -ketonowe -ketokwasw (pirogronowego, szczawiooctowego lub -ketoglutarowego). Reakcja katalizowana przez AT ma charakter ping-pong, podobnie jak wiele innych reakcji przebiegajcych z udziaem enzymu zawierajcego koenzym (w tym konkretnym przypadku jest to PLP). Dokadny mechanizm patrz punkt VI-2-a. e) kataliza kwasowo zasadowa (k-z)

Gdy substrat zwie si z miejscem katalitycznym, naadowane lub zdolne do naadowania grupy funkcyjne acuchw bocznych aa znajdujcych si blisko substratu mog bra udzia w katalizie, dziaajc jako katalizatory kwasowo zasadowe. Rozrnia si kataliz k-z swoist i ogln; rni si one m. in. kolejnoci przebiegu szybkiego i powolnego etapu reakcji: Swoista kataliza enzymatyczna k-z cechuje si zalenoci szybkoci reakcji od stenia H+, a brakiem zalenoci od stenia innych kwasw lub zasad w roztworze. Jeeli przy staym steniu buforu szybko reakcji zmienia si wraz ze zmian pH, to jest to reakcja swoicie katalizowana przez kwas (pH < 7) lub zasad (pH > 7). Rwnanie opisujce szybko reakcji swoistej katalizy k-z zawiera wycznie wartoci stenia substratu oraz odpowiednio [H+] lub [OH-]. Oglna kataliza enzymatyczna k-z cechuje si zalenoci szybkoci reakcji od ste wszystkich kwasw i zasad w roztworze. Jeeli przy staym pH szybko reakcji zmienia si wraz ze zmian stenia buforu, to jest to oglna kataliza kwasowa (pH < 7) lub zasadowa (pH > 7). f) enzymy wymagajce atomw metali

Wiele (ok. 25 %) enzymw zawiera zwizany atom metalu, niezbdny do ich aktywnoci. Wyrniamy dwa rodzaje pocze enzymu z metalem: metaloenzymy zawieraj okrelon liczb funkcyjnych atomw metalu, nie usuwanych w procesie oczyszczania, enzymy aktywowane przez metale sabiej wi atomy metalu. Jednak bez wzgldu na powinowactwo metalu i enzymu, atomy metali peni podobne funkcje. W katalizie enzymatycznej funkcjonuj trjskadnikowe kompleksy miejsce katalityczne metal substrat, ktre mog by poczone w rnoraki sposb: liniowo z mostkiem przez substrat (E-S-M) w wyniku wyparcia czsteczki wody ze strefy koordynacyjnej metalu przez substrat moe doj do poczenia z enzymem; w przenoszeniu reszty fosforanowej metal peni rol aktywatora atomu fosforu (tego rodzaju poczenia tworzy m. in. wikszo kinaz) z mostkiem przez enzym (M-E-S) metal odgrywa rol strukturaln: utrzymuje aktywn konformacj (np. syntetaza Glu) lub tworzy mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa tu te dodatkowo aktywuje jeden z substratw) z mostkiem przez metal (E-M-S) np. transfosfatazy pirogronianu i PEP, inne enzymy dziaajce na PEP, karboksylazy cyklicznie przez metal (-E-M-S-) Enzymy aktywowane przez metale tworz kompleksy wszystkich czterech w/w typw, natomiast metaloenzymy wszystkie z wyjtkiem E-S-M, gdy ju wyjciowo obecny jest silnie zespolony kompleks

- 31

enzymu z metalem, ktry nie moe by rozdzielony przez substrat. Dany enzym moe tworzy rne typy kompleksw, w zalenoci od substratu. W wielu biakach reszt aa wic metal jest His, np. karboksypeptydaza A, fosfataza zasadowa (ALP), kinaza biakowa C (PKC), rubredoksyna, hemoproteiny. Metale mog peni bardzo rnorodne funkcje w katalizie oraz bra udzia we wszystkich mechanizmach zwikszania szybkoci reakcji, tj.: oglnej katalizie kwasowo zasadowej, katalizie kowalencyjnej, zblieniu reagujcych czstek oraz indukcji zmian strukturalnym w obrbie enzymu lub substratu. Do najczciej zwizanych z kataliz metali nale: elazo, magnez, kobalt (w postaci kobalaminy) oraz mangan. Zwaszcza elazo i mangan mog wystpowa na rnych stopniach utlenienia i bra udzia w katalizie reakcji redox; zazwyczaj wystpuj wwczas w specyficznych grupach prostetycznych, jak np. hem (patrz punkt I-3-e) czy centra elazo-siarkowe (patrz punkt III-5). Odnonie rnorodnej funkcji atomw metali w katalizie mog one: uczestniczy w tworzeniu pary elektronowej wizania , gromadzi i zblia substraty, suy jako trjwymiarowa matryca do ustawiania grup zasadowych enzymu lub substratw w okrelonej pozycji, aktywowa grupy elektro- lub nukleofilowe (oglna kataliza k-z), same funkcjonowa jako nukleofile, maskowa grupy nukleofilowe i przez to kierowa reakcj na waciwy tor, indukowa zmiany konformacyjne w obrbie enzymu lub substratu. 3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

Wiele informacji dotyczcych kinetyki reakcji katalizowanych przez enzymy jest prawdziwych i wywodzi si z zasad kinetyki reakcji nieenzymatycznych, dlatego najpierw przypomniane i omwione zostan oglne reguy kinetyki chemicznej, a nastpnie pewne wyjtkowe i charakterystyczne dla przemian z udziaem enzymw. a) oglne zasady kinetyki reakcji chemicznych

Reakcje chemiczne moemy oglnie podzieli na nieodwracalne i odwracalne. Do pierwszej grupy zaliczymy te, podczas ktrych w rodowisku powstaj wycznie produkty. Przyjmuje si, e tego typu reakcje zachodz do koca. Jako przykad poda mona reakcje zobojtniania oraz te, w wyniku ktrych wytrca si nierozpuszczalny osad, wydziela si gaz lub powstaje saby elektrolit. Reakcje odwracalne to takie, podczas ktrych gromadzce si w rodowisku produkty reaguj ze sob i odtwarzaj substraty. W rodowisku reakcji oprcz produktw wystpuj nieprzereagowane substraty. Reakcje tego typu nie zachodz do koca. Jako przykad poda mona dysocjacj sabych elektrolitw lub hydroliz soli. Wikszo obserwowanych w przyrodzie reakcji naley do grupy odwracalnych. Oznacza to, i mwimy w ich przypadku o wystpowaniu pewnego stanu rwnowagi. Oglnie pod pojciem rwnowagi rozumiemy ustalony stan jakiego zjawiska. Wyrniamy rwnowag statyczn i dynamiczn. Pierwsza wystpuje w sytuacji, gdy adne procesy w rodowisku nie zachodz, a stenia reagentw nie zmieniaj si w czasie. Rwnowaga dynamiczna to stan, w ktrym przemiany chemiczne co prawda zachodz, jednak tyle samo substratw przechodzi w produkty co produktw w substraty. W stanie rwnowagi dynamicznej szybko danej reakcji oraz reakcji do niej odwrotnej s sobie rwne, a stenia reagentw ustalaj si na stay poziomie. Procesy biologiczne wystpuj w stanie rwnowagi dynamicznej wci istnieje konkurencja przemiany danej i do niej odwrotnej, miedzy ktrymi ustala si dynamiczna rwnowaga. Jak wspomniano, reakcje odwracalne mog teoretycznie przebiega w dwie strony. O tym za, w ktr stron reakcja rzeczywicie przebiega, decyduje warto wieloci zwanej energi swobodn (G) danej reakcji. Innymi sowy energia swobodna okrela samorzutno przebiegu oraz stan rwnowagi reakcji. Energia swobodna jest funkcja stanu, co oznacza, i nie zaley ona od sposobu, w jaki przemiana zachodzi, lecz jedynie od pocztkowego i kocowego stanu ukadu. Oznacza to tym samym, i nie zaley ona od iloci i jakoci wystpujcych w przebiegu reakcji stanw porednich, co bdzie miao istotne znaczenie przy katalizie enzymatycznej. Energia swobodna powizana jest z innymi funkcjami stanu charakteryzujcymi reakcj chemiczn, tj. z entalpi i entropi. Entalpi reakcji (H) nazywamy jej efekt cieplny, zachodzcy pod staym cinieniem. Na podstawie I zasady termodynamiki wyraa si ona nastpujco: H=U+pV, gdzie U oznacza zmian energii wewntrznej, pV za prac objtociow (zmiana iloci gazu o 1 mol jest rwnoznaczna z wykonaniem pracy ok. 2,6 kJ). Pojcie entalpii tumaczy zachodzenie procesw ezgoergicznych. Z kolei entropia (S) jest miar rozkadu energii w ukadzie. Wszystkie ukady d do zapewnienia moliwie najwikszej rnorodnoci sposobw podziau energii midzy drobiny oraz poszczeglne rodzaje form jej gromadzenia. Pojcie entropii tumaczy zachodzenie procesw endoergicznych, zachodzenie reakcji w ukadach izolowanych oraz samorzutne mieszanie si gazw.

- 32

Zmiany funkcji stanu w wyniku przebiegu reakcji chemicznej czy ze sob rwnanie GibbsaHelmholtza: G=H-TS. Ukady biologiczne d do zmniejszenia energii wewntrznej (H<0) oraz wzrostu wewntrznego nieuporzdkowania (S>0), co w efekcie daje G<0 stan taki oznacza reakcj samorzutn. Przez analogi G=0 oznacza ustalenie si stanu rwnowagi w ukadzie, za 4G>0 zachodzenie reakcji wymuszonej. Wartoci i znaki funkcji stanu opisuj samorzutno reakcji, nie mwi jednak nic o szybkoci jej przebiegu. Miar szybkoci reakcji jest szybko pojawiania si produktw i jednoczesnego ubytku substratw w rodowisku: v=dc/dt. Szybko zaley od pocztkowego stenia substratu: v~c0. Po wprowadzeniu wspczynnika proporcjonalnoci: v=kc0 (wspczynnik k nazywamy sta szybkoci reakcji). Z porwnania powyszych zalenoci wynika, i szybko reakcji maleje wykadniczo jest najwiksza na pocztku i stopniowo, zrwnujc si z szybkoci reakcji odwrotnej, co ma miejsce w chwili osignicia stanu rwnowagi. Dla wikszej iloci reagentw wyraenia opisujce szybko reakcji powikszaj si o iloczyn odpowiednich ste: AB v = k[A] A+AB v = k[A][A]=k[A]2 aAB v = k[A]a Oglnie dla modelowej reakcji odwracalnej: aA + bB cC + dD wyraenia opisujce szybkoci reakcji przyjmuj posta: v1=k1[A]a[B]b i v2=k2[C]c[D]d. Poniewa w stanie rwnowagi szybko reakcji danej i przeciwnej jest rwna (v1=v2), zatem: k1/k2 = [C]c[D]d/[A]a[B]b = const. Wynik tego przeksztacenia interpretuje prawo dziaania mas Guldberga-Waagego: w stanie rwnowagi chemicznej iloczyn ste (cinie) reagentw w wykadnikach potgowych ich wspczynnikw stechiometrycznych jest wielkoci sta dla danej reakcji i w okrelonej temperaturze i nazywan sta rwnowagi reakcji (steniow Kc lub cinieniow Kp, przy czym w praktyce czciej posugujemy si t pierwsz). Pomidzy staymi rwnowagi tej samej reakcji zachodzi zaleno: Kp=Kc(RT)n, gdzie: R staa gazowa, T temperatura bezwzgldna, n przyrost liczby moli produktw gazowych w czasie reakcji. Staa rwnowagi jest wielkoci chemiczn charakteryzujc ilociowo stan rwnowagi dynamicznej reakcji odwracalnej. Jej wielko nie zaley od ste reagentw, a jedynie od temperatury, zmieniajc si w sposb zaleny od efektu energetycznego reakcji. Energia swobodna reakcji zwizana jest z jej sta rwnowagi zalenoci: G = -RTlnKc. Jeeli wic reakcja jest samorzutna, czyli G<0, to Kc >1 rwnowaga przesunita jest w stron produktw. Analogicznie dla G=0 Kc=1, za dla G>0 Kc<1, czyli rwnowaga przesunita jest w stron substratw (reakcja przebiega odwrotnie). Powysze rwnanie jest uniwersalne; w przypadku ukadw redox pozwala ono na wyprowadzenie rwnania Nernsta. b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki wpywajce na szybko reakcji enzymatycznej Udzia enzymw w reakcji chemicznej dostarcza jej alternatywnych stanw porednich. Inaczej mwic enzymy obniaj barier energetyczn reakcji. Nie wpywaj one jednak na energi swobodn, ktra zaley przecie tylko od stanu pocztkowego i kocowego. Enzymy, ani te inne katalizatory, nie s w stanie wpyn na kierunek ani zmieni staej rwnowagi reakcji. Wida to wyranie po rozpisaniu rwna na stae rwnowagi: bez enzymu: A + B C + D, Kc1=[C][D]/[A][B], z enzymem: A + B + Enz ... C + D + Enz, Kc2=[C][D][Enz]/[A][B][Enz]=[C][D]/[A][B]=Kc1. Szybko reakcji katalizowanej enzymatycznie zalena jest od wielu czynnikw. Nale do nich: temperatura, odczyn rodowiska (pH), stenie enzymu, stenie substratu oraz brak lub obecno inhibitorw. Wraz ze wzrostem temperatury wzrasta szybko reakcji katalizowanej enzymatycznie, ale tylko w cile ograniczonym zakresie temperatury. Szybko reakcji pocztkowo si zwiksza, wraz ze wzrostem temperatury, z powodu zwikszania energii kinetycznych reagujcych czsteczek. Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barier energetyczn sabych wiza wodorowych i hydrofobowych, ktre utrzymuj jego struktur II- i III-rzdow. W tej temperaturze denaturacji dominuje towarzyszca strceniu biaka utrata aktywnoci katalitycznej enzymu. Zakres temperatury, w ktrym enzym utrzymuje stabiln katalitycznie kompetentn konformacj zaley zazwyczaj od temperatury komrek, w ktrych wystpuje i umiarkowanie j przekracza. Enzymy organizmu ludzkiego, ktrego temperatura wynosi ok. 37oC, zachowuj zazwyczaj stabilno do temperatury 45-55oC. Gdy aktywno enzymu zmierzy si w kilku wartociach pH, obserwuje si, e optymalna aktywno mieci si na og midzy wartociami pH 5-9, niemniej kilka enzymw, np. pepsyna, jest aktywnych przy wartociach pH wyranie wykraczajcych poza ten zakres. Ksztat krzywych wyraajcych zaleno aktywnoci od pH okrelaj czynniki takie jak: denaturacja enzymu przy maych i duych

- 33

wartociach pH oraz zmiany adunku enzymu i / lub substratw. W przypadku enzymu odczyn moe wpywa na jego aktywno przez zmian struktury lub przez zmian adunku reszty aa, biorcej udzia w przyczeniu substratu lub w katalizie. Aby to zilustrowa naley wzi od uwag ujemnie naadowany enzym E- reagujcy z dodatnio naadowanym substratem SH+: E- + SH+ ESH. Przy niskim pH enzym dy do przyczenia protonu i traci swj adunek ujemny: E- + H+ EH. Przy wysokim pH substrat jonizuje i traci swj adunek dodatni: SH+ S + H+. Poniewa jedynymi formami, ktre mog wchodzi w interakcje s SH+ i E-, kracowe wartoci pH bd zmniejszay skutecznie stenie E- i SH+, zmniejszajc w ten sposb szybko reakcji. Szybko pocztkowa jest proporcjonalna do stenia enzymu. Szybko pocztkowa reakcji jest to szybko mierzona przed utworzeniem dostatecznej iloci produktu, pozwalajcej na zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybko pocztkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna do stenia enzymu. Naley jednak podkreli, i stwierdzenie to odnosi si tylko do szybkoci pocztkowej. wpyw stenia substratu na szybko reakcji

c)

Jeeli zwiksza si stenie substratu ([S]), a wszystkie inne warunki pozostaj niezmienione, to mierzona szybko pocztkowa v zwiksza si do wartoci maksymalnej vm i nie przekracza jej. Szybko reakcji zwiksza si wraz ze zwikszaniem stenia substratu a do momentu, gdy enzym jest nasycony substratem. Mierzona szybko pocztkowa osignie warto maksymaln i nie ma na ni wpywu dalsze zwikszanie substratu, poniewa substrat wystpuje w duym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu. Stenie substratu, ktre powoduje osignicie poowy szybkoci maksymalnej, zwane jest sta Michaelisa (Km). Mona j oznaczy dowiadczalnie przez graficzne przedstawienie zalenoci V od [S] (rysunek poniej). Km ma wymiar stenia molowego.

Powysza krzywa jest wykresem tzw. rwnania Michaelisa-Menten, ktre ma posta:

Opisuje ono zachowanie si wielu enzymw przy zmieniajcym si steniu substratu. Na jego podstawie zaleno pocztkowej szybkoci reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od Km mona przedstawi nastpujco: gdy [S] Km dodanie [S] do Km w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego warto, tak e wyraenie [S] mona w mianowniku pomin; poniewa vm i Km s stae, mona ich stosunek zastpi now staa K:

Innymi sowy, jeeli stenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, ktre jest wymagane do uzyskania poowy szybkoci maksymalnej, to szybko pocztkowa zaley od stenia substratu.

- 34

gdy [S] = Km:

Oznacza to, i jeeli stenie substratu jest rwne wartoci Km, to szybko pocztkowa rwna si poowie szybkoci maksymalnej. Wskazuje to take jak oznaczy Km, a mianowicie trzeba okreli dowiadczalnie stenie substratu, przy ktrym pocztkowa szybko stanowi poow wartoci maksymalnej. gdy [S] Km dodanie Km do [S] w mianowniku zmienia jego warto bardzo niewiele, tak e wyraenie Km mona w mianowniku pomin:

Oznacza to, e jeeli stenie substratu znacznie przewysza warto Km, to szybko pocztkowa jest szybkoci maksymaln. Bezporedni pomiar liczbowej wartoci vm i obliczenie Km czsto wymaga trudnych do uzyskania w praktyce wysokich ste substratu, aby w laboratorium osign warunki nasycenia. Aby omin t przeszkod, stosuje si liniow form rwnania Michaelisa-Menten, ktra pozwala atwo ekstrapolowa vm i Km z szybkoci reakcji mierzonych przy mniejszych ni nasycajce steniach substratu. Rwnanie M-M przeksztaci mona nastpujco:

Jest to rwnanie prostej y=ax+b, gdzie y=1/v, za x=1/[S]. Jeeli y lub 1/v jest wykrelony jako funkcja x lub 1/[S], to b=1/vm na osi y, a kt nachylenia a=Km/vm. Ujemny odcinek na osi x mona okreli przez przyjcie y=0. Wtedy: x=-b/a=-1/Km.

Wykres taki nazywamy wykresem podwjnych odwrotnoci lub wykresem Lineweavera-Burka. Z jego pomoc mona okreli Km wykorzystujc albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y albo odcinek na ujemnej czci osi x. Technika podwjnych odwrotnoci wymaga stosunkowo niewielu punktw dla okrelenia Km i jest metod najczciej uywan do wyznaczania Km. Innym podejciem do dowiadczalnego wyznaczenia Km i vm jest podejcie Eadie i Hofstee. Rwnanie M-M moe by przeksztacone w nastpujcy sposb:

Aby wyznaczy Km i vm, wykrela si v/[S] (o y) wobec v (o x). Miejsce przecicia osi y wyznacza wwczas vm/Km, a miejsce przecicia osi x vm. Nachylenie wynosi 1/Km.

- 35

d) zjawisko kooperatywnoci Pewne enzymy i inne biaka przyczajce ligandy, takie jak hemoglobina, nie dziaaj zgodnie z klasyczn kinetyk nasycenia M-M. Jeeli prdko wykreli si wzgldem stenia substratu, to krzywa nasycenia ma ksztat sigmoidalny (jak rozcignita litera S) rysunek niej.

Oglnie wskazuje to na kooperatywne przyczenie substratu do licznych miejsc. Przyczenie w jednym miejscu wpywa na przyczenie w innych miejscach. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu substratem omwione powyej metody graficznej oceny stenia substratu, ktre powoduje osignicie poowy szybkoci maksymalnej, s bezuyteczne z powodu braku linii prostych. Aby oceni tak kinetyk nasycenia, mona wykorzysta graficzne przedstawienie rwnania Hilla wyprowadzonego pierwotnie, aby opisa kooperatywne przyczenie O2 do Hb. W formie linii prostej ma ono posta nastpujc:

, gdzie k jest staa zoon. Z rwnania wynika, e gdy [S] k, to szybko reakcji zwiksza si jak n-ta potga [S]. Na kolejnym rysunku przedstawiono wykres Hilla danych kinetycznych dla enzymu z kinetyk wizania kooperatywnego. Wykres v / (vm v) wzgldem log [S] daje lini prost o nachyleniu n, gdzie n jest parametrem empirycznym, ktrego warto zaley od liczby miejsc wicych substrat oraz liczby i typu interakcji midzy nimi. Gdy n=1, miejsca wizania dziaaj niezalenie jedno od drugiego. Jeeli n>1, to miejsca s kooperatywne i przy wikszej wartoci n kooperatywno jest silniejsza, a wwczas kinetyki nasycenia s bardziej sigmoidalne. Jeeli n<1, wwczas miejsca wykazuj negatywna kooperatywno. W poowie szybkoci maksymalnej: v=vm/2, wic: v / (vm v) = 1, czyli: log v / (vm-v) = 0. Aby zatem wyznaczy S50 (stenie substratu, przy ktrym szybko reakcji osiga poow szybkoci maksymalnej) naley wykreli lini prostopad do osi x z punktu, w ktrym log v / (vm v) = 0.

e)

inhibicja odwracalna i nieodwracalna

Do czynnikw modyfikujcych szybko zachodzenia reakcji enzymatycznej naley rwnie obecno inhibitora. Inhibitory dzielimy ze wzgldu na to, czy hamowanie ustpuje czy nie w wyniku zwikszenia stenia substratu, na kompetycyjne i niekompetycyjne. Podzia ten jest o tyle utrudniony, o ile wiele inhibitorw nie wykazuje idealnych waciwoci czysto nie- lub kompetycyjnych. Innym sposobem klasyfikowania inhibitorw jest podzia wedug ich miejsca dziaania. Niektre z nich wi si z enzymem w

- 36

tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne), inne za cz si z dla od miejsca katalitycznego (miejsca allosteryczne). Klasyczne hamowanie kompetencyjne zachodzi w miejscu wizania substratu (katalitycznym). Chemiczna struktura inhibitora, analogu substratu (I), oglnie przypomina budow substratu. czy si on zatem odwracalnie z enzymem, tworzc kompleks enzym-inhibitor (EI), a nie kompleks ES. Gdy jest obecny zarwno substrat, jak i ten typ inhibitora, wwczas wspzawodnicz one ze sob o te same miejsca wizania w enzymie. Klasycznym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para malonian (I) i bursztynian (S) w stosunku do dehydrogenazy busztynianowej. Enzym ten katalizuje tworzenie fumaranu przez usunicie po jednym atomie wodoru z kadego atomu -wgla bursztynianu. Malonian moe czy si z dehydrogenaz, tworzc kompleks EI. Nie moe on ulec odwodornieniu, gdy nie ma adnego sposobu, aby usun nawet jeden atom wodoru z pojedynczego atomu wgla bez utworzenia piciowartociowego atomu wgla. Jedyn reakcj, ktrej moe podlega kompleks EI jest powtrny rozpad na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji rozpadu okreli mona rwnowagi Ki=[E][I]/[EI]. Inhibitory kompetycyjne nie zmieniaj szybkoci reakcji enzymatycznej, wpywaj natomiast na sta Km. Wykresy L-B dla tej samej reakcji bez inhibitora oraz z inhibitorem kompetycyjnym bd przecinay o y w tym samym miejscu, rny natomiast bdzie odcinek po ujemnej stronie osi x. To ostatnie ma warto: 1/x=Km(1+[I]/Ki), gdzie Ki jest obliczon wczeniej sta szybkoci hamowanej reakcji.

W hamowaniu niekompetycyjnym nie wystpuje konkurencja midzy S a I. Inhibitor zazwyczaj nie wykazuje adnego albo mae podobiestwo wobec substratu i mona przyj, e wie si z inna domen enzymu. Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszaj szybko maksymaln, osigaln przy danej iloci enzymu, ale zazwyczaj nie wpywaj na Km. Poniewa I i S mog si czy w rnych miejscach, jest moliwe tworzenie zarwno kompleksw EI, jak i EIS. Poniewa EIS moe si rozpa, tworzc produkt z mniejsz szybkoci ni ES, reakcja moe by spowolniona, ale nie zatrzymana. Wykresy L-B dla tej samej reakcji bez inhibitora oraz z inhibitorem niekompetycyjnym bd miay taki sam odcinek po ujemnej stronie osi x, natomiast bd przecinay o y w rnych miejscach zalenie od powinowactwa S wzgldem E oraz EI.

Aktywno enzymatyczn cakowicie blokuj dziaajce na enzymy trucizny, np. jodoacetamid, jony metali cikich (Ag+, Hg2+), czynniki utleniajce itd. Te inhibitory zazwyczaj powoduj chemiczn modyfikacj aminokwasw w enzymie, co odgrywa istotn rol w katalizie. Proces ten nie jest atwo odwracalny ani poprzez usunicie pozostaoci wolnego inhibitora, ani przez wzrost stenia substratu. Inhibitory takie czsto nie wykazuj strukturalnego podobiestwa do substratu. Niemniej, kiedy miejsce ataku chemicznego znajduje si w obrbie miejsca katalitycznego, obecno substratu lub produktu czsto wywiera ochronny wpyw przez blokowanie lub spowalnianie dostpu inhibitora do odpowiedniego aminokwasu.

- 37

4.

Regulacja aktywnoci enzymw

Aktywno katalityczna enzymu zaley od dwch czynnikw, tj. od iloci tego enzymu oraz od jego sprawnoci katalitycznej. a) Ilo enzymu determinowana jest rwnowag pomidzy jego syntez a rozkadem. Oba te procesy zachodz rnymi drogami oraz podlegaj odmiennej i niezalenej regulacji (por. dalej). Modyfikacja syntezy i/lub degradacji jest powoln metod regulacji, ze wzgldu na zoono i wieloetapowo procesu syntezy biaka. Synteza enzymu jest reakcj na obecno swoistych drobnoczsteczkowych induktorw na og, cho nie zawsze, s to substraty enzymw podlegajcych indukcji, mog to by rwnie zwizki przypominajce budow substrat tzw. induktory gratisowe. Enzymy podlegajce tej formie kontroli okrela si jako indukowalne, za te posiadajce sta i niezmienn aktywno jako konstytucyjne. Jeden enzym (aktywno katalityczna) moe posiada zarwno izoenzymy indukowalne, jak i konstytutywne. Do grupy enzymw indukowalnych nale m. in.: 2,3-dioksygenaza tryptofanowa, dehydrataza treoninowa, transaminaza tyrozyna : -ketoglutaran, -D-fruktofuranozydaza, enzymy cyklu mocznikowego, reduktaza HMG-CoA, cytochrom P450 (CYP), syntaza tlenku azotu izoenzym i (iNOS). Synteza enzymw moe by hamowana ulega represji przez obecno w rodowisku reakcji jej produktu. Zarwno indukcja, jak i represja, przebiega przy udziale elementw cis, tj. specyficznych sekwencji DNA obecnych po stronie 5 genu kodujcego dany enzym oraz biaek regulujcych, tj. czynnikw trans. Ponadto okrelone metabolity mog stanowi korepresory lub koinduktory, ktre przez wizanie a czynnikami trans mog modulowa ich oddziaywanie z elementami cis. Due wewntrzkomrkowe stenie niektrych metabolitw (np. aa, zasady azotowe) blokuje syntez elementw biorcych udzia w ich wasnej biosyntezie. Po obnieniu tego stenia enzym powraca do pierwotnej aktywnoci ulega odblokowaniu, czyli derepresji. Powyszy mechanizm odnosi si do represji na zasadzie sprzenia zwrotnego za pomoc produktu (por. operon tryptofanowy u bakterii). Innym modelem regulacji jest represja za pomoc katabolitu, polegajca na represji syntezy enzymw katalizujcych reakcje kataboliczne pod wpywem zwizkw porednich, powstajcych w tych reakcjach (por. operon galaktozowy u bakterii). Degradacja enzymw, podobnie jak synteza, jest swoicie regulowana wraliwo biaek enzymatycznych na proteoliz zaley m. in. od obecnoci substratw, koenzymw lub jonw metali. Np. synteza arginazy nasila si po spoyciu posiku, a degradacja maleje w trakcie godzenia (wypadkowo ilo enzymu ronie w obu przypadkach, cho s to inne mechanizmy regulacji). Podobnie jest w przypadku 2,3-dioksygenazy (pirolazy) tryptofanowej kortykosteroidy zwikszaj jej syntez, za Trp spowalnia jej degradacj przez obnienie wraliwoci na proteoliz.

b) Aktywno katalityczna enzymu moe by regulowana w rny sposb poprzez odwracalne wizanie ligandw (regulacje allosteryczne) lub zmian wiza kowalencyjnych (modyfikacje kowalencyjne). Jest to o wiele szybszy sposb regulacji w porwnaniu z wpywem na syntez / rozkad enzymu. Aktywno enzymw regulacyjnych, tj. kluczowych dla danego szlaku metabolicznego, jest modulowana za pomoc maoczsteczkowych efektorw allosterycznych, na og niepodobnych ani do substratw ani koenzymw danego enzymu. Hamowanie aktywnoci enzymu szlaku biosyntezy przez kocowy produkt tego szlaku to tzw. hamowanie przez sprzenie zwrotne, a ten produkt to ujemny efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny. Wie si on zwykle z miejscem allostercznym enzymu, ktre nie pokrywa si z miejscem katalitycznym. Kinetyka hamowania przez sprzenie zwrotne moe mie charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, czciowo kompetycyjny lub inny. Mechanizm ten wystpuje najczciej jako regulacja szlakw biosyntezy, a inhibitorem zwrotnym jest ostatni zwizek drobnoczsteczkowy szlaku, stanowicy substrat do syntezy zwizkw wielkoczsteczkowych (np. aa i synteza biaek, nukleotydy i synteza kwasw nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzenie zwrotne dotyczy etapu kontrolujcego (limitujcego), charakterystycznego wycznie dla danego szlaku biosyntezy. W przypadku szlakw rozgazionych czyli gdy pocztkowe reagenty su do syntezy kilku zwizkw ostatecznych enzymy tego szlaku znajduj si pod zoonym wpywem zarwno metabolitw porednich, jak i ostatecznych, za same mechanizm regulacji potrafi by bardzo skomplikowane. Hamowanie przez sprzenie zwrotne moe mie w szlakach rozgazionych charakter:

- 38

kumulatywny gdy hamujcy wpyw 2 produktw kocowych jest sum skutkw wywoywanych przez kady z tych produktw niezalenie, zgodny czyli wielowartociowy jeli cakowite zahamowanie aktywnoci enzymu wystpuje tylko wtedy, gdy jednoczenie 2 produkty kocowe wystpuj w nadmiarze, kooperatywny gdy pojedynczy produkt kocowy hamuje enzym regulujcy, za efekt inhibicji przez 2 nadmiarowe produkty przewysza sum efektw niezalenego dziaania kadego z nich. Brak podobiestwa w budowie substratw i regulatorw allosterycznych sugeruje, i substancje te wi si z rnymi miejscami enzymu odpowiednio z katalitycznymi i allosterycznymi. Z tego powodu enzymy takie okrelamy jako enzymy allosteryczne. O niezalenoci miejsc wizania wiadczy m. in. fakt, i utrata wraliwoci na efektory allosteryczne nie musi by jednoznaczna z utrat aktywnoci katalitycznej. Ponadto efektory allosteryczne potrafi chroni miejsce katalityczne przed denaturacj skuteczniej od samych substratw, co trudno byoby wyjani, gdyby przyj ich wsplne miejsce wizania. W pewnych enzymach miejsca katalityczne i allosteryczne zlokalizowane s na rnych podjednostkach biaka oligomerycznego. Enzymy katalizujce t sam reakcj (lub typ reakcji) potrafi posiada rne efektory allosteryczne w rnych komrkach. Enzymy allosteryczne dzieli si na grupy tzw. seri K i V. Te pierwsze cechuj si kompetycyjn kinetyk nasycenia substratem wzrasta KM, a Vm pozostaje bez zmian. W przypadku drugiej grupy efektor allosteryczny zmniejsza Vm, nie wpywajc na KM. Zmiany obydwu parametrw wynikaj prawdopodobnie ze zmian konformacyjnych w miejscu katalitycznym dla serii K moe to spowodowa osabienie wizania z substratem, dla V zmian przestrzennej orientacji lub adunkw reszt aa centrum katalitycznego. Aktywno enzymw podlega nadrzdnej regulacji hormonalnej i nerwowej (tzw. przekanikw I rzdu), ktre to bodce mog pobudza syntez lub uwolnienie gotowych ju efektorw allosterycznych (tzw. przekanikw II rzdu). Regulacja aktywnoci enzymw przez kowalencyjne modyfikacje ich czsteczek moe mie charakter odwracalny lub nie w pierwszym przypadku mwimy o odwracalnej fosforylacji, w drugim za o swoistej ograniczonej proteolizie (jest to metoda nieodwracalna, gdy nie ma moliwoci ponownej resyntezy raz zhydrolizowanych wiza peptydowych). Wiele biaek syntetyzowanych jest w formie nieaktywnych prekursorw probiaek; w przypadku enzymw s to proenzymy (inaczej zymogeny). Nadanie im waciwej postaci, w ktrej mog wykazywa sw aktywno, odbywa si drog swoistej hydrolizy pewnych wiza peptydowych (proteolizy). W procesie tym acuch polipeptydowy moe traci sw cigo produkty proteolizy mog zosta na stae rozdzielone, bd utrzymywane w caoci dziki istnieniu wiza dwusiarczkowych. Rwnie nie wszystkie reszty aa obecne w probiaku musz znale si w jego formie ostatecznej niektre z powstaych peptydw mog ulec odrzuceniu jako nieaktywne biologicznie. Mog one mie jednak du warto diagnostyczn, gdy ich poziom koreluje z iloci synetyzowanego endogennie probiaka np. oznaczanie peptydu C w cukrzycy czy NT-proBNP w niewydolnoci krenia. Podstawow konsekwencj swoistej proteolizy jest uzyskanie przez biako nowej konformacji, co w przypadku enzymw oznacza odsonicie miejsca katalitycznego. Synteza probiaek ma istotne znaczenie fizjologiczne w takiej formie syntetyzowane s biaka wykorzystywane przez organizm jedynie czasowo w razie potrzeby; wwczas jednak s one potrzebne natychmiast, wobec czego synteza de novo z aa trwaaby zbyt dugo do tego czasu albo minoby zapotrzebowanie na dane biako, albo doszoby do uszkodzenia komrek i synteza okazaaby si spniona. Ponadto pewne reakcje zachodzce z udziaem biaek wymagaj precyzyjnej koordynacji czasowej. Inn przyczyn syntezy proenzymw jest ochrona syntetyzujcej je tkanki przed samostrawieniem (np. przedwczesna aktywacja zymogenw hydrolaz trzustkowych jest elementem patogenezy ostrego zapalenia tego narzdu). Do biaek syntetyzowanych w formie prekursorw zalicza si: insulin, pepsyn i proteazy trzustkowe trypsyn, chymotrypsyn, elastaz, karboksypeptydaz (patrz punkt VI-1-a), kolagen (patrz punkt VII-8-b) oraz niektre czynniki krzepnicia krwi (patrz punkt VII-4-e). Czsteczki biaek mog podlega rnorodnym modyfikacjom kowalencyjnym czy to w celu zmiany ich struktury (glikozylacja, hydroksylacja, acylacja), czy te regulacji ich aktywnoci (metylacja, ADPrybozylacja, fosforylacja). Najczciej spotykanym mechanizmem jest tu odwracalna fosforylacja. Reakcje fosforylacji biaek katalizowane s przez enzymy kinazy biaek (biakowe), ktre przenosz grup -fosforanow z ATP na reszty aa zawierajce grupy hydroksylowe, tj. Ser, Thr lub Tyr; bardzo rzadko w przyrodzie modyfikacji tej podlegaj reszty His, Lys, Arg czy Asp. Zasadniczo reakcje dotycz reszt aa odlegych o miejsca katalitycznego, std miejsca fosforylacji mog by uznawane za pewn form miejsc allosterycznych. Reszta fosforanowa moe zosta odczona w wyniku hydrolizy, katalizowanej przez fosfatazy biaek. Typowa komrka ludzka posiada tysice biaek podlegajcych

- 39

regulacji przez odwracaln fosforylacj oraz kilkaset odpowiednich kinaz i fosfataz wiadczy to o prostocie i uytecznoci tego mechanizmu, std te jest on najczciej spotykanym. Reszty fosforanowe s bardzo skutecznymi modyfikatorami struktury III-rzdowej i funkcji biaek, m. in. dziki obecnoci adunku elektrycznego (-2 w fizjologicznym pH) oraz tworzeniu wiza jonowych w resztami Arg. Fosforylacja moe zmienia sprawno katalityczn, powinowactwo do substratu, lokalizacj wewntrzkomrkow lub wraliwo na efektory allosteryczne. Jedne biaka wykazuj wiksz aktywno w formie ufosforylowanej, podczas gdy inne w zdefosforylowanej. Nie wszystkie biaka podlegaj odwracalnej fosforylacji; podobnie w biakach fosforylowanych nie ulegaj tej reakcji wszystkie dostpne grupy hydroksylowe. Oglnie biaka mog by fosforylowane w rnych miejscach i przez rne kinazy (por. regulacja syntazy glikogenowej punkt IV-5-c), z kolei poszczeglne kinazy i fosfatazy modyfikuj zazwyczaj wicej ni jedno biako, same podlegajc regulacji przez przekaniki II rzdu lub rwnie odwracaln fosforylacj. W ten sposb mog powsta regulacyjne kaskady kinaz / fosfataz, w ktrych jedne enzymy uaktywniaj lub pozbawiaj aktywnoci kolejne, podczas gdy ostatni modyfikuje aktywno waciwego biaka o aktywnoci enzymatycznej (por. regulacja reduktazy HMG-CoA punkt V-8-a; jeszcze lepiej jest to widoczne na przykadzie kinaz aktywowanych mitogenami MAPK). Pewne kinazy, same modyfikowane przez odwracaln fosforylacj, posiadaj zdolno fosforylacji wasnych miejsc allosterycznych (tzw. autofosforylacji) i zmiany swojej aktywnoci (np. kinaza tyrozynowa receptora insulinowego patrz punkt IV-8-b). W opisany wyej sposb powstaj zoone systemy przekanikw I i II rzdu, kinaz i fosfataz, miejsc fosforylacji i modyfikacji allosterycznych oraz ostatecznie efektw fosforylacji odpowiednich biaek, umoliwiajce szybk i precyzyjn regulacj czynnoci komrek, a przez to adekwatn odpowied ustroju na dziaanie czynnikw zewntrznych. Odwracalne fosforylacje reguluj przepyw metabolitw w organizmie, kierujc substraty w kierunku szlakw syntezy zwizkw aktualnie najbardziej potrzebnych oraz synchronizujc anabolim i katabolizm okrelonych grup substancji. Uproszczona klasyfikacja kinaz biakowych: rodzina kinaz serynowo-treoninowych kinaza biakowa A (PKA) zalena od cAMP kinaza biakowa G (PKG) zalena od cGMP kinaza biakowa C (PKC) zalena od Ca2+ i DAG kinaza biakowa CaM zalena od Ca2+/kalmoduliny kinazy zalene od cyklin (CDK) kinazy aktywowane mitogenami (MAPK) inne: kinaza biakowa B (PKB, Akt1), kinaza zal. od AMP (AMPK), kinazy syntazy glikogenowej (GSK) rodzina kinaz tyrozynowych receptorowe kinazy Tyr, stanowice integraln cz receptorw katalitycznych, np. receptora insulinowego czy dla czynnikw wzrostowych (PDGF, EGF, IGF-1) cytoplazmatyczne kinazy Tyr (Abl, src) kinazy mieszane tzw. o podwjnej specyficznoci 5. Znaczenie diagnostyczne pomiarw aktywnoci enzymw

Diagnostyka enzymatyczna ma praktyczne zastosowanie w chorobach wtroby, serca, trzustki, mini, krwi, koci oraz w schorzeniach nowotworowych. Kada tkanka jest wyposaona w swoisty dla siebie zestaw enzymw w przypadku uszkodzenia lub zaburzenia funkcji danego narzdu enzymy w nim wystpujce uwalniane s do krwiobiegu. Stopie zwikszenia aktywnoci enzymatycznych i czas ich utrzymania si w surowicy zaley od: nasilenia procesw patologicznych, rozlegoci uszkodze tkankowych oraz szybkoci katabolizmu i eliminacji enzymw z osocza. Na tej podstawie czsto moliwe jest okrelenie pochodzenia i stopnia zaawansowania patologii. Dokadniejsze okrelenie rodzaju uszkodzonego narzdu jest moliwe na podstawie obrazu izoenzymw w surowicy; istotnymi diagnostycznie enzymami wystpujcymi w postaci izoenzymw s m. in.: CK, ALP oraz LDH. a) Ze wzgldu na podstawow lokalizacj enzymu oraz wydzielanie go do pynw ustrojowych, wyrnia si 3 grupy enzymw: Enzymy wskanikowe (indykatorowe) to takie, ktre po zsyntezowaniu pozostaj w obrbie komrki. Przenikaj w bardzo niewielkich ilociach do krwi, co jest wyrazem powolnego, fizjologicznego obumierania produkujcych je komrek. Przez analogi ich obecno we krwi w steniach przekraczajcych norm wiadczy o nasilonym obumieraniu lub nagym uszkodzeniu tych komrek. Niestety wikszo enzymw indykatorowych jest niespecyficzna tkankowo, dlatego lokalizacja

- 40

uszkodzenia opiera si na poszukiwaniu enzymu, ktrego poziom najbardziej przekroczy norm. Do enzymw wskanikowych nale m.in.: aminotransferaza asparaginowa (AspAT), aminotransferaza alaninowa (AlAT), dehydrogenaza mleczanowa (LDH) oraz kinaza kreatynowa (CK). Enzymy ekskrecyjne syntetyzowane s w komrkach, a nastpnie wydzielane do przewodw wyprowadzajcych (, trzustka, prostata). Enzymy te, podobnie jak wczeniej omwione wskanikowe, nie wystpuj fizjologicznie we krwi w znacznych steniach. Gdy jednak taki fakt nastpi, wiadczy o utrudnieniu w odpywie wydzieliny, najprawdopodobniej spowodowanym niedronoci odpowiedniego przewodu wyprowadzajcego. Niedrono moe by z kolei spowodowana blokad wewntrz przewodu (np. przez kamie lub guz), uciskiem na przewd z zewntrz bd znacznym poszerzeniem cian przewodu (np. w wyniku stanu zapalnego). Do enzymw ekskrecyjnych nale m.in.: fosfataza alkaliczna (ALP), -glutamylotranspeptydaza (GGTP) i 5nukleotydaza (5-NT), okrelane wsplnie jako markery cholestazy (zastoju ci), gdy znaczny wzrost ich aktywnoci we krwi towarzyszy niedronoci drg ciowych. Enzymy sekrecyjne po zsyntetyzowaniu wydzielane s do krwi, wic wystpuj w niej fizjologicznie w znaczcych ilociach. Stanem patologicznym jest natomiast obnienie ich aktywnoci w surowicy, mogce wiadczy o niewydolnoci produkujcego je narzdu. Niektre z enzymw sekrecyjnych s specyficzne tkankowo, zatem obnienie ich poziomu wiadczy o uszkodzeniu jednego konkretnego narzdu. Np. pseudocholinosteraza (butyrylocholinoesteraza = BChE) jest swoista dla hepatocytw, std jej niski poziom sugeruje uszkodzenie miszu wtroby. Enzymy sekrecyjne, wystpujce we krwi w wikszych steniach ni w tkankach i penice w niej funkcje fizjologiczne, okrela si jako funkcjonalne enzymy osocza. Enzymy ekskrecyjne i wskanikowe, wystpujce we krwi w o wiele mniejszych steniach ni w tkankach i nie penice w niej adnej istotnej roli (poza diagnostyczn), okrela si jako niefunkcjonalne enzymy osocza.

b) enzymy najczciej oznaczane w praktyce klinicznej Oglnie w materiale biologicznym pobranym z ludzkiego organizmu istnieje moliwo oznaczenia aktywnoci kilkudziesiciu enzymw. Wikszo z nich oznacza si jednak rzadko i przy specjalnych potrzebach, za w rutynowej diagnostyce uywa si ok. 10 z nich. S to: AST, AspAT aminotransferaza asparaginianowa, ALT, AlAT aminotransferaza alaninowa, LDH dehydrogenaza mleczanowa, HBD dehydrogenaza hydroksymalanowa, CK kinaza kreatynowa, GGTP -glutamylotranspeptydaza, ALP fosfataza alkaliczna, ACP fosfataza kwana, AMS -amylaza, LP lipaza trzustkowa ChE esteraza cholinowa, cholinoesteraza dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

LDH jest enzymem przeksztacajcym pirogronian w mleczan lub odwrotnie (patrz punkt IV-4-a). Aktywno ta nie jest przypisana pojedynczej czsteczce LDH posiada 5 izoenzymw, numerowanych kolejno od 1 do 5. S to jednak tzw. izoenzymy rzekome, bowiem syntetyzowane s tylko dwa odmienne (rni si one struktur IV-rzdow) acuchy polipeptydowe sercowy (H) oraz miniowy (M). Z nich nastpnie formowane jest aktywne biako tetrameryczne, w ktrym oba rodzaje podjednostek mog wystpowa w dowolnym skadzie. Poniewa istnieje 5 moliwych kombinacji (HHHH, HHHM, HHMM, HMMM, MMMM), std wyrnia si 5 izoenzymw rzekomych. Warto zwrci uwag, i LDH wykazuje aktywno jedynie w postaci tetramerycznej, a pojedyncze podjednostki nie s zdolne do katalizy. Izoenzymy LDH rni si lokalizacj tkankow: LDH1 serce, nerki, mzg, erytrocyty, LDH2 mzg, nerki, serce, erytrocyty LDH3 trzustka, puca, mm. szkieletowe, LDH4 trzustka, nerki, mm. szkieletowe, LDH5 wtroba, mm., skra Dwa pierwsze LDH1 i LDH2 odpowiadaj cznie za ok. 50% aktywnoci w surowicy. Izoezymy LDH rni si rwnie okresem ptrwania dla LDH1 wynosi on ok. 100 h, podczas gdy dla LDH5 tylko ok. 10 h. Znaczenie diagnostyczne:

- 41

Duy wzrost aktywnoci w surowicy z przewag izoenzymw 1 i 2 moe wiadczy o zawale minia sercowego. Ze wzgldu na dugie T1/2 tych izoenzymw, zalicza si je do pnych markerw zawau. Powyszy wynik moe rwnie wystpi w przypadku anemii megaloblastycznej, w przebiegu ostrych biaaczek lub towarzyszy cikim uszkodzeniom nerek. Duy wzrost aktywnoci, jednak w przewag LDH5, moe wystpowa w chorobach wtroby i/lub mm. szkieletowych. Umiarkowany wzrost aktywnoci jest symptomem nieswoistym moe by obecny przy zawale serca, WZW lub procesach nowotworowych. Rwnolegy wzrost aktywnoci izoenzomw 1 i 2 oraz narastaniem aktywnoci 5 przemawiaj za zawaem serca oraz dodatkowym rozwoju zastoju w kreniu wtrobowym (tym samym rozwoju niewydolnoci krenia) i jest zym objawem prognostycznym. kinaza kreatynowa (CK), kinaza fosfokreatynowa (CPK)

Jest to enzym katalizujcy przeniesienie reszty fosforanowej z ATP na kreatyn, dajc ADP i fosfokreatyn oraz reakcj odwrotn (patrz punkt VI-3). CK bierze wic udzia w procesach energetycznych regeneracji ATP z ADP poprzez wykorzystanie innego zwizku wysokoenergetycznego, jakim jest fosfokreatyna, bowiem wizanie pomidzy kreatyn a reszt {P} naley do wysokoenergetycznych. Aktywno CK, podobnie jest obecno kreatyny, s najwiksze w tkance miniowej, w tym rwnie w miniu sercowym. CK nie jest jednorodn czsteczk posiada 3 izoenzymy: BB wystpujcy w mzgu, pucach i jelitach oraz MM i MB wystpujce w mm. szkieletowych (g. MM) i sercu (g. MB). Fizjologicznie u dorosych wystpuje przede wszystkim CK-MM, stanowicy niemal 100% oglnej aktywnoci; u dzieci obecna jest niewielka ilo CK-MB. Aktywno CK w surowicy wzrasta po duych wysikach fizycznych std czsto podwyszony poziom u sportowcw oraz w szeregu stanw patologicznych: znaczny (> 5x) wzrost moe towarzyszy stanom takim jak: zawa lub zapalenie minia sercowego, wstrzs lub niewydolno krenia oraz dystrofia mm. szkieletowych, umiarkowany (< 5x) wzrost moe wiadczy o: uszkodzeniach mini (rwnie w wyniku iniekcji lub operacji), rozlegych uszkodzeniach tkanki nerwowej, chorobie nowotworowej lub alkoholizmie. Najwiksze znaczenie pomiarom aktywnoci CK przypisuje si w diagnostyce zawau serca. Podwyszenie cakowitej aktywnoci CK pojawia si w cigu I doby od incydentu ostrego niedokrwienia serca, a izoenzym CK-MB stanowi jeden z tzw. wczesnych markerw niedokrwienia. Ju po 6h trwania zawau warto CK-MB wzrasta 10x, po czym wraca do normy ok. 3 dobach; utrzymywanie si podwyszonej aktywnoci powyej 72 h stanowi zy czynnik rokowniczy. aminotrasferazy, transaminazy: asparaginanowa (AspAT) = Serum Glutamat-Oxalazetat Transaminase (SGOT) alaninowa (AlAT) = Serum Glutamat-Pyruvat Transaminase (SGPT)

Aminotransferazy katalizuj reakcje przeniesienia grupy aminowej w tym przypadku pomidzy aminokwasami a -ketokwasmi (patrz punkt VI-2-a). Nale do enzymw wskanikowych (indykatorowych). Pod wzgldem lokalizacji komrkowej AspAT jest enzymem mitochondrialnym, za AlAT cytozolowym. Ma to istotne znaczenie diagnostyczne, bowiem przy nieznacznym uszkodzeniu komrek do surowicy przenikaj gwnie enzymy cytoplazmatyczne, natomiast przy postpujcej destrukcji doczaj do nich rwnie enzymy mitochondrialne. Transaminazy wystpuj gwnie (AlAT wycznie) w wtrobie, a pomiar ich aktywnoci suy do oceny stopnia uszkodzenia (stan zapalny, marsko) tego narzdu. AspAT obecny jest rwnie w miniu sercowym, dlatego jego poziom ronie wskutek niedokrwienia lub niewydolnoci serca. Rne moliwe przyczyny wzrostu aktywnoci transaminaz osocza przedstawia ponisza tabela. AspAT AlAT zawa serca1, WZW2, toksyczne WZW, choroby miszu wtroby, duy wzrost aktywnoci uszkodzenie wtroby, cika cika niewydolno krenia niewydolno krenia, hemoliza choroby mm. szkieletowych, choroby mm. szkieletowych, wzrost umiarkowany, nieswoisty cholestaza, niewydolno krenia marsko wtroby, taczka bez zawau, nowotwory wtroby zastoinowa 1 W zawale serca wzrost aktywnoci transanimaz powyej 250U wiadczy o istnieniu dodatkowych czynnikw zwikszajcych jej poziom np. uszkodzeniu wtroby wywoanego niedotlenieniem. 2 W WZW aktywno transaminaz zaczyna wzrasta na 7-14 dni przed wystpieniem taczki, za szczyt przypada w okresie taczkowym.

- 42

-glutamylotranspeptydaza (GGTP)

GGTP katalizuje tworzenie wizania peptydowego przez kwas glutaminowy, jednak nie z udziaem jego grupy , lecz -karboksylowej w ten sposb uczestniczy w syntezie glutationu (patrz punkty: I-2-c, VII-6-a). GGTP wystpuje na ER hepatocytw, w bonie kanalikw nerkowych, obecna jest w trzustce i gruczole krokowym stanowi nieswoisty enzym wskanikowy. Ponadto stanowi enzym ekskrecyjny ci; w przypadku niedronoci drg ciowych GGTP przenika w zwikszonych ilociach do krwi, dlatego stanowi jeden z tzw. markerw cholestazy. Osoczowa aktywno GGTP wzrasta w bardzo wielu stanach patologicznych, do ktrych zaliczamy: zastoinowe choroby wtroby, ch. drg ciowych, ch. nowotworowe wtroby i trzustki oraz stany zapalne trzustki. Enzym ten indukowany jest przez estrogeny, barbiturany (leki uspokajajco-nasenne) oraz alkohol. Jego poziom podwysza si w przewlekym alkoholizmie, za wraca do normy po 2 5 tyg. abstynencji, std GGTP suy do monitorowania terapii odwykowej uzalenienia od alkoholu. dehydrogenaza glutaminianowa (GLD)

GLD katalizuje reakcj deaminacji kwasu glutaminowego (patrz punkt VI-2-b). Jest enzymem swoistym dla hepatocytw oznaczenie aktywnoci w surowicy, wraz z transaminazami, pomaga w diagnostyce rnicowej chorb wtroby. Wysoki wzrost aktywnoci moe towarzyszy piczce wtrobowej, chorobom miszowym wtroby (np. przewlekemu stanowi zapalnemu) lub taczce zastoinowej. Umiarkowany wzrost wiadczy czsto o nowotworze wtroby pierwotnym bd przerzucie. fosfataza zasadowa = alkaliczna (ALP)

ALP posiada kilka izoenzymw: kostny (B), wtrobowy (L), jelitowy (J) i oyskowy (P). U dorosych dominuje ALP-L, stanowicy ok. 50 % oglnej aktywnoci ALP w surowicy, u dzieci znaczny udzia ma ALP-B (ze wzgldu na szybki wzrost i aktywno metaboliczn koci), za u ciarnych ok. 48 % aktywnoci ALP przypada na izoenzym P z jego powodu w III trymestrze ciy wzrasta cakowita aktywno ALP. Jest enzymem wskanikowym chorb narzdw, od ktrych bior nazwy izoenzymy, a take nerek i ledziony. Jest rwnie enzymem ekskrecyjnym ci i podobnie jak GGTP stanowi marker cholestazy. Aktywno ALP wzrasta w dwojakiego rodzaju patologiach. Pierwsze z nich to zaburzenia funkcji wtroby wwczas wzrost pochodzi od izoenzymu L, a dodatkowo ronie GGTP; mog to by: WZW, ostre lub przewleke uszkodzenie toksyczne bd przerzuty nowotworowe. Druga grupa obejmuje choroby koci, zwaszcza przebiegajce z zahamowaniem ich wzrostu wwczas wzrost ALP pochodzi od izoenzymu B, za aktywno GGTP nie odbiega od normy. Zaliczmy tu: krzywic, chorob Pageta, przerzuty nowotworowe do koci oraz demineralizacj tkanki kostnej w przebiegu nadczynnoci przytarczyc. fosfataza kwana (ACP)

ACP naley do enzymw indykatorowych takich narzdw jak: wtroba, nerki, ledziona, trzustka, jelita, koci, erytrocyty i trombocyty; ponadto jest enzymem ekskrecyjnym, obecnym w wydzielinie gruczou krokowego. U dorosych mczyzn ok. 30 % aktywnoci APC stanowi wanie izoenzym sterczowy. U dzieci w okresie pokwitania, ze wzgldu na szybki wzrost, aktywno ACP jest kilkukrotnie (2 5 x) wiksza ni u dorosych. Podstawow rol diagnostyczn ACP peni w diagnostyce schorze prostaty przerostu, zapalenia czy nowotwory; w tym ostatnim przypadku obserwuje si wzrost cakowitej aktywnoci ACP, jak rwnie izoenzymu sterczowego PAP. Aktywno ACP moe rwnie przekracza norm w takich stanach jak: choroby koci (osteoporoza, ch. Pageta, przerzuty nowotworowe, nadczynno przytarczyc), nowotwory sutka lub jelit oraz nadmierny rozpad elementw krwi: hemoliza, anemia megaloblastyczna czy trombopatie. -amylaza (AMS), diastaza

AMS katalizuje hydroliz wiza 1,4-glikozydowych w polisacharydach (patrz punkt IV-2). Jest enzymem ekskrecyjnym, wydzielanym do liny (izoenzym S), soku trzustkowego (izoenzym P) oraz jelitowego. Pomiary aktywnoci osoczowej AMS wykorzystywane s g. w diagnostyce zaburze przewodu pokarmowego, a zwaszcza chorb trzustki. Znaczny wzrost aktywnoci AMS obserwuje si w przebiegu ostrego zapalenia trzustki (OZT) bd zaostrzenia przewlekego stanu zapalnego tego narzdu (PZT). Ponadto wysoki poziom AMS stwierdza si w makroamylazemii oraz cikiej niewydolnoci nerek. -amylaza jest biakiem maoczsteczkowym, dlatego jako jedyny z enzymw fizjologicznie ulega przesczaniu kbuszkowemu, utrzymujc si w moczu duej ni we krwi, co poszerza moliwoci diagnostyczne. Nieswoisty wzrost aktywnoci AMS towarzyszy wielu patologiom przewodu pokarmowego, m. in.: urazom jamy brzusznej,

- 43

marskoci wtroby, ostremu zapaleniu pcherzyka ciowego, perforacji wrzodu trawiennego, zapaleniu otrzewnej, a take chorobom linianek (np. nagminnemu zapaleniu przyusznic tzw. wince). lipaza trzustkowa (LP)

LP katalizuje hydroliz tuszczw pokarmowych odszczepia kwasy tuszczowe z czsteczek trjacylogliceroli (TAG) (patrz punkt V-2). Jest to enzym ekskrecyjny, podobnie jak AMS wystpujcy w soku trzustkowym, lecz w odrnieniu od niej tylko w nim. LP stanowi zatem bardziej swoisty marker OZT ni AMS. Aktywno LP w surowicy wzrasta w przebiegu stanw zapalnych i nowotworw trzustki, cholestazy pozawtrobowej z zajciem trzustki, chorobach z objawami ostrego brzucha (np. ostra niedrono jelit), niewydolnoci nerek (rzadko) oraz w wyniku farmakoterapii hepatyn (lek obniajcy krzepliwo krwi) lub lekami p/blowymi (analgetykami). esteraza cholinowa, cholinoesteraza (ChE)

Cholinoesteraza syntetyzowana jest w wtrobie, po czym uwalniana do oyska naczyniowego (enzym sekrecyjny). Wystpuje w dwch formach: pierwsz jest swoista ChE acetylocholinoesteraza (AChE), obecna na bonach postsynapycznych synaps cholinergicznych, zakoczeniu neuronw cholinergicznych oraz na powierzchni erytrocytw, gdzie hydrolizuje rozkad acetylocholiny (ACh) uwalnianej z neuronw cholinergicznych. Drug jest nieswoista ChE psuchocholinoestreraza, butyrylocholinoesteraza (BChE), wystpujca w mzgu, wtrobie, skrze, miniwce gadkiej przewodu pokarmowego oraz w surowicy, gdzie katalizuje rozkad wielu substancji, m. in. kilku lekw w tym suksametonium (sukcynylocholiny). Pomiar aktywnoci ChE w osoczu suy ocenie zdolnoci wtroby do syntezy tego enzymu. Aktywno ChE zmniejsza si w chorobach miszu wtroby (np. zapaleniu) oraz w zatruciu zwizkami fosforoorganicznymi (pestycydy, gazy bojowe), ktre blokuj zdolno katalityczn enzymu. Znane s przypadki wrodzonego niedoboru aktywnoci ChE dotknita tym zaburzeniem osoba zazwyczaj nie ma o nim pojcia, gdy brak enzymu nie jest na co dzie uciliwy, jednak istnieje wwczas ryzyko cikiego zatrucia pewn grup lekw zwiotczajcych g. wspomnian sukcynylocholin. Przy normalnej aktywnoci ChE dziaanie zwiotczajce tego leku utrzymuje si przez czas rzdu minut, podczas gdy przy braku ChE efekt moe utrzymywa si przez wiele tygodni. Wzrost aktywnoci ChE wystpuje w zespole nerczycowym, nadczynnoci tarczycy (hipertyreozie) oraz w okresach rekonwalescencji po uszkodzeniach wtroby. lipaza lipoproteinowa (LPL)

LPL katalizuje hydroliz TAG do kwasw tuszczowych i glicerolu. Jest to enzym sekrecyjny, ktrego pomiary s przydatne w rnicowaniu zaburze gospodarki lipidowej (lipoproteinowej). enolaza

Enolaza naley do enzymw szlaku glikolizy katalizuje dehydratacj 3-{P}-glicerynianu do {P}enolopirogronianu (PEP) (patrz punkt IV-4-a). Wystpuje w postaci trzech izoenzymw: jest pospolity wystpuje we wtrobie, nerkach i pucach, w mm. szkieletowcyh, za w neuronach (ang. neuron-specyfic enolase = NSE). Ten ostatni ma szczeglne znaczenie w diagnostyce onkologicznej, stanowi bowiem marker raka drobnokomrkowego puc oraz neuroblastoma. c) panele enzymatyczne

Jak wida na powyszych przykadach, enzymy i narzdy ludzkiego ciaa nie s do siebie swoicie dopasowane kady z organw posiada cay zestaw enzymatyczny, za poszczeglne enzymy produkowane s przez rnorodne tkanki. Aby zatem mc lepiej oceni stan pojedynczego narzdu, oznacza si aktywno nie jednego, lecz kilku enzymw wytwarzanych i uwalnianych przez ten narzd. Odnosi si to zwaszcza do wtroby i mini (szkieletowych oraz sercowego). Powstaj w ten sposb zestawienia, okrelane jako narzdowe panele lub profile enzymatyczne. Proporcje zmian aktywnoci enzymw s niezwykle pomocnymi informacjami diagnostycznymi, przyjmuj bowiem okrelone wartoci w szeregu patologii.

- 44

panel enzymw wtrobowych AST ALT GLD 0 GGTP ALP ChE 0 0 /0

ostre zapalenie przewlekle zapalenie cholestaza marsko nowotwr

panel enzymw mini szkieletowych CK-MM 0 LDH5 ALT, AST

dystrofia Duchenne'a (DMD) miopatia neurogenne zapalenie mini panel enzymw sercowych*

wczesny okres zawau pny okres zawau niewydolno krenia (bez zawau)

CK 0

AST

ALT

LDH1 0

* Przedstawiony panel jest ju przestarzay obecnie w diagnostyce zawau minia sercowego oznacza si we krwi poziomy markerw wczesnych: sercowej troponiny I (cTpI; patrz punkt VII-7), CK-MB metod mass (pomiar stenia enzymu, a nie jego aktywnoci) oraz mioglobiny (nie zawsze). Natomiast w niewydolnoci krenia oznacza si we krwi stenie N-kocowego fragmentu prekursora mzgowego peptydu natriuretycznego (NT-proBNP). d) Pomiary aktywnoci enzymw s rwnie wykorzystywane jako narzdzie diagnostyczne w onkologii: enzym ALP-B ALP-L ALP-P ACP1 5'-NT GGTP nowotwr nowotwory koci pierwotne i przerzuty do koci pierwotny nowotwr wtroby, przerzuty do wtroby, ucisk guza na przewody ciowe rak jajnika zaaw. rak prostaty z przerzutami (tkanki mikkie, koci) przerzuty do wtroby uwagi Ca2+ i Pro-OH w moczu maa specyficzno diagnostyczna powtrny wzrost po terapii wznowa pojawia si wczeniej ni ALP i inne objawy kliniczne

pierwotne nowotwory wtroby lub przewodu pokarmowego, rak jajnika AMS, LP rak trzustki AMS2 surowiczy rak jajnika PSA3 rak prostaty czuo diagnostyczna 99% 1 izoenzym sterczowy 2 izoenzym liniankowy 3 PSA = prostate-specyfic antigene (proteaza serynowa produkowana wycznie przez nabonek kanalikw nasiennych)

- 45

ROZDZIA III TRANSPORT PRZEZ BONY I UTLENIANIA BIOLOGICZNE

1. Budowa i funkcje bon biologicznych

a) skad bon Skadnikami bon biologicznych s: lipidy, biaka i wglowodany. Wrd lipidw bonowych wyrniamy: fosfolipidy zwizki tuszczowe zawierajce doczon reszt fosforanow; dziel si one dalej na: fosfoglicerydy, zoone z glicerolu, do ktrego doczone s (do C1 i C2) dwie reszty kwasw tuszczowych dugoci 16 18 atomw C oraz reszta fosforanowa (do C3), a do niej alkohol; alkohole wystpujce w fosfolipidach to: etanoloamina, cholina, seryna (Ser), glicerol i inozytol (patrz rwnie punkt V-1-e) sfingomieliny, zoone z ceramidu, reszty fosforanowej i choliny; sam ceramid skada si ze sfingozyny i reszty KT glikosfingolipidy lipidy zawierajce sfingozyn oraz fragment wglowodanowy; wyrniamy 3 ich podgrupy: cerebrozydy sfingozyna, z doczon reszt KT, czy si ponadto z czsteczk heksozy (monosacharyd C6) globozydy j. w., ale zamiast czystej reszty cukrowej wystpuje czsteczka aminocukru (patrz punkt IV-7-a) gangliozydy jak cerebrozydy, z tym e nie z pojedyncz czsteczk cukru, a z caym acuchem heksoz, wrd ktrych moe wystpowa kwas sialowy (SA; por. punkt IV-1-c) sterole, przy czym g. cholesterol Zjawisko poprzecznej asymetrii lipidowej bon polega na rnicy skadu lipidw warstwy zewntrznej i wewntrznej bony. W warstwie zewntrznej wystpuje cholesterol oraz fosfolipidy zawierajce cholin sfingomielina (Sph) i fosfatydylocholina (PC), natomiast w wewntrznej fosfolipidy posiadajce grup aminow fosfatydyloseryna (PS) oraz fosfatydyloetanoloamina (PE). Dojrzao puc wczeniakw ocenia si na podstawie stosunku stenia lecytyny do sfingomieliny w pynie owodniowym. Biaka bon komrkowych mog by rozmaicie zlokalizowane i peni rnorakie funkcje. Problem odpychania si wiza peptydowych o charakterze hydrofilowym oraz dwuwarstwy lipidowej (hydrofobowej) rozwizywany jest przez zwinicie acucha w struktur (-helis; por. punkt I-3-c). Biaka bonowe mog peni m. in. funkcje: strukturalne, transportujce, enzymatyczne, receptorowe i antygenowe. Biaka mog by poczone z bon na dwa sposoby. Biaka peryferyjne s zwizane z bon w sposb nietrway; czsto cz si z biakami integralnymi. Te ostatnie s bowiem trwale zwizane z bonami, gdy przechodz przez dwuwarstw lipidow (std okrelenie: przezbonowe). Biaka integralne klasyfikuje si ze wzgldu na ilo razy i sposb przekraczania bony: jednokrotnie przechodzce przez bon, z N-kocem na zewntrz, np. receptor LDL (por. punkt V-3-b) jednokrotnie przechodzce przez bon, z C-kocem na zewntrz, np. receptor asjaloglikoproteinowy (por. punkt IV-7-b) wielokrotnie przechodzce przez bon, np. bonowy przenonik glukozy (GLUT; por. punkt IV-3-a) Niektre biaka enzymatyczne zlokalizowane s wycznie w niektrych bonach, stanowic ich markery. Markerami bony plazmatycznej s: 5NT, AC i Na+/K+-ATPaza, ER glukozo-6-fosfataza, wewntrznej bony mitochondrialnej syntaza ATP, aparatu Golgiego (odpowiednio: cis, rodkowego, trans i TGN) transferazy: GlcNAc I, Golgi mannozydaza II, Gal i SA. Zwizki wglowodanowe s jedynym skadnikiem bony, ktrego skad zaley nie od samej komrki, lecz od jej otoczenia. Cukry zwizane s gwnie z biakami bonowymi, tworzc N- lub O-glikoproteiny.

- 46

b) funkcje bon Dziki istnieniu bon komrkowych moliwe jest oddzielenie od siebie poszczeglnych komrek organizmu (ich indywidualizacja), a tym samym stworzenie bariery pomidzy wntrzem a zewntrzem kadej z nich. To ostatnie pozwala m. in. na utrzymywanie rnic ste substancji we wntrzu i na zewntrz komrek, co wie si z ich pobudliwoci i regulacj aktywnoci. Bony istniejce w obrbie komrki wydzielaj w niej sektory, w ktrych mog zachodzi wzajemnie przeciwstawne procesy biochemiczne (kompartmentacja por. punkt II-1-f). Obonione organella komrkowe mog sprawniej regulowa transport substancji przeze zuywanych lub produkowanych. Bony nie su jednak wycznie celom podziau rodowiska na mniejsze czci umoliwiaj one wymian substancji midzy komrkami (zcza szczelinowe) oraz percepcj sygnaw docierajcych do komrki (receptory) 2. Transport przez bony biologiczne klasy biaek transportujcych

Transport przez bony biologiczne mona generalnie podzieli na bierny i aktywny. Kryterium tego podziau stanowi kierunek transportu oraz niezbdno energii chemicznej. Transport bierny nie wymaga nakadu energii i zachodzi zgodnie z gradientem ste substancji, natomiast transport aktywny nie moe odbywa si bez dostarczania energii i transportuje zwizki chemiczne w kierunku przeciwnym do ich gradientu po obu stronach bony. Transport bierny dyfuzja przez bony moe odbywa si na dwa sposoby: jako dyfuzja prosta lub uatwiona. Dyfuzja prosta moe z kolei polega albo na bezporednim przenikaniu substancji przez bon albo na przechodzeniu przez specyficzne biaka bonowe kanay. Zdolno do bezporedniego przenikania przez bony posiadaj czsteczki obojtne chemicznie woda, obojtne gazy oddechowe oraz zwizki lipofilne steroidy. Moliwoci takiej pozbawione s czstki naadowane jony ktre ze wzgldu na swj adunek nie mog przenikn w dowolnym miejscu przez hydrofobow bon, a jedynie przej przez specyficzne kanay. Z uwagi na fakt, e kanay su gwnie do transportu jonw, uywa si pojcia: kanay jonowe. a) kanay jonowe

Zgodnie z ide transportu biernego, kanay umoliwiaj jonom przepyw w kierunku zgodnym z ich gradientem (tzn. z tej strony bony, gdzie odpowiednich jonw jest wicej, na stron, gdzie jest ich mniej). Prdko przepywu jest relatywnie wysoka zbliona do dyfuzji i osiga nawet 106-107 jonw na sekund (s to wartoci 103 x wiksze ni w przypadku innych biaek transportowych wymiennikw i pomp por. dalej). Pomimo tego kanay cechuje zazwyczaj wysoka wybirczo zazwyczaj przepuszczaj one tylko jeden okrelony rodzaj jonu, tote czsto klasyfikuje si je na podstawie rodzaju transportowanych jonw (istniej tu wyjtki, np. kanay kationowe). Kanay potrafi do pewnego stopnia kontrolowa swoj prac mianowicie maj moliwo wystpowania w rnych stanach konformacyjnych: otwartym, zamknitym i gotowoci. Wyjciowo kana znajduje si w stanie gotowoci do otwarcia (nie przepuszcza jonw). Pod wpywem pewnych czynnikw moe on przej w stan otwarty wwczas jony mog przez niego swobodnie przepywa. Po pewnym czasie, indywidualnym dla danego typu kanau, stan otwarty spontanicznie przechodzi w stan zamknity. Ten ostatni rni si od stanu gotowoci brakiem wraliwoci na bodce otwierajce. Ostatecznie kana przechodzi ze stanu zamknitego w stan gotowoci, zamykajc cykl pracy. Wspomniane czynniki pobudzajce kanay do otwarcia s podstaw ich klasyfikacji na: bramkowane napiciem (potencjaem) na bonie, bramkowane ligandem oraz bramkowane napreniem mechanicznym. Kanay zbudowane s z kilku przezbonowych podjednostek biakowych, z ktrych kada moe posiada kilka przezbonowych domen. Kanay bramkowane ligandem mog funkcjonowa jako receptory neuroprzekanikw wwczas receptory takie okrela si jako jonotropowe. Przykadem tego ostatniego jest receptor acetylocholinowy typu N. Ma on budow pentameru, zoonego z czterech rodzajw podjednostek transbonowych, wystpujcych w stosunku stechiometrycznym 2. Kada podjednostka skada si z kilku segmentw; szczeglne znaczenie maj segmenty m2 podjednostek, budujce waciw cz kanau. Ligand ACh przyczany jest jednoczenie do miejsc zczy - i - (do otwarcia kanau potrzebne jest zwizanie dwch czsteczek ACh). Indukuje to zmiany konformacyjne, ktrych efektem jest otwarcie kanau dla jonw Na+ i Ca2+. Natychmiastowy napyw kationw do wntrza komrki powoduje jej szybk depolaryzacj tzw. szybki pobudzajcy potencja postsynaptyczny (fEPSP). Fizjologicznie powoduje to: skurcz mm. szkieletowych, pobudzenie neuronu zazwojowego (przekanictwo zwojowe) oraz uwalnianie amin katecholowych z rdzenia nadnerczy. W odrnieniu od w/w, kanay Na+ i K+ bony s bramkowane napiciem na bonie, czyli rnic potencjaw elektrycznych po obu jej stronach. W stanie wyjciowym bona komrkowa jest spolaryzowana (posiada tzw. potencja spoczynkowy), a kanay s wwczas zamknite. Odpowiedniego stopnia depolaryzacja

- 47

bony, np. pod wpywem impulsu nerwowego, powoduje otwarcie tych kanaw i przepyw jonw zgodnie z kierunkiem wyznaczonym przez gradient. Zjawisko to jest podstaw powstawania potencjau czynnociowego w komrkach pobudliwych (tj. nerwowych, miniowych i gruczoowych). Kana Na+ jest pojedynczym acuchem polipeptydowym o masie 260 kDa; jego koce N i C znajduj si w rodku komrki, a ptle wystaj z obu stron bony. Skada si z 4 powtarzajcych si podjednostek, z ktrych kada zoona jest z 6 -helikalnych przezbonowych domen. Por kanau zlokalizowany jest midzy helisami 5 i 6, ma szeroko 5 8 nm i od strony wiata zawiera kwasowe (naadowane ujemnie) reszty aa. Kana K+ jest teramerem zbudowanym analogicznie jak kana Na+. Podjednostki kanau tworz por w ksztacie stoka, biegncego przez rodek i zwajcego si od strony wewntrznej; por i jego ujcie wypenione s czsteczkami wody. W najwszym (0,3 nm) punkcie kanau jon K+ ma moliwo przecinicia si tylko pod warunkiem pozbycia si otoczki hydratacyjnej; odcinek ten, utworzony przez 5 reszt aa (Thr-Val-Gly-Tyr-Gly), peni rol filtra selektywnoci kanau, preferujc wanie K+, tak i przepuszczalno dla Na+ (ktry ma przecie mniejsz rednic) jest 100 x mniejsza. Okazuje si, e wzgldnie niewielkie rozmiary jonu Na + uniemoliwiaj mu swobodne interakcje z obecnymi we filtrze atomami tlenu, ktre s tak uoone przestrzennie, e uwalniaj jon K+ z otoczki wodnej, ale nie mog zrobi tego samego z Na+. Jon Na+ pozostaje wic uwodniony i jako zbyt szeroki nie przechodzi przez kana. Jon K+, po przejciu przez filtr selektywnoci, wchodzi w drugie miejsce wizania, cechujce si nieco wikszym powinowactwem. Jednak energia wizania tego miejsca unieruchamia jon, zamykajc go w puapce. Dopiero, gdy kolejny jon K+ zostanie zwizany z pierwszym miejscem, nastpuje ich elektrostatyczne odpychanie i pierwszy z jonw zostaje uwolniony na drug stron bony. Inaktywacja kanau K+ zachodzi przez zamknicie jego poru (obrazuje to tzw. model kuli na acuchu). Niektre drobnoustroje posiadaj zdolno syntezy jonoforw substancji bezporednio przenoszcych jony przez bon lub tworzcych w niej kanay jonowe. Zwizki takie, wbudowujc si w obrb bon i zaburzajc ich wybirczo transportow, mog prowadzi do mierci komrek. Z tego powodu stosowane s jako antybiotyki np. walinomycyna czy gramicydyna A i S (patrz punkt I-2-c). b) przenoniki transbonowe translokazy Drugim rodzajem transportu biernego jest dyfuzja uatwiona. Podobnie jak wczeniej opisana dyfuzja prosta, tak te dyfuzja uatwiona zachodzi z udziaem specyficznych transbonowych biaek transportowych tu okrelanych jako przenoniki (translokazy; bior one udzia rwnie w transporcie aktywnym). Przenoniki su generalnie do transportu zwizkw wikszych ni jony pojedynczych atomw np. reszt fosforanowych, kwasw karboksylowych, aminokwasw, wglowodanw, kwasw tuszczowych i nukleotydw. Wnika z tego, i peni one rol m. in. w transporcie czsteczek podstawowych skadnikw pokarmowych. Mechanizm dyfuzji uatwionej wykazuje pewne podobiestwa z interakcj enzymu i substratu: istnieje swoiste miejsce wizania przenoszonej czsteczki, przy pewnym steniu substratu biako transportowe ulega wysyceniu (vmax), istnieje okrelona staa wizania (KM), transport moe ulec zahamowaniu przez inhibitory kompetycyjne. Midzy tymi procesami wystpuj rwnie pewne rnice np. dyfuzja uatwiona odbywa si bez interakcji kowalencyjnej biaka transportujcego z przenoszon czstk. Translokazy wystpuj w dwch podstawowych stanach konformacyjnych gotowoci do zwizania oraz uwalniania przeniesionego zwizku, a cykl ich pracy polega na cigym przeskakiwaniu midzy nimi przypomina to nieco mechanizm reakcji pingpong. Szybko transportu przez przenonik zaley od gradientu stenia przenoszonej substancji po obu stronach bony. Aktywno transporterw moe podlega regulacjom hormonalnym, np. przenonik glukozy GLUT-4 ulega przeniesieniu do bony, gdzie moe peni sw funkcj, pod wpywem insuliny (patrz punkt IV8-b). Ze wzgldu na ilo czsteczek transportowanych przez przenonik w jednym cyklu wyrniamy 2 rodzaje transportu z udziaem przenonika: unitransport gdy na raz przenoszona jest tylko jedna czstka oraz kotransport gdy przenoszone s na raz dwie. Jeeli obie czstki przenoszone na zasadzie kotransportu docelowo znajduj si po jednej stronie bony, to okrela si to jako symport, jeeli za po stronach przeciwnych, to jest to antyport. Przykadem symportu jest przenoszenie glukozy lub aa jednoczenie z kationem Na+ (por. punkty IV-3-a i VI-1-a), natomiast antyportu pompa Na+/K+ (por. dalej). Szczegln obfito rodzajw przenonikw zawiera bona mitochondrialna. Wszystkie translokazy mitochondrialne s podobnie zbudowane, tj. z ustawionych szeregowo trzech powtrze tandemowych moduu 100 reszt aa; kade z powtrze posiada prawdopodobnie 2 elementy transbonowe. Opis przenonikw zawiera ponisza tabela.

- 48

Lp. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

nazwa przenonika fosforanowy pirogronianowy anionw dwukarboksylowych anionw trjkarboksylowych -ketoglutaranowy nukleotydw adeninowych

rodzaj kotransportu antyport symport antyport antyport antyport antyport

wymieniane zwizki H2PO4 / OH pirogronian- / H+ jabczan2- lub bursztynian2lub fumaran2- / HPO42jabczan2- / cytrynian3- + H+ jabczan2- / ketoglutaran2ADP3- / ATP4- *
-

uwagi i odnoniki

blokowany przez atraktylozyd

7. glutaminowo asparaginianowy antyport glutaminian2- / asparaginian28. karnitynowo acylokarnitynowy patrz punkt V-5-b 9. ornitynowy patrz punkt VI-2-d 10. aa obojtnych 11. glutaminowy * Przenonik ten wspdziaa z przenonikiem fosforanowym w elektroobojtnym transporcie substratw do fosforylacji oksydacyjnej. Tumaczy to, dlaczego synteza 1 czsteczki ATP wymaga transportu 4 H+ poniewa 1 z nich zuywany jest na symport z fosforanem nieorganicznym, a 3 na waciw fosforylacj oksydacyjn, tj. do pracy syntazy ATP (por. dalej). c) pompy jonowe

Transport aktywny rni si od biernego przede wszystkim tym, e aby zachodzi wymaga nakadu energii swobodnej (na t form transportu zuywanych jest 30 40 % energii produkowanej przez komrk). Jako proces niekorzystny energetycznie wymaga sprzenia z innym, bardziej korzystnym procesem (procesy endoergiczne zachodz wycznie wtedy, jeli s sprzone z procesami egzoergicznymi) tym ostatnim moe by hydroliza ATP, ruch elektronw lub wiato (u rolin). Transport aktywny wykazuje pewne podobiestwa z dyfuzj uatwion: oba przebiegaj z udziaem biaek transportowych, wystpujcych w dwch stanach konformacyjnych (w przypadku transportu aktywnego nie s to translokazy, lecz pompy por. dalej), wykazuj swoisto wzgldem jonw, aa i wglowodanw, wykazuj cechy reakcji enzymatycznej, cho bez interakcji kowalencyjnych (por. wyej). Gwne rnice pomidzy nimi polegaj na tym, e transport aktywny jest jednokierunkowy (a dyfuzja uatwiona dwukierunkowa) oraz e zachodzi on zawsze przeciwnie do kierunku wyznaczonego przez gradient ste (wanie do jego przeamania wymagana jest energia). Jak wspomniano, biakami aktywnie transportujcymi czsteczki przez bon s pompy. Wyrnia si dwa rodzaje pomp wykorzystujcych ATP ATP-azy typu P oraz biaka ABC pompy posiadajce kaset wic ATP (ang. ATP binding cassette = ABC). Te pierwsze ulegaj fosforylacji w miejscu specyficznej reszty Asp i mog podlega zmianom konformacyjnym; cykl ich pracy przedstawia si nastpujco: pompa w wyjciowym stanie konformacyjnym wie czsteczki: ATP oraz substancji przenoszonej np. jonu, ATP ulega rozszczepieniu, a jego grupa -fosforanowa przeniesieniu na specyficzn reszt Asp, powysza fosforylacja przesuwa rwnowag w kierunku drugiego stanu konformacyjnego, co powoduje wyeksponowanie miejsca wizania po drugiej stronie bony, pozwalajc przenoszonej czstce na odczenie si, nisze powinowactwo pompy do jonu w drugim stanie konformacyjnym powoduje ich dysocjacj, wraz z uwolnieniem jonu uwalniana jest rwnie grupa fosforanowa, zdefosforylowana pompa powraca do pierwotnego stanu konformacyjnego. Do pomp typu ATPazy typu P nale m. in.: Na+/K+-ATPaza integralne biako bonowe obecne w wikszoci komrek organizmu, zwaszcza w komrkach pobudliwych. Wymaga do pracy obecnoci fosfolipidw. Posiada miejsca wice dla wszystkich trzech skadnikw, tj. ATP, Na+ i K+. Hydroliza ATP (i praca pompy) zachodzi tylko w sytuacji, gdy obydwa jony s zwizane. Podczas jednego cyklu pracy 3 jony Na+ transportowane s na zewntrz komrki, a 2 jony K+ do jej wntrza. Pompa sodowo-potasowa jest elektrogenna, tzn. ma pewien (ok. 10 %) wkad w utrzymywanie bony w stanie spolaryzowanym (utrzymywanie potencjau spoczynkowego). Prac Na+/K+-ATPazy hamuj inhibitory glikozydy nasercowe: ouabaina (strofantyna glikozyd skrtnika) oraz digoksyna i digitoksyna (glikozydy naparstnicy), stosowane jako leki zwikszajce kurczliwo minia sercowego, wskazane g. w stanach jego niewydolnoci.

- 49

Ca2+-ATPaza wystpuje g. w retikulum sarkoplazmatycznym miocytw. Jej praca polega na transporcie jonw wapniowych do wntrza ER, co pozwala na rozkurcz minia. Pod wzgldem budowy stanowi ona pojedynczy polipeptyd. Posiada 3 domeny cytoplazmayczne penice odmienne funkcje: wizanie ATP (domena N), przyjmowanie grupy fosforanowej (domena P) oraz regulacja domeny N (domena A). W czasie pracy nastpuje zblienie domen N i P. H+/K+-ATPaza pompa protonowa obecna w komrkach okadzinowych odka. Poprzez transport protonw do jego wiata utrzymuje silnie kwany odczyn, pozwalajc na aktywacj enzymw i niszczc bakterie. Jej funkcja jest regulowana przez ACh (receptor M1) i histamin (receptor H2). H+-ATPaza syntaza ATP ma zdolno do hydrolizy ATP i transportu protonw (por. punkt III-6 fosforylacja oksydacyjna). I- pompa jodkowa wystpuje w tarczycy, gdzie transportuje aniony jodu do komrek nabonka pcherzykw tarczycowych, umoliwiajc ich przenoszenie na aa i syntez hormonw tarczycy (patrz punkt VI-3). Do pomp posiadajcych kaset wic ATP nale m. in. biako opornoci wielolekowej (ang. multidrug resistance = MDR) oraz przezbonowe biako regulacyjne zwknienia torbielowatego tj. mukowiscydozy (ang. cystic fibrosis transmembrane regulator = CFTR). Kade z nich skada si z 4 domen dwch kaset wicych ATP (ABC) oraz dwch domen czcych z bon. d) wymienniki Oprcz opisanych biaek transportowych wyrnia si jeszcze tzw. wymienniki, czyli biaka transportujce II rzdu. Ich wyjtkowo polega na sprzganiu transportu wbrew gradientowi ste jednej substancji z transportem zgodnym z gradientem innej substancji. Przykadem jest wymiennik Na+/Ca2+, wykorzystujcy gradient jonw Na+ do odkomrkowego transportu jonw Ca2+ (w stosunku stechiometrycznym 3 Na+ : 1 Ca2+). Cechuje si on imponujc wydajnoci, moe bowiem transportowa z prdkoci do 2000 jonw/s, podczas gdy Ca2+-ATPaza jedynie 30 jonw/s. Niezbdny do pracy przenonika gradient jonw Na+ utrzymywany jest przez Na+/K+-ATPaz. 3. a) Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne klasyfikacja oksydoreduktaz

Oksydoreduktazy (EC 1) to enzymy katalizujce reakcje typu redox. Wyrnia si wrd nich 4 klasy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. Oksydazy katalizuj oderwanie od substratu atomw wodoru i przeniesienie ich na atom tlenu: AH2 + O2 A + H2O AH2 + O2 A + H2O2 Przykadem oksydazy jest oksydaza cytochromowa. Oksydazy s metaloflawoproteinami, gdy wymagaj do katalizy atomw metali (Fe, Cu) oraz grup prostetycznych w postaci nukleotydw flawinowych. Dehydrogenazy, w przeciwiestwie do oksydaz, nie mog uywa tlenu jako akceptora atomw wodoru, przenosz je natomiast z jednego substratu na drugi: AH2 + B A + BH2 Przykadem dehydrogenaz s cytochromy: b, c1, c i a; zawieraj one atom Fe, a ich funkcj jest transport elektronw pomidzy flawoproteinami a oksydaz cytochromow. Niektre z dehydrogenaz posiadaj flawinowe grupy prostetyczne, inne za wymagaj obecnoci koenzymw nikotynamidowych. Peroksydazy rozkadaj nadtlenki, przez co chroni ustrj przed skutkami stresu oksydacyjnego (por. punkt III-7 ochrona przed RFT). Klasyczne peroksydazy utleniaj pewien substrat, w celu uzyskania atomw wodoru do redukcji atomu tlenu w czsteczce nadtlenku wodoru: H2O2 + AH2 A + 2 H2O. Tak dziaa np. peroksydaza glutationowa. Katalaza (CT) zawiera 4 grupy hemowe; katalizuje reakcj dysproporcjonowania nadtlenku wodoru i nie wymaga dodatkowych substratw: 2 H2O2 2 H2O + O2

- 50

Oksygenazy katalizuj bezporednie przeniesienie i przyczenie tlenu do czsteczki substratu; uczestnicz w reakcjach syntezy lub degradacji metabolitw. Dioksygenazy przyczaj oba atomy tlenu do czsteczki substratu: A + O2 AO2. Przykadem jest dioksygenaza homogentyzynowa (enzym biorcy udzia w szlaku katabolizmu aa Tyr patrz punkt VI-3). Monooksygenazy przyczaj jeden z atomw tlenu do czsteczki substratu, tworzc grup hydroksylow (std inna nazwa hydroksylazy), za drugi atom tlenu znajduje si ostatecznie w czsteczce wody: AH + O2 + Z-H2 AOH + H2O + Z. Do monooksygenaz naley m. in. cytochrom b5 (patrz punkt VII-4-b ochrona erytrocytw przed RFT, redukcja methemoglobiny) oraz cytochrom P450 (CYP) (patrz punkt III-8 utlenianie mikrosomalne).

b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszce protony i elektrony Do nukleotydw flawinowych nale FMN i FAD. Ich prekursorem jest ryboflawina (witamina B2), skadajca si z flawiny, zawierajcej piercie izoalloksazynowy oraz z D-rybitolu.

FMN mononukleotyd flawinowy powstaje z ryboflawiny przez jej fosforylacj z udziaem kinazy ryboflawinowej (flawokinazy): ryboflawina + ATP flawokinaza FMN + ADP FMN moe przycza 2 atomy wodoru (2 H+ + 2 e-), przechodzc z formy utlenionej (FMN) przez poredni semichinonow (FMNH*) w zredukowan (FMNH2). Miejscem wizania atomw wodoru jest fragment izoalloksazynowy:

FMN jest silniejszym czynnikiem utleniajcym ni NAD+ (por. dalej). Peni on funkcj grupy prostetycznej m. in. w oksydazie -aminokwasw. FAD dinukleotyd flawinoadeninowy skada si z FMN oraz AMP. W sposb analogiczny do FMN ma zdolno przyczania 2 atomw wodoru, czemu towarzyszy redukcja do FADH2. W tej zredukowanej formie FAD moe funkcjonowa jako substrat fosforylacji oksydacyjnej (por. dalej). Stanowi on grup prostetyczn np. dehydrogenazy aldehydowej.

- 51

Koenzymami nikotynamidowmi s NAD+ oraz NADP+. Ich prekursorem jest witamina PP (niacyna, kwas nikotynowy i jego amid kwasowy).

NAD+ dinukleotyd nikotynamidoadeninowy skada si z nukleotydu niacynowego (nikotynamid + ryboza + {P}) oraz AMP. Moe on zwiza jeden proton i dwa elektrony (H+ + 2 e-; jest to wynikiem zgromadzenia na atomie azotu adunku dodatniego por. rys.), przechodzc z formy utlenionej (NAD+) w zredukowan (NADH). Jeeli dostarczane s 2 protony, to wizaniu ulega tylko jeden z nich, a pozostaje w rodowisku reakcji, dlatego te form zredukowan zapisuje si: NADH + H+. Miejscem wizania protonu i elektronw jest piercie nikotynamidowy:

Forma zredukowana (NADH + H+) moe stanowi substrat fosforylacji oksydacyjnej. NAD+ jest koenzymem enzymw biorcych udzia w oksydacyjnych szlakach metabolicznych (katabolicznych). NADP+ fosforan NAD+ rni si od NAD+ obecnoci reszty {P}, poczonej z C2 rybozy nukleotydu adeninowego. Przyczanie protonu i dwch elektronw zachodzi identycznie jak w przypadku NAD+. Rnica polega na tym, e NADPH + H+ nigdy nie stanowi bezporedniego substratu fosforylacji oksydacyjnej. Peni on natomiast rol koenzymu enzymw uczestniczcych w syntezach redukcyjnych, np. dehydrogenaz PPP czy enzymw steroidogenezy (szlaki anaboliczne). Koenzym Q, ubichinon, (CoQ, UQ, Q) skada si z piercienia p-benzochinonu, do ktrego wolnych atomw wgla przeczone zostay grupy boczne jedna metylowa, dwie zmetylowane hydroksylowe (metoksy-) oraz jeden boczny acuch poliizoprenowy. Ten ostatni skada si ze zmiennej (6-10) liczby reszt izoprenowych (-CH2-CH=C(CH3)-CH2-), wskutek czego przedstawicieli rodziny CoQ opisuje si podajc wanie ilo tych reszt. Znane s czsteczki Q6 Q10, przy czym w ludzkich mitochondriach dominuje ta ostatnia.

- 52

Dziki obecnoci piercienia benzochinonowego czsteczka CoQ moe przycza i transportowa 2 H+ i 2 e-. Redukcja formy utlenionej ubichinonu do formy zredukowanej ubichinolu zachodzi dwustopniowo: wpierw przycza si jedna para H+ + e-, w wyniku czego powstaje rodnikowa forma semichinonowa (p-chinonowa), a nastpnie druga para H+ + e-, dajc zredukowany ubichinol. Ten z kolei moe odda protony i elektrony, powracajc do formy utlenionej. Fizjologicznie CoQ podlega cigym cyklicznym przemianom: Q QH* QH2 Q itd. Ze wzgldu na znaczn mobilno, koenzym Q peni funkcj przenonika elektronw midzy nieruchomymi bo wbudowanymi w wewntrzn bon mitochondrialn kompleksami acucha oddechowego. Ubichinon zbiera rwnowaniki redukujce z kompleksw I i II, po czym przekazuje je na kompleks III (por. dalej). Centra elazo-siarkowe (Fe:S) s to ugrupowania atomw Fe i S, majce zdolno odwracalnego wizania elektronw, stanowice grupy protetyczne pewnych biaek z tego powodu rwnie okrelanych jako elazo-siarkowe. Poniewa atomy elaza wchodzce w skad centrw nie s skadnikami czsteczek hemu, ale bior udzia w katalizie, okrela si jako elaza niehemowe. Centra zwizane s z biakami poprzez wizania tworzce si midzy atomami Fe niehemowego, a atomami siarki reszt Cys lub azotu reszt His (por rys.). Atomy siarki wystpujce midzy atomami elaza w obrbie centrw wykazuj wraliwo na dziaanie niskich wartoci pH. Znanych jest kilka rodzajw centrw Fe:S, rnicych si iloci i skadem atomw, przy czym najistotniejszymi s Fe2S2 i Fe4S4. Struktura centrw Fe:S cechuje si regularnoci i symetri (por. rysunki). Ich zdolno do wizania i oddawania elektronw wynika z moliwoci wystpowania atomw elaza na rnych stopniach utlenienia II i III. Podczas wizania e- atom elaza ulega redukcji do Fe2+, za podczas oddawania eelazo utlenia si do Fe3+. Fizjologicznie centra te stanowi jednoelektronowe pomosty, transportujce elektrony z flawoprotein na koenzym Q oraz z koenzymu Q na cytochrom c1.

4.

Transport atomw wodoru przez bon mitochondrialn

Mitochondria s organellami komrkowymi, ktrych gwn funkcj jest produkcja energii. Energia ta gromadzona jest w wysokoenergetycznych wizaniach ATP. Proces syntezy ATP nazywa si fosforylacj oksydacyjn; fosforylacja wykorzystuje energi rnicy ste (gradientu) protonw po obu stronach wewntrznej bony mitochondrialnej. Gradient ten wytarzany jest z kolei przez ukad biaek bonowych, zwany acuchem oddechowym, ktry wymaga obecnoci zredukowanego substratu, od ktrego mgby odebra atomy wodoru i wykorzysta ich energi, aby ostatecznie przekaza je na tlen. Substratami acucha oddechowego s gwnie zredukowane formy nukleotydw NADH oraz FADH2; inne zwizki wykorzystywane s w ten sposb, e ulegaj utlenieniu, przekazujc swoje atomy wodoru na NAD+ lub FAD, ktre s przez to redukowane. rda przenonikw redukujcych dzieli si na wewntrz- i pozamitochondrialne.

- 53

rdem pochodzcym z samych mitochondriw jest NADPH, ktry moe przekaza atomy wodoru na NAD+ dziki aktywnoci transhydrogenazy: NADPH + H+ + NAD+ transhydrogenaza NADP+ + NADH + H+. Przenoniki pozamitochondrialne, aby mc zosta wykorzystane do pozyskania energii, musz wpierw znale si wewntrz mitochondriw. Nie mog jednak swobodnie pokona bariery w postaci podwjnej bony mitochondrialnej, dlatego te s przez ni przenoszone za porednictwem par substratw sprzonych odpowiednimi dehydrogenazami. Istniej dwa takie ukady transportujce: Ukad glicerolo-3-fosforanowy utworzony jest przez glicerolo-3-{P} (forma zredukowana) oraz {P}dihydroksyaceton (forma utleniona). Wystpuje on w mzgu, brunatnej tkance tuszczowej, biaej tkance miniowej oraz w wtrobie. Transport z jego udziaem obarczony jest stratami energii, gdy zredukowana forma NADH, z ktrej moe powsta maks. 2,5 czsteczki ATP (patrz punkt III-8), wymieniana jest na zredukowan form FADH2, z ktrej moe powsta jedynie 1,5 czsteczki ATP.

Ukad szczawiooctan jabczan asparaginian jest bezstratnym sposobem transporty. Jest to ukad uniwersalny, powszechnie wystpujcy w organizmie:

OA szczawiooctan, M jabczan, Asp asparaginian, Glu glutaminian, KG -ketoglutaran MDH dehydrogenaza jabczanowa, AT aminotransferaza (transaminaza) 1 przenonik -ketoglutaranowy, 2 przenonik glutaminianowo asparaginianowy 5. acuch oddechowy

acuch oddechowy jest to zoony ukad wielu biaek, zlokalizowany na wewntrznej bonie mitochondrialnej, ktrego funkcj jest utlenianie rwnowanikw redukujcych. Substratami acucha s zredukowane formy nukleotydw nikotynamidowych (NADH) i flawinoadeninowych (FADH2). Praca acucha polega na odebraniu im protonw i elektronw (ich utlenieniu), a nastpnie na kontrolowanym przepywie tych czstek (H+ + e-) przez kolejne ogniwa acucha o wzrastajcym potencjale redox. Przepywowi temu towarzyszy stopniowe uwalnianie energii tych czstek. Wielko uwolnionej energii jest proporcjonalna do rnicy potencjaw oksydoredukcyjnych ukadw wymieniajcych midzy sob elektrony (G = -n.F.V; G energia swobodna, n liczba elektronw, F staa Faradaya 96500 C/mol, V potencja redox). Przenoszenie elektronw pomidzy ogniwami katalizowane jest przez odpowiednie dehydrogenazy. Wyjtkiem jest ostatnia reakcja, polegajca na przeniesieniu protonw na tlen i utworzeniu w ten sposb czsteczki wody, katalizowana

- 54

przez oksydaz. Powstajca energia zuywana jest przez pompy protonowe samego acucha do transportu protonw (H+) z macierzy (matrix) mitochondrialnej do przestrzeni midzybonowej. W ten sposb po obu stronach wewntrznej bony mitochondrialnej tworzy si rnica ste protonw innymi sowy powstaje przezbonowy gradient stenia protonw, a dodatkowo poniewa od [H+] zalene jest pH gradient pH. Powstaa rnica ste wykorzystywana jest do syntezy zwizku wysokoenergetycznego ATP w procesie oksydacyjnej fosforylacji. Jak wspomniano, w skad acucha oddechowego wchodzi bardzo wiele czsteczek biakowych. Nie s one jednak ani bezadnie rozrzucone ani mobilne, lecz zorganizowane w 4 nieruchome kompleksy, przechodzce przez ca bon wewntrzn, oznaczone kolejnymi numerami rzymskimi (I IV). Kady kompleks przedstawia ukad redox, posiadajcy okrelony potencja utleniajcy; jak wyej zaznaczono, elektrony przechodz kolejno przez kompleksy o wzrastajcych potencjaach. Kompleksy I, III i IV wykazuj aktywno pomp protonowych, transportujc jony H+ na zewntrz bony wewntrznej. Poniewa kompleksy nie maj moliwoci ruchu, istniej dodatkowe ruchome przenoniki koenzym Q oraz cytochrom c. Kompleks I okrelany jest jako dehydrogenaza NADH bd oksydoreduktaza NADH : ubichinon. Zawiera on grup prostetyczn FMN oraz centra Fe:S zarwno Fe2S2, jak i Fe4S4. Kompleks ten katalizuje wpierw przeniesienie 2 H+ i 2 e- z NADH + H+ na FMN powstaje w ten sposb NAD+ i FMNH2. Nastpnie protony i elektrony s rozdzielane te pierwsze wdruj do matrix, a te drugie podlegaj transportowi przez centra Fe:S. Ostatecznie elektrony zostaj przekazane na ubichinon, ktry dobiera sobie 2 protony z matrix, dajc zredukowany ubichinol (Q QH2). Ukad NAD+ / NADH posiada potencja -0,32 V, za ukad ubichinon / ubichinol +0,10 V. Energia uwolniona w wyniku przejcia substratw midzy tymi ukadami suy do transportu 4 protonw z macierzy do przestrzeni midzybonowej. Kompleks II nosi nazw oksydoreduktazy bursztynian : ubichinon lub inaczej dehydrogenazy bursztynianowej (SDH). Zawiera FAD oraz centra Fe:S. SDH stanowi jeden z enzymw cyklu Krebsa (por. punkt II-9), jednoczenie dostarczajcy rwnowanikw redukujcych do acucha oddechowego. SDH katalizuje reakcj odwodornienia bursztynianu i przeniesienia 2 H+ + 2 e- na FAD; daje to w efekcie malonian oraz FADH2. Nastpnie protony i elektrony s rozdzielane protony tradycyjnie wdruj do matrix, a elektrony transportowane s przez centra Fe:S. Elektrony, a za nimi protony, przyczaj si do ubichinonu, redukujc go. Ukad bursztynian / fumaran posiada potencja +0,03 V. Wyjtkowo jednak przepywowi substratw przez kompleks II nie towarzyszy przezbonowy transport protonw. Kompleks II jako jedyny nie jest zwizany z aktywnoci pompy protonowej, w zwizku z czym nie wystpuje tu przyrost (zysk) energetyczny. Kompleks III to z kolei oksydoreduktaza ubichinon : cytochrom c. Zawiera on centrum Fe2S2, cytochrom b w tzw. formie niskiej (bL) i wysokiej (bH) oraz cytochrom c1. Czsteczki CoQ zarwno te zredukowane w kompleksach I i II, jak i posiadajce protony przyczone bezporednio z matrix (por. dalej) oddaj swoje protony do przestrzeni midzybonowej, przez co powracaj do formy ubichinonowej (Q). Elektrony natomiast wdruj dwiema drogami jedna cz przekazywana jest kolejno: na centrum Fe:S, na cytochrom c1, a ostatecznie na cytochrom c, druga cz natomiast czy si z cytochromem bL, ktry w wyniku tego przeksztaca si w bH. Ten ostatni przekazuje elektrony znw na czsteczk ubichinonu, ktra dobiera sobie bezporednio 2 protony z matrix, powikszajc w ten sposb pul QH2. Cytochrom c, podobnie jak CoQ, stanowi rozpuszczalny transporter, odbierajcy elektrony z kompleksu III i oddajcy go kompleksowi IV. Ukad cytochrom c utleniony / zredukowany posiada potencja +0,22 V. Energia uwolniona z substratw przechodzcych przez kompleks III wystarcza do transportu 4 protonw na zewntrz bony. Kompleks IV to oksydoreduktaza cytochrom c : tlen lub krcej oksydaza cytochromowa. Posiada on cytochromy a i a3 (z ktrych kady zawiera elazo hemowe) oraz 2 atomy miedzi CuA i CuB. Elektrony oddane kompleksowi IV przez cytochrom c1 wizane s wpierw przez atomy CuA (dziki moliwoci przejcia Cu2+ Cu+), nastpnie przekazywane na hem a, dalej na atomu CuB i hem a3, aby ostatecznie posuy do redukcji czsteczki tlenu ( O2 O2-). Ta ostatnia przyciga 2 protony z matrix, dajc w reakcji kocowy produkt acucha oddechowego czsteczk wody. Ukad tlen / woda ma potencja redox rwny + 0,82 V. Energia z transportu substratw przez ostatni kompleks przekada si na przeniesienie dwch protonw przez wewntrzn bon mitochondrialn. Podsumowujc substraty, redukujc kolejne ukady o coraz to wyszym potencjale, trac stopniowo energi, zuywan na wytworzenie gradientu protonowego. Rnica potencjau pomidzy skrajnymi ogniwami acucha NAD+ / NADH oraz O2 / H2O wynosi: V = +0,82 (-0,32) = 1,14 V, co przekada si na energi: G = - 2 mol . 1,14 V . 96500 C/mol - 220 kJ. Znak ujemny przed wynikiem oznacza, i jest to energia oddana przez substraty. Warto zwrci uwag na rnic drogi, jak pokonuj protony i elektrony z NADH, a jak z FADH2: substraty z tego pierwszego rda przechodz przez kompleksy I, III i IV, co daje w sumie 4 + 4 + 2 = 10 protonw przeniesionych na zewntrz bony, natomiast z drugiego pokonuj kompleksy II, III i IV, ale poniewa II nie pompuje protonw, transportowi ulega tylko 4 + 2 = 6 z nich. Pynie std wniosek, i utlenianie NADH jest bardziej opacalne ni utlenianie FADH2 (por. nastpny punkt).

- 55

6.

Fosforylacja oksydacyjna

Fosforylacja oksydacyjna to sprzony z oddychaniem proces wytwarzania zwizku bogatoenergetycznego (ATP), zachodzcy w mitochondrium. Umoliwia on organizmom tlenowym (aerobom) pozyskanie znacznie wikszej czci dostpnej energii swobodnej substratw oddechowych w porwnaniu z organizmami beztlenowymi (anaerobami). rdem energii do syntezy ATP jest wytworzony przez acuch oddechowy przezbonowy gradient stenia protonw i pH. Ta rnica potencjau elektrochemicznego wykorzystywana jest przez jednostki fosforylujce, pokrywajce wewntrzn powierzchni bony mitochondrialnej. Taka pojedyncza jednostka skada si z wielu podjednostek biakowych, ktre mona podzieli na dwa kompleksy F0 i F1. Hydrofobowy kompleks F0 przechodzi przez wewntrzn bon mitochondrialn. Skada si z 6 podjednostek, w obrbie ktrych wyrnia si 4 rne acuchy polipeptydowe. Najmniejsza z podjednostek tworzy transbonowy kana jonowy, przeznaczony dla protonw. Oba kompleksy poczone s za porednictwem trzonka (szyjki), rwnie zoonego z szeregu podjednostek. Nale do nich m. in.: inhibitor F1 regulujcy przepyw protonw i syntez ATP, OSCP biako warunkujce wraliwo na oligomycyn oraz podjednostka Fc2 (F6). Hydrofilowy kompleks F1 (czynnik sprzgajcy 1) ma w przyblieniu ksztat kuli o rednicy 8,5 nm i znajduje si po wewntrznej stronie bony. Skada si z 5 rodzajw podjednostek, wystpujcych w relacji stechiometrycznej 33 (czyli cznie 9 o wsplnej masie: 3 x 56 + 5 x 53 + 34 + 14 + 6 = 378 kD). Kompleks F1 wykazuje aktywno syntazy ATP transportujcej H+, ktrej praca uwarunkowana jest przechodzeniem protonw przez kana w kompleksie F0 oraz przez sam kompleks F1. Substratami do syntezy ATP s ADP i Pi. Historycznie rzecz biorc, powstao kilka teorii wyjaniajcych proces syntezy ATP. Jedne z nich zostay ju odrzucone jako nieprawdziwe, inne wci funkcjonuj i stanowi wspczesne podejcie do istoty fosforylacji. Teoria sprzenia chemicznego zakadaa bezporednie sprzenie chemiczne na wszystkich etapach procesu syntezy ATP, tak jak to ma miejsce w reakcjach generujcych ATP w szlaku glikolizy (por. punkt IV-4-a). Teoria ta zostaa odrzucona, poniewa nie udao si wyizolowa bogatoenergetycznych porednikw czcych procesy utleniania i fosforylacji. Teoria chemiosmotyczna (Mitchell) zakada, e energia z procesw utleniania przenonikw w acuchu oddechowym wykorzystywana jest przez pompy protonowe zwizane z kompleksami I, III i IV do transportu protonw na zewntrz sprzgajcej (tzn. wewntrznej) bony mitochondrialnej. Ta ostatnia jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonw, a zwaszcza dla protonw, ktre gromadzc si po jej zewntrznej stronie, wytwarzaj przezbonow rnic potencjau elektrochemicznego (H+), na ktry skada si potencja chemiczny (pH) i potencja elektryczny (E). Termodynamicznie uwarunkowany, swobodny przepyw protonw w tym ukadzie skierowany jest od matrix do przestrzeni midzybonowej. Syntaza ATP, zawierajc kana jony, umoliwia ten przepyw, a dodatkowo pochania cz jego energii, magazynujc j w odpowiednich wizaniach ATP. Teoria ta, cho dobrze tumaczy dziaanie syntazy ATP, nie wyjania do koca wszystkich aspektw tego procesu. Wykazano bowiem, e to nie sama reakcja syntezy ATP wymaga dostarczenia zewntrznej energii, a raczej etap uwalniania tego zwizku z centrum katalitycznego enzymu. Przypuszczano, i wymaga to zajcia zmian konformacyjnych w obrbie kompleksu F1, do czego miaby by niezbdny gradient protonowy. Hipoteza konformacyjna (Boyer) definitywnie dowodzi, i rol gradientu protonowego nie jest udzia w syntezie ATP, lecz odczeniu produktu od syntazy oraz e 3 miejsca wice substraty w tym enzymie wzajemnie na siebie oddziauj. Wizanie ADP + Pi do jednego miejsca pobudza usunicie ATP z drugiego, czyli syntaza ATP wykazuje kooperatywno katalityczn. 3 podjednostki katalityczne s wprawdzie identyczne, ale w kadym momencie funkcjonalnie nierwnowane: jedno miejsce katalityczne wystpuje w formie otwartej O i ma znikome powinowactwo do substratw, drugie (L) wie substraty luno i nie wykazuje aktywnoci katalitycznej, trzecie (T) wie substraty silnie i jest aktywne. W sytuacji T ATP, L ADP + Pi dostarczenie energii pobudza kaskad przej: T O, L T, O L. Protony przepywaj przez kana w syntazie ATP jedynie wwczas, gdy konformacje L, O i T wzajemnie w siebie przechodz. Te przejcia konformacyjne s powizane najprawdopodobniej przez zmiany w oddziaywaniach midzy podjednostkami syntazy. Jak wiadomo, substratami do syntezy ATP s ADP i Pi. Aby reakcja syntezy moga si dokona, oba one musz znale si w bezporednim ssiedztwie syntazy (tj. w matrix), dokd musz by przetransportowane przez odpowiednie przenoniki (por. punkt III-2-b). Do samego procesu syntezy ATP potrzebny jest przepyw przez kompleks F0F1 trzech protonw, jednak aby dostarczy do matrix czsteczk fosforanu nieorganicznego, zuywany jest jeszcze czwarty niezbdny do symportu z Pi. Poniewa utlenianie NADH w acuchu oddechowym jest rwnowane z transportem 4 + 4 + 2 = 10 protonw, zatem jedna czsteczka NADH niesie ze

- 56

sob tyle energii, ile potrzeba do syntezy 10 : 4 = 2,5 czsteczki ATP. Przez analogi utlenianie FADH2 przenosi przez bon 4 + 2 = 6 protonw, wic niesie energi odpowiadajc 6 : 4 = 1,5 czsteczki ATP. Jeeli natomiast zsyntetyzowana czsteczka ATP zostaje zuyta w obrbie matrix, to nie ma potrzeby symportu Pi (gdy jest on ju dostpny z hydrolizy ATP), zatem do syntezy 1 ATP potrzeba jedynie energii przepywu 3 protonw. W tej sytuacji utlenianie czsteczki substratu oddechowego przez dehydrogenazy zalene od NAD+ i acuch oddechowy dostarcza 3 czsteczek ATP, za przez dehydrogenazy zalene od FAD 2 czsteczek ATP: S-H2 + NAD+ S + NADH + H+ NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi NAD+ + 3 ATP S-H2 + FAD S + FADH2 FADH2 + 2 ADP + 2 Pi FAD + 2 ATP Pod pojciem trucizn oddechowych rozumie si zwizki chemiczne, ktre po dostaniu si do organizmu zaburzaj procesy oddychania komrkowego tj. hamuj acuch oddechowy, obniaj gradient protonw lub hamuj oksydacyjn fosforylacj. inhibitory acucha oddechowego Barbiturany (amobarbital, amytol), piericydyna A i rotenon zaburzaj przekazywanie elektronw z centrum Fe:S kompleksu I na CoQ. Dimerkaprol (BAL), antymycyna A i myksotiazol zaburzaj transport z cytochromu c1 na c. Siakowodr (H2S), tlenek wgla (CO), cyjanki (CN-) i azydki (N3-) hamuj aktywno oksydazy cytochromowej, m. in. przez wizanie si z atomami elaza hemowego. Karboksyna i TTFA (czynnik chelatujce Fe) zaburzaj przekazywanie rwnowanikw z SDH na CoQ. Malonian jest kompetycyjnym inhibitorem SDH. Zwizki rozprzgajce s to substancje amfipatyczne, zwikszajce przepuszczalno wewntrznej bony mitochondrialnej dla protonw, przez co zmniejszaj bonowy potencja elektrochemiczny i wywouj spicie syntazy ATP. W ich obecnoci procesy fizjologicznie zwizane (sprzone) acuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna przebiegaj niezalenie od siebie (acuch pompuje protony, a fosforylacja nie zachodzi) tzn. s rozprzeone, std nazwa. Do zwizkw takich zalicz si m. in.: 2,4dinitrofenol (DNP), dinitrokrezol, pentachlorofenol, m-chlorokarbonylocyjanidofenylohydrazon (CCCP) oraz karboksycyjanek-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP). inhibitory fosforylacji oksydacjnej Oligomycyna, wic si z podjednostk OSCP, cakowicie blokuje kompleks F0 protony nie przepywaj przez kana i fosforylacj nie zachodzi. Zwizki takie jak: atraktylozyd, karboksyatraktylozyd czy kwas bongkrekowy hamowanie przenonik antyportowy ADP / ATP. 7. Reaktywne formy tlenu (RFT, ang. ROS)

Wolne rodniki (oksydanty) to atomy, jony lub czsteczki zdolne do samodzielnego ycia, posiadajce na ostatnim orbitalu niesparowany elektron. Powstaj one w wyniku dziaania rnych czynnikw na materi: w reakcjach homolitycznego rozpadu wiza, wyrwania atomu wodoru, wyrwania elektronu, addycji lub oksydacji. Rodniki odznaczaj si ogromn reaktywnoci. W reakcjach przebiegajcych z ich udziaem wyrnia si 3 etapy: inicjacji dziaanie czynnikw: absorpcja, jonizacja (dziaanie promieniowaniem jonizujcym), sonifikacja (dziaanie ultradwikami), reakcja red-ox, prolongacji nie zmienia si nominalna ilo rodnikw, a jedynie waciwo ta przechodzi na rozmaite czsteczki nosicieli, terminacji kiedy w wyniku reakcji powstanie trway produkt. Rodniki powstaj w ywych komrkach, jak rwnie przenikaj do nich ze rodowiska zewntrznego. Do zjawisk odpowiedzialnych za generacj RFT zaliczamy m. in.: nieszczelno acucha oddechowego (1 4 %) dziaanie NADPH-oksydazy: 2 O2 + NADPH 2 O2-* + NADP+ + H+ dziaanie oksydazy ksantynowej (patrz punkt VI-4-d) toksyczne dziaanie wolnego elaza: Fe3+ + O2-* Fe2+ + O2 (reakcja Habera Weissa) Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + HO* (reakcja Fentona) O2-* + H2O2 Fe O2 + OH- + HO*

- 57

toksyczne dziaanie wolnej miedzi: Cu2+ + O2-* Cu+ + O2 Cu+ + H2O2 Cu2+ + OH- + HO* O2-* + H2O2 Cu O2 + OH- + HO* Do zewntrzkomrkowych rde wolnych rodnikw zaliczamy: spodki spoywcze, leki i chemikalia, zanieczyszczenia powietrza, ksenobiotyki domowe, tlen pod zwikszonym cinieniem, stres psychiczny, naraenie na promieniowanie. RFT s w maych steniach produkowane i wykorzystywane przez sam organizm w okrelonych celach. Fizjologicznie bior one udzia w: transporcie O2 przez HGB, aktywacji cytochromu P450, syntezie eikozanoidw oraz niszczeniu czynnikw zakanych bakterii, wirusw i grzybw. Jednak znaczne zwikszenie ich poziomu jest dla organizmu bardzo szkodliwe stan taki okrela si jako stres oksydacyjny. Przyczyn toksycznego dziaania RFT w organizmie jest gwnie rodnik hydroksylowy HO*. Przenosi on wasny elektron na rone molekuy i odszczepia od nich protony, przez co zapocztkowuje kaskad uszkodze. Peroksydacja lipidw markerem tego procesu jest stenie aldehydu dimalonowego (OHC-CH2CHO). Cholesterol wchodzcy w skad bon komrkowych (membranowy), jak rwnie stanowicy skadnik frakcji LDL lipoprotein, ulega utlenianiu do 7-oksocholesterolu; utlenianiu ulega rwnie apolipoproteina B, stanowica biakowy skadnik czsteczek LDL (patrz punkt V-3-a i b). Na poziomie bonowym obserwuje si: modyfikacj aktywnoci enzymw bonowych, utlenianie grup sulfhydrylowych (SH) biaek bonowych i nastpowe zmiany ich konformacji, wzrost przepuszczalnoci bon i konsekwentne rozprzgnicie transportu przez nie, modyfikacj stanu skupienia (pynnoci) oraz polaryzacji bon. Z kolei peroksydacja LDL powoduje zaburzenie ich rozpoznawania przez komrki wtrobowe, wobec czego zmiatane s przez makrofagi, ktre w wyniku przeadowania lipidami osiadaj w cianie naczy jako tzw. komrki piankowe; jest to istota powstawania blaszki miadycowej. Uszkodzenia biaek dotycz g. reszt bocznych aa. Uszkodzenie struktury biaka moe by wynikiem jego fragmentacji bd tworzenia wiza krzyowych midzy aa, co moe wpywa na aktywno enzymatyczn, podatno proteolityczn oraz waciwoci antygenowe. Najczstsze uszkodzenia to: oksydacyjna modyfikacja Cys i Met utlenianie atomu siarki, utlenianie metali w metaloproteinach, modyfikacje sacharydw w glikoproteinach, tworzenie wiza krzyowych g. H-H, H-W, H-Y, Y-Y, fragmentacja biaka: oksydacyjna modyfikacja Pro i hydroliza reszty Pro z powstaniem Nglutamylopeptydu bd powstanie endonadtlenku His. Uszkodzenia DNA mog dotyczy modyfikacji zasad azotowych, przemiany reszt cukrowej, rozerwania wizania glikozydowego lub fosfodiestrowego, powstania dimerw tymidynowych itp. puryny: atak na wizanie C7-C8 rozerwanie piercienia imidazolowego powstanie poch. pirymidyny, U 5-hydroksy-U, 5,6-dihydroksy-U, 5-hydroksymetylo-U, C 5-hydroksy-C, 5,6-dihydroksy-C, T 5,6-dihydro-T, glikol T, 5-hydroksy-6-hydro-T. Mechanizmy obronne komrek przed stresem oksydacyjnym: enzymatyczne: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) dysproporcjonowanie O2-*: 2 O2-* + 2 H+ H2O2 + O2 katalazy (CT) rozkad nadtlenku wodoru: H2O2 H2O + O2 peroksydazy, np. glutationowa rozkad H2O2 z wykorzystaniem zredukowanego substratu: H2O2 + S-H2 2 H2O + A nieenzymatyczne: biaka: obronne, np. albumina kontrolujce obieg metali Fe (ferrytyna, transferryna), Cu (cerulplazmina) witaminy: wit. C kwas askorbinowy antyoksydant fazy wodnej: askorbinian -2H dehydroaskorbinian wit. E tokoferol antyoksydant fazy lipidowej W reakcji zmiatania rodnika lipidowego sam przeksztaca si w form rodnikow, po czym na granicy fazy lipofilnej i hydrofilnej redukowany jest przez askorbinian. karotenoidy: wit. A (retinol), -, -, -karoteny antyoksydanty fazy lipidowej

- 58

zwizki niskoczsteczkowe: glutation (-glutamylocysteinyloglicyna) we wsppracy z peroksydaz glutationow: H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GSSG bilirubina zwizana z albumin (osocze) kwas moczowy (rdbonek, hepatocyty) melaniny eumelanina i feomelanina (skra) kreatynina, karnozyna, kwas -lipoinowy (tiooktanowy), flawonoidy rolinne 8. Utlenianie mikrosomalne

Monooksygenazy systemw mikrosomalnych wystpuj razem z cytochromami P450 i b5. NADH i NADPH dostarczaj rwnowanikw redukujcych do redukcji tych cytochromw, ktre z kolei s utlenianie przez substraty w cyklu hydroksylacyjnym. Takie mikrosomalne ukady hydroksylacyjne wystpuj w: wtrobie, gdzie bior udzia w: przemianie poch. wit. D (hydroksylacja w pozycji 25), syntezie kwasw ciowych (patrz punkt V-9) detoksykacji ksenobiotykw, m. in. benzopirenu, aminopiryny, aniliny, morfiny, benzofelaminy, w nerkach, gdzie bior udzia w przemianie pochodnych wit. D (hydroksylacja w pozycjach 1 lub 24) (patrz punkt V-10 oraz VII-2-b) w korze nadnerczy, gonadach i oysku) gdzie bior udzia w steroidogenezie (hydroksylacja w pozycjach 11, 17 i 21) (patrz punkt V-11). Schemat mikrosomalnej hydroksylacji: A-H + P450-Fe3+ H-A-P450-Fe3+ H-A-P450-Fe3+ + e- H-A-P450-Fe2+ H-A-P450-Fe2+ + O2 H-A-P450-Fe2+-O2 H-A-P450-Fe2+-O2 + e- H-A-P450-Fe2+-O2-* H-A-P450-Fe2+-O2-* + 2 H+ P450-Fe3+ + A-OH + H2O Reakcje reduktazy NADPH cytochrom P450 (dostarczanie 2 H+ i 2 e-): NADPH + H+ + FAD NADP+ + FADH2 FADH2 + 2 Fe2S23+ FAD + 2 Fe2S22+ + 2 H+ + 2 e9. Cykl Krebsa = cykl kwasu cytrynowego = cykl kwasw trjkarboksylowych (TCA)

Cyklem Krebsa nazywamy cig reakcji zachodzcych w matrix mitochondrialnej, polegajcy na katabolizmie reszt acetylowych (kwasu octowego) z uwolnieniem rwnowanikw wodorowych. Rola cyklu jest dwojaka. Po pierwsze dostarcza on substratw dla acucha oddechowego w postaci atomw wodoru przenoszonych na FAD i NAD+, ponadto dostarcza energii poprzez fosforylacj substratow. Po drugie stanowi wzowy punkt metabolizmu, gdy kocz si na nim lub od niego zaczynaj liczne szlaki metaboliczne: jest to punkt kocowy katabolizmu podstawowych skadnikw pokarmowych (wglowodanw, lipidw i biaek), jak rwnie punkt wyjcia dla: glukoneogenezy, syntezy KT, transaminacji i dezaminacji. Enzymy cyklu zlokalizowane s w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej albo przyczone do wewntrznej powierzchni wewntrznej bony mitochondrialnej uatwia to przenoszenie rwnowanikw redukujcych na odpowiednie enzymy acucha oddechowego, umiejscowionego przecie rwnie w wewntrznej bonie mitochondrialnej. a) reakcje cyklu

kondensacja: CH3CO-CoA (AcCoA) + HOOC-CO-CH2-COOH (szczawiooctan) + H2O syntaza cytrynianowa HOOC-CH2-C(OH)(COOH)-CH2-COOH (cytrynian) + CoA izomeryzacja reakcj t hamuje fluorocytrynian: cytrynian akonitaza (hydrataza akonitanowa), -H2O HOOC-CH2-C(COOH)=CH-COOH (cis-akonitan) akonitaza, Fe2+, +H2O HOOC-CH2-CH(COOH)-CH(OH)-COOH (izocytrynian)

- 59

dehydrogenacja ((*): NAD+ mitochondrium; NADP+ mitochondrium / cytozol): izocytrynian + NAD+ dehydrogenaza izocytrynianowa (*) HOOC-CH2-CH(COOH)-CO-COOH (szczawiobursztynian) + NADH + H+ dekarboksylacja: szczawiobursztynian dehydrogenaza izocytrynianowa, -CO2 HOOC-CH2-CH2-CO-COOH (-ketoglutaran) oksydacyjna dekarboksylacja (patrz punkt III-10) reakcj t hamuje arsenin i Hg2+: -ketoglutaran + NAD+ + CoA kompleks oksydazy -KG, -CO2 HOOC-CH2-CH2-CO~CoA (sukcynylo-CoA) + NADH + H+ oksydacyjna fosforylacja: sukcynylo-CoA + GDP + Pi syntetaza sukcynylo-CoA = tiokinaza bursztynianowa (tworzca GDP/ADP) HOOC-CH2-CH2-COOH (bursztynian) + GTP + CoA GTP + ADP GDP + ATP dehydrogenacja katalizuje jedyny enzym bonowy szlaku; reakcja hamowana przez malonian: bursztynian dehydrogenaza bursztynianowa HOOC-CH=CH-COOH (cis) (fumaran) hydratacja: fumaran + H2O fumaraza (hydrataza fumaranowa) HOOC-CH(OH)-CH2-COOH (L-jabczan) dehydrogenacja: L-jabczan + NAD+ dehydrogenaza jabczanowa HOOC-CO-CH2-COOH (szczawiooctan) + NADH + H+ b) bilans energetyczny cyklu dehydrogenaza izocytrynianowa dehydrogenaza -ketoglutaranowa syntetaza sukcynylo-CoA dehydrogenaza bursztynianowa dehydrogenaza jabczanowa NAD NAD substrat. FAD NAD 3 3 1 2 3 12 moli ATP

c)

powizania z innymi szlakami amfiboliczno cyklu wglowodany: glukoneogeneza (patrz punkt IV-4-b): szczawiooctan + GTP/ITP karboksykinaza {P}-enolopirogronianowa (PEPCK) {P}-enolopirogronian (PEP) + CO2 + GDP/IDP PEP glukoza konwersja do szczawiooctanu: pirogronian + CO2 + H2O + ATP karboksylaza pirogronianowa, biotyna (wit. H) szczawiooctan + ADP + Pi lipidy (patrz punkt V-6-a): AcCoA (matrix) cytynian liaza ATP-cytrynian AcCoA (cytozol) synteza KT aminokwasy punkty wejcia szkieletw wglowych aa do cyklu Krebsa patrz punkt VI-3

d) regulacja cyklu oglna: kontrola oddechowa (acuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna) poda utlenianych kofaktorw dehydrogenaz dostpno ADP szybko zuywania ATP wysiek organizmu

- 60

wewntrzna: dehydrogenaza -ketoglutaranowa czynniki regulacji jak PDH (patrz punkt III-10) syntaza cytrynianowa hamowanie przez ATP i dugoacuchowe KT dehydrogenaza izocytrynianowa hamowanie przez ATP i NADH dehydrogenaza bursztynianowa hamowanie przez szczawiooctan dehydrogenaza jabczanowa stosunek [NADH]/[NAD+] 10. Kompleks oksydazy -ketokwasw W skad kompleksu oksydazy -ketokwasw wchodz po 6 acuchw kadego z trzech skadowych enzymw: swoistej dehydrogenazy (pirogronianowa, -ketoglutaranowa), transferazy dihydrolipoamidowej oraz dehydrogenazy dihydrolipoamidowej, jak rwnie 5 kofaktorw: DPT, kwas liponowy, CoA, FAD oraz NAD+. Kompleks stanowi regularny przestrzenny ukad, poszczeglne skadowe s do stale przyczone i maj ograniczone moliwoci ruchu. Zasada dziaania zostanie dokadnie omwiona na przykadzie kompleksu PDH. Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) katalizuje oksydacyjn dekarboksylacj pirogronianu do AcCoA, przez co stanowi pomost m. in. pomidzy szlakiem glikolizy, a cyklem Krebsa i syntez KT. Na jeden cykl pracy kompleksu skada si 5 reakcji. W pierwszej pirogronian ulega poczeniu z koenzymem difosforanem tiaminy (TDP; poch. wit. B1) i dekarboksylacji: CH3COCOOH PDH CH3-C(OH)-[TDP] (hydroksyetyl) + CO2 W nastpnej hydroksyetyl ulega przeniesieniu z TDP na kolejny kofaktor kompleksu lipoamid (poczenie kwasu liponowego z reszt Lys): hydroksyetyl acetylotransferaza dihydrolipoamidowa acetylolipoamid W trzeciej reakcji reszta acetylowa ulega przeniesieniu z lipoamidu na CoA, w wyniku czego powstaje produkt AcCoA: Ac-lipoamid + CoA dihydrolipoamid + AcCoA Poniewa produktem 3. reakcji jest lipoamid w formie zredukowanej, tote w 4. nastpuje jego regeneracja z udziaem FAD: dihydrolipoamid + FAD dehydrogenaza dihydrolipoamidowa lipoamid + FADH2 Powstay FADH2 przekazuje atomy wodoru na NAD+, co stanowi wyjtkowe i niespotykane nigdzie indziej przejcie: FADH2 + NAD+ FAD + NADH + H+ Zredukowana forma NADH + H+ stanowi substrat acucha oddechowego. Kompleks PDH wraca do stanu wyjciowego i moe rozpocz kolejny cykl pracy. Regulacja pracy kompleksu opiera si na: allosterycznym hamowaniu przez produkty kocowe (AcCoA i NADH) modyfikacjach kowalencyjnych w postaci odwracalnej fosforylacji (aktywno wykazuje forma zdefosforylowana): kinaza kompleksu PDH hamowana jest przez Ca2+, pirogronian (substrat) i dwuchlorooctan, za aktywowana przez wysokie wartoci stosunkw: [AcCoA]/[CoA], [NADH]/[NAD+] oraz [ATP]/[ADP], fosfataza aktywowana jest przez: Ca2+, Mg2+ oraz insulin. W analogiczny sposb funkcjonuje kompleks dehydrogenazy -ketoglutaranowej, stanowicy jeden z enzymw cyklu Krebsa. Rol substratu peni tu -ketoglutaran, a produktu sukcynylo-CoA. (por. punkt III-9-a)

- 61

ROZDZIA IV WGLOWODANY
1. Budowa chemiczna, waciwoci i funkcje cukrw prostych i zoonych klasyfikacja wglowodanw monosacharydy triozy (C3), tetrozy (C4), pentozy (C5), heksozy (C6), heptozy (C7) aldozy (polihydroksyaldehydy) / ketozy (polihydroksyketony) oligosacharydy: disacharydy, trisacharydy itd. polisacharydy homoglikany / heteroglikany pentozany / heksozany monosacharydy Stereoizomeria monosachrydw: Izomery konfiguracyjne D i L (enancjomery) przynaleno zaley od tego, po ktrej stronie wystepuje grupa hydroksylowa przy ostatnim asymetrycznym atomie wgla. Skrcalno optyczna roztworw w prawo (+) bd w lewo (-) jest niezalena od izomerii D L. Rwnomolow mieszanin obu izomerw nazywamy recematem (mieszanin racemiczn, DL-mieszanin); w wyniku znoszenia si izomerii optycznej obu izomerw nie wykazuje ona aktywnoci optycznej. Piranozowe i furanozowe formy piercieniowe poprzez dziaanie grupy karbonylowej na reszty hydroksylowe, pooone przy dalszych atomach wgla, powstaj picio- i szecioczonowe cykliczne formy monosacharydw. Przez podobiestwo ich budowy furanu lub piranu nazywamy je odpowiednio furanozami i piranozami. Powstanie form cyklicznych, tj. hemiacetali i hemiketali powoduje wystpienie dodatkowego asymetrycznego atomu wgla. Mwimy przez to o anomerach i : anomer wystpuje, gdy grupa karboksylowa przy atomie wgla hemi znajduje si po przeciwnej stronie ni reszta przy ostatnim atomie wgla tworzcym piercie, gdy za obie grupy znajduj si po tej samej stronie jest to anomer . W roztworze ustala si stan rwnowagi pomidzy obiema formami, co nosi nazw mutarotacji. Epimerami nazywamy czsteczki rnice si konfiguracj grup hydroksylowych przy atomach C2-C4. Szereg D-aldoz: aldehyd D-glicerynowy D-treoza D-liksoza D-taloza D-Gal Szereg D-ketoz: dihydroksyaceton D-erytruloza D-ksyluloza D-tagatoza D-sorboza D-fruktoza D-rybuloza D-psikoza D-sedoheptuloza D-ksyloza D-idoza D-guloza D-erytroza D-arabinoza D-ryboza D-Man D-Glc D-altroza D-alloza

a)

Pochodne monosacharydw: estry fosforany, np. PGAL, G-6-{P} siarczany (skadowe GAG) deoksycukry = alditole, np. deoksyryboza, fukoza, rybitol aminocukry, np. GlcNH2, GalNH2, ManNH2 kwasy ( laktony) aldonowe aldarowe alduronowe, np. GlcUA, IdUA, GulUA

- 62

glikozydy (brak mutarotacji) O-glikozydy (acetale) N-glikozydy S-glikozydy b) disacharydy posiadaj waciwoci redukujce, jeeli w budowie wizania O-glikozydowego nie bior udziau jednoczenie oba aromatyczne atomy wgla przedstawiciele: maltoza: -D-Glc 14 -D-Glc sacharoza: -D-Fru 21 -D-Glc laktoza: -D-Gal 14 -D-Glc trehaloza: -D-Glc 11 -D-Glu polisacharydy homoglikany skrobia glukazon, najwaniejsze rdo wglowodanw w pokarmie amylaza (15 20 %): -D-Glc 14 amylopektyna (80 85 %): -D-Glc 14 i 16 (raz na 24 30 reszt) glikogen zwierzca skrobia, polisacharyd zapasowy zwierzt -D-Glc 14 i 16 (raz na 12 14 reszt bardziej rozgaziony ni skrobia) inulina fruktazon, zoony z ok. 30 reszt Fru 12; uywana do bada klirensu nerkowego dekstryny pprodukty hydrolizy skrobii bonnik (celuloza) (-D-Glc 14) masowy skadnik poywienia, nie ulegajcy trawieniu chityna (-D-GluNAc 14) skadnik pancerzy bezkrgowcw heteroglikany GAG (glikozoaminoglikany, mukopolisacharydy, luzowielocukry) [GluNAc lub GalNAc + GlcUA lub IdUA]n kwas sialowy (SA) = kwas neuraminowy (NA) + X; np. N-Ac-Neu (NeuAc, NANA) NA (C9) = ManNH2 (C6) + Pyr (C3) glikany proteoglikanw: (GAGn + proteina)m + HA glikany glikoprotein glikany glikolipidw Trawienie wglowodanw i jego zaburzenia Amylaza linowa (optimum 6,6-6,8, wymaga Cl-) rozkada skrobi i glikogen do maltozy i innych oligosacharydw przez hydroliz wiza 14. Ulega unieczynnieniu w pH < 4, dlatego jest nieaktywna w kwanej treci odka. -amylaza trzustkowa (optimum 7,1) rozkada skrobi i glikogen do maltozy, maltotriozy, dekstryn granicznych nierozgazionych oligosacharydw i niewielkiej iloci wolnej glukozy. Sok jelitowy zawiera swoiste oligo- i disacharydazy: maltaza -glukozydaza (optimum 5,8-6,2) odszczepia pojedyncze reszty cukrowe od sacharydw z wizaniem (1,4), rozpoczynajc od koca nieredukujcego kompleks sacharaza izomaltaza (optimum 5-7) po rozdzieleniu enzymy staj si aktywne, hydrolizujc sacharoz i wizania (1,6) dekstryn laktaza -glikozydaza (optimum 5,4-8,0) odszczepia galaktoz od laktozy, atakuje celobioz i inne -glikany, druga domena katalityczna rozszczepia glikozyloceramidy trehalaza katalizuje hydroliz trehalozy Zaburzenia trawienia: Niedobr laktazy jest przyczyn nietolerancji laktozy, sprowadzajcej si do nietolerancji mleka. Wyrnia si niedobr dziedziczny (pierwotny spowodowany mutacj genu) oraz wtrny towarzyszcy chorobom jelit, zabiegom operacyjnym na jamie brzusznej itp. Obecno w wietle jelita nie rozoonej laktozy substancji czynnej osmotycznie powoduje biegunki osmotyczne. Z kolei jej bakteryjna fermentacja dostarcza duej ilo produktw gazowych, dranicych jelito i przez to wywoujcych wzdcia i ble brzucha. Niedobr aktywnoci sacharazy i izomaltazy wywouje podobne zjawiska.

c)

2.

- 63

Disacharyduria to zaburzenie trawienia niektrych disacharydw, ktre w tej sytuacji wchaniane s w formie nie rozoonej i w zwikszonej iloci wydalane s z moczem (np. 300 mg/d). Wadliwe wchanianie monosacharydw dotyczy Gal i Glc (defekt SGLT-1) lub Fru i sorbitolu 3. a) Wchanianie i transport wglowodanw transport aktywny i bierny, biaka transportujce W wietle jelita aktywne s skupiska disacharydaz poczone z rbkiem szczoteczkowym komrek nabonkowych. Produkty trawienia wglowodanw wchaniane s z jelita czczego do krenia wrotnego w postaci monosacharydw, w tym gwnie pentoz i heksoz. Proces wchaniania odbywa si przez dyfuzj prost oraz transport aktywny. Ten ostatni jest bardziej wybirczy i wymaga okrelonej budowy transportowanej czsteczki: konfiguracji grupy hydroksylowej przy C2 jak w glukozie, piercienia piranozowego oraz obecnoci przy C5 grupy metylowej lub jej pochodnej. Transport glukozy i galaktozy odbywa si przez przenoniki zalena lub nie od Na+. Przenoniki kotransportowe (SGLT-1) przenosz jednoczenie czsteczk glukozy i kation Na+, przez co wspdziaaj z Na+/K+-ATPaz; transport ten mona wic zahamowa ouabain (inhibitor pompy Na+) lub florazyn (inhibitor reabsorpcji nerkowej). Na komrce nabonkowej wystpuj ponadto przenoniki niezalene od Na+ GLUT. Fruktoza wchania si wzgldnie wolno, biernie, przez przenonik GLUT-5.

Charakterystyka transporterw glukozy: lokalizacja mzg, nerki, jelito grube, oysko, erytrocyty wtroba, komrki wysp, jelito cienkie, nerki mzg, nerki, oysko serce, minie, tkanka tuszczowa jelito cienkie jelito cienkie, nerka rola pobieranie glukozy szybkie pobieranie / uwalnianie glukozy pobieranie glukozy pobieranie glukozy zal. od insuliny wchanianie glukozy aktywny transport zal. od Na+

przenonik GLUT-1 GLUT-2 GLUT-3 GLUT-4 GLUT-5 SGLT-1

b) zrnicowanie tkankowe transportu

- 64

c)

rola insuliny (patrz rwnie punkt IV-8-b) mechanizm wydzielania insuliny: Glc ATP zamknicie kanaw K+ zal. od ATP depolaryzacja bony otwarcie kanaw Ca2+ zal. od potencjau napywa Ca2+ do komrki egzocytoza pcherzykw zawierajcych insulin dziaanie insuliny: mobilizacja i przeniesienie na powierzchni bony przenonika GLUT-4 (minie, tkanka tuszczowa) modyfikacja ekspresji genw enzymw (wtroba) wpyw na regulacj insulinow: zwizki endogenne: egzocytoz insuliny zwikszaj aa i WKT, za zmniejszaj aminy katecholowe doustne leki p/cukrzycowe: poch. sulfonylomocznika (np. tolbutamid) oraz glinidy (np. repaglinid) przyczaj si w pobliu kanaw K+ zal. od ATP i blokuj go, przez co zwikszaj egzocytoz insuliny glitazony (np. troglitazon) bezporednio modyfikuj transkrypcj biaek, w tym enzymatycznych, podlegajcych kontroli insuliny

d) rola fosforylacji monosacharydw Fosforylacja monosacharydw peni istotn rol w ich transporcie. Heksokinaza ma due powinowactwo do heksoz (1 / KM = 20 1/mM), dlatego funkcjonuje jako transporter cukrw do tkanek; cechuje si ma swoistoci. Glukokinaza z kolei ma du swoisto i mae powinowactwo (1 / KM = 0,1 1/mM), std bierze udzia w regulacji stenia glukozy do krwi; wystpuje w wtrobie i trzustce. Dziki takiemu ukadowi po posiku glukoza transportowana jest do wtroby i zuywajcych j tkanek, natomiast w stanie midzy posikami wtroba oddaje glukoz do krwi, a tkanki obwodowe stale j zuywaj. 4. a) Metabolizm glukozy glikoliza (szlak Embdena Meyerhoffa Parnasa = EMP) lokalizacja komrkowa: cytozol; miejsca aktywne glikolitycznie skupione s w kompleksy majce posta maych organelli komrkowych glikolizosomw; enzymy szlaku zaadsorbowane s na bonach ER znaczenie glikolizy: podstawowa droga katabolizmu glukozy do AcCoA gwny szlak metabolizmu pokarmowej fruktozy i galaktozy moe zachodzi w warunkach beztlenowych, przez co dostarcza energii tkance miniowej nawet w stanie niedotlenienia stanowi jedyne rdo energii dla komrek pozbawionych moliwoci oddychania tlenowego pozbawionych mitochondriw (np. erytrocyty) przebieg glikolizy: oglne rwnanie: Glc + 2 ADP + 2 Pi 2 L-mleczan + 2 H2O + 2 ATP fosforylacja: Glc + ATP heksokinaza, Mg2+ Glc-6-{P} + ADP Reakcja ta traktowana jest za fizjologicznie nieodwracaln dziki uwalnianiu energii w postaci ciepa. Ma miejsce allosteryczne hamowanie przez produkt. Rodzaje heksokinazy: glukokinaza wtrobowa galaktokinaza wtrobowa fruktkinaza nie tylko wtrobowa mzgowa oddziauje z bon mitochondrialan izomeryzacja aldoketozowa: -D-Glc-6-{P} izomeraza fosfoheksozowa -D-Fru-6-{P}

- 65

fosforylacja: D-Fru-6-{P} + ATP fosfofruktokinaza-1 (PFK-1) D-Fru-1,6-bis-{P} + ADP Reakcja jest fizjologicznie nieodwracalna, ma ponadto due znaczenie w regulacji glikolizy. rozszczepienie: D-Fru-1,6-bis-{P} aldolaza D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy (PGAL) + {P}-dihydroksyaceton Aldolaza wystpuje w mzgu, wtrobie i miniach. Skada si z 4 podjednostek. Izoenzym A, obecny w wikszoci tkanek, sabo przeprowadza reakcj Fru-1-{P} PGAL + {P}-dihydroksyaceton, za izoenzym B, wystpujcy w wtrobie i nerce, przeprowadza obie reakcje z podobnym powinowactwem. Przy niedoborze aldolazy wystpuje wrodzona nietolerancja Fru. Z kolei wzrost tej aktywnoci obserwuje si przy zawale serca, w zapaleniu wtroby, przy dystrofiach. izomeryzacja: D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy izomeraza fosfotriozowa {P}-dihydroksyaceton utlenianie i fosforylacja: D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy + NAD+ + Pi dehydrogenza PGAL 1,3-bis-{P}-glicerynian + NADH + H+ Dehydrogenaza PGAL jest tetramerem, a kada podjednostka posiada 4 grupy SH, z czego jedna wchodzi w skad centrum katalitycznego. Ten etap szlaku blokowany jest przez jodooctan. fosforylacja substratowa 1,3-bis-{P}-glicerynian + ADP kinaza fosfoglicerynianowa, Mg2+ 3-{P}-glicerynian + ATP W tej reakcji arsenian rozprzga procesy utleniania i fosforylacji nie powstaje ATP. izomeryzacja katalizowana przez mutaz fosfoglicerynianow 3-{P}-glicerynian 2,3-bis-{P}-glicerynian 2-{P}-glicerynian dehydratacja 2-{P}-glicerynian enolaza, Mg2+/Mn2+ {P}-enolopirogronian (PEP) + H2O Reakcj t hamuje obecno fluorkw, dlatego dodaje si je do krwi pobieranej w celu oznaczenia poziomu glukozy. fosforylacja substratowa PEP + ADP kinaza pirogronianowa, Mg2+ enolopirogronian + ATP enolopirogronian spontaniczna izomeryzacja pirogronian (w formie ketonowej) Reakcj t uwaa si za fizjologicznie nieodwracaln. Jest ona hamowana przez alanin. Kinaza pirogronianowa wystpuje w kilku formach: R (erytrocyty), L (wtroba), M1 i M2 (mzg i minie). redukcja (w warunkach beztlenowych) pirogronian + NADH + H+ dehydrogenza mleczanowa (LDH) L-mleczan + NAD+ LDH posiada 5 izoenzymw, ktrych oznaczenie stosowano przy diagnostyce zawau serca (H4) oraz funkcji wtroby. bilans energetyczny: dehydrogenaza PGAL kinaza {P}-glicerynianowa kinaza pirogronianowa fosforylacja heksoz: LDH warunki tlenowe: 8 ATP warunki beztlenowe: 2 ATP

utlenianie 2 NADH fosforylacja substratowa fosforylacja substratowa heksokinaza PFK-1 2 NADH

3x2=6 1x2=2 1x2=2 1 1 3x2=6

regulacja: heksokinaza (-) Glc-6-{P} (produkt reakcji) PFK-1 (+) Fru-6-{P}, Fru-2,6-bis-{P} (-) pH (prewencja kwasicy), ATP (znosi to AMP), cytrynian ( cykl Krebsa) Fru-1,6-bis-{P} (produkt) ( (-) cAMP)

- 66

kinaza pirogronianowa (+)Fru-1,6-bis-{P} (-) alanina, cAMP ( (+) glukagon) dalsze moliwe losy pirogronianu: transaminaza alanina cykl Glu-Ala LDH mleczan cykl Cori karboksylaza pirogronianowa szczawiooctan, jabczan cykl Krebsa dehydrogenza pirogronianowa AcCoA cykl Krebsa / synteza kwasw tuszczowych dekarboksylaza pirogronianowa aldehyd octowy dehydrogenaza alkoholowa etanol (bakterie) W erytrocytach zachodzi alternatywny szlak glikolizy, rnicy si ominiciem reakcji kinazy fosfoglicerynianowej, za wytworzona z 1,3-bis-{P}-glicerynianu energia ulega rozproszeniu. Pozwala to na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP (wystpuje minimalny zysk energetyczny w postaci 1 ATP). Ponadto syntetyzowany jest 2,3-bis-{P}-glicerynian (BPG) allosteryczny regulator, przesuwajcy w prawo krzyw wysycenia hemoglobiny, co w efekcie uatwia oddawanie tlenu do tkanek. 1,3-bis-{P}-glicerynian mutaza bisfosfoglicerynianowa 2,3-bis-{P}-glicerynian (BPG) BPG fosfataza 2,3-bis-{P}-glicerynianowa 3-{P}-glicerynian + Pi

b) glukoneogeneza Przez glukoneogenez rozumiemy wszystkie mechanizmy i szlaki metaboliczne odpowiedzialne za przeksztacanie zwizkw niewglowodanowych w glukoz lub glikogen. lokalizacja Peen zestaw enzymw niezbdnych do glukoneogenezy zawieraj wtroba i nerki. Enzymy zlokalizowane s w matriks mitochondrialnej (karboksylaza pirogronianowa), w cytozolu (karboksykinaza PEP i Fru-1,6-bisfosfataza) oraz na bonach ER (Glc-6-fosfataza). Znaczenie zaspokajanie zapotrzebowania organizmu na glukoz przy niedostatecznej poday wglowodanw w diecie. Pomimo, i energetyczne potrzeby organizmu mog by zaspokajane przez inne zwizki, dla niektrych przemian metabolicznych niezbdna jest glukoza (energia dla ukadu nerwowego, erytrocytw, mini pracujcych w deficycie tlenowych, pokarm dla podu, glicerol dla tkanki tuszczowej, galaktoza do syntezy mleka). Ponadto za porednictwem tego szlaku usuwane s z krenia produkty metabolizmu innych tkanek (mleczan, glicerol, proponian). przebieg Glukoneogeneza obejmuje reakcje glikolizy, cyklu Krebsa oraz niektre reakcje specjalne. Przebieg glikolizy nie moe zosta w prosty sposb odwrcony, dlatego w dodatkowych reakcjach omijane s jej bariery termodynamiczne. pirogronian PEP translokacja pirogronianu do mitochondrium karboksylacja: pirogronian + CO2 + ATP karboksylaza pirogronianowa, biotyna (wit. H), Mg2+ szczawiooctan + ADP + Pi przeniesienie do cytozolu: wejcie w cykl Krebsa przeksztacenie w jabczan translokacja powrt do szczawiooctanu dekarboksylacja: szczawiooctan + GTP karboksykinaza PEP (PEPCK) PEP + GDP + CO2 Fru-1,6-bis-{P} Fru-6-{P} Reakcja katalizowana jest przez swoist Fru-1,6-bisfosfataz. Jej obecno warunkuje, czy dana tkanka zdolna jest do syntezy glikogenu z fosfokinaz; zdolno t posiadaj: wtroba, nerki i misie. Glc-6-{P} Glc Reakcja katalizowana jest przez swoist Glc-6-fosfataz, obecn w wtrobie i nerce, co pozwala tym narzdom na oddawanie glukozy do krwi. Glc-6-{P} glikogen Reakcja ma odmienny przebieg i zwizana jest z utworzeniem UDP-Glc przez syntaz glikogenow.

- 67

bilans energetyczny: karboksylaza pirogronianowa PEPCK kinaza {P}-glicerynianowa dehydrogenaza PGAL 2 NADH

2 ATP 2 ATP 2 ATP + 6 ATP 6 ATP

wczenie glikogenu: glicerol + ATP kinaza glicerolowa (wtroba, nerka) glicerolo-3-{P} + ADP glicerolo-3-{P} + NAD+ dehydrogenaza glicerolo-3-{P} {P}-dihydroksyaceton + NADH + H+

metabolizm propionianu: propionian + CoA + ATP syntetaza acylo-CoA, Mg2+ propionylo-CoA + AMP + PPi propionylo-CoA + CO2 + H2O + ATP karboksylaza propionylo-CoA, wit. H D-metylomalonylo-CoA + ADP + Pi D-metylomalonylo-CoA racemaza metylomalonylo-CoA L-metylomalonylo-CoA L-metylomalonylo-CoA mutaza metylomalonylo-CoA, wit. B12 sukcynylo-CoA sukcynylo-CoA cykl Krebsa

regulacja glikolizy i glukoneogenezy indukcja i represja syntezy enzymw obfito glukozy + insulina + glukagon, GKS +

enzymy gliko- i lipolizy enzymy glukoneogenezy

kowalencyjna modyfikacja przez odwracaln fosforylacj glukagon, A AC cAMP kinaza biakowa zal. od cAMP fosforylacja i inaktywacja kinazy Pyr modyfikacje allosteryczne karboksylaza Pyr

fosfofruktokinaza-1 (PFK-1)

- 68

c)

szlak pentozofosforanowy (szlak Warburga Dickensa Horeckera = WDH; ang. pentose phosphate pathway = PPP) lokalizacja Enzymy szlaku stanowi skadnik cytozolu. Cykl przeprowadzany jest g. przez wtrob, nadnarcze, tarczyc i gruczo piersiowy. W erytrocytach przetwarzane jest w ten sposb do 10 % glukozy, a powstae rwnowaniki redukujce zuywane s do regeneracji GSH, zabezpieczajcego przed skutkami stresu oksydacyjnego i hemoliz. znaczenie PPP jest alternatywn drog metabolizmu glukozy. Dostarcza NADPH do syntez redukcyjnych, np. biosyntezy KT i steroidogenezy, oraz rybozy do syntezy nukleotydw i koenzymw. porwnanie z glikoliz glikoliza NAD+ produkt PPP NADP+ obecny produkt

akceptor H CO2 ATP rybozo-{P} przebieg

oglne rwnanie: 3 Glc-6-{P} + 6 NADP+ 2 Glc-6-{P} + 3 PGAL + 3 CO2 + 6 NADPH + 6 H+ etap oksydacyjny wytwarzanie NADPH Glc-6-{P} + NADP+ dehydrogenaza Glc-6-{P}, Mg2+/Ca2+ 6-{P}-glukonolakton + NADPH + H+ 6-{P}-glukonolakton + H2O hydrolaza glukonolaktonowa, Mg2+/Mn2+/Ca2+ 6-{P}-glukonian 6-{P}-glukonian + NADP+ dehydrogenaza 6-{P}-glukonianowa 3-keto-6-{P}-glukonian + NADPH + H+ 3-keto-6-{P}-glukonian rybulozo-5-{P} + CO2 etap nieoksydacyjny wytwarzanie prekursorw rybozy

d) niektre zaburzenie przemian glukozy Kwasica mleczanowa wystpuje m. in. przy zatruciu As i Hg, niedoborze wit. B1, w dziedzicznym niedoborze dehydrogenazy Pyr, cukrzycy typu II.

- 69

5. a)

Anemia hemolityczna jest m. in. objawem dziedzicznego niedoboru aldolazy A i kinazy Pyr w erytrocytach. Deficyt aktywnoci PFK w miniach maa wydolno wysikowa. Glukozuria = obecno glukozy w moczu w nastpstwie przekroczenia progu nerkowego dl tego zwizaku. Niedobr Fru-1,6-bisfosfatazy zablokowanie glukoneogenezy nagromadzenie mleczanu kwasica mleczanowa i hipoglikemia. Hipoglikemia moe by efektem upoledzenia utleniania KT, przedawkowania lekw p/cukrzycowych (insulina lub leki doustne), wystpowa w ciy i u noworodkw. Fawizm choroba spowodowana niedoborem aktywnoci dehydrogenazy Glc-6-{P}, co powoduje zahamowanie PPP deficyt GSH w erytrocytach oporno hemolityczna napadowa hemoliza po spoyciu zwizkw utleniajcych (kwas acetylosalicylowy, sulfonamidy, primarchina, ziarna bobu (ac. vicia fava std nazwa)). Dziedziczna samoistna pentozuria niedobr aktywnoci enzymu redukujcego ksyluloz w ksilitol obecno w moczu znacznych iloci ksylulozy. Metabolizm glikogenu synteza glikogenu = glikogenogeneza (g. minie i wtroba) Glc heksokinaza / glukokinaza Glc-6-{P} Glc-6-{P} fosfoglukomutaza, Mg2+ Glc-1,6-bis-{P} fosfoglukomutaza, Mg2+ Glc-1-{P} Glc-1-{P} + UTP pirofosforylaza UDP-Glc UDP + PPi PPi + H2O nieorganiczna pirofosfataza 2 {P} UDP-Glc + (C6)n syntaza glikogenowa UDP + (C6)n+1

Ostatnia reakcja moe jedynie docza glukoz do ju istniejcego acucha, dlatego do zapocztkowania syntezy potrzebny jest primer biako glikogenina posiadajce przyczone do Tyr 4 reszty glukozowe. Enzym rozgaziajcy posiada aktywno amylo-[14][16]-transglukozydazy: gdy acuch staje si zbyt dugi, enzym ten odcina jego cz, tworzc ze boczne odgazienie. Wraz ze zwikszaniem liczby nieredukujcych reszt kocowych zwiksza si w czsetczce glikogenu cakowita liczba miejsc zdolnych do reakcji, umoliwiajc przyspieszenie zarwno glikogenogenezy, jak i glikogenolizy.

b) fosforoliza glikogenu = glikogenoliza Glikogenoliza nie jest prostym odwrceniem glikogenogenezy, lecz stanowi zupenie inny szlak przemian. (C6)n + {P} fosforylaza (C6)n-1 + Glc-1-{P} Enzym odgaziajcy posiada podwjn aktywno: [14][14]-transferazy glukonowej: przenosi trjsacharydow jednostk z bocznej gazi na acuch prosty i odsania wizanie [16], amylo-[16]-glukozydazy: odcina reszt glukozy odgazionej, w wyniku czego w procesie rozkadu glikogenu powstaje niewielka ilo wolnej glukozy. Glc-1-{P} fosfoglukomutaza, Mg2+ Glc-6-{P} Glc-6-{P} + H2O Glc-6-fosfataza Glc + {P} Glukozo-6-fosfataza wystpuje jedynie w wtrobie i w nerce, umoliwiajc tym narzdom eksport wolnej glukozy z komrek do krwi.

- 70

c)

integracja regulacji glikogenogenezy i glikogenolizy

Regulacja metabolizmu glikogenu jest efektywna dziki rwnowadze midzy aktywnociami syntazy glikogenowej i fosforylazy. Fosforylaza glikogenu wystpuje w formie (a) ufosforylowanej oraz w formie (b) zdefosforylowanej. Fosforylaza miniowa jest dimerem, zawiera PLP; forma (a) jest zawsze aktywna, za forma (b) jedynie w obecnoci AMP, powstajcego podczas wysiku. Aktywacji skurczu minia i glikogenolizy zapocztkowywana jest przez to samo biako wice Ca2+, zapewniajc synchronizacj tych procesw. Fosforylaza wtrobowa jest tetramerem, forma (a) jest aktywna, zas forma (b) nieaktywna. Kinaza fosforylazy skada si z 4 rodzajw podjednostek w stosunku stechiometrycznym ()4: podjednostki i posiadaj reszty Ser, ktre mog by odwracalnie fosforylowane przez kinaz biakow zal. od cAMP, podjednostka zawiera miejsce katalityczne, podjednostka wie 4 Ca2+, jest identyczna z kalmodulin i podobna do podjednostki C troponiny (TpC) Syntaza glikogenowa skada si z 4 podjednostek, z ktrych kada zawiera 7 reszt Ser odpowiadajcych 7 miejscom odwracalnej fosforylacji, w czym bierze udzia co najmniej 6 kinaz biakowych: 2 zal. od Ca2+/kalmoduliny, kinaza fosforylazy, kinaza biakowa zal. od cAMP oraz kinaza-3, 4 i 5 syntazy glikogenowej (GSK). Zarwno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenowa, mog by odwracalnie fosforylowane w wicej ni jednym miejscu przez odrbne kinazy. Te wtrne fosforylacje modyfikuj wraliwo pierwotnych miejsc do odwracaln fosforylacj. Taka wielopunktowa regulacja pozwala insulinie przez wzrost Glc6-{P} wywiera skutki przeciwne do cAMP.

d) glikogenozy choroby spichrzania glikogenu numer I II III IV V VI VII VIII nazwa ch. von Gierkego ch. Pompego ch. Forbesa / Cori / dekstrynoza graniczna ch. Andersena / amylopektynoza syndrom McArdlea ch. Hersa ch. Tauri enzym z deficytem aktywnoci Glc-6-fosfataza lizosomalna [14] i [16] glukozydaza (kwana maltaza) enzym odgaziajcy enzym rozgaziajcy fosforylaza miniowa fosforylaza wtrobowa PFK w miniach i erytrocytach kinaza fosforylazy w wtrobie

- 71

6. a)

Inne szlaki metabolizmu monosacharydw szlak kwasu uronowego alternatywny szlak utleniania glukozy, nie prowadzcy do powstania ATP (u czowieka synteza askorbinianu nie zachodzi z powodu braku odp. aktywnoci enzymatycznej)

- 72

b) metabolizm fruktozy

poda fruktozy synteza i estryfikacja KT, wydzielanie VLDL hipertriacyloglicerolemia, chipercholesterolemia LDL dziaanie aterogenne ATP katabolizm purynowy synteza kwasu moczowego hiperurykemia urykozuria zaburzenia przemiany fruktozy: aktywno fruktokinazy samoistna fruktozuria aktywno aldolazy B dziedziczna nietolerancja fruktozy aktywno Fru-1,6-bisfosfatazy hipoglikemia cukrzyca hiperglikemia szlak sorbitolowy zama cukrzycowa, neuropatia c) metabolizm galaktozy

poda galaktozy reduktaza aldozowa galaktitol zama przyczyny galaktozemii: aktywno galaktokinazy, 4-epimerazy lub urydylilotransferazy ( zab. metabolizmu {P} w wtrobie zab. funcki wtroby i mzgu)

- 73

7. a)

Metabolizm heteroglikanw aminocukry heksozoaminy Prekursorem do syntezy wszystkich aminocukrw jest glukoza. Aminocukry s skadnikami glikoprotein, GAG i glikosfingolipidw gangliozydw. Najpowszechniej spotykanymi przedstawicielami s: glukozoamina (GlcNH2), galaktozoamina (GalNH2), mannozoamina (ManNH2) oraz kwasu sialowe (SA) g. kwas neuraminowy (Neu). Aminocukry wystpuj w formie Nacetylowej (N-Ac-X), a donorem wystpujcej w tych poczeniach grupy N-acetylowej jest AcCoA.

b) glikoproteiny Glikoproteiny (GP) to biaka posiadajce acuchy oligosacharydowe przyczone kowalencyjnie do rdzenia polipeptydowego. Mog one peni nastpujce funkcje: strukturalne (kolagen), polizgowe (mucyny), transportujce (transferryna, ceruloplazmina), immunologiczne (immunoglobuliny), hormonalne (TSH, hCG), enzymatyczne (fosfataza alkaliczna), rola w interakcjach midzykomrkowych. Rola i znaczenie acuchw oligosacharydowych GP: modulacja waciwoci fizykochemicznych, np. due acuchy cukrowe w N-GP zwikszaj ich rozpuszczalno w wodzie, ochrona przed rozkadem (proteoliz) lub umoliwienie obrbki proteolitycznej, nadawanie aktywnoci biologicznej, okrelenie docelowego miejsca transportu w obrbie komrki, np. sygna Man-6-{P} powoduje skierowanie biaek do lizosomw, determinacja okresu ptrwania biaka (T1/2) w krwiobiegu na powierzchni hepatocytw obecne s receptory dla asialo-GP (z odsonit reszt Gal), ktre s usuwane z krenia udzia w procesach wzrostu i rnicowania (w tym rwnie lokalizacja przerzutw nowotworowych) Skadnikami oligosacharydowych fragmentw GP s: Glc, GlcNH2, Gal, GalNAc, Man, Fuc, Xyl, NeuAc. Wbudowanie sacharydw do GP poprzedzone jest aktywacj prekursorw: Glc-1-{P} + UTP pirofosforylaza UDP-Glc UDP-Glc + PPi UDP-Glc epimeraza UDP-Glc UDP-Gal UDP-Gal + biako galaktozylotransferaza biako-Gal + UDP UDP nukleotydodifosfataza UMP + Pi antyport z/do GERL: UDP-Gal / UMP

- 74

Klasyfikacja GP: O-GP: mucyny: GalNAc-Ser/Thr proteoglikany: Gal-Gal-Xyl-Ser kolageny: Gal-Hyl N-GP (GlcNAc-Asp/Glu): kompleksowe (+ Fuc, + SA) wysokomannozowe hybrydowe zakotwiczone przez GPI Mucyny wystpuj w wydzielinach luzowych. Dzieli si je na sekrecyjne i leukocytarne. Obecno NeuAc oraz grup siarczanowych nadaje im adunek ujemny i zwizan z tym lepko, z kolei rozbudowana struktura powoduje elastyczno. Budow ich mona schematycznie przedstawi w postaci: N-C-PTS-C-N, gdzie PTS oznacza sekwencje tandemowe. Mucyny speniaj funkcje ochronne w stosunku do komrek, s odpowiedzialne za zachodzce midzy nimi oddziaywania oraz maskowanie ich antygenw powierzchniowych. Proces O-glikozylacji: bierze w niej udzia zesp glikozylotransferaz glikoproteinowych zwizanych z bonami, dziaajcych w okrelanej kolejnoci, wykazujcych swoisto katalityczn wzgldem okrelonego typu wizania odpowiednie enzymy znajduj si w aparacie Golgiego substratem do reakcji jest bezporednio odpowiedni sacharyd proces zachodzi posttranslacyjnie i dotyczy reszt Ser i Thr nie wystpuje {P}-{P}-dolichol ani glikozydazy (por. dalej) Proces N-glikozylacji: Istotny jest w nim dugoacuchowy (C100) alkohol dolichol, ulegajcy wpierw fosforylacji: dolichol + ATP kinaza dolicholowa dolicholo-{P} + ADP Nastpnie z pochodnych nukleotydowych i dolicholowych doczane s do monosacharydy (w liczbie po 7 z obydwu rodzajw pochodnych) a do wytworzenia struktury: dolichol-{P}-{P}-GlcNAc2Man3Man6Glc3. W kolejnym etapie nastpuje kotranslacyjne (rwnolege z translacj mRNA na biako) przeniesienie powstaego wczeniej oligosacharydu z dolicholu na biako, katalizowane przez transferaz oligosacharydowo biakow (proces hamowany jest przez tunikamycyn). Oligosacharyd przyczony zostaje do specyficznej sekwencji Ans-X-Ser/Thr, gdzie X = Pro, Asp lub Glu. Nastpnie podstawowa sekwencja reszt sacharydowych w przyczonej do biaka strukturze ulega dalszym modyfikacjom przez enzymy: -glukozydaz I i II, mannozydaz 1, 2 oraz I i II aparatu Golgiego, transferaz GlcNac-{P} I i II, fukozotransferaz, galaktozotransferaz i sialotransferaz. Jeeli zachodzi wycznie odcinanie istniejcych podjednostek sacharydowych, wwczas powstaj NGP wysokomannozowe, jeeli za dodatkowo doczane s podjednostki syntetyzowane s N-GP kompleksowe i hybrydowe. Glipiacja Istot glipiacji jest wyposaenie biaka w tzw. kotwic GPI (glikozylofosfatydyloinozytolow) o budowie: biako-etanoloamina-{P}-Man3-GlcNH2-fosfatydyloinozytol, za pomoc ktrej moe ono utrzymywa czno z bon komrkow. Zyskuje przez to wiksz ruchomo w bonie oraz moliwo penienia roli w procesie przekazywania sygnaw. Glipiacja zachodzi posttranslacyjnie. Doczenie kotwicy GPI wie si z odciciem z C-koca biaka grupy hydrofobowej oraz reakcj z grup karboksylow. Rozkadu GPI dokonuje fosfolipaza C (PLC). Do biaek wyposaonych w kotwic GPI zaliczamy m. in.: acetylocholinoesteraz (AChE) oraz izoenzym jelitowy i oyskowy fosfatazy zasadowej (ALP). Defekt kotwicy GPI w obrbie krwinek czerwonych jest przyczyn nocnej napadowej hemoglobinurii. proteoglikany Proteoglikany to grupa biaek zoonych, zawierajcych kowalencyjnie przyczone GAG (glikozoaminoglikany), ktre same z kolei mog by niekowalencyjnie przyczone do HA. Przykady proteoglikanw: syndekan, -glikan, serglikan, prelekan, agrekan, wesikan, dekorin, biglikan, fibromodulina. Mechanizm syntezy proteoglikanw: przyczenie GAG do rdzenia biakowego, zsyntetyzowanego w RER, wyduenie acucha katalizowane przez odpowiednie glikozylotransferazy substratami s nukleotydowe pochodne sacharydw,

c)

- 75

zakoczenie wyduania acucha odbywa si przez siarczanowanie reszt cukrowych bd przeroniecie acucha poza stref glikozylacji, ostateczne modyfikacje polegaj na siarczanowaniu przez sulfotransferazy (donorem {S} jest PAPS fosfoadenylylosiarczan) oraz epimeryzacji (GlcUA IdUA) Wystpowanie GAG w organizmie: kwas hialuronowy (HA) pyn stawowy, ciao szkliste oka, tkanka czna luna siarczan chondroityny A i B (CS) chrzstki, koci, rogwka siarczan keratanu 1 (KS1) rogwka siarczan keratanu 2 (KS2) tkanka czna luna heparyna (H) ziarnistoci mastocytw, wtroba, puca, serce siarczan heparanu (HS) fibroblasty skry, ciana aorty siarczan dermatanu (DS) wystpuje powszechnie Funkcje GAG w organizmie: skadniki strukturalne macierzy pozakomrkowej (ECM), oddziaywanie z biakami macierzy, wizanie kationw, ksztatowanie napicia tkanek, uatwianie migracji komrek (HA), sprysto chrzstki (HA, CS), przejrzysto rogwki (KS1, DS), funkcja antykoagulacyjna (H) g. egzogenna, receptory interakcji midzykomrkowych (HS), selektywno filtracji kbuszkowej (HS), skadniki pcherzykw (HS)

d) Mukopolisacharydozy (MPS) s to wrodzone zaburzenia metaboliczne zwizane z defektami hydrolaz lizosomalnych katabolizujcych GAG (endo- i egzoglikozydaz, sulfataz itd.). Spowodowane s mutacjami genw kodujcych enzymy uczestniczce w rozkadzie okrelonych GAG. Niedobr hydrolaz powoduje spichrzanie ich substratw w rnych tkankach, m. in.: wtroba, ledzona, koci, skra, OUN. Skutkuje to powikszeniem narzdw, zaburzeniami wzrostu, znieksztaceniami twarzy oraz upoledzeniem umysowym. Najczciej wystpujce mukopolisacharydozy to zespoy: Hurler Scheiego, Huntera, Sanfilippo A D, Morquio A B, Monteaux Lamy, Slyego. 8. a) Regulacja przemiany wglowodanw zrnicowanie tkankowe przemiany wglowodanowej i integracyjna rola wtroby Poszczeglne narzdy organizmu rni si zarwno sposobem pobierania cukrw (ich przenonikami), jak i zestawem enzymw biorcych udzia w ich metabolizmie oraz wraliwoci na bodce metaboliczne i hormonalne, regulujce przemian wglowodanow. Dla mzgu jedynym rdem energii jest glukoza, a jej niedostatek, np. w wyniku zatrzymania akcji serca, powoduje zmiany w obrbie kory mzgowej ju po kilku minutach. W komrkach miniowych (miocytach) zachodzi glikoliza, mogca dostarcza energii nawet pod nieobecno tlenu i zaciga dug tlenowy. Powstay mleczan wydalany jest do krwi, wchodzc nastpnie w cykl Corich. Cz mleczanu, jak rwnie glukoza pobierana z krwi, przeksztacane s w glikogen, ktry moe ulega fosforolizie. Nie wystpuje moliwo oddawania glukozy do krwi. Produktem przemian (po transaminacji szczawiooctanu) moe by alanina, usuwana do krwi i zasilajca cykl glukozowo alaninowy. Tkanka tuszczowa (adipocyty) pobiera glukoz z krwi i przeksztaca j w 3-{P}-glicerynian i dalej w glicerol, wykorzystywany do syntezy TAG. Po lipolizie glicerol usuwany jest do krwi, po czym wtroba regeneruje go w szlaku glukoneogenezy. W krwinkach czerwonych (erytrocytach) nie wystpuj mitochondria, dlatego glukoza jest jedynym rdem energii. Ma tu miejsce modyfikacja glikolizy z powstaniem BPG, allosterycznego modyfikaora uwalniajcego tlen z oksyhemoglobiny. Ok. 10 % glukozy zuywana jest w oksydacyjnym etapie PPP w celu regeneracji zredukowanej formy glutationu (GSH). Nerka pod wzgldem zestawu enzymw podobna jest do wtroby. Ma moliwo przeprowadzenia glukoneogenezy, glikogenolizy cznie z oddawaniem glukoz do krwi oraz fosforylacj i dalsze przemiany frukozy. W gruczole sutkowym w okresie laktacji nastpuje przeksztacanie glukozy w galaktoz oraz synteza laktozy z obu powyszych monosacharydw.

- 76

Tkanki przeprowadzajce syntezy redukcyjne zuywaj duo glukozy na pierwszy, a tkanki intensywnie dzielce si na drugi etap PPP. Wtroba peni nadrzdn rol, koordynujc metabolizm wglowodanw w caym organizmie. Dochodzi tu do regeneracji glukozy z produktw przemiany innych tkanek, tj.: mini, erytrocytw, czy tkanki tuszczowej, a wic: mleczanu, glicerolu, alaniny i propionianu. Zachodzi PPP. Stenie glukozy we krwi w okresie midzy posikami regulowane jest dziki glikogenogenezie i glikogenolizie z moliwoci oddawania glukozy do krwi. Przeprowadzana jest izomeryzacja fruktozy do glukozy. Dziaa szlak kwasu uronowego, dostarczajc tego substratu do syntezy proteoglikanw. Z glukuronianem sprzgane s steroidy, bilirubina, leki i ich metabolity (np. kwas acetylosalicylowy), co uatwia ich wydalenie z moczem (funkcja detoksykacyjna). Granulocyty cznotkankowego zrbu wtroby produkuj GAG heparyn, bdc naturalnym antykoagulantem. Wtroba jest zatem miejscem zbierajcym wszystkie szlaki metabolizmu wglowodanw.

b) kontrola stenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu wglowodanw Glukoza w organizmie jest produktem i substratem wielu reakcji. Pojawia si w wyniku spoywania pokarmw oraz przeksztaceni dwojakiego rodzaju zwizkw recyclingowych (mleczan i alanina) oraz nierecyclingowych (aa, propionian i glicerol). Zuywana jest przez rne tkanki do rnych celw. Regulacja stenie glukozy odbywa si ju na etapie jej wchaniania. Powszechna w komrkach heksokinaza jest allosterycznie modyfikowana przez glukozo-6-{P}, ma wic miejsce pewna autoregulacja. W wtrobie i trzustce obecna jest niewraliwa na glukozo-6-{P} glukokinaza oraz dwukierunkowy transporter GLUT-2. W komrkach B () trzustki napyw glukozy powoduje zwikszenie stenia ATP, ktre blokuje kanay K+. W podobny sposb dziaaj doustne leki p/cukrzycowe poch. sulfonylomocznika (m. in. tolbutamid i gliburyd). Powoduje to dalej depolaryzacj i otwarcie napiciowo-zalenych kanaw Ca2+, co powoduje egzocytoz do krwi pcherzykw zawierajcych insulin. Dodatnio na jej wydzielanie wpywaj KT i aa, ujemnie za aminy katecholowe. Insulina dociera do swojego receptora o stechiometrii 22. Podjednostka bezporednio wie insulin dziki obecnoci domeny bogatej w Cys. Podjednostka ulokowana jest transbonowo jej cz zewntrzna czy si z podjednostk przez mostek dwusiarczkowy, cz cytozolowa za wykazuje aktywno kinazy tyrozynowej i waciwoci autofosforylujce. Przyczenie insuliny do receptora indukuje w nim zmiany konformacyjne. Receptory grupuj si i internalizuj w pcherzyki klatrynowe, skd mog by recyclingowane do cytoplazmy. Fosforylacja wasnych i obcych reszt tyrozynowych stanowi podstaw wewntrzkomrkowego przekanictwa sygnau. Substrat IRS2 daje IRS2-Y-P i aktywuje kinaz PI3. Ta za porednio powoduje szereg efektw: translokacj do bony transporterw GLUT-4 oraz receptorw wasnych i IGF-2, zmian aktywnoci genw: PEPCK, IGFBP, glukagonu, hekso- i glukokinazy oraz kinazy pirogroninowej, zmian aktywnoci enzymw przemiany: cAMP, glukozy, glikogenu (podwjnie), lipidw i czsteczek sygnaowych. Z kolei IRS IRS-Y-P a Shc Shc-Y-P wpywaj na mobilizacj wzrostu komrek i syntezy DNA. Insulina wpywa na rozwj organizmu, a jej brak powoduje leprechaunizmu (krasnoludkowatoci). W ten sposb dochodzi do zmniejszenia poziomu glukozy we krwi (efekt hipoglikemizujcy). Spadek poziomu glukozy w osoczu powoduje z kolei uwalnianie glukagonu przez komrki A () wysp trzustkowych, ktry indukuje fosforylaz wtrobow, powoduj glikogenoliz i uwalnianie glukozy do krwi. W przeciwiestwie do glukagonu, aminy katechlowe wpywaj zarwno na fosforlaz miniow, jak i wtrobow, przez co umoliwiaj miniom efektywniejsz prac. Pomaga to rwnie w wytonej pracy umysowej, gdy ukad nerwowy jest wwczas lepie zaopatrzony w glukoz. Uwalniany przy skurczu minia wap dodatkowo i podwjnie mobilizuje glikogenoliz. Efekt hiperglikemizujcy wywieraj rwnie glikokortykoidy przez mobilizacj glukoneogenezy i przysparzanie dla niej substratw, a take hormony przedniego pata przysadki (GH, ACTH), demobilizujce przenonik GLUT-4.

- 77

ROZDIZA V LIPIDY
1. a) Budowa chemiczna, podzia i rola tuszczw prostych i zoonych funkcje tuszczw: materia energetyczny tkanka tuszczowa jest izolatorem termicznym oraz mechanicznie ochrania delikatne narzdy przed uszkodzeniem izolacja elektryczna wok aksonw mielinowych skadniki bon biologicznych rozpuszczalniki witamin lipofilnych (A, D, E, K, F) oraz EFA prekursory hormonw (steroidy), czsteczek aktywnych biologicznie i midzykomrkowych przekanikw informacji (eikozanoidy)

b) podzia lipidw: proste (KT + alkohol) tuszcze waciwe (KT + glicerol) ... oleje pynne woski (KT + dugoacuchowy alkohol alifatyczny) zoone (KT + alkohol + X) fosfolipidy (KT + alkohol + {P} + zasada azotowa) glicerofosfolipidy sfingofosfolipidy glikolipidy = glikosfingolipidy (KT + glicerol + sacharyd) inne sulfolipidy aminolipidy prekursory i poch. lipidw: KT, glicerol, steroidy, alkohole, aldehydy tuszczowe, ciaa ketonowe, wglowodory, witaminy lipofilne, hormony lipidy obojtne = glicerydy oraz cholesterol wolny i jego estry c) kwasy tuszczowe (KT, ang. fatty acids FA) KT dzielimy oglnie na nasycone i nienasycone; s one nierozgazione i posiadaj zazwyczaj parzyst liczb atomw wgla kwasy nasycone w niszych temperaturach przyjmuj form zygzaka, za w wyszych dochodzi do rotacji wok wiza podwjnych dlatego bony biologiczne staj si ciesze ze wzrostem temperatury w kwasach nienasyconych wizania podwjne dodawane s midzy istniejcym wizaniem podwjnym a karboksylowym atomem wgla, dlatego wyodrbni mona rodziny 9, 6 i 3; naturalne kwasy nienasycone wystpuj zazwyczaj w konfiguracji cis (ksztat litery L o rozwarciu 120o) n 3 2 1 CH3 ... CH2 CH2 COOH oznaczenie pooenia wizania podwjnego: 18:1,9; 9 18:1; 9 C18:1; n-9, 18:1 kwasy o konfiguracji trans wystpuj w margarynie, wytwarzanej przez utwardzanie tuszczw rolinnych oraz w tuszczach przeuwaczy w wielonienasyconych KT zwiksza si ilo moliwych konfiguracji, np. C20:4 forma supa lub litery U temperatura topnienia KT wzrasta wraz z dugoci acucha, za maleje ze wzrostem nienasycenia czsteczki; regulacja Tt i zwizanego z tym skadu KT zachodzi zalenie od funkcji lipidy zapasowe s nasycone, skadniki bon ju bardziej pynne, najbardziej za lipidy tkanek naraonych na chd

d) triglicerydy (TG) = triacyloglicerole (TAG) TAG s gwn form zapasow KT przyczone do glicerolu KT zazwyczaj rni si od siebie z trjwymiarowego punktu widzenia atomy C1 i C3 glicerolu rni si midzy sob i s odmiennie rozpoznawane przez enzymy w syntezie i hydrolizie TAG bior udzia monoacyloglicerole (MAG) i diacyloglicerole (DAG)

- 78

e)

fosfolipidy gwnym zwizkiem porednim syntezy TAG i fosfoglicerydw jest kwas fosfatydowy (KF: glicerol + KT1 + KT2 + {P}); w pozycji sn-1 znajduje si zazwyczaj rodnik nasycony, za w sn-2 rodnik nienasycony fosfoglicerydy wystpujce w organizmie ludzkim: fosfatydyloglicerol (KF + glicerol) bisfosfatydyloglicerol = kardiolipina (KF + glicerol + KF) syntetyzowany w mitochondriach z fosfatydyloglicerolu, skadnik wewntrznej bony mitochondrialnej, odpowiedzialny w duym stopniu za jej nieprzepuszczalno dla jonw fosfatydyloetanoloamina = kefalina (KF + etanoloamina) fosfatydylocholina = lecytyna (KF + cholina) istotny skadnik bon biologicznych, penicy rol w przewodnictwie nerwowym; ponadto stanowi zapas grup metylowych oraz rdo rodnikw acylowych do estryfikacji cholesterolu; dipalmitoilolecytyna jest skadnikiem surfaktantu pucnego, ktrego niedobr manifestuje si zespoem bon szklistych fosfatydyloseryna (KF + Ser), fosfatydylotreonina (KF + Thr) fosfatydyloinozytol (PI) (KF + mio-inozytol) + 2{P} fosfatydyloinozytolo-4,5-bis{P} (PIP2) rola w wewntrzkomrkowym szlaku przekazywania sygnaw lizofosfolipidy (np. lizolecytyna) zawieraj tylko jeden acyl, drugie miejsce pozostaje wolne plazmalogeny stanowi 10% fosfolipdw mzgu i mini, posiadaj przy C1 wizanie eterowe oraz nienasycony alkohol (np. kwas plazmenowy + etanoloamina plazmalogen etanoloaminowy = plazmenyloetanoloamina) sfingomieliny (ceramid + {P} + cholina; ceramid = sfingozyna + KT poczone wizaniem amidowym) glikolipidy tworz one sacharydy powierzchni komrki (glikokaliks) glikosfingolipidy = ceramid + fragment cukrowy cerebrozydy glukozyloceramid tkanki pozanerwowe galaktozylocerebrozyd w mzgu i tkance nerwowej sulfogalaktozylocerebrozyd (sulfatyd) skadnik mieliny globozydy = ceramid + aminocukier gangliozydy s pochodnymi glukozyloceramidu zawierajcymi kwas sialowy (SA; g. N-Acneuraminowy = NANA); wystpuj g. w tkance nerwowej, penic m. in. funkcje receptorowe GM3: Cer-Glc-Gal-NeuAc GM1: Cer-Glc-Gal(-NeuAc)-GalNAc-Gal receptor toksyny cholery w jelicie cienkim

f)

g) steroidy budowa steroidw opiera si na szkielecie wglowym cyklopentanoperhydrofenantrenu:

piercienie cykloheksanowe wystpuj w formie krzesowej wzajemne uoenie piercieni: A-B cis/trans; B-C trans; C-D trans (w wyj. glikozydw nasercowych) h) poliprenoidy skadaj si z jednostek izoprenowych (-CH=C(-CH3)-CH=CH-) np.: koenzym Q (ubichonon), dolichol, witaminy A, E, K, -karoten, kamfora, kauczuk 2. Trawienie i wchanianie lipidw Lipaza jzykowa (optimum 4 4,5) wytwarzana jest przez gruczoy Ebnera na grzbiecie jzyka (u czowieka enzym ten nie jest a tak istotny) W odku panuj odpowiednie warunki do hydrolizy lipidw temperatura powoduje ich upynnienie, ruchy perystaltyczne wspomagaj proces tworzenia emulsji tuszczowych, lipaza odkowa (optimum 4 4,5) wraz ze linowa trawi TAG do 1,2-DAG i KT. Optymalne pH dla lipaz wynosi 3 6. Chtniej odszczepiane s KT krtsze i nienasycone, dlatego lipidy mleka s najlepszym substratem. KT krtko- i

- 79

rednioacuchowe wchaniane s przez cian odka do . wrotnej, za KT dugoacuchowe rozpuszczaj si w kroplach tuszczowych i wdruj do dwunastnicy. Wtroba produkuje , ktra zagszczana jest w pcherzyku ciowym. Skada si z wody (86-97%) i rozpuszczonych w niej skadnikw staych: kwasw ciowych (37%), mucyny i barwnikw (21%), soli nieorganicznych (33%), KT (7%) i cholesterolu (2%). powoduje emulgacj lipidw i pokrycie nimi czstek pokarmu, zobojtnienie treci odkowej, wydalanie cholesterolu, kwasw ciowych i barwnikw ciowych, a take lekw, toksyn i metali cikich (Cu, Zn, Hg). Wraz z ci do dwunastnicy wydalany jest sok trzustkowy zawierajcy lipaz trzustkow (optimum 8); trypsyna usuwa N-kocowy pentapeptyd (enterostatyn) z prolipazy, dajc aktywn lipaz, hamowan pocztkowo przez sole kwasw ciowych. Kolipaza czy si z lipaz i faz graniczn TAG pokrytych przez sole po zakotwiczeniu lipazy kolipaza znosi efekt inhibicji soli. Lipaza odcza KT z pozycji sn-1 i sn-2, a g. produktami kocowymi trawienia s 2-MAG, ktre tylko w 20% s izomeryzowane i rozkadane. Esteraza cholesterolowa aktywowana solami kwasw ciowych rozkada estry cholesterolu, ktry wchaniany jest w formie wolnej. Trzustkowa fosfolipaza A2 (PLA2) aktywowana trypsyn i Ca2+ przeksztaca glicerofosfolipidy w lizofosfolipidy detergenty wspomagajce emulgacj i trawienie tuszczw. W jelicie fosfataza (optimum 8,6) odszczepia {P} z glicerofosforanw, za zesp fosfolipaz (A1, A2, B, C, D) rozkada glicerolofosfolipidy na poszczeglne skadowe. KT, 2-MAG i niewielkie iloci 1-MAG dyfunduj z fazy olejowej zawiesiny tuszczowej do miceli mieszanych i liposomw, ktre z kolei osigaj rbek szczoteczkowy luzwki i ulegaj wchoniciu do enterocytw. W cianie jelita 1-MAG ulegaj dalszej hydrolizie. 2-MAG wchodz w szlak monoacyloglicerolowy i s przeksztacane do TAG (resynteza) przy udziale syntetazy acylo-CoA. TAG zawierajce KT o acuchach krtkiej i redniej dugoci mog by wchaniane bezporednio i rozkadane w nabonku. Produkty rozkadu lipidw przeksztacane s do acylo-CoA i wykorzystywane jako substraty do resyntezy TAG. Glicerol z jelita wdruje do krenia wrotnego, za pochodzcy z enterocytw ulega przeksztaceniu do glicerolo-3-{P} i wbudowaniu w TAG. Powstae w jelicie TAG stanowi skadnik chylomikronw limfy i wdruj przewodem piersiowym do lewego kta ylnego, gdzie osigaj oysko ylne. KT krtszy ni C10 przechodz jako FFA do . wrotnej, gdy nie zajmuje si nimi syntaza acylo-CoA. Poza witamin D fitosterole nie wchaniaj si ze wiata jelita.

zaburzenia wchaniania: zwknienie torbielowate trzustki (mukowiscydoza) niewydolno egzogenna stolce tuszczowe niedobr kolipazy niedobr aktywnej lipazy trzustkowej stolce tuszczowe (steatorrhoea) przetoka limfatyczno moczowa chyluria (wydalanie: mlecznego moczu) karmienie KT < C12 niepr. poczenie naczy limfatycznych jamy brzusznej z jam opucnow chylothorax karmienie KT < C12 kamica ciowa Tworzenie kamieni ciowych spowodowane jest niedostateczn rozpuszczalnoci cholesterolu w ci. Rozpuszczalno ta zaley od stosunku ste cholesterolu, fosfatydylocholiny i soli kwasw ciowych (prawidowo: 5% : 15% : 80%) oraz od zawartoci wody. U chorych z kamica ma miejsce spadek aktywnoci 7-hydroksylazy i w efekcie zmniejszenie puli kwasw ciowych w kreniu jelitowo wtrobowym oraz wzrost syntezy cholesterolu przez hepatocyty, co z kolei powoduje przesycenie ci cholesterolem. Sprzyjajcy czynnik, np. infekcja bakteryjna, inicjuje powstanie jder krystalizacji, ktre nie wydalone wzrastaj do znacznych rozmiarw. Powstae kamienie usuwa si operacyjnie (wraz z pcherzykiem) lub rozbija ultradwikami. Litogenno ci zmniejsza kwas chenodeoksycholowy przez hamowanie syntezy cholesterolu na etapie HMG-CoA, natomiast zwikszaj niektre leki, np. fibraty.

- 80

3. a)

Transport lipidw w chonce i w osoczu budowa lipoprotein skad lipidw osocza: TAG 1,6 45 fosfolipidy 3,1 35 ch. cak. 5,2 15 ch. wolny 1,4 WKT 0,4 5

mM % KT

Problem transportu niepolarnych lipidw (TAG i estrw cholesterolu) w polarnym rodowisku osocza rozwizany zosta przez ich zwizanie z lipidami amfipatycznymi (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z biakami. W ten sposb powstaj lipoproteiny (Lp). Lp skada si z lipidowego rdzenia (TAG i estry cholesterolu), warstwy powierzchownej (fosfolipidy i wolny chlesterol) oraz z apolipoproteiny (apoLp) o zrnicowanej mobilnoci. ApoLp speniaj rne funkcje: mog stanowi cz struktury Lp, np. apoB, mog stanowi kofaktory enzymw, np. A I dla LCAT, C II dla LPL, mog by ligandami dla receptorw Lp, np. B100 + E rec. LDL, A I HDL. Podziau lipoprotein dokonuje si za wzgldu na ich gsto oraz umiejscowienie elekktroforetyczne: klasa chylomikrony VLDL IDL LDL HDL VHDL FFA pooenie 0 (bezruch) pre- g. skadnik TAG cholesterol fosfolipidy % biaek % lipidw g. apoLp B48 B100 B100 A albumina rednica; gsto

b) transport lipidw w lipoproteinach osocza Lipoliza TAG i dziaanie lipazy Lp (LPL) s rdem WKT, ktre cz si z albuminami osocza. Ich ilo waha si w szerokich granicach: w stanie poabsorpcyjnym wynosi 0,5 mM, w godzeniu 0,8 mM, a w cukrzycy nawet 2 mM. WKT s najbardziej aktywn metabolicznie frakcj lipidw osocza. Ulegaj one utlenianiu lub estryfikacji stan odywienia ma niewielki wpyw na frakcj WKT pobieranych przez tkanki, wpywa natomiast na proporcj kwasw utlenianych do estryfikowanych. W pobliu bony kompleks albumin z KT dysocjuje i te ostatnie wizane s przez bonowe biako wice KT. Nastpnie zachodzi kotransport z Na+ oraz wizanie przez wewntrzkomrkowe biako wice KT. TAG eksportowane s przez jelito i wtrob jedyne narzdy, skd lipidy wdruj jako Lp. Na RER produkowana jest apoB, ktra w SER ulega poczeniu z lipidem, a w aparacie Golgiego glikozylacji, po czym Lp usuwana jest z komrki na zasadzie odwrconej pinocytozy. W jelicie TAG pakowane s w chylomikrony, ktre ze wzgldu na rozmiary nie mog przej przez rodbonek naczyniowy, wobec czego usuwane s do przestrzeni midzy enterocytami, a stamtd do ukadu limfatycznego jelita. Wraz z chonk dostaj si do przewodu piersiowego, aby w lewym kcie ylnym dosta si do ukadu krwiononego. Wtroba wysya TAG w postaci VLDL, ktre przechodz przez przestrze okoozatokow (Dissego) do zatok wtrobowych, a std przez okienka rdbonka do krwi. Gdy chylomikrony i VLDL znajd si ju w ukadzie krenia, przenoszone s na nie apoLp z HDL apoC i apoE. TAG chylomikronw i VLDL hydrolizowane s przez LPL zlokalizowan w cianach woniczek, zakotwiczon przez siarczan heparanu. LPL wystpuje w sercu, tkance tuszczowej, ledzionie, pucach, rdzeniu nerki, aorcie, przeponie, gruczole sutkowym i wtrobie noworodka. Ilo LPL zwiksza si po podaniu heparyny. Kofaktorami hydrolizy s fosfolipidy i apoC II.

- 81

Niewielka ilo KT wraca do krwiobiegu, aby zwiza si z albumin, wikszo za wnika do tkanek. KM tkanki tuszczowej = 10 x KM serca, dlatego podczas godzenia zachodzi redystrybucja pobierania KT z tkanki tuszczowej na korzy serca. Podobna sytuacja ma miejsce w gruczole sutkowym podczas laktacji. LPL pozbawia chylomikrony 90% TAG i apoC, ktra wraca do HDL, ale nie apoE, ktra towarzyszy chylomikronom resztkowym (remnantom chylomikronw). Podobnie VLDL przechodzi w remnenty VLDL, czyli IDL. Oba typy remnantw wychwytywane s przez hepatocyty w procesie endocytozy z udziaem receptorw (receptor B100 + E, LRP = receptor 2-makroglobuliny). Lipaza wtrobowa dziaa jako ligand Lp oraz uczestniczy w hydrolizie jej TAG oraz fosfolipidw. IDL nie wychwycone przez wtrob ulegaj przeksztaceniu w LDL (przenoszce g. cholesterol). LDL ulegaj degradacji w wtrobie (70%) oraz w tkankach pozawtrobowych (30%) wychwytywane s przez receptor LDL (B100 + E). W apoB48 brakuje C-domeny apoB100, czyli waciwego ligandu dla receptora, z powodu procesu redagowania mRNA w jelicie (transkrypcji do apoLp ulega tylko 48% genu por. punkt VIII-3-d). Receptor LDL jest biakiem transbonowym o masie 115 kD, posiadajcym 5 domen: 1: N-koniec wie si z sekwencj 7 x 40 ( Cys) ujemnie naadowane boczne acuchy oddziauj z dodatnio naadowan apoB100; po endocytozie protonacja Gln i Asn w kwanych endosomach uwalnia LDL od receptora 2: homologiczna do czci EGF, zawiera 2 acuchy oligosacharydowe (N) 3: duo reszt Ser/Thr z przyczonymi sacharydami (O) te i zw. z glikoforyn funkcjonuj jako podprki odstaj od bony, dziki czemu domena 1. jest dostpna dla LDL 4: transbonowa 5: cytozolowa, kontaktuje oddziaywanie receptora z dokami opaszczonymi reguluje endocytoz HDL syntetyzowane s w wtrobie i w jelicie w poczeniu z apoA I, po czym w osoczu doczane s apoC i apoE (HDL stanowi ich skad). Nowo wytworzona HDL ma ksztat dyskoidalny, zawiera dwuwarstw fosfolipidow, wolny cholesterol, apoA I i LCAT (acylotransferaza lecytyna : cholesterol). LCAT przenosi acyle z fosfolipidw (lecytyna) na cholesterol, dajc estry cholesterolu i lizolecytyn; te pierwsze wnikaj do wntrza, za lizolecytyna czy si z albumin osocza. W ten sposb HDL3 staje si pseudomicelarne i przeksztaca w HDL2, ktre znw ulega lipazie wtrobowej i powraca jako HDL3, dodatkowo oddzielana jest wolna apoA I, ktra tworzy pre--HDL lub jest rozkadana w nerce. Aktywno lipazy wtrobowej zwikszaj androgeny, a zmniejszaj estrogeny, dlatego kobiety posiadaj wicej HDL2. zaburzenia transportu lipoproteinowego hipolipoproteinemie abetalipoproteinemia kropelki lipidw gromadz si w cianie jelita i wtrobie rodzinna hipobetlipoproteinemia LDL dugowieczno rodzinny niedobr -lipoproteiny ch. wyspy Tanger / ch. rybiego oka, niedobory apoA I hiperlipoproteinemie rodzinny brak LPL (I) powolne oczyszczanie osocza rodzinna hipercholestrolemia (II) wysoka aterogenno (szybsza miadyca) ch. Walmana spichrzanie cholesterolu rodzinna hiperbetalipoproteinemia (III) defekt apoE, taki, aterogenno rodzinna hipertriacyloglicerolemia (IV) aterogenno, NIDDM, otyo rodzinna hiperlipoproteinemia (V) TAG i cholesterol rodzinna hiperalfalipoproteinemia HDL dugowieczno niedobr LPL zwyrodnienie tuszczowe cian naczy rodzinny niedobr LCAT HDL rulonowe, obecna Lp X rodzinny nadmiar Lp fibrynoliza, aterogenno apoE wystpuje w trzech izoformach (E2, E3, E4) pacjenci homozygotyczni wzgldem genu E4 wykazuj kilkakrotne zwikszenie zachorowalnoci na ch. Alzheimera, gdy apoE4 atwiej wie si do -amyloidu pytek zwyrodnieniowych ukadu nerwowego.

c)

- 82

d) rola wtroby w metabolizmie lipidw (patrz rwnie punkt VII-5-b) produkcja ci uatwiajcej trawienie i wchanianie lipidw z jelita aktywne ukady enzymatyczne syntetyzujce i utleniajce KT, syntetyzujce TAG i fosfolipidy przeksztacanie KT w ciaa ketonowe (ketogeneza) integracja metabolizmu Lp osocza Wzrost syntezy TAG i wydzielanie VLDL wystpuje w stanie sytoci, przy karmieniu wglowodanami (zw. fruktoz), przy wysokim poziomie WKT, przy spoywaniu etanolu oraz przy wzrocie stosunku insulina : glukagon. Mechanizm zmian patomorfologicznych wtroby: marsko wknienie stuszczenie (nagromadzenie lipidw g. TAG) typ I: WKT mobilizacja z adipocytw, hydroliza TAG przez LPL, insulina ( godzenie) typ II: metaboliczny blok syntezy Lp blok syntezy apoLp puromycyna, etionina ( ATP), CCl4, CHCl3, P, Pb, As synteza VLDL synteza biaka godzenie blok czenia apoLp z lipidami stres oksydacyjny CCl4 niewydolno wydzielnicza stres oksydacyjny CCl4 zab. glikozylacji kwas orotowy fosfolipidy EFA, cholesterol, cholina (cz. lipotropowy) Met (donor grupy metylowej) Metabolizm etanolu: I: etanol + NAD+ dehydrogenaza alkoholowa aldehyd octowy + NADH aldehyd octowy dehydrogenaza aldehydowa kwas octowy AcCoA NADH utlenianie i estryfikacja KT stuszczenie wtroby lipogeneza, biosynteza cholesterolu hiperlaktocydemia wydalanie moczanw hamowanie dehydrogeazy jabczanowej hamowanie cyklu Krebsa (TCA) II: etanol + NADPH + O2 MEOS aldehyd octowy + NADP+ + 2 H2O adaptacja do alkoholizmu konkurencja z lekami (np. barbiturany) III: katalaza (niewielki udzia)

- 83

4. a)

Tkanka tuszczowa rola w metabolizmie lipidw metabolizm adipocytw Tkanka tuszczowa jest gwnym magazynem TAG w organizmie, ktrych ilo jest wypadkow szybkoci lipogenezy i -oksydacji. Jednym z substratw do syntezy TAG jest gligerolo-3-{P}, ktry moe powstawa dziki kinazie glicerolowej. Ta jednak wykazuje niewielk aktywno, wobec czego rdem jest glukoza, przeksztacana w procesie glikolizy w {P}-hydroksyaceton, redukowany nastpnie przez dehydrogenaz glicerolo-3-{P} do glicerolo-3-{P}. Glukoza moe rwnie: zasila TCA ( CO2), PPP ( NADPH), by przeksztacona w AcCoA i dalej w acylo-CoA. Do adipocytw docieraj TAG z Lp. Po rozkadzie przez LPL glicerol wraca do osocza i jest metabolizowany przez kinaz glicerolow w wtrobie lub nerkach, za KT tworz pul WKT2 o krtkim T1/2. TAG adipocytw ulegaj lipolizie przez lipaz wraliw na hormony ((+): ACTH, TSH, ADH, A/NA, glukagon, (-): insulina, PGE1, kwas nikotynowy) do glicerolu, usuwanego do osocza oraz do KT tworzcych pul WKT1. Obie pule WKT dostarczaj substratu do syntezy acylo-CoA. Gdy estryfikacja nie rwnoway lipolizy, WKT gromadz si i przenikaj do osocza, czc si z albuminami.

- 84

b) regulacja Procesy zachodzce w tkance tuszczowej podlegaj cise regulacji hormonalnej. Insulina mobilizuje przenonik GLUT-4 na powierzchni komrki, wzmaga aktywno dehydrogenazy pirogronianowej, karboksylazy AcCoA (ACC) i acylotransferazy glicerolo-3-{P} oraz hamuje aktywno lipazy wraliwej na hormony, przez co wzmaga metabolizm i usuwa glukoz w osocza oraz hamuje uwalnianie WKT do krwi. Lipoliz pobudzaj: A/NA, glukagon, ACTH, /-MSH, TSH, GH, ADH, KS, T3/4, metyloksantyny.

c)

Brunatna tkanka tuszczowa uczestniczy w termogenezie. Wystpuje u zwierzt hibernujcych i noworodkw ludzkich. Jej brzowy kolor pochodzi od nagromadzenia cytochromw w mitochondriach. Zawiera dodatkowo biako termogenin (hamowan przez puryny). Pod wpywem pobudzenia ukadu wspczulnego wydzielana NA zwiksza poziom cAMP, przez co lipaza hormonozalena staje si aktywna i hydrolizuje TAG do WKT. Te odblokowuj termogenin oraz dostarczaj acylo-CoA, przenoszonego nastpnie do wntrza mitochondriw, utlenianego w szlaku -oksydacji i dostarczajcego rwnowanikw redukujcych, ktre z kolei wykorzystywane s przez acuch oddechowy do tworzenia gradientu pH. Normalnie suy on do pracy syntazy ATP, jednak termogenina wykorzystuje gradient do jaowych cykli, podczas ktrych energia nie jest gromadzona w wysokoenergetycznych wizaniach, lecz rozpraszana, podnoszc temperatur tkanki, a przez to caego organizmu.

- 85

5. a)

Utlenianie kwasw tuszczowych lokalizacja komrkowa i tkankowa Utlenianie KT zachodzi w matrix mitochondrialnej. Proces ten zachodzi g. w wtrobie, chocia wikszo tkanek organizmu jest w tanie przeprowadzi peny szlak oksydacji KT.

b) aktywacja i transport KT do mitochondrium Utlenianie KT poprzedzone jest ich aktywacj, polegajc na przeksztaceniu w bezporedni substrat dla -oksydacji. Jest to jedyna reakcja szlaku wymagajca ATP. KT + ATP + CoA syntetaza acylo-CoA (tiokinaza) acylo-CoA + AMP + PPi PPi + H2O pirofosfataza nieorganiczna 2 {P} Dziki obecnoci pirofosfatazy nieorganicznej liczba traconych wysokoenergetycznych wiza fosforowych wzrasta do 2 i z tego powodu reakcja zachodzi do koca. Syntetazy acylo-CoA wystpuj na ER, w peroksysomach, na zewntrznej bonie mitochondrialnej i w jej matrix. Karnityna syntetyzowana jest z Lys i Met w wtrobie i w nerkach, za najwiksza jej ilo wystpuje w miniach. Nisze KT mog by aktywowane i utleniane bez jej udziau, w przeciwiestwie do wyszych.

c)

-oksydacja nasyconych KT

Proces ten zachodzi w matrix mitochondrialnej przy udziale kompleksu enzymatycznego oksydazy KT, umiejscowionego w pobliu acucha oddechowego. Zalenie od dugoci KT jest on utleniany przez swoiste dla siebie enzymy przebieg: dehydrogenacja powstaje 2-trans-enoilo-CoA R-CH2-CH2-CO~SCoA + FAD dehydrogenaza acylo-CoA R-CH=CH-CO~SCoA + FADH2 hydratacja powstaje L(+)-3-hydroksyacylo-CoA R-CH=CH-CO~SCoA + H2O hydrataza 2-enoilo-CoA R-CH(OH)-CH2-CO~SCoA dehydrogenacja powstaje 3-ketoacylo-CoA R-CH(OH)-CH2-CO~SCoA + NAD+ dehydrogenaza L(+)-3-hydroksyacylo-CoA R-CO-CH2-CO~SCoA + NADH + H+ rozcicie powstaje acylo-CoA skrcony o C2 i AcCoA R-CO-CH2-CO~SCoA + CoA-SH tiolaza 3-ketoacylo-CoA (acetylotransferaza acetoacetylo-CoA) R-CO~SCoA + CH3-CO~S-CoA

bilans energetyczny: aktywacja: - 2 ATP FADH2 + 2 ATP x (n-1) NADH + H+ + 3 ATP x (n-1) AcCoA + 12 ATP x n Dla kwasu o C2n atomach wgla zysk energetyczny wynosi 12 n + 5 (n 1) = 17 n 7 ATP np. dla kwasu palmitynowego (C16) mamy 128 ATP.

- 86

KT o nieparzystej liczbie atomw wgla s utleniane w podobny sposb, a powstanie z nich trjwglowa reszta propionylo-CoA. Ten ulega przeksztaceniu do sukcynylo-CoA, ktry metabolizowany jest w cyklu Krebsa (patrz punkt IV-4-b). Reszta propionylowa jest jedynym glukogennym fragmentem nieparzystych KT. W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana -oksydacja, gdy obok AcCoA powstaje H2O2 na etapie dehydrogenazy z flawoprotein, ktry nastpnie rozkadany jest przez katalaz. Sytuacja ta nie jest zwizana z fosforylacj i produkcj ATP, lecz uatwia dziaanie na KT o bardzo dugich acuchach ( C20). Peroksysomy nie utleniaj acylo-CoA krtszych ni C8. -oksydacja zachodzi w mzgu i polega na stopniowym usuwaniu po jednym atomie wgla, poczwszy od C1. Reakcja ta nie wymaga CoA, nie powstaj te w niej wizania makroergiczne. -oksydacja zachodzi w ER przy udziale CYP. Kocowa reszta metylowa KT (CH3-) utleniana jest kolejno do pochodnej alkoholowej (-CH2OH), a nastpnie karboksylowej (-COOH). Powstay kwas dwukarboksylowy ulega oksydacji do kwasu adypinowego (C6) lub korkowego (C8), ktre s wydalane z moczem.

d) oksydacja nienasyconych KT Zalenie od pooenia wizania nienasyconego odpowiednie acylo-CoA degradowane s w szlaku oksydacji do momentu powstania 3-cis-acylo-CoA lub 4-cis-acylo-CoA. W pierwszym przypadku pochodna 3 ulega izomeryzacji przez izomeraz 3-cis/trans2-transenoilo-CoA do 2-trans-enoilo-CoA, po czym ulega dalszemu utlenianiu. Kady 4-cis-acylo-CoA zarwno powstajcy z utleniania pochodnej 3, jak i wchodzcy do szlaku bocznie, jest poddawany dehydrogenazie acylo-CoA i tak powstaje 2-trans-4-cis-dienoilo-CoA. Ten ulega dziaaniu NADPH-zalenej reduktazy 2-trans-4-cis-dienoilo-CoA, w wyniku czego powstaje 3-trans-enoilo-CoA, na ktry dziaa znw izomeraza 3-cis/trans2-trans-enoilo-CoA, dajc 2trans-enoilo-CoA, ktry utleniany jest nastpnie w klasycznym szlaku -oksydacji. ketogeneza

e)

Powstawanie cia ketonowych u czowieka ma miejsce w wtrobie w warunkach znacznego nasilenia oksydacji. Powoduje to odwrcenie reakcji katalizowanej przez tiolaz, czyli kondensacj 2 AcCoA acetoacetylo-CoA. Do niego przycza si jeszcze jedna czsteczka AcCoA, i w reakcji katalizowanej przez syntaz HMG-CoA (mit) powstaje 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo-CoA (HMG-CoA). Nastpnie liaza HMG-CoA (mit) odcza AcCoA, pozostawiajc acetooctan, ktry pozostaje w rwnowadze z D(-)--hydroksymalanem dziki obecnoci dehydrogenazy D(-)-hydroksymalanowej (mit); stan tej rwnowagi zaley od stosunku [NAD+]/[NADH]. Acetooctan ulega rwnie spontanicznej dekarboksylacji do acetonu. Wymienione trzy zwizki, okrelane cznie jako ciaa ketonowe, transportowane s z krwi, gdzie ich stenie nie powinno przekracza 0,2 mM. Z osoczem wdruj one do puc, gdzie lotny aceton jest wydychany (zapach acetonu z ust jest jednym z objaww cukrzycy), a take do nerek, gdzie kilka % usuwanych jest z moczem. Ketonemia (nadmiar cia ketonowych w osoczu) spowodowany jest raczej zwikszonym ich wytwarzaniem w wtrobie, ni zmniejszon utylizacj przez tkanki pozawtrobowe. Dla tkanek pozawtrobowych ciaa ketonowe stanowi bowiem substraty oddechowe -hydroksymalan przeksztacany jest do acetooctanu, ktry z kolei dziki transferazie CoA sukcynylo-CoA : acetooctan czy si z AcCoA. Powstay acetoacetylo-CoA ulega dziaaniu tiolazy, dajc 2 czsteczki AcCoA, ktre utleniane s w cyklu Krebsa. Regulacja ketogenezy opiera si na trzech zasadniczych przemianach: po pierwsze: ketogeneza wystpuje przy zwikszonym utlenianiu KT, pochodzcym z lipolizy TAG w adipocytach, reguluj j zatem czynniki mobilizujce WKT, po drugie: WKT oprcz utleniania mog by estryfikowane, przy czym decydujc rol odgrywa CPT I zmniejsza ona swoj aktywno w stanie sytoci pod wpywem malonylo-CoA. Wwczas pochaniane przez hepatocyty WKT s estryfikowane i eksportowane jako VLDL. W okresie godzenia jest odwrotnie: WKT acylo-CoA ACC malonylo-CoA CPT I. po trzecie: proporcja AcCoA ulegajcego ketogenezie i oksydacji jest tak regulowana, aby cakowita powstaa energia nie wahaa si zbytnio w czasie. Ketogeneza pozwala wtrobie utlenia zwikszajce si iloci KT w ukadzie cile skojarzonych oksydacyjnych fosforylacji bez zwikszania cakowitego wydatku energetycznego.

- 87

f)

zaburzenia oksydacji KT niedobr karnityny wczeniaki, hemodializa, acyduria spowodowana kwasami organicznymi napady hipoglikemii, hiperlipidemia i osabienie mini (objawy podobne do zespou Reyea) niedobr CPT I dotyczy wtroby; hipoglikemia niedobr CPT II dotyczy g. mini; osabienie, martwica, mioglobinuria hamowanie CPT hipoglikemizujcy efekt lekw p/cukrzycowych poch. sulfonylomocznika (tolbutamid, gliburyd) ostre ciowe stuszczenie wtroby deficyt dehydrogenazy dugoacuchowych -hydroksyacylo-CoA niedobr liazy HMG-CoA zab. ketogenezy i degradacji leucyny jamajska choroba wymiotna hipoglicyna hamuje oksydacj acyduria dwukarboksylowa brak dehydrogenazy dla KT o acuchach redniej dugoci ch. Refsuma nagromadzenie kwasu fitanowego z fitolu zesp Zellwegera (mzgowo wtrobowo nerkowy) brak peroksysmw w tkankach gromadzenie w mzgu wielonienasyconych dugoacuchowych KT (C26-C38) upoledzenie syntezy kwasw ciowych i lipidw eterowych (plazmalogenw) ketoza (ketonemia i nastpowa ketonuria) moe spowodowa kwasic ketonow, co ma miejsce np. w cukrzycy

6. a)

Lipogeneza synteza kwasw tuszczowych lokalizacja i transport substratw Enzymy biosyntezy KT zlokalizowane s w cytozolu, za ukad elongacji acucha na ER hepatocytw. Lipogeneza zachodzi w wtrobie, nerce, mzgu, pucach, gruczole sutkowym i adipocytach. AcCoA powstay z wglowodanw wskutek wewntrzmitochondrialnego utleniania pirogronianu nie moe swobodnie przechodzi do cytozolu, by da si przeksztaci w KT. AcCoA kondensuje wic ze szczawiooctanem w cytrynian, ktry ulega antyportowi z jabczanem i OH- do przestrzeni pozamitochondrialnej; tu dziki ATP, CoA i liazie ATP : cytrynianowej ulega przeksztaceniu w AcCoA, ktry moe ulega karboksylacji przez ACC do malonylo-CoA i budowa KT. Pozostay szczawiooctan moe przej w jabczan dziki NADH-zalenej dehydrogenazie jabczanowej, po czym nastpuje generacja NADPH przez enzym jabczanowy. Jabczan moe rwnie wnikn do mitochondrium.

b) przebieg lipogenezy Pierwszym etapem lipogenezy jest karboksylacja AcCoA katalizowana przez kompleks enzymatyczny, zoony m. in. z biotyny (wit. H) i jej karboksylazy, biaka nonikowego karboksybiotyny, transkarboksylazy oraz allosterycznego miejsca regulatorowego. Donorem CO2 jest HCO3-. AcCoA + HCO3- + ATP ACC malonylo-CoA + ADP + Pi U czowieka kompleks syntazy KT jest homodimerem i tylko w takiej formie wykazuje aktywno. Kady monomer jest pojedynczym polipeptydem, kodowany przez jeden gen, co zapewnia du wydajno i brak interferencji. Monomery cz si mostkiem dwusiarczkowym obecnym midzy 4{P}-pantetein biaka przenoszcego acyl (ACP), a cystein syntazy 3-ketoacylowej (pooenie 69). Kompleks wykazuje 7 aktywnoci enzymatycznych: transacylaza acetylowa, transacylaza malonylowa, syntaza 3-ketoacylowa, reduktaza 3-ketoacylowa, hydrataza, reduktaza enoilowa oraz tioesteraza.

Kolejno reakcji: poczenie AcCoA z Cys-HS przez transacylaz acetylow poczenie malonylo-CoA z grup SH 4-{P}-panteteiny przez transacylaz malonylow; wytworzenie acetylo(acylo)-malonylo-enzymu atak grupy acylowej na grup metylenow reszty malonylowej katalizowany przez syntaz 3ketoacylow oraz uwolnienie CO2, dziki czemu reakcja zachodzi do koca; powstanie 3-ketoacyloenzymu = acetoacetylo-enzymu redukcja grupy 3-ketoacylowej przez reduktaz 3-ketoacylow

- 88

dehydratacja grupy 3-hydroksyacylowej przez hydrataz redukcja wizania nienasyconego przez reduktaz enoilow; utworzenie nasyconego acylo-S-enzymu poczenie malonylo-CoA z grup HS 4-{P}-panteteiny i wyparcie reszty acylowej na miejsce poczenia z Cys-HS szeciokrotne powtrzenie procesu wytworzenie rodnika palmitylowego (C16) hydroliza do czystego enzymu i palmitynianu przez tioesteraz = deacylaz (w gruczole sutkowym enzym ten wystpuje w kilku formach, odpowiednio dla C8, C10 i C12) Sumaryczna reakcja: CH3-CO~SCoA + 7 HOOC-CH2-CO~SCoA + 14 (NADPH + H+) CH3-(CH2)14-COOH + 7 CO2 + 6 H2O + 8 CoA-SH + 14 NADP+ Inicjatory reakcji: standardowy: AcCoA w gruczole sutkowym i wtrobie: butyrylo-CoA dla nieparzystych KT: propionylo-CoA rda NADPH: PPP wtroba, adipocyty, gruczo sutkowy, enzym jabczanowy = dekarboksylujca dehydrogenaza jabczanowa pozamitochondrialna dehydrogenaza cytrynianowa Otrzymanie KT duszych ni C16 moliwe jest dziki mikrosomalnemu ukadowi elongazy KT. Do reakcji wchodzi nasycony lub nienasycony KT C10, ktry aktywowany jest do acylo-CoA. Ten czy si z malonylo-CoA dziki syntetazie 3-ketoacylo-CoA. Powstay produkt ulega swoistej reduktazie, hydratazie oraz reduktazie 2,3-enoiloacylo-CoA. Ostatecznie powstaje acuch wyduony o C2. W mzgu elongacja ulega przyspieszeniu podczas mielinizacji, aby dostarczy KT C22 i C24 dla sfingolipidw. Godzenie i cukrzyca hamuj elongacj. Istnieje rwnie mniej wydajny mitochondrialny ukad elongazy wykorzystujcy AcCoA. Anaboliczn faz cyklu ywieniowego stanowi m. in. przeksztacanie w tuszcz nadmiaru glukozy, pirogronianu, mleczanu i AcCoA. Gwnym czynnikiem regulujcym aktywno lipogenezy jest stan odywienia organizmu proces ulega zwolnieniu przy godwce, diecie tuszczowej i niedoborze insuliny (np. w przebiegu cukrzycy). Lipogeneza zaley rwnie odwrotnie proporcjonalnie od stenia WKT w osoczu. Fruktoza wzmaga lipogenez przez ominicie regulacji glikolizy na poziomie PFK-1; dostarcza przez to zarwno substratu do syntezy KT, jak i glicerolu do ich estryfikacji. Regulacja lipogenezy wystpuje w formie krtkoterminowej jako modyfikacje kowalencyjne i allosteryczne oraz w formie dugoterminowej kontroli adapatacyjnej przez modyfikacj ekspresji genw.

- 89

c)

synteza nienasyconych KT Moliwe jest wstawianie wiza podwjnych do KT w pozycjach 4,5,6,9, lecz nie dalej (zdolno t posiadaj roliny, co zwizane jest z syntez EFA). Jednonienasycone KT otrzymywane s z odpowiednich acyli nasyconych przez mikrosomalny ukad 9-desaturazy (wtroba i inne narzdy) zoony z cytochromu b5, reduktazy NADPH cytochrom b5 oraz desaturazy z elazem niehemowym wraliwym na CN-. palmitoilo-CoA + O2 + NADH + H+ 9-desaturaza palmitooleilo-CoA + 2 H2O + NAD+ steareilo-CoA + O2 + NADH + H+ 9-desaturaza oleilo-CoA + 2 H2O + NAD+

Dodatkowe wizania podwjne wprowadzane s midzy istniejce ju wizanie nienasycone (9) oraz atom C1 przez ukad 5-desaturazy i elongazy. W ten sposb mona otrzyma kwas arachidonowy z linolenowego, dziki czemu nie jest on niezbdny w poywieniu. Aktywno tego ukadu zmniejszaj: A, glukagon i deficyt insuliny. -linolenoilo-CoA 5-desaturaza -linolenoilo-CoA elongaza dihomo--linolenoilo-CoA 5-desaturaza arachidonoilo-CoA

Egzogenne kwasy tuszczowe (EFA, wit. F) potrzebne s do tworzenia eikozanoidw oraz stanowi strukturalne lipidy komrki kwas arachidonowy stanowi do 10 % KT fosfolipidw, za DHA wystpuje w jdrze, spermie, korze mzgowej i siatkwce, gdzie zwiksza pynno lipidw wspomagajc dziaanie rodopsyny (w przypadku niedoboru rozwija si retinitis pigmentosa). Generalnie deficyt EFA powoduje zmiany skrne i zaburzenia transportu lipidw. Zaburzenia metabolizmu EFA wystpuj przy zwknieniu torbielowatym trzustki (mukowiscydoza), acrodermatitis enteropathica, zespole wtrobowo nerkowym, chorobie Crohna, marskoci wtroby, zespole Reyea, zespole Zellwegera oraz alkoholizmie.

d) metabolizm eikozanoidw (patrz rwnie punkt VII-1-b)

PG odkryte w nasieniu (std nazwa), hormony miejscowe (autakoidy) biorce udzia m. in. w rozwoju stanu zapalnego PGI produkowana przez rdbonek, hamuje skurcz naczy i agregacj trombocytw TX produkowane przez trombocyty, nasilaj skurcz naczy i agregacj trombocytw LT zw. z leukocytami, silne rozszerzenie naczy i skurcz oskrzeli

- 90

7. a)

Synteza trjglicerydw lokalizacja tkankowa i komrkowa

Kinaza glicerolowa wystpuje w wtrobie, nerkach, jelicie, brunatnej tkance tuszczowej i gruczole sutkowym, niewielk za aktywno wykazuje w miniach i tej tkance tuszczowej (tam za to dziaa dehydrogenaza glicerolo-3-{P}). Wikszo enzymw syntezy TAG wystpuje w ER, chocia acylotransferaza glicerolo-3-{P} zwizana jest z mitochondriami, a fosfohydrolaza fosfatydowa z cytozolem (przy czym jej forma aktywna zwizana jest z bonami). b) przebieg syntezy

- 91

8. a)

Cholesterol biosynteza cholesterolu

Wszystkie tkanki zoone z komrek eukariotycznych posiadaj zdolno syntezy cholesterolu. Ok. poowa puli cholesterolu w ludzkim organizmie pochodzi z poywienia (g. jajka, miso, wtroba, mzg), reszta jest syntetyzowana de novo 10 % w wtrobie oraz w 10 % w jelitach. Proces biosyntezy cholesterolu ma miejsce w ER i w cytozolu.

Regulacja syntezy cholesterolu zachodzi na etapie HMG-CoA. T3/4 wpywaj na szlak jak insulina, za KS jak glukagon.

- 92

b) trawienie i wchanianie cholesterolu pokarm cholesterol + jego estry hydroliza estrw cholesterol wchanianie () estryfikacja 80 90 % chlomikrony LPL remnanty chylomikronw wtroba (hydroliza remnantw chylomikronw, IDL i LDL) VLDL LPL IDL LDL tkanki pozawtrobowe c) rwnowaga cholesterolu i endocytoza LDL

pula cholesterolu: (+): pobieranie w Lp przez receptor LDL lub oczyszczajcy (zmiatajcy) pobieranie do bony biosynteza hydroliza estrw cholesterolu (-): usuwanie gradientu ste do HDL3 estryfikacja przez ACAT (acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol) synteza kwasw ciowych i hormonw sterydowych

d) wydalanie cholesterolu e) Z poywieniem dostarczane jest ok. 0,4 g cholesterolu dziennie. Wraz z ci do jelita wydala si dziennie ok. 0,6 g cholesterolu oraz 0,4 g kwasw ciowych, z czego 98 % ulega zwrotnemu wchoniciu w jelicie krtym do krenia jelitowo wtrobowego. W wyniku dziaania flory bakteryjnej jelita w cholesterolu powstaje koprostanol. miadyca

Istot miadycy jest odkadanie cholesterolu z lipoprotein zawierajcych apoLp B100 w postaci wolnej i zestryfikowanej w tkance cznej cian ttnic. Do czynnikw ryzyka zaliczamy: nadcinienie ttnicze, nadmierne spoycie soli, kawy i alkoholu, obfite posiki, diet wysokotuszczow, picie mikkiej wody, nadwag, palenie tytoniu (nikotyna, CO, stres oksydacyjny), pe msk, otyo zwaszcza brzuszn ( HDL), brak ruchu, stres. Wzrost zachorowalnoci wystpuje przy okrelonych hipolipoproteinemiach, w cukrzycy, nerczycy lipidowej, niedoczynnoci tarczycy i uoglnionej hiperlipidemii. Prognoza choroby zaley od stosunku [cholesterol HDL] : [cholesterol LDL]. Terapia niefarmakologiczna obejmuje m. in. zmian diety polegajc na zastpieniu nasyconych KT (maso, tuszcz woowy, olej kokosowy) przez jedno- (oliwa z oliwek) i wielonienasycone (olej sonecznikowy, sojowy, kukurydziany, baweniany) oraz wykluczenie fruktozy i zawierajce j sacharozy (dziaanie hiperlipemizujce). Nasycone KT nasilaj tworzenie oraz spowalniaj katabolizm mniejszych czsteczek VLDL z wiksz iloci cholesterolu. Natomiast nienasycone KT nasilaj katabolizm i wydalanie cholesterolu oraz LDL poprzez oddziaywanie z ich receptorami (zjawisko regulacji w gr). W terapii farmakologicznej stosuje si: ywice jonowymienne (cholestyramina, cholestipol), fibraty (klofibrat, gemfibrozil), leki hamujce lipoliz (kwas nikotynowy), antyoksydanty (probukol). W wyjtkowych

- 93

przypadkach decyduje si na zabieg chirurgiczny, polegajcy na wyczeniu jelita krtego z konsekwentnym zaburzeniem krenia jelitowo wtrobowym kwasw ciowych. 9. Kwasy ciowe

Synteza kwasw ciowych zachodzi w wtrobie. Prekursorem jest cholesterol, hydroksylowany przez 7-hydroksylaz (ER); reakcja wymaga O2, NADPH, witaminy C i CYP. Jest to etap regulujcy ca syntez nasila go sam cholesterol, hamuje za produkt (kwasy ciowe poprzez receptor FXR) oraz niedobr witaminy C. 7-hydroksylaza regulowana jest wsplnie z reduktaz HMG-CoA, obie te ulegaj modyfikacjom kowalencyjnym, przy czym hydroksylaza wykazuje aktywno w formie ufosfrylowanej. Powstay 7-hydroksycholesterol podlega nastpnie kilku etapom przemian z udziaem O2, NADPH, CoA i ewentualnie 12-hydroksylazy wysycane jest wizanie 5,6, acuch boczny skracany jest o C3 (propionylo-CoA), reszta karboksylowa wizana z CoA, za C12 hydroksylowany. Powstaje w ten sposb choloilo-CoA oraz chenodeoksycholoilo-CoA, ktre czone z glicyn i tauryn w proporcji 1:3 daj pierwotne kwasy ciowe, wydalane z ci do wiata jelita. Umoliwiaj tam trawienie i wchanianie, tworzenie emulsji tuszczowych i rozbijanie tuszczu na micele, pokrywanie tuszczem innych czstek pokarmowych i lepszy dostp enzymw. Dziki dziaalnoci flory bakteryjnej jelita pierwotne kwasy ulegaj dekoniugacji i 7dehydroksylacji, dajc odpowiednio kwas deoksycholowy i litocholowy wtrne kwasy ciowe. W jelicie krtym ogromna wikszo kwasw ciowych ulega wchoniciu do krenia jelitowo wtrobowego, z wyjtkiem nierozpuszczalnego kwasu litocholowego. Reszta wydalana jest z kaem, stanowic gwn drog wydalania cholesterolu z organizmu.

- 94

10. Kalcyferole (patrz rwnie punkt VII-2-b) Witamina D jest prohormonem sterydowym, jej przedstawicielem jest ergosterol, wystpujcy w rolinach i drodach oraz 7-dehydrocholesterol, obecny u zwierzt rni si one midzy sob nasyceniem i metylacj acucha bocznego. Kady z nich ulega u odpowiednich gatunkw reakcji fotolitycznej, przebiegajcej z rozbiciem wizana C9-C10 w piercieniu B, dajc ergokalcyferol (D2) lub cholekalcyferol (D3). Witaminy te po spoyciu w pokarmach (g. olej rybi, tka jaj, wtroba) wchaniane s przez jelita do krwi, gdzie wie je biako nonikowe. Wychwytywane przez wtrob ulegaj 25-hydroksylazie (ER), a powstaa 25OH-D3 jest form zapasow gromadzon w hepatocytach, adipocytach i miocytach, podlega kreniu jelitowo wtrobowemu. W kanalikach nerkowych, kociach i oysku 25-OH-D3 ulega 1-hydroksylazie (mitochondria), dajc 1,25-(OH)2-D3 (synteza regulowana przez PTH i [{P}] w osoczu). Szlak alternatywny prowadzi przez 24hydroksylaz (mitochondria), obecna w kanalikach nerkowych, chrzstce, kociach, jelicie i oysku. Aktywna witamina D reguluje ekspresj odpowiednich genw, przez co uczestniczy w regulacji gospodarki wapniowo fosforanowej i ksztatowaniu koci, procesach rnicowania oraz zjawiskach immunologicznych.

- 95

11. Hormony sterydowe Hormony o budowie sterydowej syntetyzowane s przez kor nadnerczy oraz przez gonady. Kora nadnerczy (cortex glandulae adrenalis) syntetyzuje kortykosteroidy. W obrbie kory wyrniamy 3 warstwy, wydzielajce odmienne rodzaje hormonw. Warstwa kbuszkowata produkuje mineralokortykosteroidy (C21), ktrych gwnym przedstawicielem jest aldosteron. Warstwa pasmowata produkuje glukokortykosteroidy (C21): kortyzol = hydrokortyzon, kortyzon i kortykosteron. Warstwa siateczkowata produkuje androgeny (C19): DHEA i androstendion. Substratem do syntezy hormonw steroidowych jest cholesterol. W tkankach docelowych steroidogenezy podlega on dziaaniu enzymu odgaziajcemu z grupy cytochromu P450 (CYP SCC ang. side-chain cleavage enzyme), ktry pozbawia cholesterol atomw C22-C27; produktem tej reakcji jest 5-pregnenolon, waciwy macierzysty zwizek wszystkich naturalnych sterydw. W wyniku dziaania na enzymw: dehydrogenazy 3--hydroksysteroidowej, 21--hydroksylazy, 11-hydroksylazy, 17--hydroksylazy, 17,20-liazy oraz syntazy aldosteronowej powstaj wymienione wyej grupy hormonw kory nadnercza. Gwne dziaanie mineralokortykoidw polega na wzrocie resorpcji zwrotnej wody, Na+ i Cl- w kanaliku dalszym, przez co regulowana jest objto pynw krcych w oysku naczyniowym oraz ich cinienie osmotyczne. Dziaanie glukokortykoidw polega na rozlegym wpywie na metabolizm ( glikemia std nazwa, nasilenie katabolizmu lipidowego i azotowego), gospodark wodno elektrolitow (cho nie w takim stopniu jak aldosteron), syntez skadnikw tkanki cznej oraz na modyfikacji ukadu immunologicznego m. in. hamowaniu tkanki limfoidalnej i dziaaniu przeciwzapalnym przez hamowanie izoenzymu 2 syntazy PGH2 (PGHS-2). Gonada mska (jdro; testis) produkuje androgeny (C19), g. testosteron. Jego synteza moliwa jest dziki obecnoci dodatkowego enzymu dehydrogenazy 17--hydroksysteroidowej, ktra pozwala przeprowadzi DHEA w androstandiol oraz androstendion w testosteron. Ten podlega obwodowej redukcji przez 5-reduktaz do dihydrotestosteronu (DHT), wykazujcego wiksz aktywno i odpowiedzialnego za wikszo efektw dziaania androgenw. Androgeny s niezbdne do wyksztacenia mskich cech pciowych; ponadto dziaaj anabolicznie m. in. na ukad ruchu, zwikszajc mas mini szkieletowych i aktywno osteoblastw, pobudzaj do wydzielania gruczoy ojowe (objawy trdziku) oraz stymuluj przerost gruczou krokowego. Androgeny metabolizowane s do 17-ketosteroidw (17-KS), wydalanych nastpnie z moczem. U kobiet cao wydalanych 17-KS pochodzi z nadnerczy, za u mczyzn 2/3 ma pochodzenie nadnerczowe, a 1/3 gonadalne. 17-KS uywane s jako marker diagnostyczny. Zwikszenie ich poziomu wystpuje fizjologicznie w ciy, a take towarzyszy takim patologiom jak: rak kory nadnerczy, guz wirylizujcy nadnerczy lub jajnikw, zesp Cushinga, zesp nadnerczowo pciowy (wrodzony przerost nadnerczy), nowotwory jdra produkujce androgeny. Z kolei spadek poziomu 17KS towarzyszy pierwotnej i wtrnej niedoczynnoci kory nadnerczy (o rnej etiologii) oraz obnieniu czynnoci hormonalnej jder, np. przy hipogonadyzmie. Gonada eska (jajnik) wytwarza progestageny (C21), g. progesteron oraz estrogeny (C18): estradiol, estron i estriol. Do syntezy progesteronu wystarczy aktywno enzymu odgaziajcego i dehydrogenazy 3--hydroksysteroidowej. Natomiast powstawanie estrogenw wymaga obecnoci dehydrogenazy 17--hydroksysteroidowej (jak w jdrze), desmolazy, katalizujcej C19-demetylacj oraz aromatazy, nadajcej piercieniowi A szkieletu steroidowego charakter aromatyczny. Estrogeny s niezbdne do dojrzewania pciowego dziewczt i podnoci kobiet; ponadto przeciwdziaaj miadycy (hamowanie lipazy wtrobowej HDL2) oraz osteoporozie (hamowanie osteoklastw). Progestageny, wydzielane g. przez ciako te, uatwiaj zagniedenie trofoblastu i umoliwiaj utrzymanie ciy; poza tym pobudzaj rozwj gruczow sutkowych oraz przyspieszaj metabolizm zwizany jest z tym niewielki skok temperatury ciaa towarzyszcy owulacji (wykorzystanie w naturalnej antykoncepcji metodzie termicznej i nowszych, objawowo termicznych).

- 96

- 97

ROZDZIA VI PRZEMIANA AZOTOWA

1. a) Trawienie biaek w przewodzie pokarmowym enzymy i ich specyficzno Trawienie biaek rozpoczyna si w odku, gdzie kontakt z HCl wytwarzanym przez komrki okadzinowe powoduje ich denaturacj, tj. utrat struktury IV i III-rzdowej przez zniszczenie wiza wodorowych, wyprostowanie polipeptydw i wzrost podatnoci na dziaanie proteaz. Gwn funkcj odka jest trawienie biaek. Komrki gwne wytwarzaj zymogen, ktry pod wpywem aktywacji proteolitycznej przez H+ ulega przeksztaceniu w pepsyn (A dno, B odwiernik; optimum 1 2). Pepsyna rozkada dalsze czsteczki zymogenu na zasadzie autokatalizy. Pepsyna jest endopeptydaz atakujc wizania peptydowe utworzone przez aa aromatyczne lub dwukarboksylowe, dzielc zdenaturowane biako na due polipeptydy. Rennina (chymozyna; optimum 4) wystpuje w odku niemowlt, gdzie w obecnoci Ca2+ przeksztaca kazeinw parakazein, bdc substratem dla pepsyny, zapobiegajc szybkiemu przedostaniu si mleka z odka do jelit. Tre odkowa przechodzi do dwunastnicy, gdzie jest neutralizowana przez zasadow i zasadowy sok trzustkowy (optimum 7,5 8). Sok trzustkowy zawiera liczne enzymy proteolityczne. Do endopeptydaz zaliczamy: trypsyn, chymotrypsyn i elastaz wszystkie wydzielane pocztkowo jako zymogeny. luzwka jelita wydziela enteropeptydaz (enterokinaz), rozbijajc wizania peptydowe Lys, przez co rozprostowuje i uaktywnia trypsyn (optimum 7,9; dziaa na aa zasadowe). Aktywna trypsyna przeprowadza autokataliz oraz przeksztaca chymotrypsynogen w chymotrypsyn (optimum 8,0; dziaa na pozbawione adunku), proelastaz w elastaz (dziaa na mae aa) oraz prokarboksypeptydaz w karboksypeptydaz (egzopeptydaza odczajca pojedyncze C-kocowe aa od polipeptydw). Schemat aktywacji proteolitycznej chymotrypsyny: pro-CT: 1 245 -CT: 1 15 16 245 -CT: 1 A 13 16 B 146 149 C 245 Sok jelitowy zawiera aminopeptydaz (ezgopeptydaza odcinajca N-kocowe aa poli- i oligopeptydw) oraz dwupeptydazy o rnej swoistoci. Naturalne izomery L-aa transportowane s aktywnie przez rbek szczoteczkowy przy udziale PLP przez liczne przenoniki podobne do SGLT-1. Wyrniamy nastpujce przenoniki: zalene od Na+: dla aa obojtnych, Phe i Met oraz Pro i Hyp, niezalene: dla aa lipofilnych i obojtnych (Leu, Phe) oraz zasadowych (Lys). (transport aa w kanalikach nerkowych patrz punkt VII-6-a) Flora bakteryjna jelita powoduje przeksztacanie niewchonitych aa: dekarboksylaza bakteryjna wytwarza ptomainy (R-CH2-NH2): Lys kadaweryna, Arg agametyna, Tyr tyramina, Orn putrescyna, His histamina, Trp indol, metyloindol (skatol) aa siarkowe przeksztacane s w tiole (metylomerkaptan, etylomerkaptan), z ktrych powstaje siarkowodr: CH3SH + 2 H CH4 + H2S powstay z deaminacji amoniak dostaje si do krenia wrotnego, skd eliminuje go wtroba; w schorzeniach tego narzdu mone rozwin si hiperamonemia, prowadzca do amoniakowej piczki wtrobowej i encefalopatii wtrobowej antybiotyki (np. neomycyna) hamuj wzrost flory fizjologicznej zaburzenia trawienia i wchaniania biaek: wchanianie nie strawionych biaek moe wywoa reakcje immunologiczne, sprue rodzinna (nie tropikalna) powstaje gdy polipeptydy powstae z glutenu uszkadzaj luzwk jelita oraz powoduj powstawanie przeciwcia p/glutenowych; jej odpowiednikiem u dzieci jej celiakia (choroba trzewna), ze wchanianie produktw trawienia biaek wywouje obrzki i osteoporoz,

- 98

defekt przenonika jelitowego dla aa obojtnych wywouje chorob Hartnupw (uoglniona aminoacyduria, objawy przypominajce pelagr), kwashiorkor wystpuje gdy dziecko odstawione od piersi matki przechodzi na diet niskobiakow, wyniszczenie (kacheksja, marazmus) to niedobr energetycznego poywienia oraz swoistych aa b) transport azotu pomidzy tkankami Gwn rol w utrzymaniu stenie krcych w osoczu aa odgrywaj minie i wtroba miocyty s rdem ponad poowy puli wolnych aa, za hepatocyty przeprowadzaj glukoneogenez i cykl mocznikowy, niezbdny do wydalania nie magazynowanego azotu. W stanie poresorpcyjnym aa uwalniane s z mini dotyczy to g. Ala i Gln. Ta ostatnia wdruje do jelit i nerek, gdzie stanowi rdo amoniaku i powraca do krwi jako Ala lub Ser (tylko z nerek). Ala ostateczny transporter azotu wychwytywana jest przez wtrob, gdzie stanowi gwny aa glukogenny, poniewa hamuje glikoliz na etapie kinazy pirogronianowej oraz stanowi doskonay substrat dla glukoneogenezy, wysycajcy ten proces dopiero w steniu 20 30 x wikszym od fizjologicznego. Cz aa ulega w wtrobie cyklowi mocznikowemu. Po bogatobiakowym posiku transport zachodzi w odwrotnym kierunku, tj. z tkanek trzewnych do mini. Aa o rozgazionym acuchu g. Val stanowi na czczo rdo energii dla OUN, w stanie resorpcyjnym za wychwytywane s przez minie po uprzednim oszczdzeniu przez wtrob. 2. Oglna przemiana aminokwasw i metabolizm grupy aminowej

W przeciwiestwie do innych skadnikw pokarmowych, jak cukry i tuszcze, aa nie s w organizmie gromadzone w postaci zapasowej, lecz usuwane w przypadku nadmiaru. Pierwszym etapem tych przemian jest zazwyczaj transaminacja, tj. wymiana grupy aminowej z -ketokwasem, daj nowy ketokwas i nowy aa. Glu jako jedyny nie wymienia azotu z innym zwizkiem, lecz odcza go w procesie oksydacyjnej dezaminacji. Tak powstay NH3 jest transportowany, aby ostatecznie ulec poczeniu z CO2 w cyklu mocznikowym, dajc mocznik g. metabolit azotowy u czowieka. a) transaminacja Aa pokarmowe oraz wasne traktowane s identycznie, tj. rozbijane na grup aminow i szkielet wglowy. Typowa transaminacja polega na przemianie 2 -aa i 2 -ketokwasw. Czasami do reakcji wchodz grupy karbonylowe i nie--aminowe, np. grupa -aminowa Orn. Transaminacji nie ulegaj: Lys, Thr, Pro i Hyp. W wikszoci tkanek obecne s: transaminaza Ala Pyr (AlAT, GPT, SGPT) oraz Glu szczawiooctan (GluAT, GOT, SGOT). Kada transaminacja jest swoista dla jednej pary substratw. Dziki temu e Ala moe wej do reakcji katabolizowanej przez GluAT, cay azot aminowy pochodzcy z aa podlegajcych transaminacji moe by zgromadzony w Glu. W miejscu katalitycznym transaminaz wystpuje PLP (fosforan pirydoksalu) pochodna wit. B6 wchodzca w skad enzymw metabolizujcych aa.

- 99

Aa przycza si do PLP przez poczenie typu zasady Schiffa.:

Mechanizm transaminacji (przykad reakcji ping pong): w sytuacji wyjciowej PLP poczony jest z apoenzymem przez zasad Schiffa pomidzy grup aminow Lys a grup aldehydow pirydoksalu, przyczenie -aa1 powoduje wyparcie grupy -aminowej Lys, poczenie PLP z apoenzymem przez wizanie jonowe z udziaem grupy fosforanowej PLP oraz utworzenie nowej zasady Schiffa aldoiminy. odczenie H+ od C2 -aa1 powoduje przegrupowanie do ketoiminy i dearomatyzacj PLP, przyczenie H2O i H+ powoduje rozpad do -ketokwasu1 i fosforanu pirydoksaminy, poczonego nadal jonowo z apoenzymem, nastpnie zachodzi reakcja odwrotna przycza si -ketokwas2 i usuwane s H2O i H+ z utworzeniem ketoiminy, przyczenie H+ powoduje przegrupowanie wiza i powstanie aldoiminy, odczenie -aa2 daje powrt do stanu wyjciowego, tj. PLP poczony przez zasad Schiffa z grup aminow Lys apoenzymu, niedobr wit. B6 wystepuje przy wielowitaminowym deficycie grupy B, podczas laktacji, u alkoholikw oraz przy leczeniu grulicy izoniazydem (INH): izonikotynian hydrazyny (izoniazyd) + pirydoksal hydrazon pirydoksalu ( mocz) + H2O Aa mog by rwnie przeksztacane przez oksydaz aa, obecn w wtrobie i nerkach:

b) dezaminacja Centraln pozycj w metabolizmie azotu zajmuje dehydrogenaza Glu enzym rozpowszechniony w wielu tkankach i wykorzystujcy NAD(P)+. Katalizuje on odwracalne przejcie Glu -ketoglutaran + NH3. W wtrobie aktywno t nasila ADP, zmniejszaj za: ATP, GTP oraz NADH. c) transport Stale wytwarzany w tkankach amoniak jest toksyczny dla organizmu, dlatego te musi by na bieco usuwany. Funkcj t peni wtroba, syntetyzujc Glu, Gln i mocznik. Syntetaza glutaminowa katalizuje reakcj: Glu + NH4+ + ATP Gln + H2O + ADP + Pi Jest to enzym mitochondrialny, wystpujcy w znacznych ilociach w tkance nerwowej, gdzie gwnym mechanizmem detoksykacyjnym jest synteza Gln. W stanach nadmiaru NH3 zachodzi karboksylacja ketokwasw na potrzeby sprzgania i unieczynniania NH3. Uwalnianie azotu amidowego Gln katalizuje glutaminaza: Gln + H2O Glu + NH4+. Wspdziaanie obu powyszych enzymw warunkuje rwnowag pomidzy jonem amonowym a Gln.

100 - -

d) eliminacja U czowieka 80 95 % azotu wydalane jest przez nerki w postaci mocznika, powstaego w cyklu mocznikowym, zachodzcym g. w wtrobie. Cykl ten ma zatem kluczowe znaczenie w detoksykacji organizmu. Po przetransportowaniu CO2 i NH4+ do matrix mitochondrialnej reaguj one z 2 ATP, co katalizuje syntetaza karbamoilofosforanowa I (mitichondrialna). Reszta karbamoilowa ulega przeniesieniu na Orn, ktra dostaje si do mitochondrium dziki translokazie ornitynowej. Produktem reakcji jest Pi oraz Cyt, eksportowana do cytozolu. Reakcj katalizuje transkarbamoilaza ornitynowa. W cytozolu cytulina reaguje z ATP dajc cytrulilo-AMP, ktry wraz z Asp tworzy argininobursztynian. Reakcj katalizuje syntetaza argininobursztynianowa. Argininobursztynian ulega trans-eliminacji katalizowanej przez argininobursztynaz, w wyniku czego powstaje Arg i fumaran. Arginaza wystpuje w wtrobie, tkance nerwowej, mzgu, gr. sutkowym, jdrze, skrze; aktywno ta hamowana jest przez Orn i Lys. Katalizuje ona rozczepienie grupy guanidynowej Arg, dajc Orn i mocznik, usuwany do krwi.

Regulacja cyklu: Godzenie nasila syntez enzymw, aby moliwe byo wydalanie wikszej iloci mocznika z powodu zwikszonego katabolizmu biakowego. Kluczowe znaczenie ma pierwsza reakcja cyklu syntetaza karbamoilfosforanowa I wykazuje aktywno wycznie w obecnoci allosterycznego modyfikatora (N-Ac-Glu) zwikszacego powinowactwo do ATP. Poziom N-Ac-Glu jest wypadkow reakcji syntezy i degradacji: Glu + AcCoA syntaza N-Ac-Glu N-Ac-Glu hydrolaza N-Ac-Glu Glu + octan

101 - -

Zaburzenia cyklu oglnie wywouj wymioty, unikanie pokarmw bogatobiakowych, przerywan ataksj, nerwowo, letarg i opniony rozwj umysowy. hiperamonemia typ I defekt syntetazy karbamoilofosforanowej I hiperamonemia typ II defekt transkarbamoilazy Orn Glu cytrulinemia defekt syntetazy argininobursztynianowej, Cyt acyduria argininobursztynianowa defekt argininobursztynazy, amliwe wosy skupione w kpki w cytrulinemii i acydurii argininobursztynianowej podaje si Arg i benzoesan hiperargininemia defekt arginazy Arg, podobiestwo do lizynocystynurii 3. Metabolizm poszczeglnych aminokwasw

Ze wzgldu na moliwo biosyntezy de novo wszystkie aa dzielimy na endogenne i egzogenne. Te pierwsze mog by zsyntetyzowane przez organizm czowieka, drugie za nie z powodu braku odpowiednich enzymw i musz by dostarczane wraz z pokarmem. Do aa endogennych zaliczamy: Glu, Gln, Ala, Asp, Ans, Ser, Gly, Pro, Cys, Tyr, Hyp i Hyl, pozostae za do egzogennch. Moliwo syntezy niektrych aa (ich endogenny charakter) zaley w pewnych przypadkach od odpowiedniej poday innych, np. Tyr moe by syntetyzowana pod warunkiem obecnoci odpowiedniej iloci Phe. Charakter aa zmienia si rwnie z wiekiem, np. Arg jest egzogenna dla dzieci, z powodu ich szybkiego wzrostu, natomiast u dorosych cakowicie wystarcz zasoby produkowane w cyklu mocznikowym. Ze wzgldu na to, czy produkty katabolizmu szkieletu wglowego danego aa zasilaj szlaki syntezy wglowodanw czy lipidw, dzielimy aa na glukogenne i ketogenne. Do aa czysto glukogennych nale: Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Glu, Arg, His, Pro i Hyp, do czysto ketogennych jedynie Leu, za do jednoczenie gluko- i ketogennych: Ile, Lys, Phe, Tyr oraz Trp. a) Kwas asparaginowy (asparaginian, Asp, D) jest aa endogennym. Syntetyzowany jest ze szczawiooctanu w reakcji transaminacji: szczawiooctan + Ala AT Asp + Pyr. Jego katabolizm polega na przebiegu tej samej reakcji w przeciwn stron.

b) Asparaginaza (amid kwasu asparaginowego, Asn, N) jest rwnie endogenna. Powstaje z Asp w reakcji katalizowanej przez syntetaz Asn: Asp + Glu + ATP syntetaza Asn Asn + Glu + AMP + PPi ( 2 Pi) Jej rozkad przez asparaginaz daje z powrotem Asp: Asn + H2O asparaginaza Asp + NH4+ c) Kwas glutaminowy (glutaminian, Glu, E) jest endogenny powstaje z -ketoglutaranu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz Glu: -ketoglutaran + NH4+ + NAD(P)H + H+ dehydrogenaza Glu Glu + H2O + NAD(P)+ Katabolizowany jest z powrotem do -KG w reakcji transaminacji: Glu + Pyr AT -ketoglutaran + Ala Glu jest substratem do syntezy -aminomalanu (GABA), penicego funkcje hamujcego neurotransmitera w UN: Glu dekarboksylaza Glu, PLP GABA GABA ulega degradacji przez przeksztacenie do skadnikw cyklu Krebsa: GABA semialdehyd bursztynowy -KG lub bursztynian

d) Glutamina (amid kwasu glutaminowego, Gln, Q) jest endogenna syntetyzowana z Glu przy udziale aktywnoci syntetazy Gln: Glu + NH4+ + ATP syntetaza Gln Gln + ADP + Pi Rozkadana jest do Glu przy udziale glutaminazy: Gln + H2O glutaminaza Glu + NH4+ e) Alanina (Ala, A) jest zarwno syntetyzowana, jak i katabolizowana przez transaminacj z / do pirogronianu: Pyr + Glu AT Ala + -KG Glicyna (Gly, G) jest aa endogennym. Moe by syntetyzowana na kilka sposobw: z glioksalanu przez transaminacj (w wtrobie): glioksalan + -aa AT Gly + -ketokwas (1)

f)

102 - -

z choliny: cholina aldehyd betainowy betaina dimetyloglicyna sarkozyna Gly (2) z Ser: Ser + THF hydroksymetylotransferaza Ser Gly + metyleno-THF (3) Powstajca z Gly cholina uywana jest do syntezy: acetylocholiny (ACh) neurotransmitera: cholina + AcCoA acetylotransferaza cholinowa ACh ACh esteraza cholinowa (AChE) cholina + octan fosfolipidw skadnikw bon biologicznych: cholina cholino-{P} CDP-cholina CDP-cholina + DAG fosfatydylocholina = lecytyna Degradacja Gly zachodzi albo przez zachodzenie reakcji (1) i (3) w drug stron albo przez rozkad z udziaem syntazy Gly: Gly + NAD+ + THF syntaza glicynowa, PLP CO2 + NH4+ + NADH + H+ + metyleno-THF g) Seryna (Ser, S) jest endogenna. Moe powstawa albo z Gly w wyej podany sposb (t drog zachodzi rwnie jej degrdacja), jak rwnie z 3-{P}-glicerynianu w cigu przemian: 3-{P}-glicerynian + NAD+ {P}-hydroksypirogronian + NADH + H+ {P}-hydroksypirogronian + -aa AT {P}-seryna + -ketokwas {P}-seryna + H2O seryna + Pi h) Prolina (Pro, P) jest aa endogennym. Zarwno jej synteza, jak i rozkad, zachodz przez przeksztacenia z / do Glu: Glu + NADH + H+ dehydrogenaza -semialdehyd Glu + NAD+ -semialdehyd Glu dehydroprolina + H2O dehydroprolina + NADH + H+ dehydrogenaza Pro Pro + NAD+ i) Hydroksyprolina (Hyp) jest endogenna, cho nie jest kodowana przez aden kodon mRNA. Powstaje z Pro w wyniku nieodwracalnej hydroksylacji zachodzcej na mikrosomach (ER) w skrze, wtrobie, pucach, sercu, misniach i ziarninujcych ranach: Pro hydroksylaza Pro, Fe2+, O2, wit. C, -KG Hyp Moe by degradowana do Pyr i glioksalanu, gwnie jednak wydalana jest z moczem w formie niezmienionej. Poniewa wystpuje wycznie w proteinach cznotkankowych kolagenie i elastynie jej poziom uznawany jest za diagnostyczny wskanik szybkoci degradacji tkanki cznej (g. koci). Wzrasta on w takich patologiach jak: choroba Pageta, pierwotna i wtrna nadczynno przytarczyc / tarczycy / kory nadnerczy, przerzuty nowotworowe do koci oraz w osteoporozie. Arginina (Arg, R) jest generalnie endogenna, cho zaley to od wieku (patrz wyej). Jest elementem cyklu mocznikowego (patrz punkt VI-2-d) syntetyzowana przy udziale argininobursztynazy, za degradowana przez arginaz do Orn. Arg bierze udzia w syntezie dwch istotnych zwizkw: kreatyna przenonik energii g. w miniach: Arg + Gly transamidynaza Arg-Gly (nerka) glikocyjamina = guanidynooctan guanidynooctan + ATP + SAM metylotransferaza guanidynooctanowa (wtroba) fosforan kreatyny (PCr, minie, mzg, krew) + ADP + SA-homocysteina fosfokreatyna + ADP kinaza (fosfo)kreatynowa = CK / CPK kreatyna + {P} + ATP kreatyna nieenzymatyczna cyklizacja w miniach kreatynina ( wydalanie z moczem) + H2O Poniewa powstawanie kreatyniny jest reakcj nieenzymatyczn, jej poziom jest proporcjonalny do masy miniowej organizmu (wykorzystywane w sporcie). Szybko usuwania kreatyniny z krwiobiegu przez nerki (tzw. klirens endogennej kreatyniny) przyjmuje si za rwny szybkoci filtracji kbuszkowej (GFR) parametr sucy do oceny sprawnoci pracy nerek (np. w oparciu o niego okrela si stopie zaawansowania przewlekej niewydolnoci nerek). GFR mona rwnie obliczy porednio na podstawie stenia kreatyniny we krwi (wzr Cockcrofta Gaulta). Z kolei poziom CPK jest wskanikiem diagnostycznym uszkodzenia tkanek, g. mini. Wzrasta przy kontuzjach, nadmiernym wysiku fizycznym, w chorobach mini, w tym serca, OUN, wylewach, napadach epileptycznych, niedoczynnoci tarczycy, radioterapii, farmakoterapii statynami. Spadek CPK moe oznacza RZS lub alkoholow chorob wtroby. Izoenzym sercowy (CK-MB) uywany jest w diagnostyce zawau minia sercowego. (por. II-5-b i c)

j)

103 - -

tlenek azotu (NO): Arg + O2 syntaza tlenku azotu (NOS) Cyt + NO NOS wymaga kofaktorw: NADPH, FAD, FMN, THB (tetrahydrobiopteryny) oraz hemu. Wystpuje w trzech formach dwch konstystucyjnych (rdbonkowa eNOS, neuronalna nNOS) oraz jednej indukowalnej (makrofagowa iNOS). NO produkowany przez rdbonek w odpowiedzi na pobudzenie PS+ ( ACh PIP2 IP3 + DAG Ca2+ Ca2+/kalmodulina NOS NO) dyfunduje do lecej gbiej miniwki gadkiej naczy, gdzie pobudza GC do produkcji cGMP, ktry stymuluje defosforylacj acuchw lekkich miozyny, wykazujc dziaanie rozszerzajce naczynia oraz hamujce agregacj trombocytw. Dziaanie tego ukadu mona nasili podajc egzogenny donator NO (np. nitrogliceryn) lub zahamowa PDE rozkadajc cGMP (np. sildenafil). NO jest usuwany przez wizanie z hemoproteinami oraz interakcje ze zwizkami tlenu: NO + O2 NO2 NO + HO2* ONOOH (peroksyazotyn) NO2 + OH* k) Ornityna (Orn) nie jest kodowana przez mRNA, a jedynie powstaje z Arg jako jeden z produktw cyklu mocznikowego. Moe albo wczy si w nastpny obrt cyklu (kondensacja z karbamoilofosforanem) albo zosta rozoona przez transaminacj: Orn + -KG -aminotransferaza Orn -semialdehyd Glu + Glu Dalsze przemiany -semialdehydu Glu prowadz do Glu lub Pro (patrz Pro). Orn moe podlega rwnie dekarboksylacji do putrescyny, ktra stanowi substrat do syntezy biogennych amin alifatycznych poliamin:

Poliaminy (spermidyna i spermina) to zasadowe substancje zwizane z proliferacj i wzrostem komrkowym (przez wizanie z kwasami nukleinowymi powoduj ich stabilizacj i stymuluj biosyntez). Ponadto obniaj RR i temperatur ciaa. l) Cysteina (Cys, C) naley do aa endogennych. Syntetyzowana jest w przez fuzj dwch innych aa Met i Ser, a dokadniej (patrz rwnie Met): Met homocysteina homocysteina + Ser cystationina Cys Moe rwnie powstawa przez rozkad wiza dwusiarczkowych cystyny: Cys-S-S-Cys + NADH + H+ reduktaza cystynowa 2 Cys-SH + NAD+ Jej katabolizm jest odbywa si rwnie na dwa sposoby, prowadzce do wsplnego koca: I: Cys dioksygenaza cysteinosulfinian AT -sulfinylo-Pyr desulfinaza Pyr II: Cys AT tiolo-Pyr siarkotransferaza Pyr Oprcz wyjtkowej funkcji w ksztatowaniu struktury biaek, Cys stanowi jeden z substratw do syntezy glutationu (GSH): Cys + Glu + ATP syntetaza -Glu-Cys -glutamylocysteina + ADP -Glu-Cys + Gly + ATP syntetaza GSH ADP + -glutamylocysteinyloglicyna (GSH)

104 - -

m) Fenyloalanina (Phe, F) jest dla czowieka egzogenna (organizm nie potrafi samodzielnie jej wytworzy). Praktycznie jedyn reakcj (poza wbudowywania do biaek) Phe jest hydroksylacja do Tyr zachodzca w hepatocytach: Phe hydroksylaza Phe Tyr Niedobr tego enzymu jest przyczyn hiperfenyloalaninemii typu I, czyli klasycznej fenyloketonurii (PKU). Wobec braku enzymu Phe jest katabolizowana przez transaminacj do nie fizjologicznych metabolitw, jak fenylopirogronian (fenyloketon), felylooctan i fenyloetyloamina; ten pierwszy mona wykrywa w moczu i stanowi wwczas wskanik diagnostyczny PKU. n) Tyrozyna (Tyr, Y) jest aa endogennym, ktry powstaje w wyniku hydroksylacji Phe o ile nie wystpuje niedobr tej ostatniej lub blok metaboliczny hydroksylacji (PKU). Katabolizm Tyr obejmuje szereg reakcji: Tyr + -KG AT, PLP {P}-hydroksyfenylo-Pyr + Glu {P}-hydroksyfenylo-Pyr + O2 dioksygenaza, Cu2+, wit. C homogentyzynian + CO2 homogentyzynian + O2 dioksygenaza, Fe2+ maleiloacetooctan maleiloacetooctan izomeraza cis-trans, GSH fumaryloacetooctan fumaryloacetooctan + H2O fumaryloacetoacetaza fumaran + acetooctan (AcAc) Nastpnie fumaran wchodzi do cyklu Krebsa, za acetooctan zasila pule cia ketonowych (patrz punkt V-5-e). Niedobr dioksygenazy homogentyzynianu powoduje alkaptonuri. Gwne objawy choroby zwizane s ze wzmoon konwersj Tyr do melaniny i jej odkadaniem w tkankach i obejmuj: ochranoz (wzmoon pigmentacj tkanki cznej), zapalenie staww oraz ciemnienie moczu na powietrzu. Ponadto Tyr moe ulega: dezaminacji do tyraminy, sprzganiu z jodem do mono- (MIT) i dwujodotyrozony (DIT), z ktrych nastpnie powstaj hormony tarczycy trjjodoyronina (T3) oraz tyroksyna (T4), hydroksylacji przez hydroksylaz Tyr do dihydroksyfenyloalaniny (DOPA): Tyr 3-monooksygenaza (hydroksylaza) Tyr, Cu2+ DOPA DOPA peni niezwykle istotn rol metaboliczn, stanowi bowiem zwizek wyjciowy dla dwch wanych szlakw, tj.: syntezy amin katecholowych (neurony, rdze nadnerczy), stanowicych neurotransmitery i hormony: DOPA dekarboksylaza DOPA, PLP dopamina (D) dopamina -oksydaza dopaminowa, Cu2+, wit. C noradrenalina (NA) noradrenalina N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa adrenalina (A) Katecholaminy s katabolizowane przez oksydaz monoaminow (monoaminooksydaz = MAO) oraz katecholoksymetylotransferaz (COMT) odpowiednio: D do kwasu homowalinowego (HVA), NA do normetanefryny i kwasu wanilinomigdaowego (VMA), za A do metanefryny i VMA. Zarwno wolne aminy katecholowe, jak i ich metabolity, stanowi wskanik diagnostyczny oglnoustrojowej produkcji. Markery te ulegaj zwikszeniu w guzie chromochonnym rdzenia nadnerczy (phaeochromocytoma). syntezy barwnikw skry i wytworw naskrkowych melanin (melanogeneza): DOPA oksydaza katechlowa dopachinon dopachinon trichochromy, feomelaniny (czerwone), melaniny mieszane, melanochrom melanochrom i inne eumelaniny (ciemnobrzowe) eumelaniny / feomelaniny + biaka macierzy melanosomalnej melanoproteiny Zaburzenia enzymw szlaku melanogenezy prowadz do hipopigmentacji bd albinizmu. o) Lizyna (Lys, K) jest dla czowieka aa egzogennym. Ulega ona katabolizmowi bez transaminacji do CO2 i H2O. Lys stanowi substrat do syntezy karnityny przenonika dugoacuchowych KT przez bon mitochondrialn (patrz punkt IV-5-b): Lys N6-trimetylo-Lys N6-trimetylo-3-hydroksy-Lys karnityna Moe rwnie ulega mikrosomalnej hydroksylacji do Hyl. p) Hydroksylizyna (Hyl, Lys-OH) jest endogenna, cho nie kodowana przez mRNA powstaje z Lys pod wpywem swoistej hydroksylazy na zasadzie analogicznej do syntezy Hyp z Pro: Lys hydroksylaza Lys, Fe2+, O2, wit. C, -KG Hyl

105 - -

q) Histydyna (His, H) jest aa egzogennym. Ulega degradacji w nastpujcym cigu reakcji: His histydaza urokanian urokanian urokanaza 4-imidazolo-5-propionian 4-imidazolo-5-propionian imidazolopropionaza N-formimino-Glu (FIGLU) FIGLU + THF formiminotransferaza Glu Glu + formimino-THF His jest ponadto prekursorem aminy biogennej histaminy: His dekarboksylaza aa aromatycznych / dekarboksylaza His histamina Dekarboksylaza His hamowana jest przez aa -metylowe. Histamina bierze udzia w rozwoju alergii i stanu zapalnego. Katabolizowana jest przez imidazolo-N-metylotransferaz, monooksygenaz (MAO) i dioksyganaz (DAO) do N-metyloimidazolooctanu. Histamina moe by wydzielana przez pewne guzy przewodu pokarmowego (np. rakowiaka). r) Treonina (Thr, T) jest aa egzogennym. Katabolizm przebiega nastepujco: Thr aldolaza Th, PLP aldehyd octowy + Gly aldehyd octowy dehydrogenaza aldehydowa octan syntaza AcCoA AcCoA Metionina (Met, M) rwnie jest egzogenna. Ulega nastpujcym reakcjom katabolicznym: Met aktywacja, - CH3, - S, - NH3 -ketomalan -ketomalan oksydacyjna karboksylacja -KG -KG - CO2 propionylo-CoA propionylo-CoA + CO2 metylomalonylo-CoA metylomalonylo-CoA wit. B12 sukcynylo-CoA Dziki niepowtarzalnej budowie (grupa metylowa poczona z reszt czsteczki przez atom siarki) Met bierze udzia w przenoszeniu grup metylowych na inne zwizki: Met + ATP adenozylotransferaza Met S-adenozylo-Met (SAM) SAM + X transmetylaza SA-homocysteina + X-CH3 SA-homocysteina adenozylotransferaza homocysteina Ponadto dekarboksylowana SAM bierze udzia w syntezie poliamin (patrz Orn), za homocysteina w syntezie Cys (patrz Cys). Tryptofan (Trp, W) zaliczany jest do aa egzogennych. Ulega on katabolizmowi w skomplikowanym szlaku kinureninowo antranilanowym z udziaem PLP do CO2 i H2O. Trp jest prekursorem zwizkw aktywnych biologicznie: serotoniny oraz melatoniny: Trp hydroksylaza Trp 5-hydroksy-Trp (5-HTP) 5-HTP dekarboksylaza 5-HTP / aa aromatycznych 5-hydroksytryptamina (5-HT, serotonina) 5-HT transmetylaza hydroksyindolowa (HIOMT) 5-metoksytryptamina 5-HT MAO 5-hydroksyindolooctan (HIAA) 5-HT N-Ac-transferaza 5-HT N-Ac-5-HT N-Ac-5-HT HIOMT N-Ac-5-metoksytryptamina = melatonina Serotonina bierze udzia w wielu procesach fizjologicznych, m. in. w regulacji motoryki przewodu pokarmowego oraz agregacji trombocytw (patrz punkt VI-4-d). Serotonina i jej metabolity (HIAA), podobnie jak histamina, mog by wydzielane przez guzy neuroendokrynne przewodu pokarmowego (np. rakowiaka). Oznaczenie poziomu HIAA w moczu odzwierciedla oglnoustrojow produkcj serotoniny.

s)

t)

106 - -

u) Walina (Val, V), leucyna (Leu, L) oraz izoleucyna (Ile, I) s okrelane wsplnie jako aa o rozgazionym acuchu bocznym. Caa grupa jest egzogenna. Ulegaj one rozkadowi w wtrobie, nerkach, miniach, sercu oraz tkance tuszczowej.

Zaburzenie aktywnoci dehydrogenazy ketokwasw poch. z aa rozgazionych jest przyczyn choroby syropu klonowego (nazwa wzia si od charakterystycznego zapachu moczu osb na ni cierpicych). Nieprzestrzeganie diety prowadzi do upoledzenia fizycznego i umysowego. Punkty wejcia metabolitw aa do cyklu Krebsa: szczawiooctan Asp Asn cytrynian AcCoA Ile, Leu, Trp Pyr Ala, Cys, Gly, Hyp, Ser, Thr AcAcCoA Leu, Lys, Phe, Trp, Thr -ketoglutaran Glu Arg, His, Gln, Pro sukcynylo-CoA Ile, Met, Val fumaran Phe, Tyr 4. a) Przemiana nukleotydw trawienie kwasw nukleinowych w przewodzie pokarmowym sok trzustkowy rybonukleaza, dezoksyrybonukleaza trawienie kwasw nukleinowych do nukleotydw sok jelitowy polinuklotydazy, nukleozydazy ( rozkad nukleotydw do zasad N i pentozo-{P})

107 - -

b) budowa nukleotydw (patrz punkt VIII-1-a)

A = 6-aminopuryna G = 2-amino-6-oksypuryna H = 6-oksypuryna X = 2,6-dioksypuryna c)

O = kwas 2,4-diokso-1,2,3,6-tetrahydro-4-pirymidynowy U = 2,4-dioksypirymidyna C = 2-oksy-4-aminopirymidyna T = 2,4-dioksy-5-metylo-pirymidyna

biosynteza nukleotydw purynowych Szlak ten jest o tyle istotny, o ile pobrane z pokarmem zasady azotowe nie s wcale lub prawie wcale wbudowywane do endogennych kwasw nukleinowych. Gwnym narzdem syntezy puryn jest wtroba. Zdolnoci tej pozbawiony jest mzg, erytocyty i leukocyty wielojdrzaste. synteza de novo z amfibolicznych zwizkw porednich (kreski z prawej strony oznaczaj wystpowanie aktywnoci enzymatycznych w kompleksach; N oglny symbol nukleotydu)

108 - -

109 - -

reakcje rezerwowe (ang. salvage) fosforylacja puryn: A + PRPP {P}-rybozylotransferaza adeninowa AMP + PPi H + PRPP {P}-rybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa (HGPRT-aza) IMP + PPi G + PRPP HGPRT-aza GMP + PPi fosforylacja nukleozydw purynowych: N-R + ATP kinaza NMP + ADP regulacja syntezy puryn

biosynteza dezoksyrybonukleodytw (redukcja rybonukleotydw)

d) degradacja puryn zachodzi g. w wtrobie i prowadzi do powstania kwasu moczowego

110 - -

U czowieka ostatecznym produktem katabolizmu purynowego jest kwas moczowy. Wikszo innych ssakw potrafi natomiast utlenia mocznik do alantoiny, nazwanej tak od jednej z bon podowych omoczni (ac. allantois) w ktrej ulega gromadzeniu. Kwas moczowy peni rol antyoksydantu, co stanowi przewag nad alantoin, jest jednak od niej kilkukrotnie gorzej rozpuszczalny w wodzie. Z tego powodu przy nadmiernym steniu we krwi (hiperurykemii) ulega wytrceniu, uszkadzajc nerki (kamica moczanowa, niewydolno) i stawy (guzki dnawe dna moczanowa). Przyczynami hiperurykemii mog by: wysoka poda puryn i/lub fruktozy w diecie, godzenie, jednoczesny rozpad duej iloci komrek np. rozlege urazy, oparzenia, zesp rozpadu guza (TLS) towarzyszcy nowotworom ukadu krwiotwrczego. Postpowanie lecznicze obejmuje: odpowiedni diet, zmniejszenie syntezy kwasu moczowego inhibitory oksydazy ksantynowej (allopurinol), zwikszenie rozpuszczalnoci moczanw w moczu przez podniesienie jego pH np. inhibitory anhydrazy wglanowej (acetazolamid), podanie enzymu rozkadajcego kwas moczowy do alantoiny rekombinowana urykaza (rasburikaza) e) odzysk puryn cykl nukleotydw purynowych

f)

synteza nukleotydw pirymidynowych

111 - -

synteza de novo

szlaki rezerwowe fosforylacja pirymidyn, np. OA + PRPP rybozylotransferaza orotanowa OMP + PPi fosforylacja rybonukleotydw: U-R + ATP kinaza urydynowo-cytydynowa UMP + ADP C-R + ATP kinaza urydynowo-cytydynowa CMP + ADP C-dR + ATP kinaza deoksycytydynowa dCMP + ADP T-dR + ATP kinaza tymidynowa dTMP + ADP regulacja syntezy pirymidyn

112 - -

g) degradacja pirymidyn produkty rozpuszczalne w wodzie

h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydw rola kwasu foliowego w metabolizmie nukleotydw kwas foliowy = pterydyna + PABA + Glu W jelicie kwas foliowy ulega reduktazie folianowej zalenej od NADPH, dajc DHF (reakcj hamuje trimetoprim) oraz THF (hamuje metotreksat (MTX)). Rol THF jest udzia w przenoszeniu reszta jednowglowych (C1):

Niedobr kwasu foliowego i/lub wit. B12 uniemoliwia syntez nukleotydw purynowych i TMP, a przez to niedokrwisto megaloblastyczn. Synteza puryn blokowana jest przez analogi Glu: azaseryna blok wczania N3 diazanorleucyna blok wczania N9 azatiopryna 6-merkaptopuryna (6MP) bezporedni blok powstawania AMP i XMP kwas mykofenolowy (MPA) bezporedni blok powstawania XMP Analogi pirymidyn kompetycyjnie hamuj enzymy biorce udzia w ich biosyntezie ({P}rybozylotransferaza orotanowa, np. 5-fluorouracyl (5FU), allopurinol.

113 - -

Wydalanie i reabsorpcja moczanw s kompetycyjnie hamowane przez wysokie dawki ASA. Klasyfikacja chorb przebiegajcych z hiperurykemi: prawidowe wydalanie moczanw, defekt pracy nerek nadmierna produkcja i wydalanie moczanw niedobr enzymatyczny (sPRPP, HGPRT, glukozo-6-fosfataza) wtrna patologia (nowotwr, uszczyca) nieznana etiologia Przyczyn dny moczanowej jest enzymatyczne upoledzenie katabolizmu puryn ( vm, KM lub brak regulacji syntazy PRPP, niedobr HGPRT-azy). Hiperurykemia prowadzi do krystalizacji moczanw w stawach w postaci guzkw dnawych, przeciwko ktrym skierowana zostaje odpowied zapalna. Rozwija si przewleke dnawe zapalenie staww dajce artretyzm. W zespole Lescha Nyhana wystpuje deficyt aktywnoci HGPRT-azy, co powoduje PRPP puryn hiperurykemia, kamica moczanowa, poraenie mdkowe, samookaleczenia. Choroba von Gierkego polega na niedoborze glukozo-6-fosfatazy, co powoduje PRPP, hiperurykemi i kwasic mleczanow. Niedobr aktywnoci oksydazy ksantynowej moe by spowodowany mutacj kodujcego genu lub silnym uszkodzeniem wtroby. Objawia si hiperurykemi, ksantynuri i kamic ksantynow. niedobr transaminazy kwasica -aminoizomalanowa niedobr ornitynotranskarbamoilazy lekka kwasica orotowa, nietolerancja biaek, encefalopatia wtrobowa orotoacudyria: typ II defekt dekarboksylazy orotydylanowej anemia megaloblastyczna typ I j. w. + defekt {P}-rybozylotransferazy orotanowej j. w. + niedobr immunologiczny niedobr deaminazy adenozynowej (1) lub fosforylazy nukleotydu purynowego (2) nagromadzenie nie rozoonego dATP i gGTP allosteryczne zahamowanie reduktazy rybonukleotydowej pozbawienie komrek dCTP niedobr immunologiczny: (1) limfocyty T i B, (2) tylko limfocyty T Metabolizm porfiryn struktura porfiny 4 piercienie pirolowe (I IV) poczone mostkami metinowymi ( ) (por. punkt I-3-e)

5.

podstawniki: A = octan, M = metyl, P = propionian, V = winyl g. hemoproteiny: mioglobina, hemoglobina, cytochrom c, cytochrom P450 (CYP), katalaza (CT), 2,3dioksygenaza Trp, syntaza tlenku azotu (NOS)

114 - -

a)

synteza hemu 85 % zachodzi w komrkach erytroidalnych szpiku, za prawie caa reszta w wtrobie

regulacja syntezy hemu zachodzi na etapie syntazy ALA i polega g. na modulacji ekspresji genw (-) hem + aporepresor (+) leki metabolizowane przez CYP (barbiturany, gryzeofulwina) (-) podawanie glukozy lub hematyny

115 - -

b) rozkad hemu cz porfirynowa katabolizowana jest przez komrki ukadu siateczkowo rdbonkowego (RES) wtroby, ledziony i szpiku

c)

zaburzenia metabolizmu porfiryn

Porfirie to wrodzone (dziedziczone g. AD) lub nabyte choroby zwizane z wadliw syntez hemu. Zalenie od enzymu, ktrego dotyczy defekt, wyrnia si 5 typw choroby. Nagromadzenie ALA i PBG w tkankach i pynach ustrojowych powoduje toksyczne dziaanie na nerwy brzuszne, std ble brzucha. Wychwyt ALA przez mzg i jego hamujcy wpyw na aktywno ATP-azy powoduje upoledzenie neurotransmisji i przez to zaburzenia neuropsychiczne. Zwikszony poziom porfirynogenw w skrze i tkankach, poczony z ich samorzutnym utlenianiem si do porfiryn pod wpywem wiata, znacznie nasila stres oksydacyjny; wolne rodniki uszkadzaj organella komrkowe, m. in. lizosomy, ktre uwalniaj enzymy, niszczce skr i powodujce jej bliznowacenie (std nadwraliwo na wiato). Leczenie polega na unikaniu lekw i alkoholu, podawaniu glukozy, hematyny (hamuj syntez hemu) i -karotenu (antyoksydant) oraz aplikowaniu na skr filtrw hamujcych promienie wiata widzialnego u UV.

116 - -

hiperbilirubinemia dyfuzja do tkanek taczka produkcja np. hemoliza hiperbilirubinemia retencyjna = miszowa bilirubina nie sprzona = porednia taczka jder podstawnych (kernicterus) usuwanie np. uszkodzenie wtroby, niedobr enzymu, mechaniczna blokada odpywu hiperbilirubinemia zwrotna = zastoinowa bilirubina sprzona = bezporednia bilirubina w moczu (choluria)

hiperbilirubinemia z dominacj bilirubiny nie sprzonej anemia hemolityczna fizjologiczna taczka noworodkw hemoliza HbF i niewydolno enzymatyczna wtroby w zakresie dostatecznie szybkiego usuwania bilirubiny poredniej; taczka jder podstawnych mzgu powoduje upoledzenie umysowe; leczenie obejmuje podawanie fenobarbitalu (nasila proces sprzgania) oraz fototerapi (stymuluje rozkad bilirubiny w skrze) zesp Criglera Najjara typ I wrodzona taczka niehemolityczna defekt UDP-glukuronylotransferazy typ II podobny defekt o agodniejszym przebiegu zesp Gilberta defekt wychwytu i sprzgania bilirubiny hiperbilirubinemia toksyczna uszkodzenie wtroby: CCl4, CHCl3, arsfenamina (Salwarsan), acetaminofen (Paracetamol), WZW, marsko, zatrucie grzybami (muchomory amanototoksyny) hiperbilirubinemia z dominacj bilirubiny sprzonej niedrono przewodw ciowych, ucisk przez guz trzustki cholestaza taczka cholestatyczna zesp Dubina Johnsona, przewleka taczka samoistna defekt przenonika sprzonej bilirubiny do kanalikw ciowych zesp Rotora defekt transportu anionw organicznych przez hepatocyty typ taczki fizjologia hemolityczna mechaniczna typ taczki fizjologia hemolityczna wtrobowa mechaniczna bilirubina sprzona w moczu w normie + bilirubina w moczu +/ + urobilinogen w moczu niewiele urobilinogen w kale +

bilirubina w surowicy + porednia bezporednia

urobilinogen w moczu + /+

117 - -

ROZDZIA VII BIOCHEMIA FUNKCJONALNA TKANEK

1. a) Endogenne regulatory procesw metabolicznych regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaniki wtrne receptory

Dziaanie hormonu na komrk rozpoczyna si od poczenia z wysoko swoistym receptorem. S to struktury zapewniajce wychwyt hormonw ju w bardzo niewielkich steniach, 106 109 x mniejszych ni czsteczki o podobnej budowie. Oprcz swoistoci receptory charakteryzuj si duym powinowactwem, szybk odwracalnoci oraz wysycalnoci. W strukturze receptora wyrniamy dwie domeny czynnociowe rozpoznajc (przycza hormon) oraz sygnalizacyjn (przekada informacj na czynno wewntrzkomrkow tzw. sprzenie receptorowo efektorowe). Receptory skadaj si z kilku czci, np. nAChR z 5, insulinowy 4, kaskadowy cAMP 7, steroidowy 4. Jeeli chodzi o umiejscowienie, to hormony biakowe, polipeptydowe i katecholaminy cz si z receptorami bonowymi, modulujcymi aktywno enzymw, za hormony sterydowe, tarczycowe i retinolowe stanowi ligandy dla receptorw rdkomrkowych (cytozolowych lub jdrowych), ktre modyfikuj ekspresj genw. Receptory sieroce s spokrewnione z rodzin receptorw typu steroidowo tarczycowego, ale nie posiadaj znanego ligandu. Przykadowo receptor glikokortykoidowy ma budow: C koniec domena wica hormon domena wica DNA (cilej sekwencj odpowiedzi hormonalnej HRE) 2 regiony aktywujce transkrypcje genu 2 regiony translokacji z cytoplazmy do jdra region wicy Hsp (biako szoku cieplnego, chaperon) w nieobecnoci ligandu N koniec. hormony

Hormony s czsteczkami chemicznymi, ktre po zwizaniu ze swoistymi receptorami moduluj czynnoci yciowe komrki. Hormony s substancjami endogennymi, co odrnia je od wielu ksenobiotykw, ktre rwnie mog wywoywa efekty biologiczne. Hormony klasyfikowa mona ze wzgldu na rne kryteria. Pod wzgldem struktury chemicznej mwimy o pochodnych aminokwasw, polipeptydach i steroidach. Mog to by czsteczki rozpuszczalne w wodzie (hydrofilne) lub w tuszczach (lipofilne). Receptory dla hormonw mog by zlokalizowane na powierzchni komrki bd w jej wntrzu. Wreszcie odnonie II przekanika moe nim by kompleks hormonu z receptorem, cAMP, cGMP, PIP2, Ca2+ lub kaskada kinazowa. Powysze cechy ukadaj si w pewne wzory, co pozwala na klasyfikacj hormonw na dwie gwne grupy. Pierwsza grupa hormonw obejmuje steroidy, jodotyroniny, kalcytriol i retinoidy. S to zwizki lipofilne, dlatego do transportu w osoczu wymagaj biaek nonikowych, co przedua ich okres ptrwania do rzdu godzin lub dni. Jednoczenie lipofilno pozwala im na przenikanie przez bony wszystkich komrek, jednak wywieraj efekty biologiczne wycznie tam, gdzie znajduje si swoisty dla nich receptor. Poczenie hormonu pierwszej grupy z receptorem rdkomrkowym daje II przekanik. Taki kompleks ulega aktywacji (np. przez odczenie Hsp90 w receptorze glikokortykoidowym), po czym moe migrowa do jdra i wiza si z chromatyn, aktywujc lub dezaktywujc okrelone geny. Modyfikacja moe zachodzi na rnych etapach szlaku informacyjnego: transkrypcji, translacji, stenia swoistych biaek (nie wicej ni 1%). Wyrni mona dwa miejsca regulujce gen i pooone przed nim, na ktre moe wpyn hormon: nieswoisty element promotorowy okrelajcy miejsce wizania polimerazy RNA II oraz swoista sekwencja odpowiedzi hormonalnej (HRE) skadajca si z kilku fragmentw i odpowiedzialna za modulacj czstoci inicjacji transkrypcji (HRE wie si z kompleksem silniej ni inne fragmenty DNA por. punkt VIII-3-b). Geny kontrolowane przez kilka hormonw maj odpowiedni liczb HRE. Zmienna ilo HRE i fragmentw DNA wsptworzy jednostki odpowiedzi hormonalnej (HRU) ich analiza pozwala na caociow ocen wpywu hormonu na komrk. Aktywno genw moe by modulowana przez hormony peptydowe rwnie za porednictwem cAMP oraz CREB.

118 - -

grupa hormonw hormony pciowe: androgeny, estrogeny, progestyny hormony kory nadnerczy: gliko- i mineralokortykoidy hormony tarczycy: trjjodotyronina i tyroksyna kalcytriol (aktywna witamina D3) kwas retinolowy (poch. witaminy A)

swoisty HRE ARE, ERE, PRE GRE, MRE TRE VDRE RARE

Druga grupa hormonw skada si z polipeptydw, biaek i katecholamin. S to czsteczki hydrofilne, nie transportowane w poczeniach z biakami nonikowymi, dlatego ich okres ptrwania jest rzdu minut. Po zwizaniu z receptorem bonowym uwalniany jest II przekanik w zalenoci od niego wyrniamy 4 podgrupy: podgrupa II A II B II C II D II przekanik cAMP cGMP Ca2+ / PIP2 kaskada kinaz przykady hormonw i receptorw (+) ACTH, CT, FSH, hCG, ADH, CRH, LPH, LH, MSH, PTH, TSH, glukagon, katecholaminy (receptor ) ANF, NO receptory M (ACh), CCK, PDGF, OT, TRH, ADH, PS, angiotensyna II, gastryna, gonadoliberyna, katecholzminy (receptory 1) FGF, IGF-I/II, EGF, NGF, PDGF, EPO, GH, CS, PRL, insulina

Hormony grupy II A wpywaj na cyklaz adenylanow (AC), aktywujc j (HS+) lub dezaktywujc (Hi-). Aktywna cyklaza katalizuje przejcie ATP w cykliczny AMP (cAMP). Ten sam hormon moe jednak rnie zmienia poziom cAMP w rnych tkankach, np. adrenalina dziaa gwnie na minie, a glukagon gwnie na wtrob. Jeeli tkanka reaguje na kilka hormonw tej samej podgrupy, to musi posiada dla kadego z nich niepowtarzalny receptor, regulujcy na waciwy sobie sposb aktywno cyklazy. Rwnoczesne dziaanie hormonw na komrk nie jest jednak addytywne. Cyklaza adenylanowa nie wystpuje samodzielnie, lecz jako fragment wikszego kompleksu receptor dla hormonw tej podgrupy skada si ponadto z czci wicej hormon oraz biaka G. Bezporedni receptor skada si z 7 hydrofobowych transbonowych domen; poprzez zmiany konformacji pod wpywem hormonu ma on zdolno indukcji biaka G. Samo za biako G (biako wice GTP GTPBP) jest heterotrimerem o budowie . Istnieje wiele odmian GTPBP wyrniona dotychczas 16 odmian podjednostki , 6 , 12 oraz 8 odmian cyklaz. Podjednostki i s cile ze sob zwizane i zakotwiczone w bonie dziki posttranslacyjnej poliprenylacji resztami farnezylu oraz mirystylacji. Podjednostka jest mobilna i w zalenoci od jej wystpowania w wersji S lub i mwimy o biakach G pobudzajcych (GS) oraz hamujcych (Gi). Indukcja przez bezporedni receptor katalizuje reakcj: GDP- + GTP GTP- + + GDP, za powrt do stanu wyjciowego moliwy jest dziki GTP-azowej aktywnoci podjednostki S. Toksyna cholery jest nieodwracalnym aktywatorem cyklazy przez zniesienie aktywnoci GTP-azy, podobnie toksyna krztuca przez zniesienie aktywnoci podjednostki i. Podjednostka zwizana z GTP aktywuje odpowiedni efektor moe nim by nie tylko cyklaza adenylanowa, lecz rwnie kanay potasowe, wapniowe lub fosfolipaza C (PLC). Dziki temu kompleksy biaek bior udzia w regulacji metabolizmu, skurczu minia, akcji serca i cinienia ttniczego, aktywnoci nerwowej oraz w percepcji wzrokowej i wchowej. cAMP wywiera odpowiednie efekty fizjologiczne poprzez poczenie z heterotetrameryczn czsteczk kinazy zalenej od cAMP. Skada si ona z dwch podjednostek regulatorowych (R) i dwch katalitycznych (C): 4 cAMP + R2C2 R2(cAMP)4 + 2 C. Uwolniona i przez to zaktywowana podjednostka katalityczna katalizuje przeniesienie reszty -fosforanowej z ATP na seryn lub treonin odpowiedniego biaka, zazwyczaj w sekwencji RRXS lub KRXXS. Powstanie fosfoprotein wywouje efekty biologiczne, jako e fosforylacja dotyczy najczciej czsteczek enzymw. Dochodz do tego wtrne fosforylacje oraz wpyw cAMP na geny poprzez biako CREB. Przerwanie dziaania odbywa si gwnie przez hydroliz cAMP do 5-AMP przez fosfodiesterazy (PDE). Podlegaj one regulacji przez inne hormony, kompleks Ca2+-kalmodulina oraz ksenobiotyki (np. metyloksantyny). Rwnie fosfoproteiny ulegaj rozkadowi przez fosfatazy, ktre z kolei mog znw by regulowane przez odwracaln fosforylacj oraz interakcje z biakami. Hormony grupy II B dziaaj podobnie na cyklaz guanylanow, katalizujc przejcie GTP w cGMP. Ten ostatni peni funkcj II przekanika dla atriopeptyn (np. ANF), wywoujc natriurez, diurez, wazodylatacj oraz spadek produkcji aldosteronu. Podobnie dziaaj: tlenek azotu (NO), nitroprusydek sodu, nitrogliceryna, azotyn sodu (NaNO2), azydek sodu (NaN3) dziki fosforylacji acuchw lekkich miozyny miocyty ulegaj relaksacji, a naczynia rozszerzeniu. Efekt ten wzmagaj inhibitory PDE, np. cytrynian sildenafilu (preparat Viagra).

119 - -

Jon wapniowy (Ca2+) jest istotnym regulatorem wewntrzkomrkowym, biorcym udzia w skurczu minia, hemostazie, przekanictwie synaptycznym oraz modyfikacji aktywnoci enzymw. Pomimo znacznego gradientu stenia ok. 5 10 tys. x (Ca2+ w ECF 2,5 mM a w ICF 0,1 10 M) transport przez bon jest ograniczony. Stan taki mone by zmieniony przez dziaanie hormonw podgrupy II C, mobilizujcych wymiennik Na+/Ca2+ (dua pojemno a mae powinowactwo). Ponadto wystpuj: wymiennik Ca2+/H+ (due powinowactwo a maa pojemno) oraz mechanizm mobilizacji wapnia z mitochondriw i ER. Wiele swoistych efektw Ca2+ wywiera przez zalene od siebie biako regulatorowe kalmodulin. Po wysyceniu w nim czterech miejsc wicych Ca2+ zmiany konformacyjne prowadz do uformowania -helisy, co pozwala na modyfikacj aktywnoci enzymw. Czsto kalmodulina stanowi fragment wikszego kompleksu biakowego, w ktrych peni wwczas funkcje regulatorowe. Poczenie Ca2+-kalmodulina jest w stanie modyfikowa aktywno nastpujcych enzymw: cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa, PDE, Ca2+-zalena kinaza biakowa, kinaza biakowa zalena od Ca2+ i fosfolipidw, kinaza miozyny, kinaza fosforylazy, kinaza NAD+, fosfataza fosfoproteinowa 2B, fosfolipaza A2, kinaza pirogronianowa, dehydrogenaza pirogronianowa, karboksylaza pirogronianowa, Ca2+/Mg2+-ATP-aza, dehydrogenaza glicerolo-3-{P}, syntaza glikogenowa. Szlak polifosfoinozytolowy polega na aktywacji fosfolipazy C (PLC) oraz otwarciu kanaw wapniowych przez kompleks receptora z hormonem za porednictwem biaka G. PLC katalizuje rozpad bonowego fosfatydyloinozytolodwufosforanu (PIP2) do inozytolotrjfosforanu (IP3) oraz diacyloglicerolu (DAG). Ten pierwszy indukuje uwalnianie wapnia z ER i mitochondriw. Wzrost cytozolowego poziomu wapnia powoduje jego czenie z kalmodulin oraz konsekwentn aktywacj kinaz kalmoduliny swoistej i wieloczynnociowej. IP3 moe ulec przeksztaceniu w nieaktywny IP2 lub w potencjalnie aktywny IP4. 1,2-DAG wraz z Ca2+ aktywuje kinaz biakow C (PKC). Kinazy kalmoduliny oraz PKC fosforyluj odpowiednie biaka. Powstae fosfoproteiny oraz inne skutki dziaania Ca2+ wywouj reakcje biologiczne. Hormony grupy II D dziaaj przez kaskad kinaz biakowych. Do tej grupy nale regulatory procesw wzrostu i rnicowania oraz reakcji zapalnych. Hormon bezporednio lub porednio (tj. odpowiednio przez receptor bd proteiny Tyk-2 czy JAK-1/2) aktywuje kinazy tyrozynowe, ktre dalej katalizuj lawin fosforylacji. b) eikozanoidy budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne Eikozanoidy s pochodnymi kwasu arachidonowego oraz innych 20-wglowych kwasw tuszczowych z wizaniami podwjnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi. Zwizki te peni funkcje lokalnie dziaajcych hormonw, oddziaywujcych na komrki docelowe za porednictwem receptorw zwizanych z biakami G. Czsteczka kwasu arachidonowego pochodzi zazwyczaj z pozycji sn-2 fosfolipidw bonowych, skd odszczepiana jest przez fosfolipaz A2 (PLA2); proces ten nasila adrenalina, angiotensyna II, bradykinina, trombina oraz Ca2+. Nastpnie od arachidonianu rozpoczyna si szlak cyklooksygenazy (PG, PGI, TX) oraz lipoksygenazy (LT, LX). Wyrniamy 3 grupy (I, II, III) eikozanoidw powstajcych z kwasw tuszczowych zawartych w diecie: linolowego, arachidonowego oraz -linolenowego. Eikozanoidy charakteryzuje si podajc, do ktrej z 5 rodzin nale, dodajc liter, oznaczajc ilo i rodzaj podstawnikw oraz liczb, oznaczajc cakowita ilo wiza podwjnych oraz seri.

Biosynteza prostanoidw jest katalizowana przez syntaz prostaglandyny H (PGHS, izoenzym 1 i 2), posiadajc aktywno cyklooksygenazy (COX) i peroksydazy: arachidonian + 2 O2 PGG2 PGH2. Powstay endoperoksyd moe ulec przeksztaceniu do: PGD2 (izomeraza), PGE2 (izomeraza) i dalej PGF2 (reduktaza), PGI2 (syntaza prostacyklinowa) i dalej 6-keto-PGF1, TXA2 (syntaza tromboksanowa) i dalej TXB2 oraz do malonylodwualdehydu i hydroksyheptadekatrienoanu (HHT). Podobne przeksztacenia zachodz w grupach I i III. Cyklooksygenaza wykazuje zdolno katalizowania samozagady gdy zaprzestaje syntezy prostanoidw rozkada sam siebie. Ze wzgldu na udzia prostanoidw w rozwoju stanu zapalnego wiele lekw p/zapalnych uderza wanie w ukad PGHS. Substancje p/zapalne mona podzieli na sterydowe i niesterydowe.

120 - -

Fizjologicznie kortykosteriody cakowicie hamuj transkrycj PGHS-2. Kwas acetylosalicylowy acyluje i inaktywuje PGHS. Wiele niesteroidowych lekw p/zapalnych (NLPZ, ang. NSAID) kompetycynie hamuje cyklooksygenaz, np. ibuprofen czy indometacyna. Raz powstae prostanoidy ulegaj degradacji przez dehydrogenaz 15-hydroksyprostaglandynow; wpyw ten jest hamowany przez sulfasalazyn i indometacyn. Szlak lipoksygenazy prowadzi do powstania leukotrienw (LT) i lipoksyn (LX). LT to sprzone trieny wytworzone w leukocytach, mastocytach i trombocytach. Wystpuj tam 5-, 12- oraz 15-lipoksygenaza, ktre przeksztacaj arachidonian w hydroksyperoksyeikozatetraenoany (HPETE), te za z kolei pod wpywem peroksydazy daj hydroksyeikozatetraenoany (HETE). Przez dehydratacj 5-HPETE powstaje LTA4, ktry hydrolaza epoksydu LTA4 przeksztaca w LTB4, za S-transferaza glutationowa w LTC4. Nastpnie GGTP przeksztaca LTC4 w LTD4, za dwupeptydaza Cys-Gly LTD4 w LTE4. LX s sprzonymi tetraenami powstajcymi w leukocytach pod wpywem wicej ni jednej lipoksygenazy, natomiast ich dalsze przeksztacanie w LXA4-E4 zachodzi podobnie jak LT. Prostaglandyny (PG) i prostacykliny (PGI) bior udzia w rozwoju stanu zapalnego, regulacji szerokoci naczy krwiononych ((-): PGA, PGE, PGI, (+): PGF), PGI2-3 produkowane w rdbonku zapobiegaj agregacji trombocytw, zawarte w nasieniu pobudzaj miniwk macicy, wydzielane przez pd indukuj pord; stosowane s w antykoncepcji, aborcji, chorobie wrzodowej odka, stanie zapalnym, nadcinieniu, astmie oskrzelowej i nieycie nosa. Tromboksany (TX) produkowane przez pytki autokrynnie indukuj ich agregacj i zwaj naczynia (TXA2). Leukotrieny (LT) produkowane s w leukocytach; wchodz w skad substancji wolno dziaajcej anafilaksji (SRS-A) LTC4-E4 wywouj silny skurcz oskrzeli. LTB4-E4 rozszerzaj naczynia krwionone i zwikszaj ich przepuszczalno oraz indukuj chemotaksj i aktywacj leukocytw, przez co przyczyniaj si do rozwoju odpowiedzi immunologicznej. 2. Gospodarka wapniowo fosforanowa w organizmie i jej regulacja

a)

rola wapnia oraz biaek wicych wap

Wap jest dla organizmu pierwiastkiem niezbdnym, penicym wiele bardzo rozmaitych funkcji. Nieorganiczne sole wapnia (fosforany i wglany) stanowi jeden z gwnych skadnikw strukturalnych koci i zbw. Wap jest pierwiastkiem bardzo nierwnomiernie rozmieszczonym w organizmie, a wzrost jego stenia w komrce powoduje liczne zmiany metaboliczne, m. in. przez czenie z kalmodulin, aktywacj kinaz i fosforylacj odpowiednich biaek, w tym wielu enzymw. Z kalmodulin analogiczna jest podjednostka C troponiny (TpC), a napyw Ca2+ do miocytu powoduje jego skurcz. W przypadku mini szkieletowych jest to wap organelli komrkowych (gwnie retikulum sarkoplazmatycznego), za skurcz mini gadkich i minia sercowego zaleny jest rwnie od zasobw pozakomrkowych. Brak kontroli nad rozkadem wapnia w przestrzeniach wodnych organizmu prowadzi do stenia pomiertnego. Wiele lekw naczyniowych i nasercowych wywouje swj efekt poprzez wpyw na czynno kanaw wapniowych. Depolaryzacja bony kolbki aksonu powoduje otwarcie napiciowozalenych kanaw wapniowych, wap indukuje czenie si pcherzykw zawierajcych neurotransmiter z bon presynaptyczn, warunkuje zatem przekanictwo synaptyczne. Wap bierze rwnie udzia w hemostazie przez czenie si z resztami Gla (karboksyglutaminianowymi) wystpujcymi na osoczowych czynnikach krzepnicia: II, VII, IX i X; efekt biologiczny jest efektem interakcji biaek, fosfolipidw i Ca2+. Ponadto wap zwiksza szczelno naczy i bon komrkowych. Ciao ludzkie zawiera ok. 1 kg wapnia, stanowicego 4 % jego suchej masy. Z tej iloci a 99 % tworzy hydroksyapatyt koci, z czego tylko 1 % moe ulega wymianie z pul wapnia pynu pozakomrkowego; proces ten podlega cisej regulacji hormonalnej. W osoczu wap wystpuje w kompleksach z cytrynianami, fosforanami i innymi anionami nieorganicznymi (6 %), w poczeniu z biakami (CBP, 47 %) oraz jako wolny i zjonizowany (47 %). Ta ostatnia forma jest aktywna i ze wzgldu na to wymaga najbardziej precyzyjnej regulacji. Fizjologicznie czny poziom wapnia we krwi wynosi 2,25 2,75 mM (9 11 mg%) mwimy wwczas o izokalcemii. Biaka wice wap z grupy albumin i globulin s po pierwsze niezbdne do wchaniania tego pierwiastka z przewodu pokarmowego (w pokarmie powinno kadego dnia znale si 0,8 1,2 mg), a po drugie zapobiegaj przekroczeniu iloczynu rozpuszczalnoci i powstawaniu ektopowych

121 - -

kalcyfikacji. Hipoproteinemia wie si zatem z hipokalcemi. Podobnie obnienie pH powoduje przejcie wapnia z CBP do formy jonowej, za wzrost pH dziaa odwrotnie (wyjania do drtwot w zespole hiperwentylacyjnym). b) regulacja przemiany wapniowej Wchanianie wapnia obejmuje: wychwyt przez rbek szczoteczkowy i bon mikrokosmkw, aktywny transport przez bon enterocytw oraz rwnie aktywne wydalanie do pynu pozakomrkowego. parathormon (PTH)

Niedoczynno przytarczyc moe by pierwotna (np. autoimmunologiczna), wtrna (jatrogenna) lub rzekoma (defekt efektora). W kadym przypadku powoduje obnienie stosunku Ca / {P}, moe powodowa tyczk, poraenie mini oddechowych, skurcz goni, zmiany skrne, zam oraz kalcyfikacj jder podkorowych mzgu. Nadczynno przytarczyc moe by pierwotna w wyniku przerostu lub nowotworu. Stan taki, podobnie jak wydzielanie peptydu podobnego do PTH (PTHRP), powoduje wzrost stosunku Ca / {P}, rozleg resorpcj koci, kamic nerkow, wapnic i / lub niewydolno nerek, zapalenia drg moczowych. Niewydolno nerek powoduje spadek produkcji kalcytriolu i wtrn nadczynno przytaczyc bdne koo chorobowe prowadzi do osteodystrofii nerkowej. Kalcytonina (CT) (32 aa) produkowana jest gwnie przez komrki pcherzykowe (parafolikularne, komrki C) tarczycy. Przy N kocu obecna jest 7-aa ptla, poczona wizaniem dwusiarczkowym. Hiperkalcemia mobilizuje produkcj CT, to za zwiksza aktywno nerkowej 24-hydroksylazy; powoduje to spadek poziomu kalcytiolu i konsekwentne obnienie [Ca2+] w ECF.

122 - -

kalcytriol 1,25(OH)2-D3

Krzywica u dzieci a osteomalacja u dorosych wystpuje wskutek spadku zarwno Ca2+ jak i {P}. Typ I spowodowany jest deficytem aktywnoci 1-hydroksylazy, za typ II defektem motywu palca cynkowego w receptorze i tym samym jego niewraliwoci na ligand (por. punkt VIII-1-j). c) rola fosforanu nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powizania z gospodark wapniow

Chocia chemicznie czysty fosfor jest pierwiastkiem silnie szkodliwym, to w formie ortofosforanu wystpuje w wielu zwizkach chemicznych ciaa ludzkiego, nie wykazujc dziaa toksycznych. Fosfor stanowi 2,5 % suchej masy ciaa; dzienne zapotrzebowanie wynosi 800 1200 mg. Wikszo tego pierwiastka zdeponowana jest w tkance kostnej w postaci hydroksyapatytu. Reszta fosforanowa przyczona jest rwnie do wielu zwizkw: kofaktorw (DPT, FMN, FAD, NAD+, NADP+, CoA, PLP), przenonikw energii (ADP, ATP, PCr), II przekanikw hormonalnych (cAMP, cGMP), kwasu fosfatydowego ({P} + glicerol + 2 FA) wchodzcego w skad fosfolipidw bon plazmatycznych oraz nukleotydw i przez to DNA i RNA. O wykorzystaniu fosforanu w procesach magazynowania energii decyduje szybki potencja przenoszenia grupy, czyli tzw. bogatoenergetyczne wizania fosforanowe. Odwracalne doczanie fosforanu do biaek, katalizowane przez kinazy i fosfatazy, umoliwia regulacje procesw metabolicznych oraz ich integracje na poziomie komrki. Odczenie pirofosforanu (PPi) w trakcie przemian chemicznych oraz jego rozkad do 2 {P} przez nieorganiczn fosfataz umoliwia zachodzenie wielu reakcji do koca. Fosforan wystpuje w kociach i w osoczu (izofosfatemia 1 1,5 mM / 3 4,5 mg%) w poczeniu z Ca2+ ten fakt oraz wsplna regulacja hormonalna przyczyniy si do rozpatrywania ich wsplnie, dlatego mwi si o gospodarce wapniowo fosforanowej. Obecno we krwi anionw fosforanowych o rnym stopniu uprotonowania pozwala na ich funkcjonowanie jako ukadu buforujcego osocza. Ilo fosforanu zaley od przypywu z pokarmem i mobilizacji przez osteoklasty oraz od wydalania z moczem i deponowania jako

123 - -

hydroksyapatytu. Hiperfosfatemia mobilizuje PTH, ktry pobudza osteoliz i klirens {P}, wypadkowo zmniejszajc [{P}] w ECF. Kalcytriol z kolei obnia klirens {P}. Hipofosfatemia oddziauje na koci rwnie niekorzystnie jak hipokalcemia. 3. Gospodarka elazem w organizmie wchanianie, regulacja, zaburzenia przemiany

elazo dostarczane jest z pokarmem w iloci 10 15 mg dziennie, jednak z powodu maej wydajnoci wchaniania do krwiobiegu dostaje si tylko 1 mg. Wchanianie Fe2+ zachodzi przez komrki krypt jelita czczego przy udziale biaka apoferrytyny. Nastpnie elazo czy si z przenoszcym je biakiem transferryn (1globulina), ktra przenosi Fe3+ do szpiku i innych narzdw. Transferryna po zwizaniu si z receptorem ulega internalizacji na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem. W lizosomach nastpuje oddzielenie Fe3+, po czym kompleks apotransferrytyny z receptorem wdruje do bony, gdzie rwnie ulega rozpadowi. Transferryna wystpuje we krwi w steniu ok. 300 mg% i jest w stanie zwiza ok. 3 mg Fe / l osocza (tzw. cakowita zdolno wizania elaza = TIBC). Fizjologicznie wysycenie ferrytyny wynosi ok. 1/3, a zatem 3 4 mg w caym organizmie. W obrbie komrki elazo ulega wbudowaniu w hem, by nastpnie wej w skad hemoprotein, do ktrych nale: hemoglobina (2,5 g Fe), mioglobina, cytochromy (CYP, cyt. c), katalaza, dioksygenaza tryptofanowa, syntaza tlenku azotu (NOS) i inne (cznie 300 mg). Kadego dnia 1 % erytrocytw ulega rozkadowi, uwalniajc przez to 25 mg elaza, ktre ulega zwizaniu przez transferryn. Ferrytyna jest biakiem magazynujcym elazo. Skada si z apoferrytyny (24 podjednostki x 18,5 kD = 444 kD) otaczajcej 3 4 tys. atomw elaza wystpujcych w postaci micelarnej. Czciowa degradacja ferrytyny prowadzi do powstania hemosyderyny. W biakach magazynujcych zgromadzone jest cznie ok. 1 g elaza. Kadego dnia w wyniku zuszczania komrek nabonka jelitowego zawierajcych elazo i wydalania ich z kaem organizm traci ok. 1 mg elaza. Ilo elaza w komrce wpywa na syntez wicych je biaek oraz ich receptorw. Wzrost poziomu Fe wzmaga translacj mRNA ferrytyny oraz degradacj mRNA receptora transferrynowo ferrytynowego (TfR). Z kolei spadek stenia Fe nasila translacj mRNA TfR, za unieczynnia mRNA apoferrytyny (por. punkt VIII-4e). Zagadnienie przemian elaza jest istotne u kobiet z powodu comiesicznych jego strat. Podobnie u ciarnych dzienne zapotrzebowanie wzrasta do 25 mg. Do niedoboru dochodzi moe w wyniku nieprawidowego odywiania. Deficyt elaza moe powodowa anemi (niedokrwisto), a erytrocyty s wwczas hipochromiczne (niedobarwliwe). Nadmiar elaza w organizmie okrela si jako hemochromatoza. Moe by ona pierwotna (o podou genetycznym mutacja 6p21.3) lub wtrna (w wyniku czstych transfuzji lub gotowania w elaznych naczyniach). Przyczyn nadmiernego poziomu elaza (> 15 g w organizmie) jest utrata regulacji wchaniania tego pierwiastka. W nadmiernych ilociach elazo przyczynia si do nasilenia stresu oksydacyjnego, ktry uszkadza wiele tkanek, g. wtroby, trzustki, skry i miokardium. Gromadzenie si w skrze melaniny i elaza nadaje jej barw szaro-ziemist. Dodatkowo rozwija si marsko wtroby, cukrzyca, kardiomiopatie, artropatie oraz bezpodno. Leczenie polega na powtarzalnych upustach krwi oraz podawaniu rodkw chelatujcych (np. desferioksamina). Haptoglobina (HAP) jest biakiem osocza zwizanym z transportem pozakrwinkowej hemoglobiny. HAP wystpuje w surowicy w iloci 0,4 1,7 g / l, ktra pozwala zwiza 400 1800 mg HGB. Codziennie 10 % katabolizowanej HGB przedostaje si do krenia, skd mogaby by usuwana z moczem (65 kD), powodujc straty elaza i wytrcanie w wietle kanalikw. HAP wystpuje w 3 formach polimorficznych (Hp 1-1, 2-1, 2-2), z ktrych kada ma mas > 90 kD. Powstay kompleks HAP-HGB (155 kD) nie ulega przesczaniu, jest za to wychwytywany i rozkadany przez hepatocyty, po czym elazo moe by wykorzystane ponownie. HAP jest ponadto biakiem ostrej fazy. Hemopeksyna (1-globulina) wie wolny hem; wpierw albumina tworzy z methemem methemalbumin, aby nastpnie przekaza go hemopeksynie. 4. a) Biochemia krwi biaka osocza i ich rola

Osocze krwi zawiera fizjologicznie 70 80 g/l biaek. S to zarwno biaka proste (gwnie albuminy), jak i zoone (lipo-, gliko-, chromo- i metaloproteiny). Ze wzgldu na budow i ruchliwo elektroforetyczn wyrniamy: albuminy (ok. 55%), globuliny 1, 2, i (ok. 38%) oraz fibrynogen (7%). Najwaniejsze 1 globuliny to: kwana glikoproteina (-seromukoid, orozomukoid), HAP, HDL1 i transkortyna, 2: CER, HDL2, protrombina i 2-makroglobulina, : LDL, transferyna i plazminogen. Stosunek iloci albumin do globulin nazywamy wskanikiem biakowym osocza; wynosi on rednio 1,2 w elektroforezie oraz 1,7 przy wysalaniu;

124 - -

wzrasta w krwotokach, a maleje w stanie zapalnym, chorobach nerek i wtroby oraz deficycie biaka w poywieniu. Funkcje biaek s bardzo istotne, jak i rnorodne: utrzymywanie cinienia onkotycznego (3,5 kPa / 25 mmHg), za co w 75 80 % odpowiedzialne s albuminy, rola buforujca dziki charakterowi amfoterycznemu, stabilizacja skadnikw morfotycznych dziki powierzchniowemu adunkowi elektrycznemu (dlatego wskanik biakowy osocza jest skorelowany z odczynem opadania krwinek OB), hemostaza, m. in. obecno ok. 20 czynnikw krzepnicia, funkcje odpornociowe -globuliny (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD), ukad dopeniacza (C1-9), biaka ostrej fazy (CRP, HAP, CER, AAT, kwana 1-glikoproteina = orozomukoid = seromukoid, plazminogen, fibrynogen) aktywno enzymatyczna (np. ChE poczona przez GPI z RBC), diagnostyczne enzymy komrkowe (AlAT, AspAT, GGTP, LDH, CPK), aktywno hormonalna (np. EPO), modyfikacja aktywnoci innych biaek, np. antyproteazy: 1-antytrypsyna (AAT) inhibitor proteaz serynowych, antychymotrypsyna, 2-makroglobulina inhibitor panproteinazowy, transport: nieswoisty: albuminy (bilirubina, FFA, hormony, Ca2+, Cu2+, Zn2+, sulfonamidy, penicylina G, dikumarol, kwas acetylosalicylowy), lipoproteiny (FA, TG, cholesterol i jego estry), swoisty: Fe (transferyna, ferrytyna, hemosyderyna), hem (hemopeksyna), HGB (HAP), Cu2+ (CER), Ca2+ (CBP), witamina B12 (TC), T3/4 (TBP, TBPA), glikokortykoidy (transkortyna), retinoidy (RBP), hormony pciowe (TBP), cholekalcyferol (VDBP). b) struktura i funkcja erytrocytw Gwn funkcj erytrocytw jest transport O2, CO2 i H+ oraz ich wymiana z tkankami. Krwinka czerwona zbudowana jest z bony komrkowej otaczajcej roztwr hemoglobiny, stanowicej 95% wszystkich biaek. Bona jest dwuwarstwowa, zoona w poowie z biaek i w poowie z lipidw. Gwnymi proteinami s: spektryna 22, ankiryna, biako wymiany jonw (prka 3.), biako prka 4.1, aktyna, G6PDH, tropomiozyna, glikoforyny A, B i C, adducyna. Do lipidw bony zewntrznej nale fosfolipidy cholinowe (PC, Sph), za na bonie wewntrznej wystpuj fosfolipidy zawierajce aminokwasy (PE, PS). Ponadto na bonie wystpuj determinanty antygenowe w postaci ukadw grupowych krwi; najistotniejszy (gwny) ukad ABO zaley od genw: H (Fuc-transferaza), A (NAc-Gal-transferaza) oraz B (Gal-transferaza). Bona zawiera ukady transportowe o duym powinowactwie do glukozy przenonik GLUT-1 (permeaza glukozowa). Erytrocyt nie zawiera natomiast mitochondriw (nie funkcjonuje cykl Krebsa ani acuch oddechowy), lizosomw, aparatw Golgiego ani jdra (brak syntezy kwasw nukleinowych, biaek, FA i glikogenu). Gwnym czynnikiem stymulujcym tworzenie erytrocytw jest erytropoetyna (EPO), wytwarzana przez nefrony w odpowiedzi na spadek pO2. EPO po dostaniu si do szpiku pobudza kinazy za porednictwem receptora, co powoduje proliferacj komrek macierzystych. Gwnym rdem energii jest glukoza osocza. W wyniku glikolizy beztlenowej powstaje mleczan i ATP, zuywany m. in. na utrzymanie dwuwklsego ksztatu krwinki oraz rwnowagi wodno-elektrolitowej. Jednoczenie obecna jest modyfikacja glikolizy, gdy kosztem wytwarzania tylko jednej czsteczki ATP z jednej czsteczki glukozy powstaje 2,3-BPG allosteryczny modyfikator dysocjacji oksyhemoglobiny, umoliwiajcy sprawniejsze oddawanie tlenu w tkankach. Alternatywnie 5 10 % wchonitej glukozy zuywa PPP, w wyniku czego powstaje NADPH, zuywany przez reduktaz glutationow do regeneracji glutationu (GSH). GSH jest jednym z nieenzymatycznych mechanizmw obrony przed stresem oksydacyjnym. Reaktywne formy tlenu (RFT; ROS) (O2-*, H2O2, ROO*, OH*) powstaj w wyniku autooksydacji hemoglobiny (ok. 3 % dziennie), nieszczelnoci acucha oddechowego (do 4 %), dziaania enzymw: reduktazy CYP, oksydazy ksantynowej, oksydazy -aminokwasw, oksydazy NADPH, mieloperoksydazy czy reakcji Fentona czy Habera Weissa (szkodliwo metali Fe i Cu). Istotnym enzymem PPP jest bonowa G6PDH, za jej niedobr znany jest jako fawizm; wwczas spoycie produktw zawierajcych silne utleniacze (bb, primarchina, sulfonamidy, naftalen) wywouje napady hemolizy i konsekwentn anemi. Stres oksydacyjny moe prowadzi do peroksydacji lipidw bonowych i hemolizy oraz do utleniania grup sulfhydrylowych hemoglobiny i powstawania ciaek Heinza. Powstanie methemoglobiny jest niwelowane przez jej reduktaz sprzon z utlenianiem cytochromu b5, ktry z kolei jest regenerowany przez utlenianie NADH z udziaem reduktazy cytochromu b5 (reduktazy methemoglobiny). Methemoglobinemia moe by wrodzona (niedobr aktywnoci reduktazy) lub nabyta (spoycie duej iloci sulfonamidw lub aniliny). Leczenie polega na podawaniu rodkw redukujcych (kwas askorbinowy, bkit metylenowy). Erytrocyty zawieraj liczne enzymy metabolizmu nukleotydowego: deaminaz adenozynow, nukleotydaz pirymidynow i kinaz adenylanow.

125 - -

Stare i uszkodzone erytrocyty wychwytywane s przez makrofagowo histiocytarny ukad siateczkowo rdbonkowy (RES niektrych narzdw miszowych, gwnie wtroby i sledziony. Hemoglobina rozkadana jest do globiny i hemu. acuchy globinowe ulegaj dalszemu rozkadowi do aminokwasw, ktre mog by powtrnie wykorzystane. Hem z kolei pozbawiany jest elaza i utleniany do bilirubiny, ktra z ci dostaje si do wiata jelita i wchodzi w skad mas kaowych. c) budowa i metabolizm leukocytw na przykadzie neutrofili

Gwn funkcj neutrofili jest udzia w odpowiedzi immunologicznej. Odznaczaj si one aktywnym metabolizmem i zawieraj wiele unikatowych biaek. Pozyskiwanie energii zachodzi na drodze glikolizy tlenowej oraz umiarkowanej fosforylacji oksydacyjnej z powodu relatywnie niewielkiej liczby mitochondriw. Dziaa rwnie PPP, dostarczajc NADPH m. in. do funkcjonowania NADPH-oksydazy. Neutrofile s ruchliwymi komrkami ernymi, biorcymi gwny udzia w ostrym odczynie zapalnym. Przedostanie si mikroorganizmw do tkanek powoduje reakcj makrofagw, ktre, gdy nie s w stanie samodzielnie ich zwalczy, wydzielaj czynniki chemotaktyczne dla neutrofili, powodujc ich aktywacj i imigracj. Podobnie dziaa np. skadnik C5a dopeniacza oraz egzogenne peptydy bakteryjne (N-formino-MetLeu-Phe). Przycigane w dane miejsce neutrofile musz opuci wiato naczynia (diapedeza), poniewa jednak normalnie nie s do tego zdolne, musi zaj cig przemian chemicznych. Mastocyty (komrki tuczne) uwalniaj histamin, ktra rozszerza naczynia i zwiksza ich przepuszczalno. Biaka osocza dostarczaj aktywnych fragmentw dopeniacza (C3a, C4a, C5a), wazodylatacyjnej bradykininy i produktw rozpadu fibryny (FDP). Same neutrofile wydzielaj rne eikozanoidy, w tym wazodylatacyjne PG i TX oraz PAF (czynnik aktywujcy pytki). Z kolei zaktywowane pytki uwalniaj serotonin. Wszystkie przedstawione procesy wywouj przekrwienie danej czci ciaa, powodujc podniesienie temperatury (ac. calor), obrzk (oedema), zaczerwienienie (rubor) i dranienie zakocze nerwowych (bl dolor); s to cztery objawy stanu zapalnego, znane ju w staroytnoci. Przycignite neutrofile ulegaj marginalizacji, toczeniu po rdbonku, ich wasne integryny asocjuj z ligandami glikoproteinowymi rdbonka (kolagen, fibronektyna, laminina, ICAM-1), a wreszcie przenikaj przez cian naczynia i zwalczaj zakaenie. Aktywacja neutrofili zachodzi pod wpywem pobudzenia przez bakterie, czynniki chemotaktyczne oraz kompleksy antygen-przeciwciao. Powoduje to poprzez szlak polifosfoinozytolowy wzrost poziomu wewntrzkomrkowego Ca2+ i nastpnie asocjacja mikrotubul (egzocytoza zawartoci ziarnistoci) oraz pobudzenie ukadu aktyna miozyna (ruchliwo pozwala na odszukanie rda zakaenia). Kontakt ze rdem czynnika aktywujcego powoduje jego fagocytoz, dlatego neutrofile nazywamy mikrofagami (w odrnieniu od makrofagw fagocytujcych agranulocytw). Zabijanie bakterii poprzedzone jest eksplozj tlenow, tj. szybkim zuyciem tlenu celem wytworzenia ROS. Aktywacja pobudza dwa peptydy cytozolowe do przeniesienia si na bon, gdzie w poczeniu z cytochromem b558 tworz NADPH-oksydaz. Ta katalizuje z kolei reakcj powstawania anionorodnikw ponadtlenkowych (2 O2 + NADPH 2 O2-* + NADP+), ktre wydalane s do fagolizosomw, gdzie spontanicznie daj nadtlenek wodoru (2 O2-* + 2 H+ H2O2 + O2), ten z kolei daje rodnik hydroksylowy (2 H2O2 2 OH*). Dodatkowo mieloperoksydaza wytwarza kwasy podhalogenowe (H2O2 + H+ + X- HOX + H2O, gdzie X = Cl, Br, I, SCN), dysocjujce na aniony podhalogenowe (OX-). Oglnie powstajce w fagolizosomach warunki ( pH, O2-*, H2O2, OH*, OX-) w poczeniu z proteazami prowadz do unieszkodliwienia drobnoustrojw. Mutacje genw kodujcych skadniki NADPH-oksydazy daj przewlek chorob ziarnicz. Neutrofile umiercane w walce z zakaeniem tworz rop, ktra ze wzgldu na zawarto mieloperoksydazy moe przybiera barw zielon. Powstawanie ropy w obrbie narzdu moe prowadzi do nacieku, ropnia lub sepsy uoglnionego zakaenia organizmu. Oprcz ataku ROS przez neutrofile, organizm posiada rwnie mechanizmy odpornoci nieswoistej. Lizozym niszczy cian komrkow bakterii przez hydroliz wiza peptydoglikanu midzy kwasem N-Acmuraminowym a D-Glc-N-Ac. Defenzyny to tlenoniezalene 30-aa zasadowe peptydy antybiotykowe, rwnie uszkadzajce cian komrkow. Laktoferryna wie elazo, przez co moe hamowa wzrost niektrych bakterii. Proteazy (elastaza, kolagenaza, elatynaza, katepsyna G, aktywator plazminogenu = PA) zabijaj zarwno komrki obce, jak i wasne, dlatego organizm musi broni si przez aktywno antyproteazow. Do antyproteaz nale: 1-antytrypsyna = 1-antyproteaza, 1-antychymotrypsyna, 2-makroglobulina, wydzielniczy inhibitor leukoproteaz, inhibitor-1 aktywatora plazminogenu (PAI-1), tkankowy inhibitor metaloproteaz. Destrukcyjne skutki palenia tytoniu opieraj si m. in. na utlenianiu grup sulfhydrylowych i w konsekwencji obnianiu aktywnoci antyproteaz, co daje przewag proteazom.

126 - -

d) budowa i metabolizm trombocytw Tromocyty, zwane rwnie pytkami krwi, s obonionymi fragmentami cytoplazmy megakariocytw szpikowych. Nie posiadaj jdra, a jedynie centralne zagszczenie cytoplazmy zwane granulomerem, oddzielne od bony bardziej przejrzystym hialomerem. W trombocytach wystpuje system kanalikowy otwarty i zamknity, suce odpowiednio do transportu oraz wydzielania. Ziarnistoci pytek dzielimy na , gste i lizosomalne. Fizjologicznie trombocyty kr swobodnie w osoczu. Trombocyty pod wpywem okrelonych czynnikw (kolagen rdbonka, trombina osocza, TXA2 i ADP innych pytek, PAF wydzielany przez neutrofile) ulegaj aktywacji. Aktywne pytki wykazuj adhezj do uszkodzonej ciany naczyniowej, uwalniaj zawarto swych ziarnistoci oraz agreguj w zespoy. Adhezja trombocytw do kolagenu naczynia krwiononego zachodzi przez receptorowy kompleks glikoproteinowy GP Ia-IIa (integryna 21). Wizanie do warstwy podrdbonkowej uatwia czynnik von Willebranda (vWF), stanowicy ligand dla GP Ib-V-IX. Trombina dziaajc na swj receptor pobudza szlak polifosfoinozytolowy, prowadzc przez DAG do fosforylacji plekstryny i w konsekwencji uwolnienia zawartoci ziarnistoci. Uwalniany z ziaren gstych ADP pobudza agregacj innych pytek. Kontakt z kolagenem pobudza PLA2 do odszczepiania z fosfolipidw bonowych arachidonianu, stanowicego substrat dla COX produkujcej TXA2 dziaa on synergistycznie z trombin, pobudzajc PLC-. Rwnoczenie uwolnienie IP3 powoduje napyw Ca2+ z RER. Ca2+ wspdziaa z kalmodulin i kinaz lekkich acuchw miozyny fosforylacja tych ostatnich prowadzi do wsppracy z aktyn, przesunicia i zmiany ksztatu trombocytw, powoduj ich rozpaszczenie na uszkodzonej powierzchni. Na aktywnych trombocytach dochodzi do ekspresji na zewntrznej powierzchni bony kompleksu GP IIbIIIa (integryna IIb3), umoliwiajcego czenie z fibrynogenem i agregacj oraz fosfolipidw wystpujcych spoczynkowo po cytozolowej stronie bony (PS, PI), a niezbdnych do aktywacji czynnikw krzepnicia X i II. Synergistycznie z substancjami pobudzajcymi agregacj dziaa adrenalina (poprzez receptor 2), serotonina (5-HT2A) i wazopresyna (V1). Komrki rdbonka naczy produkuj PGI2, ktra, dziaajc na trombocyty poprzez swj receptor, pobudza AC do produkcji cAMP, co obnia poziom Ca2+, a przez to aktywno PLA2 i produkcj TXA2. rdbonek rozkada ponadto ADP i produkuje NO, siarczan heparanu, trombomodulin i tkankowy aktywator plaminogenu (tPA). Wszystkie te mechanizmy maj na celu dziaanie antykoagulacyjne.

e)

hemostaza osoczowa

Hemostaza jest procesem zatrzymywania krwawienia, nastpujcym po uszkodzeniu ciany naczynia krwiononego. W zjawisku tym obserwujemy wspdziaanie ciany naczyniowej, trombocytw i osoczowych czynnikw krzepnicia. Reakcja naczyniowa (hemostaza naczyniowa) polega wpierw na obkurczeniu naczynia w miejscu uszkodzenia, a nastpnie na obkurczeniu naczy w odcinku proksymalnym oraz zwolnieniu akcji serca. Hemostaza pytkowa obejmuje rwnie obkurczenie naczynia oraz agregacj i adhezj pytek do miejsca uszkodzenia, prowadzce do wytworzenia czopu pytkowego. Hemostaza osoczowa polega na powstaniu sieci fibryny gromadzcej czop pytkowy (skrzep biay) i/lub erytrocyty (skrzep czerwony). Wyrnia si 13 czynnikw krzepnicia, ktre dzielimy na: zymogeny proteaz serynowych (II, IX, X, XI, XII, VII), kofaktory (III, V, VIII), wknik = fibrynogen (I) i transglutaminazy (XIII). Dodatkowo w hemostazie bior udzia: Ca2+ (IV), biako C, biako S, trombomodulina, kalikreina, wysokoczsteczkowy kininogen oraz pytkowe czynniki krzepnicia w postaci fosfolipidw bonowych.

127 - -

Powstanie sieci fibrynowej moe zosta zapocztkowane na dwa sposoby. Uszkodzenie naczynia odsaniajce wkna kolagenowe, tworzce tzw. aktywn powierzchni, lecz nie poczone z uszkodzeniem okolicznych tkanek, aktywuje tzw. szlak wewntrzpochodny. Z kolei uszkodzenie tkanek i kontakt z nimi krwi wcza szlak zewntrzpochodny. W pewnym momencie oba szlaki zbiegaj si, aby utworzy wspln drog kocow. Szlak wewntrzpochodny rozpoczyna si ekspozycj ujemnie naadowanych fragmentw kolagenu. Wwczas kalikreina aktywuje czynnik XII (czynnik kontaktu, czynnik Hagemana) do XIIa. Ten ostatni wykazuje aktywno proteazy serynowej dziaa na prekalikrein, uwalniajc kolejne czsteczki kalikreiny, odszczepia bradykinin z wielkoczsteczkowego kininogenu oraz aktywuje czynnik XI (prekursor lub czynnik poprzedzajcy tromboplastyn osoczow = PTA, czynnik przeciwhemofilowy C) do XIa. Ten jest rwnie proteaz serynow i w obecnoci Ca2+ aktywuje czynnik IX (czynnik Christmasa, skadnik tromboplstyny osoczowej = PCT, czynnik przeciwhemofilowy B) do IXa zawiera on Gla i rwnie jest proteaz serynow. Niewielkie iloci trombiny aktywuj czynnik VIII (czynnik przeciwhemofilowy A, globulina antyhemofilowa = AHG) do VIIIa, ktry jest kofaktorem sucym jako receptor dla czynnikw IXa i X na powierzchni trombocytu. Na zewntrznej powierzchni bony aktywowanych pytek powstaje kompleks aktywny zoony z czynnikw VIIIa, IXa, Ca2+ oraz X (czynnik Stewarta Prowera). Wwczas IXa rozkada wizanie Arg-Ile w czsteczce X, tworzc dwuacuchow proteaz serynow Xa (czynna troboplastyna osoczowa; zawiera Gla). Szlak zewntrzpochodny uaktywniany jest przez ekspresj czynnika III (czynnik tkankowy = TF, nieczynna tromboplastyna tkankowa) na komrkach naczynia. Niewielka ilo trombiny lub Xa przeksztaca VII (prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny = SPCA, kotromboplastyna) do VIIa (konwertyna, proteaza serynowa; zawiera Gla), ktry w obecnoci Ca2+ i kofaktora III katalizuje aktywacj X do Xa. Dodatkowo kompleks VIIa-III aktywuje IX do IXa, zatem szlak zewntrzpochodny moe aktywowa wewntrzpochodny. Xa stanowi punkt zbiegnicia si obu szlakw krzepnicia. Ulega on inhibicji przez inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI), bdcy gwnym fizjologicznym inhibitorem krzepnicia. Niewielka ilo trombiny katalizuje przejcie czynnika V (proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator globuliny) do Va = VI (akceleryna). Na powierzchni aktywowanych pytek wytwarza si kolejny kompleks, gdzie Xa w obecnoci Ca2+ i kofaktora Va hydrolizuje 2 wizania w obrbie czynnika II (protrombina; zawiera Gla), dajc IIa (trombina, proteaza serynowa). IIa dziaa na wiele pozostaych czynnikw: I, VII, VIII, XI, XIII. Dodatkowo przez tworzenie kompleksu z trombomodulin nabiera zdolnoci aktywacji biaka C, ktre wwczas po poczeniu z biakiem S tworzy kofaktor ACP, rozkadajcy Va i IIa-Va, ograniczajc krzepliwo. Aktywacja II hamowana jest przez naturalne inhibitory antytrombin III, 2-makroglobulin, kofaktor heparyny III i 1-antytrypsyn = 1-antyproteaz. Efekt inhibicji mona nasili kwanymi proteoglikanami (heparyna, siarczan heparanu) lub znie zasadowymi polipeptydami (protamina). Fibrynogen (czynnik I) skada si z 3 par acuchw (AB)2. B i zawieraj acuchy sacharydowe przyczone przez Asn. Regiony N utrzymywane s blisko siebie, podczas gdy C le po przeciwnych stronach. Do i przyczone s fibrynopeptydy A i B (FPA i FPB), zawierajce Asp, Glu i O-siarczan Tyr, ktre zwikszaj rozpuszczalno i zapobiegaj niepodanej agregacji. IIa w obecnoci Ca2+ hydrolizuje 4 wizania Arg-Gly pomidzy i A oraz i B. Powoduje to odsonicie miejsc wicych monomerw fibryny ()2, ktre spontanicznie agreguj w fibryn labiln (czynnik Ia), zatrzymujc elementy morfotyczne krwi i prowadzc do powstania skrzepu. IIa przeksztaca rwnie XIII (czynnik stabilizujcy fibryn = FSF, fibrynoligaza) do XIIIa (tiolowo-zalena transglutamylaza). Czynnik ten czy kowalencyjnie czsteczki fibryny przez utworzenie wiza peptydowych midzy grup amidow Gln a aminow Lys z eliminacj NH4+. Powstaje w ten sposb ostateczna fibryna stabilna (czynnik Ib). Powstay penowartociowy skrzep ulega retrakcji, czyli obkurczeniu poczonemu z wyciskaniem surowicy. Ostatecznie za musi zosta rozpuszczony, za co odpowiedzialna jest plazmina (fibrynolizyna, proteaza serynowa), dajc produkty degradacji fibryny i fibrynogenu (odpowiednio fdp i FDP). Plazmina powstaje z osoczowego plazminogenu pod wpywem dziaania rnych fibrynolizynokinaz, dezaktywowana za jest przez 2-antyplazmin. Fibrynolizynokinazy rozszczepiaj wizanie Arg-Val plazminogenu. Do tej grupy zwizkw nale: streptokinaza (SK) produkowana przez paciorkowce (ac. Streptococci), tkankowy aktywator plazminogenu (tPA), hamowany przez inhibitor aktywatora plazminogenu oraz urokinaza, powstajca z prourokinazy przez dziaanie kalikreiny (z tego powodu podejrzewa si, i szlak wewntrzpochodny bierze udzia bardziej w procesie fibrynolizy ni hemostazy). W skad produktw degradacji fibryny stabilnej wchodz D-dimery (DD) wspomniane wyej poczenia Gln z Lys, ktre z powodu obecnoci wiza kowalencyjnych tworzonych przez XIIIa wykazuj oporno na trawienie przez plazmin. Poziom D-dimerw koreluje z aktywnoci fibrynolizy, zalen od obecnoci skrzepw, dlatego jest istotnym parametrem diagnostycznym, pomocnym w ocenie takich patologii jak: zakrzepica . gbokich, zatorowo pucna czy zesp rozsianego wykrzepiania wewntrznaczyniowego (DIC).

128 - -

5. a)

Biochemia wtroby rola tkanki wtrobowej

Wtroba peni w organizmie wiele istotnych funkcji, bez ktrych niemoliwe byoby ycie. Przyjmuje ona rozgazienia . wrotnej, prowadzcej krew z jelit i ledziony stanowi przez to filtr dla zwizkw potencjalnie niebezpiecznych, ktre rozpoznaje, wie i wydala rnymi drogami. Buforuje ponadto stenia skadnikw odywczych krwi, magazynujc ich nadmiar bezporednio po posiku, a uwalniajc je stopniowo w miar potrzeby; w przypadku deficytu przeksztaca substancje rednio istotne na te najwaniejsze. Wtroba degraduje jednoczenie wasne czsteczki organizmu, krce we krwi zbyt dugi czas. Z drugiej strony syntetyzuje wiele zwizkw czynnych biologicznie, w tym funkcjonalne enzymy osocza oraz biaka osocza (poza -globulinami). Wikszo znanych szlakw metabolicznych zachodzi w wtrobie, z czego wycznie w tym narzdzie. Wtroba spenia zatem funkcj integrujc biologiczne przemiany gwnych skadnikw chemicznych organizmu. Dochodzi tu rwnie do produkcji ci, penicej zarwno funkcje trawienne, jak i wydalnicze. Ponadto wtroba stanowi magazyn pewnej iloci krwi, skad elaza oraz zapas witamin rozpuszczalnych w tuszczach. Szybki metabolizm podnosi temperatur wtroby o ok. 2o, jest wic narzdem termogenezy. b) przemiana wglowodanowa, lipidowa i azotowa w wtrobie Wtroba posiada bardzo bogaty zestaw enzymw, niespotykany w adnym innym narzdzie, co umoliwia funkcjonowanie w niej wikszoci szlakw metabolicznych. Jak ju wspomniano, jest miejscem integracji gospodarki wglowodanowej, lipidowej i azotowej. Dostarczenie duej iloci skadnikw odywczych po spoyciu pokarmu powoduje ich napyw do wtroby, gdzie ulegaj pierwszym przeksztaceniom. Nadmiar glukozy zostaje zmagazynowany jako glikogen (glikogenogeneza), aby w czasie midzy posikami by stopniowi uwalniany (glikogenoliza), utrzymujc poziom glukozy w osoczu na niemal niezmienionym poziomie. Glukoza i glikogen mog by ponadto regenerowane z produktw metabolizmu tkanek pozawtrobowych tj. z pirogronianu, mleczanu, alaniny, glicerolu i propionianu (glukoneogeneza). Tkanka wtrobowa jest miejscem izomeryzacji do glukozy innych cukrw prostych fruktozy i galaktozy. Zachodzi rwnie szlak pentozofosforanowy (PPP), dostarczajc rwnowanikw redukujcych do procesw detoksykacji oraz syntez redukcyjnych (lipogeneza, steroidogeneza). Funkcjonuje tu szlak kwasu uronowego, produkujcy glukuronian, zuywany w II fazie detoksykacji oraz do syntezy proteoglikanw. Do tych ostatnich naley siarczan heparanu naturalny antykoagulant wydzielany przez granulocyty cznotkankowego zrbu wtroby do krwi. Rwnie donona jest rola wtroby w przemianie lipidw. Produkuje ona apolipoproteiny, bdce nonikami dla hydrofobowych tuszczy. Jednoczenie za posiada receptory dla lipoprotein, wychwytujc lipidy i wczajc je w reakcje. Zachodzi tu rwnie synteza kwasw tuszczowych (lipogeneza), jak i ich utlenianie w szlaku -oksydacji. Napywajce z adipocytw trjglicerydy s rozkadane, daj kwasy tuszczowe oraz glicerol, ktre mog posuy jako rda energii lub zosta przebudowane w inne czsteczki. Syntetyzowane s rwnie fosfolipidy istotne skadniki bon biologicznych, penice zarwno funkcje strukturalne, jak i biorce udzia w hemostazie, apoptozie, syntezie eikozanoidw i transdukcji sygnaw hormonalnych. Nadmierne nasilenie oksydacji prowadzi do powstania cia ketonowych (ketogeneza), ktre mog by wykorzystane jako substrat energetyczny przez tkanki pozawtrobowe lub wydalane z wydychanym powietrzem (aceton w cukrzycy). Tkanka wtroby to rwnie miejsce zbierania cholesterolu z reszty organizmu oraz syntezy go de novo. Cholesterol moe zosta przeksztacony w kwasu ciowe i wydalony do wiata jelita lub wysany przez krew do tkanek przeksztacajcych go w hormony sterydowe (kora nadnerczy i gonady). Wtroba jest wreszcie miejscem 25-hydroksylacji prowitaminy D3 etapu powstawania kalcytriolu, bdcego regulatorem gospodarki wapniowo fosforanowej. Podobnie przedstawia si integracja przemiany azotowej. Do wtroby trafiaj aminokwasy pochodzenia pokarmowego oraz glikoproteiny krwi pozbawione reszt kwasu sialowego (asialoglikoproteiny), ktre narzd ten wychwytuje za pomoc receptora i hydrolizuje do aa. Dodatkowo zachodzi tu synteza aa endogennych z ich zwizkw prekursorowych. Aa wtroby zuywane s przez ni do syntezy biaek osocza (z wyjtkiem -globulin produkowanych przez plazmocyty) oraz enzymw funkcjonalnych osocza. W przeciwiestwie do cukrw i tuszczy nadmiar aa nie moe by nie moe by zmagazynowany, lecz podlega transaminacji i dezaminacji. Powstae szkielety wglowe mog by utleniane bd przeksztacane w inne zwizki, za amoniak, cznie z pul powstajc w wyniku dezaminacji jelitowej, przenoszony jest na CO2; nastpnie jako mocznik przenoszony jest z krwi do nerek, gdzie podlega filtracji kbuszkowej i usuwany jest z moczem. Wtroba unieszkodliwia rwnie produkty dezaminacji i dekarboksylacji jelitowej indol, skatol i ptomainy (kadaweryna, putrescyna, agametyna). W wtrobie dochodzi ponadto do syntezy i rozkadu zasad azotowych. Pirymidyny rozkadane s do produktw rozpuszczalnych w wodzie (CO2, NH3, octan, -hydroksymalan), puryny za do nierozpuszczalnego

129 - -

kwasu moczowego, ktry podobnie jak mocznik ulega wydaleniu z moczem. Wraz ze ledzion wtroba stanowi miejsce rozpadu hemoglobiny i hemu, a powstaa bilirubina sprzgana jest z glukoronianem i poprzez trafia do mas kaowych. Narzd ten jest rwnie miejscem ostatniej reakcji w szlaku syntezy kreatyny miniowego przenonika energii. c) wtroba jako gruczo zewntrzwydzielniczy

Wtroba jest miejscem produkcji ci, ktra przechodzc kolejnymi przewodami zbiera si w pcherzyku ciowym, aby opuci go podczas trawienia. Skurcze pcherzyka powoduj wtaczanie ci do dwunastnicy, zaraz za przed ni dochodzi do zmieszania z sokiem trzustkowym. wtrobowa jest lekko zasadowa (pH 7,1 7,3) i skada si z wody (97%) i rozpuszczonych w niej skadnikw staych: kwasw ciowych (37%), soli nieorganicznych (33%), mucyn i barwnikw ciowych (21%), kwasw tuszczowych (7%) oraz cholesterolu (2%). W pcherzyku ulega 4 5 x zagszczeniu, tak i woda stanowi 86%, a pH moe waha si w do szerokich granicach (6,9 7,7). Sole kwasw ciowych przez zmniejszanie napicia powierzchniowego uatwiaj jelitow emulgacj tuszczy i rozpuszczanie kwasw tuszczowych, przez co wspomagaj trawienie i wchanianie zarwno samych lipidw, jak i rozpuszczalnych w nich witamin. Porednio wpywa to na trawienie wszystkich skadnikw pokarmowych. Ponadto lekko zasadowa neutralizuje kwan tre pokarmow, przygotowujc j do trawienia enzymami jelitowymi. Przez organizm pozbywa si rwnie cholesterolu, kwasw ciowych, metabolitw lekw i toksyn oraz metali cikich (Cu, Zn, Hg). d) procesy biotransformacji i detoksykacji Ksenobiotykami nazywamy wszelkie substancje obce dla organizmu leki, kosmetyki, rodki czystoci i zanieczyszczenia rodowiska . Po dostaniu si do organizmu bardzo rzadko opuszczaj go w formie niezmienionej najczciej ulegaj rnorodnym przemianom, nierzadko z udziaem wielu enzymw. Przemiany te mone podzieli na reakcje I i II fazy. W fazie I zachodzi najczciej hydroksylacja przez monooksygenazy, ale rwnie: dezaminacja, dehalogenacja, desulfuracja, peroksydacja, redukcja czy hydroliza. W fazie II dochodzi do sprzgania produktw fazy I ze zwizkami endogennymi: glukuronianem, siarczanem, octanem, glutationem (GSH), aa lub reszt metylow. Celem obu faz jest zwikszenie polarnoci i rozpuszczalnoci w wodzie, a przez to zapobieganie akumulacji w lipidach i umoliwienie wydalenia. Najczciej efekt ten zostaje osignity, czasem jednak reakcje te prowadz do powstania produktu bardziej toksycznego ni pierwotny. Gwn reakcj I fazy jest hydroksylacja przez monooksygenazy, tj. enzymy grupy cytochromu P450 (CYP, zawierajcej ogem 35 60 enzymw): RH + O2 + cyt-H2 R-OH + H2O + cyt. Poza ksenobiotykami substrat mog stanowi lipofilne steroidy, eikozanoidy, kwasy tuszczowe i retinoidy. Jest to najbardziej uniwersalny ze znanych biokatalizatorw (przetwarza ok. 50% lekw). Stanowi oksydaz o mieszanej funkcji, gdy jeden atom tlenu wchodzi w skad czsteczki wody, a drugi do grupy hydroksylowej produktu. W reakcjach uczestniczy NADPH oraz reduktaza NADPH : CYP; przeniesienie elektronu indukuje redukcyjn aktywacj tlenu czsteczkowego, donorem elektronw za moe by mikrosomalny cytochrom b5. W skad ukadu CYP wchodzi gwny fosfolipid ER fosfatydylocholina; ukad zawiera rwnie hem. Wystpuje gwnie w jelicie cienkim, w wtrobie (gdzie stanowi do 20% frakcji mikrosomalnej), w nadnerczach (rwnie w mitochondriach, gdzie posiada adrenodoksyn i reduktaz adrenodoksynow), w mzgu i w pucach. Synteza ukadu wzmaga si pod wpywem okrelonych zwizkw, np. fenobarbitalu, gwnie przez oddziaywanie na wzrost transkrypcji mRNA. Ma to znaczenie w zjawisku interakcji lekw, np. dikumarol-fenobarbital-CYP2C9, etanol-rozpuszczalniki-CYP2E1. Niektre (CYP1A1) bior udzia w metabolizmie wielopiercieniowych wglowodorw aromatycznych (PAH), dlatego nazywa si je hydroksylaz wglowodorw aromatycznych (AHH); moe ona przeksztaca prokarcynogeny, np. dymu tytoniowego. Zjawisko polimorfizmu genw cytochromw jest przyczyn osobniczego zrnicowania reakcji organizmu na dan substancj. Reakcje II fazy przeksztacaj substrat w form, w jakiej jest on wydalany z organizmu (z moczem, ci lub inn drog). Nale tu nastpujce procesy sprzgania: typ reakcji glukuronidacja sulfatacja sprzganie z GSH ( merkapturan zaw. grup Ac-Cys) endogenny donor grupy UDPGlcUA 3-{P}-adenozno-5-{P}siarczan = PAPS GSH, AcCoA enzym(y) transferaza glukuronylowa transferaza siarczanowa S-transferaza glutationowa, GGTP, dipeptydaza CysGly, transacetylaza przykady ksenobiotykw 2-acetyloaminofluoren, anilina, benzoesan, meprobenat, fenol, steroidy alkohole, aminy aromatyczne, fenole elektrofilowe ksenobiotyki, np. pewne karcynogeny

130 - -

acetylacja metylacja

AcCoA S-adenozylo-Met (SAM)

transacetylaza transmetylaza

Efekty dziaania ksenobiotykw: cytotoksyczny w wyniku poczenia si reaktywnych metabolitw z witalnymi makroczsteczkami, immunologiczny w wyniku poczenia haptenu z biakami komrkowymi moe powsta antygen, przeciwko ktremu skierowana zostanie odpowied immunologiczna (nadwraliwo, alergia), karcynogeneza chemiczna efekt mutagenny w wyniku poczenia karcynogenw z DNA. 6. a) Biochemia nerek funkcje i regulacja

Nerki peni wiele funkcji niezbdnych do ycia organizmu: usuwaj kocowe metabolity i toksyny, utrzymuj rwnowag wodno mineraln i kwasowo zasadow oraz stanowi organ wydzielniczy. Najistotniejsz rol nerek jest oczyszczanie ustroju ze szkodliwych produktw metabolizmu, m. in. gospodarki azotowej, a take K+ i H2O. W ciaku nerkowym dochodzi do filtracji osocza po zatrzymaniu elementw morfotycznych i makroczsteczkowych (> 60-70 kDa) woda i rozpuszczone w niej zwizki przechodz do kanalika nerkowego, tworzc mocz pierwotny. Poniewa ten ostatni posiada bardzo du objto (ok. 200 l/dob) i zawiera wiele cennych skadnikw, tote w kanaliku bliszym (proksymalnym) dochodzi do resorpcji wody, jonw, glukozy, aa, witamin i polipeptydw. Tu rwnie wydalane s do kanalikw: kreatynina, leki i substancje diagnostyczne (np. kwas para-aminohipurowy = PAH). Ptle nefronu dziki zrnicowanej przepuszczalnoci i pompom jonowym wytwarza gradient osmotyczny w tkance rdmiszowej (tzw. wzmacniacz przeciwprdowy). W obrbie kanalika dalszego (dystalnego) aktywnie wchaniany jest Na+ (zalenie od aldosteronu) zachodzi jego wymiana z K+, H+ i NH4+ oraz bierny transport Cl-. Wreszcie w cewkach zbiorczych komrki gwne wymieniaj Na+ na K+ (zalenie od aldosteronu i ADH), za komrki wstawkowe K+ na H+. Dziki wytworzonemu przez ptle i naczynia proste gradientowi osmolalnemu dochodzi tu rwnie do ostatecznego zagszczania moczu, tak i staje si on hipertoniczny wzgldem krwi i w takiej formie jest wydalany. Wymiana wodno elektrolitowa zachodzca midzy ptlami a naczyniami prostymi okrelana jest jako wymiennik przeciwprdowy. Nerka jest rwnie narzdem wydzielniczym. Sama tkanka rdmiszowa jest rdem zwizkw regulujcych cinienie krwi PGA2 i PGE2. Na biegunie naczyniowym kbuszka znajduje si aparat przykbuszkowy, zoony z trzech elementw. Komrki mioidalne s zmodyfikowan miniwk ttniczki doi odprowadzajcej; peni one funkcje pressoreceptorw i wydzielaj renin, ktra przez angiotensyn II i aldosteron podnosi cinienie krwi (ukad RAA). Plamka gsta skada si z komrek fragmentu ciany kanalika dystalnego, przylegajcego do bieguna naczyniowego; jest to osmochemoreceptor czuy na zmiany poziomu Na+ i majcy moliwo wpywu na czynno komrek mioidalnych. Wreszcie mezangium pozakbuszkowe wystpuje midzy powyszymi elementami i w razie spadku pO2 wydziela nerkowy czynnik erytropoetyczny (renal erythropoetic factor = REF), przeksztacajcy prekursorow globulin osocza w erytropoetyn, regulujc proces tworzenia krwinek czerwonych w szpiku kostnym. Pod wzgldem biochemicznym nerka jest narzdem o duej aktywnoci metabolicznej zuywa 20x wicej energii ni przecitna tkanka. Posiada zestaw enzymatyczny zbliony do wtrobowego. Pobiera z krwi mleczan, FFA i glicerol cz z nich zaspokaja jej wasne potrzeby energetyczne, reszta za wchodzi w szlak glukoneogenezy. Powstaa glukoza, wraz z iloci odzyskan z moczu przez przenonik SGLT-1, powraca do krwi dziki obecnoci dwukierunkowego transportera GLUT-2. Resorpcja aa z moczu zachodzi poprzez cykl glutamylowy z udziaem glutationu:

GGT (-glutamylotransferaza = -glutamylotranspreptydaza = GGTP) oprcz bony komrek kanalikw nerkowych wystpuje na ER hepatocytw. Nerka jest miejscem produkcji NH4+ z mocznika i glutaminy, przez co moe kompensowa kwasic bez mobilizacji istotnych dla organizmu zasad. Zachodzi tu rwnie reakcja wymiany: Arg + Gly Orn + glikocyjamina = guanidynooctan, ktrej produktem jest pprodukt do syntezy

131 - -

kreatyny miniowego przenonika energii. W wyniku nieenzymatycznej reakcji cyklizacji kreatyny powstaje kreatynina, wydzielana do moczu w kanaliku bliszym; pomiar jej stenia jest wskanikiem filtracji kbuszkowej. Podobnie wydzielany jest hipuran produkt sprzgania Gly z benzoesanem, pochodzcym z konserwantw pokarmowych lub z metabolizmu ksenobiotykw aromatycznych. Mitochondria komrek kanalika proksymalnego zawieraj 1- oraz 24-hydroksylaz, przeprowadzajc ostatni etap syntezy kalcytriolu. b) skad i waciwoci moczu w normie i w patologii Dorosy czowiek produkuje fizjologicznie w cigu doby ok. 1500 ml moczu (600 3000 ml; < 500 ml to oliguria (skpomocz), < 100 ml to anuria (bezmocz), > 2500 ml to poliuria (wielomocz)). Barwa zaley od urochromu i zazwyczaj jest somkowota (czerwona krew, HGB, leki, moczony; brzowa bilirubina; brzowienie na powietrzu alkoptoniuria). Swoisty zapach moe ulec zmianie w gnilny ( zapalenie), fermentujcych jabek ( ciaa ketonowe) lub dranicy ( fenyloketonuria). Gsto waha si prawidowo w granicach 1,018 1,022, cho moe wynosi 1,002 1,035. pH jest lekko kwane (ok. 6), lecz zaley wyranie od diety (bogatobiakowa do 4,6, jarzynowo mleczna do 8). Mocz jest wodnym roztworem wielu zwizkw organicznych i mineralnych znajdujemy w nim (stenie molowe / stenie objtociowe): mocznik (410 / 24,6), kwas moczowy (5 / 0,85), kreatynin (11,9 / 1,35), hipuran, glukuroniany, mleczan, octan, szczawian, witaminy, hormony i ich metabolity (aldosteron, katecholaminy, kortyzol, metanefryna, kwas wanilinomigdaowy = VMA, 11,17-hydroksykortykosteroidy, 17ketosteroidy), enzymy (m. in. AspAT i AlAT), barwniki i ich metabolity (kwas -aminolewulinowy = ALA, porfobilinogen = PBG, urobilinogen) oraz jony Na+ (148 / 3,4), K+ (100 / 3,9), Ca2+ (4 / 0,16), Mg2+ (11 / 0,27), NH4+, Cl- (150 / 5,3), {P} (37 / 3,5), SO42- (25 / 1,2). Fizjologicznie mocz nie zawiera biaek (co najwyej wydalanych jest 50 100 mg / dob). Proteinuria (albuminuria) moe wiadczy o uszkodzeniu ukadu filtrujcego. Podobnie glukozy nie powinno by wicej ni 0,1 1 mM / 1,8 18 mg%. Glikozuria moe by nastpstwem hiperglikemii, wystpujcej w cukrzycy, ciy, pod wpywem stresu, w zaburzeniach hormonalnych (akromegalia, choroba Cushinga). Prawidowo nie pojawiaj si w moczu ciaa ketonowe, a ketonuria bywa nastpstwem godzenia, cukrzycy, wymiotw lub wysiku fizycznego. Podobnie nie powinna wystpowa bilirubina, a bilirubinuria wiadczy o taczce za- lub wtrobowej albo nowotworach. Urobilinogen wystpuje fizjologicznie w niewielkiej iloci, a moe wzrasta przy niedronoci drg ciowych i antybiotykoterapii hamujcej flor jelitow. Uszkodzenie miszu moe dawa hematuri (krwiomocz). Obecno kwasw ciowych to choluria, cystyny cystynuria, ksantyny ksantynuria. Przy mukopolisacharydozach pojawiaj si siarczany dermatanu i heparanu, a przy mukolipidozach fragmenty glikoprotein. 7. a) Biochemia mini budowa i charakterystyka biaek mini

Aktyna G jest biakiem globularnym stanowicym wszystkich biaek minia. W fizjologicznej sile jonowej i obecnoci Mg2+ dochodzi do kowalencyjnej polimeryzacji, w wyniku czego powstaje fibrylarna aktyna F. Tropomiozyna jest heterodimerem o budowie fibrylarnej, przycza si do aktyny F w rowku midzy acuchami. Troponina jest heterotrimerem: podjednostka T czy elementy filamentu w cao, I hamuje interakcj aktyny F i miozyny, za C jest analogiem kalmoduliny wicym 4 Ca2+. Miozyny stanowi rodzin kilkunastu biaek. Miozyna I jest monomerem czcym mikrofilamenty z bonami. Miniowa miozyna II stanowi ponad masy biaek minia. Jest heksamerem, skada si w dwch skrconych helis, z ktrych kada zakoczona jest globularn gwk. Posiada 2 acuchy cikie H i 4 lekkie L (po dwa podstawowe i dwa regulatorowe). Rozkad trypsyn ujawnia meromiozyny: lekka LMM stanowi fragment skrconych -helis trzonu, nie wie aktyny F i nie jest ATP-az; cika HMM posiada cz globularn S1 i nitkowat S2, ktre mona rozdzieli papain. HMM-S1 wie acuchy lekkie L oraz aktyn (w nieobecnoci ATP), jest ATP-az, a aktywno ta wzrasta 100-200x po zwizaniu z aktyn F. HMM-S2 posiada struktur podobn do LMM. Inne biaka filamentu to: tytyna siga od linii Z do M i peni rol w rozkurczu minia, nebulina rozciga si od linii Z wzdu nitek aktyny, regulujc ich tworzenie i dugo, -aktynina stabilizuje aktyn, zakotwiczajc j w liniach Z, desmina ukad si wzdu aktyny i czy si z plazmalemm, dystrofina rwnie poczona z plazmalemm, jej defekt jest przyczyn dystrofi mini, kalcyneuryna wykazuje aktywno fosfatazy regulowanej przez kalmodulin, biako C wice miozyn uoone jest poprzecznie w prkach A, integruje ono struktur sarkomeru przez wizanie tytyny i miozyny.

132 - -

b) mechanizm skurczu minia Gwki miozyny S1 hydrolizuj ATP, nie pozwalajc jednoczenie produktom na odczenie si; kompleks miozyna-ADP-{P} jest w stanie wysokoenergetycznym. Pobudzenie miocytu zwiksza powinowactwo aktyny do miozyny, gwki odnajduj i wi si z odpowiednimi miejscami na aktynie. Oddzielenie ADP i {P} indukuje zmiany konformacyjne gwek wzgldem trzonu i przesunicie nitek wzgldem siebie. Do kompleksu w stanie niskoenergetycznym przycza si ATP, zmniejszajc powinowactwo aktyny do miozyny i powodujc rozpad kompleksu. Regulacja skurczu odbywa si z udziaem Ca2+. Mechanizm oparty na aktynie wystpuje w miniu szkieletowym i sercowym, za oparty na miozynie w miniu gadkim. Inhibitorem skurczu jest troponina zwizana z tropomiozyn. TpI zapobiega czeniu aktyny z miozyn przez przesunicie tropomiozyny na miejsce wizania gwek miozynowych, wobec czego misie pozostaje w rozkurczu. Spoczynkowe sarkoplazmatyczne [Ca2+] wynosi 10-100 nM i jest utrzymywane przez Ca2+-ATP-az pompujc wap do ER, gdzie przejciowo czy si z kalsekwestryn. Sarkomery i ER stykaj si z pobudliwymi bonami w postaci w postaci cian kanalikw porzecznych (T). Powstanie potencjau czynnociowego na sarkolemmie powoduje aktywacj powolnych napiciowo-zalenych kanaw wapniowych (DHPR = receptor dihydropirydynowy), a przez to ATP-Ca2+-zalenych kanaw uwalniajcych Ca2+ z ER (RYR1 = receptor rianodynowy 1; 2 w sercu, 3 w UN). Gwatowny wzrost sarkoplazmatycznego [Ca2+] do 10 M powoduje czenie Ca2+ z TpC, wpyw na TpT i TpI i usunicie tropomiozyny z dotychczasowych miejsc. Podczas rozkurczu [Ca2+], wap uchodzi z TpC, tropomiozyna wraca na pierwotne miejsce i w obecnoci ATP kompleks aktyna-miozyna ulega rozpadowi. Brak ATP powoduje utrzymanie wysokiego [Ca2+] oraz utrudnia dysocjacj aktyny i miozyny w konsekwencji misie pozostaje w skurczu, co moe prowadzi do stenia. Zoliwa hipertermia spowodowana jest mutacj podjednostki RYR1 z nastpowym utrzymujcym si wysokim [Ca2+]. Obserwuje si nadwraliwo na anestetyki (halotan) i/lub leki zwiotczajce (sukcynylocholina = suksametonium). Leczenie obejmuje m. in. dantralen (poch. hydantoniny). W miniu sercowym miocyty tworz syncytium. Obecny jest wasny automatyzm dziki powolnej spoczynkowej depolaryzacji komrek P przedsionkw. Obserwuje si silniejszy rozwj kanalikw T, za sabszy ER, co uzalenia skurcz od zewntrzkomrkowych zasobw wapnia. Wymiana Ca2+ pomidzy kardiomiocytem a pynem pozakomrkowym zachodzi przez kanay wapniowe L i T (ukad CIRC), wymiennik 3Na+/Ca2+ oraz Ca2+-ATP-az, Miocyty sercowe posiadaj receptory bonowe dla hormonw i wykazuj wraliwo na cAMP, czym tumaczy si dodatnie inotropowe dziaanie agonistw -adrenergicznych. W miniu gadkim nie dostrzegamy uporzdkowania odpowiedzialnego za poprzeczne prkowanie. Brak rwnie ukadu troponiny. Istotny jest wap zewntrzkomrkowy, a pompy Ca2+ dziaaj wolno. Lekkie acuchy miozyny zbudowane s inaczej, ponadto wystpuje miozynowy mechanizm regulacji skurczu. Miozyna nie wykazuje aktywnoci ATP-azy oraz to lekki acuch p zapobiega czeniu si aktyny F z miozyn; oba te efekty znoszone s przez fosforylacj acucha lekkiego p. Wzrost [Ca2+] powoduje czenie si go z kalmodulin, nastpnie wizanie z kinaz miozynow i fosforylacj przez ni acucha lekkiego p, ostatecznie dochodzi do interakcji aktyny z miozyn. Powrt do stanu wyjciowego zapewnia fosfataza. Sam skurcz jest dugi i powolny, z maym zuyciem ATP; moe by zapocztkowany zarwno przez stymulacj nerwow, jak i hormonaln. cAMP aktywuje odpowiedni kinaz, ktra fosforyluje kinaz acucha lekkiego wwczas u tej spada powinowactwo do kompleksu Ca2+-kalmodulina; w ten sposb pod wpywem -adrenergicznym dochodzi do zahamowania skurczu. W miniu gadkim wystpuje kaldesmon, ktry wic si z aktyn i tropomiozyn zapobiega skurczowi. Wzrost [Ca2+] i wizanie z kalmodulin poprzedza wizanie z kaldesmonem i umoliwienie skurczu; podobnie dziaa fosforylacja. rda energii dla skurczu minia (ATP): glikogen fosforylaza aktywowana przez Ca2+, A i AMP; glukoza i TAG z osocza kreatyna (Cr) fosforylowana przez kinaz (CK) ADP

133 - -

8. a)

Biochemia tkanki cznej skadniki tkanki cznej, ich budowa i funkcja

Kada tkanka organizmu skada si z komrek, pomidzy ktrymi wystpuje zmienna ilo substancji midzykomrkowej. Ta ostatnia ma najwikszy udzia w strukturze tkanki cznej. Substancja midzykomrkowa skada si z wkien oraz istoty (substancji) podstawowej. Wkna dzielimy na kolagenowe, siateczkowe (zbudowane z kolagenu III) oraz spryste (zoone z elastyny oraz mikrofibryli, zbudowanych z fibryliny). W skad istoty podstawowej wchodz mukopolisacharydy (glikozoaminoglikany = GAG: kwas hialuronowy (HA), siarczan chondroityny A i C (CSA+C), siarczan dermatanu (DS), siarczan keratanu (KS) oraz siarczan heparanu (HS)), jak rwnie biaka niekolagenowe: fibronektyna, laminina i inne. Elastyna odpowiada za sprysto tkanek. Wystpuje w znacznych ilociach w pucach, duych ttnicach i niektrych wizadach sprystych, mniej za jej zawiera skra i maowina uszna. Syntetyzowana jest jako monomeryczna proelastyna, ktrej okrelone Pro ulegaj hydroksylacji do Hyp. W przeciwiestwie do kolagenu nie wystpuj peptydy ekstensyjne, acuchy cukrowe, Hyl, powtarzalne sekwencje ani mnogo odmian. Po wydaleniu z komrki niektre Lys ulegaj oksydacyjnej dezaminacji do aldehydw, po czym kondensacja takich trzech z niezmienion Lys daje desmozyn; zapewnia one nierozpuszczalno, stabilno, sprysto i dugi okres ptrwania. Mutacje genu elastyny (7q11-23) prowadz do zespou Williamsa, ktry objawia si zweniem aorty, zaburzeniami tkanki cznej i OUN, gromadzeniem si elastyny (twardzina) lub jej niedoborem (rozedma puc, nadmierna rozcigliwo i starzenie si skry). Fibrylina to glikoproteina, ktra po opuszczeniu komrki ulega wbudowaniu do mikrofibryl, stanowicych rusztowanie dla odkadanej elastyny. Mutacje genu fibryliny (chromosom 15) prowadz do zespou Marfana. Jej wystpowanie we wknach soczewki, w okostnej i we wknach sprystych duych ttnic tumaczy objawy zespou: ektopi (przesunicie) soczewki, wysoki wzrost, arachnodaktyli i anomalie sercowo naczyniowe, np. ttniak aorty wstpujcej. Fibronektyna to gwna glikoproteina substancji pozakomrkowej, wystpujca rwnie w osoczu. Jest homodimerem, zawiera 3 typy motyww tworzce 7 czynnociowych fragmentw czsteczki ich rol jest wizanie heparyny, fibrynogenu, kolagenu, DNA i powierzchni komrek. Poprzez sekwencj RDG czy si z receptorow integryn przezbonow, a ta z kolei czy si poprzez adhezyny (talina, winkulina, -aktynina, biako czapeczkowe) z aktyn cytozolow. Fibronektyna bierze udzia w adhezji i migracji komrek. Laminina to heterotrimer o budowie AB1 B2, tworzcy czsteczk o ksztacie krzya. Wie ona kolagen IV, heparyn oraz integryny powierzchniowe komrek, odpowiada za spjno nabonka z bon podstawn. Wie si z entaktyn penic podobne funkcje. Ujemne adunki na powierzchni czsteczki lamininy wytwarzane przez siarczan heparanu i kwane glikoproteiny speniaj istotne funkcje w bonie filtracyjnej kbuszkw nerkowych, odpychajc ujemnie naadowane biaka osocza i zapobiegajc ich przechodzeniu do moczu pierwotnego. b) synteza kolagenu reakcje i regulacja procesu Kolagen stanowi gwny skadnik wikszoci tkanek cznych oraz jest najbardziej rozpowszechnionym biakiem zwierzcym (stanowi 25% wszystkich biaek ssakw). U czowieka wystpuje 19 typw kolagenu, zbudowanych z 30 rnych acuchw polipeptydowych. Wyrniamy typy tworzce wkna (I, II, III, V, XI), tworzce sieci (IV, VIII, X), FACIT (IX, XII, XIV, XVI, XIX), koralikowe (VI), kotwiczce (VII), przezbonowe (XIII, XVII) i inne (XV, XVIII). Niektre odmiany cechuj si dobr rozcigliwoci (cigna, skra), twardoci (koci, zby) lub przejrzystoci (rogwka). Produktem translacji mRNA jest preprokolagen, ktry dziki sekwencji sygnaowej wdruje do ER. Tam peptyd sygnalny jest odszczepiany, dajc prokolagen, ktry podlega hydroksylacji i glikozylacji. Na obu kocach prokolagenu wystpuj peptydy ekstensyjne, zawierajce reszty Cys, tworzce wewntrz- (N+C) oraz

134 - -

midzyacuchowe wizania dwusiarczkowe, uatwiajce tworzenie superhelisy. acuch polipeptydowy jest lewoskrtn helis (n 3), za 3 acuchy skrcone s w prawoskrtn superhelis. Co 3 aa stanowi Gly, gdy jest ona na tyle maa, aby zmieci si w ograniczonej przestrzeni w rodkowej czci rdzenia superhelisy. Struktura wyglda zatem jak (Gly-X-Y)n, gdzie 3n 1000. Helisa podlega hydroksylacji Pro i Lys oraz glikozylacji powstaego Hyl. Pro hydroksylaza Pro, askorbinian, -ketoglutaran Hyp Lys hydroksylaza Lys, askorbinian, -ketoglutaran Hyl O-glikozylacja + Gal, + Gal-Glc Pro i Hyp, obie wystpujce w iloci ok. po 100, zapewniaj czsteczce odpowiedni sztywno, a poprzez wzajemne odpychanie wymuszaj posta wyduonej lewoskrtnej helisy. Aparat Golgiego pomaga w wydaleniu takiej formy prokolagenu poza komrk, gdzie aminoproteinaza i karboksypeptydaza prokolagenowa usuwaj peptydy ekstensyjne. Umoliwia to spontaniczn agregacj nowo powstaych czsteczek kolagenu do wkien kolagenowych typy wkniste ukadaj si superhelisami bok do boku przy przesuniciu , co tumaczy prkowanie wkien tkanki cznej. Ostatnim etapem jest stabilizacja wkien przez tworzenie wiza poprzecznych z udziaem oksydazy lizynowej; utlenia ona grupy -aminowe Lys i Hyl, a powstae reszty aldehydowe ulegaj kondensacji aldolowej midzy sob lub tworz zasad Schiffa z nieutlenionymi grupami aminowymi. Po niewielkich przeksztaceniach struktura ulega wzmocnieniu i nabiera ostatecznego ksztatu. Choroby: Zesp Ehlersa Danlosa charakteryzuje si nadmiern rozcigliwoci skry i zwikszon ruchomoci staww. Wyrniono 11 typw, z czego w IV obserwuje si samoistne pkanie cian jelit i naczy, w VI pknicia gaki ocznej, w VII C mikk skr i nadmiern ruchomo staww. Zesp Alporta zwizany jest z defektem kolagenu VI budujcego bony podstawne. Objawia si krwiomoczem i niewydolnoci nerek. Epidermoliza pcherzykowa to defekt wkien kotwiczcych, zbudowanych z kolagenu VII, co powoduje pkanie skry i urazowe tworzenie pcherzy. Szkorbut polega na deficycie witaminy C, co upoledza struktur kolagenu. Pojawia si krwawienie z dzise, wybroczyny podskrne i upoledzone gojenie ran. c) biochemia koci

W skad tkanki kostnej wchodz substancje organiczne i mineralne. 95% tych pierwszych stanowi kolagen I, reszta to kolagen V oraz biaka niekolagenowe: osocza, proteoglikany CD-PG I III, osteonektyna, osteokalcyna, osteopontyna, sialoproteina kostna, BMP. Skadniki nieorganiczne to gwnie hydroksyapatyt Ca10(PO4)6(OH)2, a take Na+, Mg2+, K+, Cl-, F-, wglany i cytryniany. Osteoklasty odpowiadaj za trawienie tkanki kostnej. Na bonie apikalnej wystpuje rbek szczoteczkowy, gdzie ATP-aza pompuje protony do przestrzeni resorpcyjnej, obniajc pH do ok. 4. Uatwia to rozpuszczanie hydroksyapatytu i demineralizacj, za kwane proteazy lizosomalne rozkadaj biaka kostne. Aktywatorami osteoklastw s: PTH, 1,25(OH)2D3, IL-1, IL-6, TNF, TGF-, za inhibitorami: kalcytonina, estrogeny (przez IL-6), TGF-, IFN-, PGE2. Osteoblasty wytwarzaj biaka, czynniki wzrostu i cytokiny; kontroluj mineralizacj przez migracj Ca + {P} przez ich bony zawierajce fosfataz alkaliczn, ktra pozyskuje {P} z fosforanw organicznych. Aktywacja zachodzi pod wpywem: PTH, 1,25(OH)2D3, T3/4, hGH, IGF-I, PGE2, TGF-, estrogenw, za hamowanie przez glikokortykoidy. Choroby: karowato genetyczna (achondroplazja), hormonalna (przysadkowa GH, tarczycowa T3/4), krzywica i osteomalacja hipowitaminoza D3, choroba zwyrodnieniowa staww mutacje kolagenu I i II, osteoporoza zmniejszenie gstoci koci uatwia ich zamania; zwizek z estrogenami (niedobr po menopauzie), IL-6, IL-6 osteopetroza = marmurowato koci defekt procesu resorpcji powoduje wzrost gstoci koci; przyczyn jest mutacja genu anhydrazy wglanowej II (CA-II, 8q22); wystpuje rwnie kwasica nerkowa i zwapnienia mzgowia przedwczesne zarastanie szww czaszkowych: zesp Pfeiffera mutacja FGFR-1 zesp Jacksona Weissa mutacja FGFR-2 zesp Crouzona mutacja FGFR-2 achondroplazja / dysplazja tanatoferyczna mutacja FGFR-3

135 - -

Wrodzona amliwo koci (ac. osteogenesis imperfecta; inna nazwa zesp bkitnych biakwek) spowodowana jest mutacjami w obrbie genu kolagenu I, np. zamian Gly na wikszy aa. Obecno jednego nieprawidowego acucha prowadzi do proteolizy caej czsteczki, co znane jest jako samobjstwo prokolagenu. Najgroniejsza jest wrodzona zaawansowana posta u noworodkw, ktre mog wwczas rodzi si z wieloma zamaniami i umiera. Dodatkowo twardwki oczu s patologicznie cienkie i przejrzyste, tak i przewituj przeze yy naczyniwki, nadajc barw lekko niebiesk, std inne okrelenie zesp bkitnych biakwek. Biochemia zmysu wzroku rola i przemiany karotenoidw w organizmie czowieka

9. a)

W jarzynach wystpuje -karoten (prowitamina A) ty barwnik zoony z dwch czsteczek retinalu i wykazujcy 1/6 jego aktywnoci. W jelicie ulega on dioksygenazie -karotenowej i przy wspudziale kwasw ciowych oraz tlenu czsteczkowego daje 2 czsteczki retinalu (witamina A1). Retinal w reakcji katalizowanej przez NADPH-zalen reduktaz retinalow daje odwracalnie retinol (witamina A), za utleniony przechodzi nieodwracalnie w kwas retinolowy. Estry retinolu rozpuszczalne w tuszczach pokarmowych ulegaj emulgacji w kroplach ci, hydrolizie w wietle jelita oraz wchoniciu przez nabonek. Retinol jest estryfikowany i wbudowywany do chylomikronw, ktrych remnanty wychwytywane s przez hepatocyty. Nastpnie retinol magazynowany jest w lipocytach pod postaci lipoglikoprotein lub transportowany przez RBP (retinol binding protein) do tkanek pozawtrobowych, gdzie wie go CRBP. Retinol wolny, wystpujcy we krwi po przekroczeniu pojemnoci biaek transportowych, jest toksyczny i teratogenny. Kwas retinolowy transportowany jest przez albuminy. Retinol i kwas retinolowy ulegaj wizaniu przez biaka jdrowe, dziaajc niczym hormony sterydowe na regulacj ekspresji genw. Kwas retinolowy reguluje syntez surfaktantu fosfolipidowego pcherzykw pucnych, wpywa na ukad reprodukcyjny, nasila procesy wzrostu i rnicowania komrek przez wspomaganie syntezy glikoprotein (fosforan retinoilowy jest bonowym przenonikiem oligosacharydw). 5,6-epoksyretinolan peni funkcje antyoksydacyjne. 11-cis-retinal jest istotnym skadnikiem rodopsyny, penicej funkcje barwnika wzrokowego. Czsteczka retinolu poczona jest przez zasad Schiffa z Lys296 opsyny. b) reakcje zachodzce w procesie fotorecepcji Do funkcjonowania rodopsyny wymagana jest dua pynno bony, co zapewnia obecno kwasu dekozaheksaenowego (DHA) w fosfolipidach siatkwki. Absorpcja kwantu wiata przez rodopsyn powoduje izomeryzacj 11-cisretinalu do formy all-trans, co z kolei destabilizuje poczenie typu zasady Schiffa. Rodopsyna przechodzi przez kilka stadiw, rozpadajc si na zaktywowan opsyn i all-trans retinal. Ten ostatni ulega izomerazie retinalowej, przechodzc z powrotem w form 11-cis, ktra moe czy si z opsyn w rodopsyn. Zanim jednak do tego dojdzie zaktywowana opsyna oddziauje z biakiem GT trasnsducyn, powodujc wymian w nim GDP na GTP. Powoduje to oddzielenie podjednostki od zakotwiczonego w bonie kompleksu . czy si ona z podjednostk PDE cGMP, odsaniajc aktywny katalitycznie kompleks . Aktywno PDE prowadzi do znacznego spadku [cGMP] w komrce wiatoczuej i zamknicie cGMPzalenych kanaw kationowych (dla Na+ i Ca2+). Przy niezakconej pracy innych mechanizmw wymiany jonw prowadzi to do zwikszenia ujemnego adunku wntrza komrki, czyli jej hiperpolaryzacji, ktra po przekroczeniu odpowiedniego progu wzbudza potencja czynnociowy. Informacja o odebraniu bodca wdruje przez kolejne warstwy siatkwki do nerwu wzrokowego, po czym drog wzrokow do korowego orodka wzroku. 10 x spadek poziomu wewntrzkomrkowego Ca2+ aktywuje GC do produkcji cGMP, co otwiera kanay kationowe i niweluje hiperpolaryzacj. Podjednostka trasnducyny rozkada GTP i ustaje aktywno GTPazy. Kinaza rodopsynowa fosforyluje, a arestyna wie barwnik wzrokowy. W ten sposb ukad zdolny jest do odebrania nastpnego bodca.

136 - -

ROZDZIA VIII KWASY NUKLEINOWE I BIOSYNTEZA BIAEK

1. a) Budowa i waciwoci kwasw nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny elementy skadowe kwasw nukleinowych zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy

Czsteczki nazywane kwasami nukleinowymi bior swoj nazw od gwnego miejsca wystpowania w komrce jdra (ac. nucleus). Wyrnia si dwa rodzaje kwasw nukleinowych kwas rybonukleinowy (ang. ribonucleic acid RNA) oraz dezoksyrybonukleinowy (ang. desoxiribonucleic acid DNA). W budowie obydwu z nich dostrzec mona tak podobiestwa, jak i rnice. Rni si one ponadto funkcj i lokalizacj komrkow: DNA wystpuje w jdrze i stanowi magazyn informacji genetycznej, za RNA obecny jest w jdrze i w cytoplazmie, a jego podstawow rol jest udzia w biosyntezie biaek. Wszystkie kwasy nukleinowe s polimerami mniejszych czsteczek, zwanych nukleotydami. Nukleotyd skada si z nukleozydu, do ktrego przyczona jest reszta fosforanowa (PO43-). Nukleozyd z kolei stanowi poczenie zasady azotowej oraz cukru piciowglowego (pentozy). zasady azotowe

Zasady azotowe wchodzce w skad kwasw nukleinowych to pochodne puryny (zasady purynowe) lub pirymidyny (zasady pirymidynowe). Zasady purynowe to adenina (A; 6-aminopuryna) i guanina (G; 2-amino-6hydrokypuryna), za pirymidynowe cytozyna (C; 2-hydroksy-4-aminopirymidyna), uracyl (U; 2,4dihydroksypirymidyna) i tymina (T; 5-metylouracyl). Metabolizm tych zwizkw opisany jest w punkcie V-4. Adenina, guanina i cytozyna wystpuj w obu rodzajach kwasw nukleinowych, natomiast tymina tylko w DNA, a uracyl tylko w RNA. Ponadto w kwasach nukleinowych zwierzt, rolin i drobnoustrojw wystpuj w niewielkich ilociach pochodne powyszych zasad, np.: hipoksantyna (H; 6-hydroksypuryna), N6metyloadenina, N6,6-dimetyloadenina, N1-metyloguanina, 5-metylocytozyna czy 5-hydroksymetylocytozyna. Zasady azotowe mog wystpowa w dwch formach tautomerycznych puryny w ketonowej i enolowej, za pirymidyny w aminowej i iminowej. W kwasach nukleinowych dominuj te pierwsze ketonowa w purynach, a aminowa w pirymidynach co ma istotne znaczenie w tworzeniu wiza wodorowych (por. dalej). Obecno ukadu wiza nienasyconych powoduje, e omawiane zwizki silnie pochaniaj promieniowanie z zakresu ultrafioletu (UV), z maksimum absorpcji w okolicach 260 nm. Ma to dwojakiego rodzaju konsekwencje z jednej strony czyni promienie UV wyjtkowo silnym czynnikiem mutagennym (zastosowanie w lampach bakteriobjczych), z drugiej za umoliwia ich wykorzystanie do identyfikacji kwasw nukleinowych (zawierajca je prbka wieci w wietle UV na pomaraczowo). pentozy, nukleozydy

Drugim skadnikiem nukleozydu jest cukier C5 pentoza. Nazwy kwasw nukleinowych wziy si wanie od wchodzcych w ich skad cukrw kwas rybonukleinowy zawiera D-ryboz, za dezoksyrybonukleinowy 2-dezoksy-D-ryboz. Obie pentozy wystpuj w kwasach nukleinowych w postaciach piercieniowych (-furanozowych). Atomy wgla wchodzce w skad piercienia pentozy numeruje si, dodajc znaczek (prim), dla odrnienia od numeracji atomw zasad azotowych. Nukleozydy s N-glikozydami pentoz zasad azotowych, przy czym wizanie glikozydowe czy atom C1 piercienia cukrowego z atomem N1 zasady pirymidynowej lub N9 zasady purynowej. Ze wzgldu na pooenie zasady i pentozy wzgldem tego wizania wyrnia si konfiguracje syn i anty nukleozydw, przy czym fizjologicznie dominuje ta druga. Nazwy nukleozydw tworzone s od wystpujcych w nich zasad. W nukleozydach purynowych kocwk zasady ina zamienia si na ozyna: nukleozyd adeniny (9-N--D-rybofuranozyloadenina) to adenozyna, a guaniny (9-N-D-rybofuranozyloguanina) guanozyna. Nazwy nukleozydw pirymidyn tworzy si w inny sposb: nukleozyd uracylu (1-N--D-rybofuranozylouracyl) to urydyna, cytozyny (1-N--D-rybofuranozylocytozyna) cytydyna, za tyminy (1-N-2-dezoksy--D-rybofuranozylotymina) tymidyna (wystpuje tylko w DNA i zawsze zawiera dezoksyryboz). Inne ni tymidyna nukleozydy zawierajce dezoksyryboz przybieraj dodatkowo przedrostek dezoksy-: dezoksyadenozyna (9-N-2-dezoksy--D-rybofuranozyloadenina), dezoksyguanozyna (9-N-2dezoksy--D-rybofuranozyloguanina) oraz dezoksycytydyna (1-N-2-dezoksy--D-rybofuranozylocytozyna). Nukleozydy zawierajce ryboz okrela si jak rybozydy, a dezoksyryboz dezoksyrybozydy. Jednoliterowe skrty nazw zasad (A, G, C, T, U) stosuje si rwnie jako skrty nazw ich nukleozydw, czyli np. G oznacza zarwno guanin, jak i guanozyn, zalenie od kontekstu. Wyjtkowo w kwasach nukleinowych mog

137 - -

wystpowa nukleozydy zawierajce inne ni wyej opisane rodzaje wiza np. w pseudourydynie (5rybozylouracyl, -urydyna lub po prostu ) ryboza zwizana jest z atomem C5, a nie C1 uracylu; zwizek ten wystpuje w pewnych rodzajach RNA (tRNA, por. dalej). nukleotydy

Nukleotydy s estrami fosforowymi (dokadnie ortofosforowymi (V)) nukleozydw. Reszta fosforanowa zwizana jest z jedn z grup hydroksylowych pentozy: w rybozydach przy C2, C3 lub C5, a dezoksyrybozydach przy C3 lub C5. Nazwy nukleotydw tworzy si od nazw ich nukleozydw, dodajc numer atomu wgla, z ktrym zwizana jest zestryfikowana grupa hydroksylowa i tak kwas 5-adenylowy to adenozyno-5-fosforan (ang. adenosine 5-monophosphate 5-AMP), kwas 5-guanylowy guanozyno-5monofosforan (GMP), kwas 5-urydylowy urydyno-5-monofosforan (UMP), kwas 5-cytydylowy cytydyno5-monofosforan (CMP); okrela si je cznie mianem rybotydw. Przez analogi dezoksyrybotydy to: kwas tymidylowy tymidyno-5-monofosforan (TMP), kwas dezoksyadenylowy (dAMP), dezoksyguanylowy (gGMP) oraz dezoksycytydylowy (dCMP). W niewielkich ilociach wystpuj w kwasach nukleinowych nietypowe nukleotydy, jak np. kwas 5-inozynowy inozyno-5-monofosforan (IMP), w ktrym zasad jest hipoksantyna. Wszystkie nukleozydy mog by rwnie fosforylowane przy C3, a rybozydy take przy C2. Istniej te cykliczne nukleotydy, w ktrych reszta fosforanowa estryfikuje dwie kolejne grupy hydroksylowe (tj. przy C2 i C3 lub C3 i C5); aby zaznaczy ich cykliczny charakter, dodaje si do skrtu liter c, np. cykliczny 3,5-guanozynomonofosforan to 3,5-cGMP. Monofosforany nukleozydw mog by dalej fosforylowane powstaj wwczas dwu- (ADP, GDP, CDP, TDP, UDP) i trjfosforany nukleozydw (ATP, GDP, CDP, TTP, UTP). Substratami do biosyntezy kwasw nukleinowych s wanie te ostatnie (por. dalej). Ponadto trjfosforany nukleozydw uywane s jako czsteczki aktywujce inne zwizki, pozwalajc im na penienie funkcji substratw w wielu reakcjach por. UDP i synteza glikogenu (patrz punkt III-5-a), metabolizm galaktozy (III-6-c) czy aminocukrw (III-7-a), CTP i synteza fosfolipidw, ATP i synteza biaek (VIII-4-b). polinukleotydy

Kwasy nukleinowe zarwno DNA, jak i RNA s polinukleotydami, tj. liniowymi polimerami odpowiednich nukleotydw, poczonych ze sob wizaniami fosfodwuestrowymi (reszta fosforanowa czy atom C3 jednej pentozy z C5 kolejnej). W ten sposb powstaje polarna ni, w ktrej wyrni mona koniec 5 oraz 3; na 5-kocu obecna jest zazwyczaj wolna grupa hydroksylowa (rzadko ufosforylowana), a na 3-kocu ufosforylowana (rzadko wolna). Sekwencj nukleotydw w czsteczce kwasu nukleinowego, czyli jego struktur I-rzdow, podaje si zawsze w kolejnoci 53, chyba e zaznaczone jest inaczej. W odpowiednich warunkach reszty fosforanowe dysocjuj, co nadaje polinukleotydom adunek elektryczny. To z kolei umoliwia im wdrwk w staym polu elektrostatycznym, a przez to rozdzia metod elektroforezy (patrz punkt I-1-g). b) budowa przestrzenna i waciwoci DNA Badacze J. D. Watson i F. C. K. Crick wykazali, e DNA posiada struktur II-rzdow w postaci podwjnej prawoskrtnej helisy. Dwie nici polinukleotydowe wystpuj jako wzajemnie splecione helisy, oplatajce lini rubow wspln o dug. W zalenoci od warunkw rodowiska, dwupasmowe DNA moe wystpowa w co najmniej 6 formach: A, B, C, D, E i Z, przy czym w warunkach fizjologicznych (niskie stenia soli, wysoki poziom uwodnienia) dominuje forma B. W formie B szeroko helisy (odlego midzy atomami C1 danej zasady i zasady komplementarnej) wynosi ok. 1,1 nm, skok p = 3,4 nm, ilo par zasad na skok n = 10, zatem odlego midzy ssiadujcymi zasadami wynosi 3,4 : 10 = 0,34 nm, a ich wzajemne skrcenie: 360o : 10 = 36o. Paszczyzny piercieni ssiadujcych ze sob zasad s rwnolege i wystpuj midzy nimi tzw. oddziaywania warstwowe. Pomidzy warstwy te mog wnika rne inne czsteczki, zaburzajc funkcjonowanie DNA, co pozwolio na ich zastosowanie jako rodki dezynfekcyjne (barwniki akrydynowe, np. etakrydyna Riwanol) lub leki cytostatyczne (p/nowotworowe). Obie helisy rozdzielone s przez 2 rnej wielkoci rowki wikszy i mniejszy stanowice miejsca interakcji z biakami, ktre mog dziki temu rozpoznawa i wiza si ze swoistymi sekwencjami nukleotydowymi bez potrzeby rozdzielania par zasad komplementarnych (por. punkt VIII-1-j). Forma Z powstaje w warunkach zmniejszonego uwodnienia (hydratacji). Cechuje si rozsuniciem obu nici i obecnoci wolnej przestrzeni wewntrz czsteczki. W formie E zaasdy nie wystpuj w ukadzie osiowym, lecz niejako rozsunitym.

138 - -

Poniewa oba acuchy s prawoskrtne i polarne, musz by przeciwbiene, tzn. sekwencje atomw i grup ukadaj si w kadym z nich w kierunku przeciwnym. Pasmo biegnce w kierunku 53 okrela si jako kodujce, poniewa koduje przekazywan informacj genetyczn (przekada si na sekwencj aa w kodowanym biaku), drugie natomiast (35) jako matrycowe, gdy stanowi matryc do syntezy mRNA. Grupy cukrowe i fosforanowe stanowi zewntrzny szkielet, wijcy si helikalnie, natomiast zasady schowane s we wntrzu czsteczki, co chroni informacj genetyczn i umoliwia oddziaywania midzy zasadami. Kada zasada jednego acucha jest bowiem poczona kilkoma wizaniami wodorowymi z naprzeciw lec zasad drugiego acucha. Poniewa odlego midzy nimi jest staa, a wymiary zasad purynowych i pirymidynowych rne, tote wnioskowa mona, e wizania tworz si midzy zasad purynow jednego acucha a pirymidynow drugiego. Jednak skad pary puryna pirymidyna tworzcej wizania nie jest dowolny, ograniczaj go bowiem moliwoci rotacji wok wiza fosfodwuestrowych, preferencja konfiguracji anty wizania N-glikozydowego oraz dominacja okrelonych form tautomerycznych zasad azotowych (keto enolo, amino imino). Analiza tych ogranicze uzasadnia obserwacj, e wizania wodorowe tworz si tylko midzy parami A i T oraz G i C z tego powodu zasady kadej z par okrela si jako komplementarne (uzupeniajce si). W parze A-T jedno wizanie powstaje midzy atomem N1 A a atomem wodoru przy N5 T, drugie za midzy grup aminow przy C6 A a grup ketonow przy C4 T; obecne s wic dwa wizania, wzajemnie do siebie rwnolege. Natomiast w parze G-C tworz si 3 wizania: jedno midzy atomem wodoru przy N1 G a atomem N5 C, drugie midzy grup ketonow przy C6 G a grup aminow przy C4 C oraz trzecie midzy grup aminow przy C2 G a grup ketonow przy C6 C. Obecno dodatkowego wizania wodorowego powoduje, ze siy utrzymujce par GC s mocniejsze ni w przypadku A=T. Nastpstwem komplementarnoci jest rwna ilo uzupeniajcych si zasad w czsteczce DNA (A = T, a G = C), przez co w konsekwencji ilo puryn (A + G) jest taka sama jak ilo pirymidyn (C + T). Natomiast stosunek A+T : G+C jest zmienny gatunkowo. Dugo odcinka DNA lub sparowanego RNA wyraa si podajc ilo wchodzcych w jego skad par zasad (ang. base pairs bp). Cay genom ludzki skada si z ok. 3 Gbp. Denaturacja (topnienie) DNA polega na rozpleceniu podwjnej helisy i zmianie paszczyzn wzajemnego pooenia zasad przy zachowaniu struktury I-rzdowej (sekwencji nukleotydw). Do zmian w rodowisku powodujcych denaturacj zaliczamy wysok temperatur i obnienie stenia soli. Poniewa rnie regiony DNA cechuj si zrnicowan wraliwoci na czynniki denaturujce, przez temperatur topnienia (Tm) DNA rozumie si redni temperatur rozpoczcia i zakoczenia rozplatywania DNA. Zaley ona od skadu zasad DNA (ilo wiza komplementarnych i oddziaywania warstwowe decyduj o tym, e regiony DNA o duej zawartoci par GC s bardziej odporne na denaturacj ni bogate w pary A=T), stenia soli w roztworze oraz od obecnoci innych substancji, np. formamid destabilizuje wizania wodorowe i uatwia denaturacj. Denaturacji towarzyszy spadek lepkoci roztworu oraz tzw. efekt hiperchromiczny, polegajcy na zwikszeniu absorpcji promieniowania UV przez zasady azotowe. Po powrocie do fizjologicznej temperatury i siy jonowej nastpuje powrt do postaci natywej renaturacja, czyli ponowne poczenie (reasocjacja) rozdzielonych pasm komplementarnych lub tworzenie hybryd z cDNA lub mRNA, co wykorzystuje si w analityce odpowiednio w metodach Southern- i Northern-blotting. Denaturacj ciepln wykorzystuje si rwnie w technice PCR.

W niektrych niszych organizmach (bakterie, wirusy) DNA ma form kolist, co niweluje wolne koce 5 i 3. Taka czsteczka moe wystpowa w postaci rozlunionej albo silnie skrconej (gdy zajdzie skrcenie wok wasnej osi bd skrcenie linijnej czsteczki o zakotwiczonych kocach). Proces dodatkowego skrcania wymaga dostarczenia energii w iloci proporcjonalnej do stopnia skrcenia. Oznacza to, e czsteczka zawierajca dodatkowe skrty posiada zmagazynowan w ten sposb energi, przez co atwiej poddaje si reakcjom endoergicznym (np. rozdzielaniu pasm niezbdnemu do replikacji i transkrypcji) i dziki temu jest preferowan postaci w ukadach biologicznych. Zmiany stopnia skrcenia, tj. topologiczne zmiany DNA, katalizowane s przez enzymy topoizomerazy ich przykadem jest bakteryjna gyraza DNA, czerpica energi z ATP w celu wprowadzania dodatkowych skrtw. Zablokowanie aktywnoci topoizomeraz uniemoliwia podziay komrkowe, std zastosowanie ich inhibitorw jako chemioterapeutyki (chinolony) i cytostatyki (kamptotecyna i jej pochodne).

139 - -

c)

budowa, waciwoci i klasyfikacja RNA

W przeciwiestwie do DNA, kwas rybonukleinowy skada si z pojedynczego acucha polinukleotydowego; istnieje tu tylko jeden wyjtek w postaci sekwencji palindromowych, zawierajcych cigi komplementarnych zasad o odwrconej polarnoci, ktre mog ulega parowaniu. Konsekwencj jednonicowej budowy RNA jest nierwna ilo A i U oraz G i C (rwno moe zdarzy si przypadkowo). Ponadto w RNA tymina (T) zastpiona jest przez uracyl (U), a pentoz jest ryboza obecno grupy hydroksylowej przy atomie C2 cukru warunkuje wraliwo RNA na hydroliz zasadow, w wyniku ktrej powstaj cykliczne 2,3dwuestry nukleozydw. RNA powstaje w wyniku transkrypcji DNA jest wic komplementarny do matrycowego pasma rdowego DNA i moe z nim hybrydyzowa (Northern-blotting). W komrce istnieje 5 klas RNA (mRNA, tRNA, rRNA, hnRNA i snRNA), rnicych si wielkoci, stabilnoci i szczegow rol, ale ogln funkcj wszystkich z nich jest udzia w biosyntezie biaek. Informacja z DNA przepisywana jest w procesie transkrypcji na informacyjny RNA (ang. messager RNA mRNA). W komrce moe wic wystpowa tyle rodzajw mRNA, ile genw posiada jej materia genetyczny, a wic u czowieka a 30 tys. mRNA posiada sta sedymentacji w granicach 18 30S i stanowi niewielk cz (5%) oglnej puli RNA komrki. U Eucariota DNA jest wpierw przepisywane na heterogenny jdrowy RNA (ang. heterogenous nuclear RNA hnRNA), ktry nastpnie przechodzi proces skadania, dajc ostatecznie dojrzae mRNA. W skadaniu RNA uczestniczy pomocniczo maoczsteczkowy jdrowy RNA (snRNA; ok. 10 rodzajw czsteczek). Informacja z gotowego mRNA jest nastpnie przepisywana na sekwencj aa w kodowanym biaku w procesie translacji. To tego ostatniego niezbdne s dwa kolejne rodzaje RNA, tj. rybosomalny (rRNA) oraz transportujcy (tRNA). Istniej tylko 4 rodzaje rRNA, jednak stanowi one a 80% komrkowego RNA. Wraz z odpowiednimi biakami wsptworz podjednostki rybosomalne (wiksz i mniejsz), ktre zoone w cao daj kompletny rybosom. tRNA peni funkcj poredniczc pomidzy sekwencj nukleotydw a sekwencj aa ma budow niejako dwubiegunow i moe przycza oba te elementy. Istnieje ok. 50 rodzajw tRNA, ta klasa ma jednak znikomy udzia ilociowy w RNA komrki. Pewne rodzaje RNA (rRNA, snRNA) wykazuj wewntrzn aktywno katalityczn (dziaaj jak enzymy), dlatego okrela si je mianem rybozymw (rybonukleinowych enzymw). Stanowi to fenomen biochemiczny, poniewa aktywno katalityczna jest cech przypisywan wycznie czsteczkom biaek. snRNA peni funkcje rybozymu w reakcjach endorybonukleolizy i transestryfikacji w procesie skadania mRNA (por. punkt VIII-3-c), za rRNA w reakcji hydrolizy estru aminoacylowego w elongacji translacji (por. punkt VIII-4-d). d) budowa chromatyny W organizmach eukariotycznych niemal cao materiau genetycznego (DNA) znajduje si na terenie jdra komrkowego, gdzie wystpuje w formie zwizanej z biakami jako chromatyna. S to gwnie biaka zasadowe histony, reszt stanowi kwane i wiksze biaka niehistonowe. W skad chromatyny wchodzi rwnie niewielka ilo RNA. Histony to maa grupa blisko spokrewnionych ze sob biaek. Oznacza si je symbolami: H1, H2A, H2B, H3 i H4. 2/3 czsteczki poczwszy od C koca zawiera zwyky skad aa, natomiast w 1/3 N-kocowej czci dominuj aa zasadowe w H2A i H2B jest to gwnie Lys, a w H3 i H4 Arg. Histon H1 jest najsabiej zwizany z chromatyn i daje si z niej atwo usun roztworem soli, co pozwala na rozpuszczenie chromatyny. Pozostae rodzaje histonw wchodz w skad rdzenia nukleosomw: H3 i H4 agreguj w tetramer (H3/H4)2, a H2A i H2B cz si w dimer H2A/H2B, ktry moe polimeryzowa do form (H2A/H2B)n fizjologicznie n=2, czyli powstaje drugi tetramer. Oba tetramery asocjuj, tworzc oktamer histonowy, ktry spontanicznie czy si z DNA, w wyniku czego powstaje nukleosom. Tworzenie struktury nukleosomu uwarunkowane jest obecnoci H3 i H4, za H2A i H2B stabilizuj pierwotn czsteczk i wi 2 dodatkowe pskoki spirali DNA. Ni polinukleotydowa owinita jest wok oktameru 1,75 x, co odpowiada odcinkowi 146 bp, natomiast poszczeglne nukleosomy oddzielone s od siebie odcinkami o dugoci ok. 30 bp. Dalsze upakowanie materiau genetycznego zaley od interakcji histonw H1 z przylegymi nukleosomami. Wikszo komrkowego DNA wystpuje wanie w postaci nukleosomw, a cay genom ludzki zawiera ich ok. 17 mln. Preferencja nukleosomw do pewnych regionw na szczeglnych czsteczkach DNA okrelana jest jako fazowanie. Histony nukleosomw mog podlega 5 rodzajom modyfikacji kowalencyjnych, ktrych znaczenie nie zostao do koca poznane; s to: acetylacja w przypadku H3 i H4 jest to mechanizm regulacji transkrypcji genw, fosforylacja dodanie reszty {P} do H1 towarzyszy kondensacji chromosomw w czasie cyklu replikacyjnego, ADP-rybozylacja zwizana jest z napraw DNA, kowalencyjne zwizanie z ubikwityn tylko w przypadku H2A, metylacja.

140 - -

Nukleoplazmina jest pentamerem kwanego biaka, ktre nie wie si ani z DNA ani z chromatyn, lecz ma zdolno odwracalnego oddziaywania z oktamerem histonowym, dziki czemu zasadowe (kationowe) histony nie przylegaj nieswoicie do kwanych (anionowych) powierzchni takich jak DNA. Biako to utrzymuje w jdrze komrkowym rodowisko jonowe powodujce swoiste oddziaywania DNA z histonami i tworzenie struktur nukleosomw. Po utworzeniu nukleosomw nukleoplazmina uwalnia si od histonw. Strukturami wyszego rzdu od nukleosomw s nici chromatydowe 10 nm oraz 25-30 nm. Ni 10 nm (stopie upakowania 1-10 x) skada si z nukleosomw uoonych w taki sposb, e ich brzegi stykaj si, a ich paskie powierzchnie le rwnolegle do dugiej osi nici. Ni 10 nm jest dodatkowo skrcona, tworzc ni 30 nm (upakowanie 40-60 x), zawierajc 6 7 nukleosomw na 1 skok. Zwoje tej spirali s dosy paskie, a paskie powierzchnie nukleosomw kolejnych skrtw s niemal rwnolege. Ni 30 nm jest prawdopodobnie stabilizowana przez histony H1. Nici chromatyny mog ulega dalszemu zwiniciu w ptle (domeny), zakotwiczone w strukturze szkieletowej (macierzy podporowej) jdra. Jedna domena obejmuje odcinek DNA o dugoci 30 100 kbp. W ich obrbie okrelone sekwencje DNA mog posiada nieprzypadkowe uoenie. e) chromatyna aktywna i nieaktywna

Pomimo faktu, i kada komrka ludzkiego ustroju zawiera te same czsteczki DNA, to poszczeglne komrki wykazuj bardzo zrnicowan ekspresj genw. Jest to wynikiem rnic w aktywnoci poszczeglnych sekwencji DNA, okazuje si bowiem, e chromatyna zawiera fragmenty transkrypcyjnie aktywne oraz nieaktywne. Chromatyna aktywna euchromatyna wystpuje w postaci rozlunionej, tzn. ma zmienion lub cakowicie zniesion struktur nukleosomaln. Zawiera due (ok. 100 kbp) regiony wraliwe na trawienie nukleaz (np. DNAaz I), w obrbie ktrych istniej krtkie (100-300 bp) odcinki o wybitnie zwikszonej (nawet 20x) wraliwoci, czsto pooone bezporednio przed aktywnym genem. W powstawaniu miejsc nadwraliwych bior udzia biaka uczestniczce w transkrypcji oraz zaangaowane w utrzymywanie dostpu do pasma matrycowego. Chromatyna nieaktywna heterochromatyna jest natomiast gsto upakowana. Dzieli si ona na dwa rodzaje. Heterochromatyna konstytutywna jest zawsze nieaktywna (upakowana), wystpuje w regionach w pobliu centromeru i w telomerach. Natomiast heterochromatyna fakultatywna moe by przejciowo aktywna i ulega transkrypcji, przez reszt czasu bdc skondensowan i nieaktywn. Jej przykadem jest drugi chromosom X u kobiet, ktry kondensuje w tzw. ciako Barra, ale ulega dekondensacji w okresie gametogenezy i jest aktywny we wczesnej embriogenezie. Chromatyna wykazuje najwikszy stopie upakowania w stadium metafazy wwczas wystpuje w postaci chromosomw (u czowieka w licznie 2n = 46). Ptle chromosomw metafazowych posiadaj wspczynnik upakowania ok. 8000x. Kady chromosom skada si z dwch identycznych (siostrzanych) powek, zwanych chromatydami kada z nich stanowi pojedyncz czsteczk dwupasmowego DNA. Chromatydy poczone s w centromerze nazwanym tak, gdy pooony jest mniej wicej w poowie dugoci chromosomw. Centromer ma dugo ok. 130 bp i zawiera region bogaty w pary A=T, a wraz z licznymi biakami tworzy kompleks zwany kinetochor, do ktrego przycza si wrzeciono kariokinetyczne. Na kocach kadego chromosomu obecne s telomery, zoone z wielokrotnie powtrzonej pojedynczej sekwencji bogatej w T i G (u czowieka: 5-TTAGGG-3). Telomery ulegaj skracaniu wraz z kadym podziaem komrki, co warunkuje ich ywotno. W niektrych komrkach istnieje odtwarzajcy je enzym telomeraza; obecno telomerazy w komrkach nowotworowych warunkuje ich niemiertelno. f) sekwencje powtarzajce; mutacje dynamiczne; konwersja genu

Dua cz ludzkiego (i innych ssakw) genomu wystpuje w nadmiarze wikszo posiadanego przez nas DNA nie niesie informacji i nie ulega ekspresji. Cao DNA mona zatem podzieli na sekwencje unikatowe (nie powtarzajce si, zoone z pojedynczych kopii genw kodujcych biaka) oraz sekwencje powtarzajce (2 10 mln kopii w kadej komrce), stanowice 20 30 % genomu. Te ostatnie dziel si na sekwencje umiarkowanie oraz czsto powtarzajce. Sekwencje czsto powtarzajce skadaj si z odcinkw dugoci 5 500 bp, powtarzanych wielokrotnie w postaci tandemu. S one zgrupowane w centromerach i telomerach, wystpuj w liczbie 1 10 mln kopii, s nieaktywne transkrypyjnie i mog peni funkcje strukturalne. Sekwencje umiarkowanie powtarzajce wystpuj w mniejszej liczbie (< 1 mln kopii) i nie s zgrupowane, lecz rozproszone wrd sekwencji unikatowych. Mog ulega transkrypcji przez polimeraz RNA II i posiada czapeczki metylacyjne. Dziel si na dugie (LINEs 6-7 kbp, 20-50 tys. kopii) oraz krtkie (SINEs 70-300 bp, 100 tys. kopii). Prawdopodobnie s one retropozonami, tj. sekwencjami powstaymi wskutek transpozycji oraz utworzonymi za porednictwem RNA i odwrotnej

141 - -

transkryptazy. Przykadem SINE jest rodzina sekwencji Alu, wystpujca w liczbie mln kopii, a ktrej przedstawiciele wykazuj zdolno poruszania si w obrbie genomu. Sekwencje powtarzajce istniej w formie rozproszonej lub zgrupowanych tandemw sekwencji mikrosatelitarnych dugoci 2-5 bp, ok. 50 powtrze, najczciej AC na jednym pamie i TG na drugim, zlokalizowane w ok. 50 100 tys. miejsc w genomie. Heterozygotyczno pod wzgldem liczby kopii poszczeglnych sekwencji mikrosatelitarnych, czyli inaczej mwic istnienie rnej iloci powtrze na dwch chromosomach homologicznych, jest cech dziedziczn. Mnogo i atwo wykrywania tych sekwencji metod PCR czyli z nich uyteczne narzdzie diagnostyczne wikszo genw towarzyszy bowiem co najmniej jednemu markerowi satelitarnemu, przez co mona oznaczy ich pooenie (mapy sprze), a ponadto mona bada polimorfizm mikrosatelitarny u duej liczby spokrewnionych osb. Mutacje dynamiczne, gwnie zwikszenie liczby powtrze sekwencji trjnukleotydowych, czyli niestabilno sekwencji mikrosatelitarnych, jest przyczyn wielu chorb, m. in. zespou amliwego chromosomu X (powtrzenia CGG), choroby Huntingtona (CAG), dystrofii miotonicznej (CTG), atrofii miniowej rdzeniowo opuszkowej (CAG) czy choroby Kennedyego (CAG). Konwersja genu to ujednolicenie sekwencji skadowych rodzin powtarzajcego DNA w wyniku przypadkowego utrwalenia jednego z ich wariantw. Sytuacja taka ma miejsce, gdy podobne sekwencje na chromosomach homologicznych nieprzypadkowo wytwarzaj midzy sob sparowane struktury dwupasmowe i eliminuj wszystkie sekwencje niesparowane. g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych Materia genetyczny moe ulega rearanacji, m. in. drog rekombinacji chromosomalnej, czyli rwnej i wzajemnej wymiany fragmentw chromosomw homologicznych (ang. crossing-over dosownie: przechodzenie na drug stron). Zjawisko to zachodzi w stadium pachytenu profazy I mejozy. Jeeli osobnik jest heterozygot wzgldem genu pooonego w odcinku podlegajcym rekombinacji, wwczas mog pojawi si zauwaalne i dziedziczne rnice w sprzeni genw. Z kolei przy niedokadnym uoeniu chromosomw moe dochodzi do nierwnej wymiany materiau tzw. nierwnego crossing-over. Oddziauje to na tandemow organizacj powtarzajcych sekwencji DNA i moe zmieni liczb kopii rodziny takich sekwencji. Wymiana chromatyd siostrzanych to proces rekombinacji, zachodzcy midzy identycznymi chromatydami w tetraploidalnych komrkach, ktre zakoczyy faz S cyklu komrkowego. S one identyczne, poniewa s produktami semikonserwatywnej replikacji wsplnej macierzystej czsteczki DNA. Wymiana chromatyd siostrzanych nie niesie ze sob adnych konsekwencji genetycznych tak dugo, jak nie dochodzi do nierwnego crossing-over. h) gen i jego ekspresja; genom Gen jest podstawow jednostk informacji genetycznej. Dokadna definicja genu ulegaa wielokrotnej modyfikacji. Pierwotnie, zanim poznano budow i rol DNA, przez gen rozumiano czynnik determinujcy wystpowanie u organizmu okrelonej cechy. Pniej, gdy odkryto e DNA niesie informacje o strukturze biaek, genem nazywano odcinek DNA kodujcy struktur pojedynczego biaka. Poniewa jednak wykazano istnienie biaek zoonych z kilku podjednostek, kodowanych przez odmienne geny, tote wspczenie przez gen rozumie si fragment DNA kodujcy jeden acuch polipeptydowy. Ekspresja (dosownie: wyraanie) genu to proces tumaczenia zawartej w nim (w postaci sekwencji nukleotydw) informacji na struktur I-rzdow nowo biosyntetyzanego biaka (czyli sekwencji wystpujcych w tym biaku aa). Ekspresja genu jest bardzo zoona pod wzgldem biochemicznym, mona j podzieli na 2 etapy. W pierwszym, zwanym transkrypcj, sekwencja dezoksyrybotydw DNA przepisywana jest na sekwencj rybotydw RNA zazwyczaj mRNA. Innymi sowy na matrycy w postaci jednego z pasm DNA (z tego wanie powodu okrelanego jako matrycowe) syntetyzowana jest nowa czsteczka RNA. Produkt transkrypcji (RNA) stanowi jednoczenie substrat dla drugiego etapu translacji, w ktrym z kolei sekwencja rybotydw RNA przekadana jest na sekwencj aa w powstajcym biaku. Przez analogi do powyszego na matrycy RNA (rwnie nazywanego matrycowym std mRNA) biosyntetyzowane jest nowe biako. Czsteczki mRNA stanowi zatem w tym acuchu porednie ogniwo. Ekspresja genw podlega zoonej regulacji. Genomem nazywamy cao materiau genetycznego, jaki posiada kada komrka organizmu. U niszych organizmw genom stanowi pojedyncza, zamknita czsteczka DNA, u wyszych natomiast DNA podzielone jest na due odcinki, z ktrych kada ulega upakowaniu w jeden chromosom. Mona wic powiedzie, e genom to inaczej pojedynczy (haploidalny) zestaw chromosomw (przykadowo u czowieka liczcy n = 23 chromosomy). Genom ludzki zawiera ok. 30 tys. genw, tzn. znajduje si w nim informacja o budowie takiej liczby acuchw polipeptydowych. Genom to jednak wicej ni zbir wszystkich genw, wystpuje w nim bowiem jeszcze dua ilo tzw. materiau midzygenowego nie ulegajcego tumaczeniu na struktur biaek, lecz penicemu funkcje strukturalne i regulacyjne.

142 - -

i)

transpozony; geny przeksztacone

W komrkach eukariotycznych istniej mae elementy DNA tzw. skaczce DNA zdolne do transpozycji, czyli zmiany swojego pooenia w obrbie genomu bez zaburzania funkcji ssiednich sekwencji DNA. Dowodem na ich istnienie jest obecno genw przeksztaconych, tj. zoonych z sekwencji DNA identycznych lub bardzo podobnych do mRNA kodujcego produkt odpowiedniego genu. W genach tych nietranskrybowany region 5-kocowy, fragment kodujcy pozbawiony intronu oraz 3-kocowa sekwencja poliadenylowa uoone s w sposb cigy. Jedynym wyjanieniem tego zjawiska jest wsteczna transkrypcja mRNA do DNA na zasadzie transpozycji. Znane s geny przeksztacone m. in. dla czsteczek immunoglobulin, -globuliny i innych. Pseudogeny to geny przeksztacone, ktre w przebiegu ewolucji zostay tak zmienione, e zawieraj kodony nonsensowne (por. punkt VIII-4-d termiacja translacji), uniemoliwiajce ich ekspresj. j) motywy funkcjonalne biaek wicych si z DNA

Wiele biaek, m. in. regulatorw transkrypcji, musi wiza si do okrelonych sekwencji DNA z wysokim powinowactwem, wykazujc jednoczenie niewielkie do innych. Umoliwiaj im to trzy unikatowe motywy funkcjonalne: helisa-skrt-helisa, palec cynkowy i zamek leucynowy. W bezporedni kontakt z DNA wchodz jedynie niewielkie regiony tych biaek, zawierajce powysze motywy, pozostae czci czsteczek odpowiadaj za dimeryzacj i stabilizacj. Biaka te wi si kooperatywnie do kilku miejsc w obrbie DNA, a kontakt biako-DNA utrzymywany jest dziki wizaniom niekowalencyjnym wodorowym i van der Waalsa. Motyw helisa-skrt-helisa (ang. helix-turn-helix) wystpuje u ssakw w biakach homeobox (por. geny homeotyczne) i pou, jak rwnie u organizmw prymitywnych, np. w represorze Cro bakteriofaga . Monomer biaka Cro skada si z trzech przeciwrwnolegych paszczyzn (1 3) oraz trzech -helis (1 3). Elementem bezporednio rozpoznajcym i wicym si do powierzchni DNA jest helisa 3. rednia szeroko -helisy wynosi 120 nm, co odpowiada mniej wicej szerokoci wikszego rowka DNA w formie B. Motyw helisa-skrthelisa powstaje w ten sposb, e helisy 2 i 3 s utrzymywane pod ktem 90o przez skrt 4 aa. Dwa monomery biaka Cro asocjuj przez zwinicie antyrwolegych paszczyzn 3 w dimer o podwjnej osi symetrii. Reszta czsteczki odpowiada gwnie za jej stabilizacj. Domena rozpoznajca DNA kadego monomeru oddziauje z nim na odcinku 5 bp. Cay odcinek DNA przyczajcy biako zawiera sekwencje palindromowe i ma dugo 340 nm odpowiada to dugoci jednego kompletnego zwoju podwjnej helisy DNA, przez co umoliwia dopasowanie kolejnych pskrtw w rowku wikszym na tej samej powierzchni. Motyw palca cynkowego (ang. zinc finger) wystpuje u ssakw m. in. w rodzinie receptorw steroidowo tarczycowych oraz w biaku Sp1. Palce cynkowe stanowi seri powtrzonych domen (2 9 x), z ktrych kada osadza si na atomie cynku w postaci tetraedralnej konformacji. Atom ten zwizany jest przez 2 kolejne reszty Cys, nastpnie obecna jest sekwencja 12 13 aa, po czym znw wystpuj 2 reszty Cys (np. w THIIIA) lub 2 reszty His (np. w rodzinie receptorw steroidowo tarczycowych) atom cynku jest wic umocowany do biaka czterema wizaniami. Biaka zawierajce taki motyw wi si do jednej paszczyzny helisy DNA, a kolejne palce uoone s naprzemiennie w obrbie duego skrtu w duym rowku, oddziaujc na odcinku 5 bp. Mutacja pojedynczego aa w jednym z dwch palcw cynkowych receptora dla 1,25(OH)2D3 powoduje krzywic typu II. Motyw zamka leucynowego (ang. leucine zipper) wystpuje w wielu ssaczych biakach regulatorowych C/EBP, Fos, Jun/Ap1, c-myc, n-myc, l-myc. Wystpuje w postaci 30-aa sekwencji -helikalnej, w ktrej reszty Leu powtarzaj si w staej odlegoci 7 aa, przez co znajduj si po jednej stronie helisy w uoeniu liniowym. Organizacja taka obejmuje 8 helikalnych skrtw i 4 powtarzajce si reszty Leu. Prawdopodobnie struktura ta pozwala na poczenie monomerw biakowych w homo- (np. Jun*Jun) lub heterodimery (Jun*Fos), podobnie jak zamek byskawiczny. Zamek leucynowy, w przeciwiestwie do dwch poprzednich motyww, bierze wic udzia w interakcjach typu biako-biako, ktre wzmacniaj oddziaywania poszczeglnych pojedynczych domen z docelowymi sekwencjami DNA. Tak struktura wydaje si niezbdna do utrzymania domen wicych DNA kadego monomeru w odpowiedniej konformacji, umoliwiajcej waciwe wizanie. 2. Replikacja i naprawa DNA; cykl komrkowy i jego regulacja

Replikacja (duplikacja, kopiowanie) DNA jest procesem syntezy nowej czsteczki DNA, identycznej z ju istniejc. W jej wyniku ilo materiau genetycznego komrki ulega podwojeniu. Do replikacji dochodzi w fazie S interfazy, czyli okresu poprzedzajcego podzia komrki (por. dalej). Skopiowanie materiau genetycznego jest bowiem niezbdne, jeeli kada z dwch komrek potomnych ma zawiera identyczny i kompletny genom. Replikacja zachodzi wg modelu semikonserwatynego (dosownie: p-konserwatywnego; autorzy: Messelson i Stahl). Substratem jest macierzysta czsteczka dwupasmowego DNA (ang. double-stranded DNA dsDNA), a kade jej pasmo suy do syntezy nowego. W rezultacie powstaj dwie identyczne czsteczki DNA, z

143 - -

ktrych kada zawiera jedn ni macierzyst (star) oraz jedn nowo zsyntetyzowan (now) std nazwa modelu. Replikacja jest procesem zoonym, przebiegajcym w trzech etapach inicjacji (rozpoczcia), elongacji (wyduania) oraz terminacji (zakoczenia). Bierze w nim udzia szereg enzymw: polimerazy, helikazy, topoizomerazy, biaka SSB, primaza i ligaza, z czego najwaniejsza jest polimeraza DNA, wykazujca liczne aktywnoci katalityczne. Chocia replikowana jest czsteczka dwuniciowa, to pojedyncza polimeraza DNA kopiuje jednoczenie tylko jedno pasmo, wymaga zatem do pracy DNA jednoniciowego (ang. single-stranded DNA ssDNA). a) inicjacja

Inicjacja replikacji rozpoczyna si odnalezieniem w obrbie DNA miejsca, od ktrego ma si ona zacz, okrelanego jako ori (od ang. origin pocztek). Organizmy prokariotyczne posiadaj tylko jedn, kolist czsteczk DNA i w zwizku z tym jeden punkt pocztku replikacji. U bakterii E. coli jest to ori C, natomiast u bakteriofaga ori . U ssakw natomiast istnieje wiele miejsc rozpoczcia replikacji, zgrupowanych po ok. 100. Proces przebiega w obu kierunkach wzdu chromosomu i oba pasma replikowane s jednoczenie. W wyniku tego powstaj tzw. baki replikacyjne. Zgrupowania przylegych miejsc rozpoczynaj replikacj w sposb zsynchronizowany, co przemawia za obecnoci mechanizmw regulacji czasowo przestrzennej by moe funkcjonalne domeny chromatyny replikuj si jako pene jednostki. Bakteryjny ori C ma dugo 145 bp i zawiera kilka charakterystycznych konserwatywnych sekwencji. Po pierwsze zawiera 4 sekwencje powtarzalne o odwrotnej orientacji (), dugoci 9 nukleotydw i skadzie: 5-TTATNCANA-3, gdzie N oznacza dowolny nukleotyd, po drugie 3 sekwencje powtarzalne o jednakowej orientacji (), dugoci 13 nukleotydw i skadzie: 5-GATCTNTTNTTTT-3. Dua zawarto par A=T w tych odcinkach uatwia rozdzielenie pasm (por. dalej). Do sekwencji typu powtarzalnego wprost (ang. direct repeats) asocjuj swoiste biaka wice: u E. coli 4 czsteczki biaka dna A przyczaj si do 4 sekwencji 9-nukleotydowych, za u faga 4 czsteczki biaka O cz si z analogicznymi odpowiednimi sekwencjami w obrbie ori . Do biaek tych doczaj si kolejne, tak i powstaje kompleks DNA dugoci 150 200 bp oraz multimerw biakowych w liczbie ok. 40. Do takiego kompleksu, okrelanego na tym etapie jako zamknity, doczaj si bakteryjne czynniki HU, FIS i IHC. Dla porwnania: u drody obecne s autonomiczne sekwencje replikujce (ARS), zawierajce odcinki zwane elementami pocztku replikacji (ORE) o dugoci 11 bp, zlokalizowane w regionie przylegym do sekwencji bogatej w pary A=T o dugoci 80 bp ten ostatni to tzw. rozplatajcy element DNA (DUE); do ORE przyczaj si biaka analogiczne do dna A, tworzc kompleks pocztku replikacji (ORC). Niezalenie od organizmu (wirus fag, bakteria E. coli, grzyb drode) powysze zabiegi maj na celu rozdzielenie pasm podwjnej helisy DNA, bowiem tylko pojedyncza ni stanowi substrat replikacji. Nastpnym etapem jest rozdzielnie na krtkim odcinku struktury podwjnej helisy z wyodrbnieniem pojedynczego pasma (ssDNA). Dziki interakcjom midzy samymi biakami oraz midzy biakami i DNA, ten ostatni owija si wok kompleksu biakowego, a komplementarne wizania stabilizujce zaczynaj pka, poczwszy od sekwencji 13-nukleotydowej. Miejscowa denaturacja DNA umoliwia powstanie kompleksu otwartego, oczka i wideek replikacyjnych. Do kompleksu otwartego przycza si helikaza DNA u E. coli jest to biako dna B, transportowane przez biako dna C. Heksamer proteinowy (dna B)6 . (dna C)6 wprowadzony zostaje do wideek replikacyjnych, po czym ulega rozpadowi biako dna C odchodzi, zabierajc ze sob niepotrzebne ju biako dna A. Aby nie doszo do przedwczesnej renaturacji DNA do formy dwupasmowej, do kadej z nici przycza si stabilizujce j biako wice jednopasmowy DNA (ang. single-staranded DNA binding protein SSB). Poniewa obie nici s nie tylko wzajemnie poczone, ale i skrcone w przestrzeni, zatem dsDNA musi ulec rozkrceniu potrzebne jest do tego wyksztacenie struktury obrotowych wideek, katalizowane przez topoizomerazy DNA (np. bakteryjna gyraza DNA nazwa od ac. gyrus zwj, zakrt). Enzymy te wprowadzaj tymczasowe przerwy w jednym pasmie, umoliwiajc obrt wideek i likwidacj napre, po czym przerwy s spajane. W nacinanym miejscu tworzy si wizanie wysokoenergetyczne midzy enzymem a reszt 5-fosforanow wolnego koca DNA, dziki czemu reakcja spajania nie wymaga nakadu energii (w przeciwiestwie do spajania DNA przez ligazy). Topoizomerazy maj rwnie zdolno rozkrcania struktur wyszego rzdu kolistych czsteczek DNA, np. skrconych wok wasnego rodka (tzw. superzwinit DNA). W medycynie stosuje si inhibitory topoizomeraz por. punkt VIII-1-b. U E. coli zakaonej fagiem biako P faga wie biaka dna B, po czym kompleks P/dna B oddziauje z biakiem O i wie si do ori . Nastpnie 3 biaka szoku cieplnego (dna K, dna J i Grp E) zabieraj dna B z kompleksu P/dna B/O i aktywuj je, co pozwala na rozplecenie DNA. W ten sposb w zakaonej komrce bakteryjnej replikacji ulega materia genetyczny faga, a nie bakterii.

144 - -

b) elongacja Przygotowane w powyszy sposb oczko replikacyjne jest gotowe do elongacji, polegajcej na waciwej biosyntezie pasm komplementarnych. Ze wzgldu na fakt, e polimeraza DNA ma zdolno jedynie przyczania nukleotydw do ju istniejcego pasma, a nie rozpoczynania synezy de novo, enzym primaza (u E. coli biako dna G) syntetyzuje krtkie (10 200 nukleotydw) starterowe sekwencje komplementarnego RNA primery posiadajce woln grup 3. Polimeraza DNA syntetyzuje nowe siostrzane pasmo, komplementarne do macierzystego, uywajc jako substratw trjfosforanw odpowiednich dezoksyrybotydw (dNTP). Reakcja przebiega w ten sposb, e nukleofilowa grupa 3OH primera atakuje grup -fosforanow pierwszego NTP z odszczepieniem pirofosforanu (PPi). Nastpnie grupa 3OH ostatnio przyczonego monofosforanu dezoksyrybotydu (dNMP) atakuje nastpny dNTP, odszczepiajc PPi itd. Wybr odpowiedniego dNTP, tj. tego, ktrego grupa fosforanowa zostanie zaatakowana, zaley od odpowiedniego parowania z siostrzanym pasmem DNA, zgodnie z zasadami komplementarnoci. W ten sposb stale rosnce pasmo stale ulega wydueniu. Replikacja obydwu rozdzielonych pasm zachodzi jednoczenie, cho asymetrycznie, bowiem nici s antyrwnolege (przeciwbiene), a polimeraza DNA katalizuje wyduanie nici jedynie w kierunku 53. Wobec tego jedno z pasm (tzw. wiodce, prowadzce, liderowe) replikowane jest normalnie w sposb cigy w kierunku 53, drugie za (tzw. opnione, wsteczne) rwnie w stron 53, lecz skokowo (po kawaku), tak e za kadym razem dobudowywany jest komplementarny odcinek o dugoci 1 5 tys. nukleotydw, zwany fragmentem Okazaki. Helikaza, dziaajc na nici opnionej, rozwija dsDNA w stron 53, a towarzyszca jej primaza syntetyzuje primery na pamie opnionym; taki ruchliwy kompleks primazy i helikazy nosi nazw primosomu. Po ukoczeniu syntezy fragmentu Okazaki polimeraza odcza si, a primaza wstawia nowy primer, po czym ta sama czsteczka polimerazy syntetyzuje kolejny fragment Okazaki itd. Synteza przebiega wwczas w kierunku tylnego koca poprzedzajcego primera RNA, a nie w kierunku niezreplikowanej czci czsteczki. Okrela si to poowiczn niecig biosyntez DNA. Gdy powstanie odpowiednia ilo fragmentw Okazaki, kompleks replikacyjny usuwa primery RNA, uzupenia powstae po nich ubytki odpowiednimi dezoksyrybotydami oraz czy ze sob nowo zsyntetyzowane fragmenty to ostatnie katalizuj ligazy DNA. Podczas gdy w jdrach ssakw wikszo primerw jest usuwana, w mitochondriach mae odcinki RNA pozostaj jako integralna cz zamknitych kolistych struktur DNA. U Eucariota chromosomy nie jest koliste, lecz liniowe, w zwizku z czym posiada wolne koce telomery. Poniewa polimeraza funkcjonuje tylko w jednym kierunku, sekwencja zwizana z primerem najbliszym telomerowi nie ulega replikacji jest to tzw. problem replikacji koca. W efekcie kademu podziaowi komrki towarzyszy pewne skrcenie chromosomu, co jest przyczyn starzenia si komrki i ogranicza jej ywotno. Ma to swoje pozytywne aspekty, gdy zmniejsza ryzyko rozwoju procesu nowotworowego, polegajcego na cigych i niekontrolowanych podziaach komrek (proliferacji). Komrki intensywnie dzielce si (embrionalne i komrki pnia) posiadaj natomiast telomeraz, enzym rybonukleoproteinowy (RNP) dobudowujcy brakujce koce nici opnionej. Jej integralna czsteczka RNA zawiera sekwencj bogat w C, ktra funkcjonuje jako matryca dla nici wiodcej, do ktrej dobudowywane s sekwencje telomerowe. Nastpnie primaza syntetyzuje primer na nici opnionej, polimeraza DNA odtwarza odpowiedni fragment, po czym primer jest wycinany. W efekcie powstaje nowy ubytek, jednak w obrbie telomeru, a nie obszaru strukturalnego (zawierajcego geny). Aktywno telomerazy zmniejsza si wraz z wiekiem. W wikszoci komrek somatycznych jest ona zablokowana, reaktywuje si natomiast w komrkach nowotworowych (85 95 % nowotworw ludzkich), ktre mog cechowa si nawet jej podwyszon aktywnoci, co ma znaczenie diagnostyczne. Zarwno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych wystpuje kilka typw polimeraz, penicych trojakiego rodzaju funkcje. Po pierwsze wyduaj pasmo, czego miar jest szybko wstawiania komplementarnych nukleotydw [nukleotydy/s]. Po drugie reprodukuj sekwencj, co odpowiada liczbie nukleotydw dodanych do nici przed odejciem polimerazy od matrycy [Mb/cykl]. Po trzecie identyfikuj i koryguj bdy (tylko u Procariota por. dalej). U E. coli najwiksze znaczenie i najwysze parametry replikacji posiada dekameryczna (10 podjednostek, > 1 MDa) polimeraza DNA III (replikaza; biako dna E). Jej holoenzym wie si z DNA jako cz wielobiakowego kompleksu, w skad ktrego wchodz rne czynniki pomocnicze: , , , i . Dwie identyczne podjednostki otaczaj matryc, pozwalajc polimerazie na stabilny ruch. Polimeraza DNA II zajmuje si gwnie identyfikacj i napraw bdw replikacji, a polimeraza DNA I uzupenia przestrzenie midzy fragmentami Okazaki. W organizmach eukariotycznych polimeraza DNA (odpowiednik I) wypenia przerwy i syntetyzuje pasmo opnione, (odpowiednik III) reprodukuje oraz syntetyzuje pasmo prowadzce (wiodce), za polimerazy , i (odpowiadaj II) identyfikuj bdy (), naprawiaj DNA ( i ) oraz syntetyzuj mitDNA (). W komrkach ssakw polimeraza dziaa ok. 10 x wolniej (wstawia kilkaset nukleotydw/s) ni u Procariota (kilkanacie tysicy nukleotydw/s), co moe wynika z nawinicia DNA na histony, czyli obecnoci nukleosomw. Jednak obecno wielu miejsc inicjacji powoduje, e oglna sprawno procesu jest wysza u Eucariota.

145 - -

c)

terminacja

W kolistym genomie E. coli miejsce terminacji pooone jest naprzeciwko ori C i ma dugo ok. 600 bp. Wystpuj tam 4 sekwencje terminalne ter, do ktrych przyczaj si biaka ter A D. Jeeli polimerazy przesuwaj si w oczku replikacyjnym zgodnie z kierunkiem ruchu wskazwek zegara, to przechodz przez punkty A i D, a zatrzymuj si w B i C, jeeli za przeciwnie do ruchu wskazwek, to odwrotnie. Dziki temu zatrzymanie polimeraz odbywa si w odpowiednim miejscu. Rozplecione pasma schodz si, a dwie potomne czsteczki DNA rozdzielaj. U Eukariota nastpuje odtwarzanie struktury chromatyny: nowo zreplikowany DNA jest szybko organizowany w nukleosomy, a oktamery histonw rozmieszczaj si na kady ramieniu wideek replikacyjnych. d) regulacja replikacji i cykl komrkowy Replikacja zachodzi w fazie S (tzw. okres syntezy) cyklu komrkowego. Znacznie wzrasta wwczas ilo polimerazy DNA oraz enzymw syntetyzujcych substraty replikacji, tj. trjfosforany nukleotydw. Faza syntezy (S) oddzielona jest od fazy podziau (M) przez okresy przerw (ang. gap) G1 i G2. Komrka nie dopuszcza do biosyntezy DNA poza okresem, kiedy przygotowuje si do podziau. Przejcie komrki z jednej fazy do drugiej uwarunkowane jest obecnoci odpowiednich biaek, zwanych cyklinami nazywanych tak, poniewa ich poziom koreluje z fazami cyklu i podlega cyklicznym zmianom. Cykliny aktywuj z kolei kolejn grup biaek kinazy zalene od cyklin (ang. cyclin-dependent kinases CDK), ktre z kolei fosforuluj substraty odpowiedzialne za przebieg cyklu. Gwne cykliny to A, B, D1-3 i E (istniej rwnie F, K, H, L i T, ale maj mniejsze znaczenie); CDK oznacza si numerami 1 11. Poziom cykliny D wzrasta pod koniec fazy G1, przez co komrka przekracza punkt startowy (drode) lub restrykcyjny (ssaki), wkraczajc nieodwracalnie w faz S. Cykliny D aktywuj CDK 4 i 6, wystpujc z nimi we wsplnym kompleksie, ktry wykazuje aktywno kinazy Ser/Thr. Jednym z jego substratw jest biako Rb (nazwa pochodzi od pewnego nowotworu siatkwki retinoblastoma), ktre wie i inaktywuje czynnik transkrypcyjny E2F, niezbdny do przejcia G1S. Fosforylacja Rb przez CDK4/6 uwalnia czynnik E2F od Rb, umoliwiajc progresj cyklu. Cyklina E i CDK 2 tworz kompleks w pnej fazie G1. Cyklina E ulega degradacji, za uwolniona CDK 2 wie si z cyklin A. Taka sekwencja zdarze jest krytyczna dla rozpoczca syntezy DNA w fazie S. Cyklina B i CDK 1 reguluj przejcie fazowe G2M, czyli wejcie komrki w faz podziau. Wydzielanie cyklin w nieodpowiedniej iloci lub czasie moe zaburza cykl komrkowy. Przykadowo onkogen bcl, zwizany z choniakiem typu B, koduje cyklin D1. e) naprawa DNA

rdami uszkodze materiau genetycznego s bdy procesu replikacji oraz dziaanie czynnikw zewntrznych fizycznych i chemicznych. Warunkiem poprawnoci i dokadnoci replikacji DNA jest swoiste parowanie nukleotydw, zalene od obecnoci preferowanych postaci tautomerycznych zasad azotowych. Faworyzowanie odpowiednich zasad zapewnione jest przez system dwukrotnego monitorowania ich parowania pierwszy raz w trakcie wczania trifosforanw dezksyrybotydw oraz drugi raz przy ponownej kontroli (i ewentualnie naprawie). Dziki temu pomyki spowodowane bdnie wstawion zasad zdarzaj si nie czciej ni 1 : 10810. U organizmw prokariotycznych, jak E. coli, elementem monitorujcym jest aktywno egzonukleazy 35, jak wykazuje sama polimeraza DNA II. U ssakw funkcje te zostay przejte przez inne systemy enzymatyczne. Mechanizmy naprawy DNA s skuteczne w przypadku uszkodzenia tylko jednego pasma dsDNA. Umowna klasyfikacja uszkodze DNA: zamiana 1. zasady: depuryncja, deaminacja CU lub AH, alkilacja zasady, insercja lub delecja nukleotydu, inkorporacja (wczenie) analogu zasady, zamiana 2. zasad: dimery tymidynowe (indukowane UV), wizania poprzeczna dwufunkcyjnym czynnikiem alkilujcym, pknicie acucha: pod wpywem promieniowania jonizujcego, rozpad wiza fosfodwuestrowych pod wpywem radioaktywnoci, wizania poprzeczne: midzy zasadami tego samego pasma lub pasm przeciwlegych, midzy DNA a biakami (np. histonami).

146 - -

Wyrnia si 4 mechanizmy naprawy DNA: przez napraw niesparowanych zasad, przez wycicie zasady, przez wycicie nukleotydu oraz napraw pkni dwupasmowych. Naprawa niesparowanych zasad (ang. mismatch repair MMR) koryguje bdy replikacji, powstae np. w wyniku polizgu lub zacicia polimerazy, w postaci nadmiarowego wstawienia pojedynczej zasady lub obecnoci ptli z kilku (2-5) niesparowanych nukleotydw. Nowo zsyntetyzowany odcinek DNA jest przeszukiwany od ktem bdw; punkt orientacyjny stanowi zmetylowana adenina w sekwencji GATC. Jeeli znaleziona zostanie niesparowana zasada lub maa ptla nukleotydowa, wwczas endonukleaza GATC przecina w odpowiednim miejscu pasmo zawierajce mutacj, nastpnie egzonukleaza trawi pasmo i usuwa zmutowan sekwencj, a ostatecznie ubytek wypeniany jest komplementarymi zasadami dziki aktywnociom polimerazy, SSB i ligazy. U E. coli do rozpoznania i przecicia potrzeba 3 biaek (Mut S, C i H), u ssakw za a 6. Zaburzenie tego mechanizmu ma udzia w patogenezie dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego (HNPCC). Zaburzenia dotycz tu genw hMSH2 (na chromosomie 6, odpowiednik bakteryjnego Mut S) oraz hMLH1 (odpowiednik Mut L); w ich wyniku powstaj dysfunkcje enzymw naprawczych, co powoduje wyduenie sekwencji mikrosatelitarnych, co z kolei zaburza funkcje biaek krytycznych dla nadzoru cyklu komrkowego w nabonku jelita grubego. Naprawa przez wycicie zasady odwraca m. in. skutki depurynacji. Wizanie N-glikozydowe, czce reszty cukrowe i zasad azotowych, jest wraliwe na dziaanie temperatury (termolabilne). W komrkach dochodzi wic stale do jego rozbijania i pozbawiania nukleotydw zasad purynowych, co jest jednoznaczne z utrat niesionej przez nie informacji. Depurynacja w temperaturze 37oC zachodzi w tempie 5 10 tys. w kadej komrce w cigu doby. Miejsca depurynacji s rozpoznawane przez swoiste N-glikozylazy, co jednoczenie stanowi sygna dla endonukleazy apurynowej lub apirymidynowej, ktre usuwaj reszt cukrow pozbawion zasady. Nastpnie naprawcza polimeraza DNA uzupenia nukleotyd, a ligaza czy go z ssiednimi. W podobny sposb przebiega naprawa deaminacji, alkilacji lub substytucji zasad przez ich analogi. Naprawa przez wycicie nukleotydu uywana jest do usuwania i zastpowania wikszych (dugoci ok. 30 nukleotydw) regionw DNA, bierze w niej rwnie udzia wiksza liczba biaek. Takie uszkodzenia mog powstawa w wyniku: dziaania promieni UV ( dimery cyklobutanowe midzy dwoma pirymidynami), dymu tytoniowego ( addukcja beznzo[a]pirenu do guaniny), promieniowania jonizujcego i lekw cytostatycznych ( modyfikacje zasad, pkanie pasm, sieciowanie DNA-DNA lub DNA-biaka). W opisywanym mechanizmie hydrolizie ulegaj dwa wizania fosfodwuestrowe w uszkodzonym pamie, co katalizuje egzonukleaza zoona z wielu podjednostek (u E. coli 3, u czowieka 17). Usunity odcinek jest uzupeniany (u czowieka przez polimeraz /) oraz czony przez ligaz DNA. Zaburzenie tego typu naprawy zwizane jest z patogenez typw A i C choroby xeroderma pigmentosum (XP). Naprawa pkni dwupasmowych, poza funkcjonowaniem jako mechanizm naprawy DNA, jest czci fizjologicznego procesu rearanacji genw immunoglobulin. W niehomologicznym czeniu zama dwupasmowych bierze udzia biako Ku, ktre wie si do wolnych kocw DNA i wykazuje latentn aktywno helikazy zalenej od ATP. Nastpnie aktywacji ulega zalena od DNA kinaza biakowa (DNA-PK), ktra wie wolne koce i zblia je do siebie. W powstaym kompleksie kinaza ulega aktywacji, fosforylujc biako Ku i inn czsteczk DNA-PK, pooon na przeciwlegym pamie w pozycji trans. Kinaza dysocjuje wwczas z kompleksu, a aktywacji ulega helikaza biaka Ku, ktra rozplata oba koce. Rozpleciona i zblione koce ulegaj parowaniu, a dodatkowe ogony nukleotydowe usuniciu przez egzonukleaz. Przerwy midzy nukleotydami s ostatecznie scalane przez ligaz DNA. Zaburzenia mechanizmw naprawy s ponadto przyczyn chorb: ataxia teleangiectasia (AT), cechujc si zwikszon wraliwoci na promieniowanie X oraz anemia Fanconiego, gdzie defekt dotyczy naprawy uszkodze wywoanych wizaniami poprzecznymi w DNA. 3. Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje

Transkrypcja (dosownie: przepisywanie) jest procesem, w ktrym informacja zawarta w DNA przenoszona jest na RNA (najczciej mRNA). Innymi sowy na podstawie budowy DNA, a dokadniej sekwencji nukleotydw w jego pamie matrycowym, syntetyzowana jest nowo czsteczka RNA. Ta ostatnia jest wic komplementarna do pasma matrycowego swojego genu, a dokadnie identyczna z jego pasmem kodujcym (oczywicie T zamienione s na U). W dwupasmowym DNA pasmo matrycowe jednego genu nie musi by tym samym dla drugiego w helisie DNA kade z dwch pasm dsDNA peni rol pasma matrycowego dla jednych, a kodujcego dla drugich genw. Transkrypcja jest procesem polarnym: informacja z pasma matrycowego czytana jest w kierunku 35, za nowo powstajca czsteczka RNA syntetyzowana jest w kierunku 53; ma to istotne konsekwencja m. in. w sprzeniu transkrypcji z translacj u Procariota (por. dalej).

147 - -

Istniej pewne podobiestwa pomidzy replikacj a transkrypcj. Oba procesy podzielone s na 3 etapy (inicjacja, elongacja, terminacja), w obu bior udzia due biakowe kompleksy inicjacyjne, w obu wreszcie kolejne nukleotydy nowo syntetyzowanego kwasu nukleinowego wstawiane s na zasadzie komplementarnoci z nukleotydami ju istniejcej nici. Jednak, w przeciwiestwie do replikacji, w transkrypcji substratem s trifosforany rybotydw (NTP), zamiast T wstawiany jest U, nie wystpuj primery, a produkt nie jest sprawdzany pod ktem poprawnoci wstawionych zasad. Ponadto w procesie replikacji kopiowany jest cay komrkowy DNA, transkrypcji natomiast podlega tylko pewna niewielka jego cz. Fragment DNA podlegajcy transkrypcji to tzw. jednostka transkrypcyjna. Jest ona poprzedzona przez obszar zwany promotorem, za ni za obecny jest terminator. Promotor i terminator wyznaczaj miejsca pocztku (inicjacji) i koca (terminacji) transkrypcji, czyli wyznaczaj granice jednostki transkrypcyjnej. Pierwszy nukleotyd jednostki transkrypcyjnej oznaczany jest +1 (jest to puryna G lub rzadziej A), a dalsze kolejnymi liczbami naturalnymi; nukleotydy promotora oznaczane s kolejnymi liczbami ujemnymi (w kierunku 35). a) transkrypcja u Procariota

Inicjacja transkrypcji polega na odnalezieniu przez polimeraz RNA (RNAP) promotora genu na pamie matrycowym i zwizaniu si z nim. Niezwykle wany jest wybr odpowiedniego promotora genom E. coli (4 Mbp) zawiera ich bowiem ok. 2 tys., za ludzki (3 Gbp) ok. 100 tys. RNAP przeszukuje wic genom z prdkoci ok. 1 kbp/s w poszukiwaniu miejsca, do ktrego wykazuje wysokie powinowactwo. budowa promotora

Promotory bakteryjne maj dugo ok. 40 bp (4 zwoje podwjnej helisy), tak i mog by w danym momencie cakowicie pokryte przez pojedyncz czsteczk RNAP (kompleks RNAP pokrywa 30 75 bp zalenie od konformacji). Promotor zawiera 2 konserwatywne sekwencje: w pozycji -35 bp znajduje si 8nukleotydowa sekwencja 5-TGTTGACA-3, z ktr wie si RNAP, tworzc kompleks zamknity, za w pozycji -10 bp wystpuje 6-nukleotydowa sekwencja 5-TATAAT-3 (tzw. ramka TATA ang. TATA box; inaczej ramka Pribnowa). Ta ostatnia, ze wzgldu na zawarto samych wiza podwjnych, atwo ulega denaturacji, pozwalajc na dysocjacj pasma kodujcego i matrycowego i jego odczyt tego przez RNAP (kompleks otwarty). Inne bakterie posiadaj inaczej zbudowane promotory, ale zazwyczaj zawieraj one rwnie 2 charakterystyczne sekwencje (ramki). budowa polimerazy RNA

U E. coli DNA-zalena polimeraza RNA (RNAP) skada si z tetramerycznego rdzenia, do ktrego odwracalnie przycza si podjednostka ; razem tworz one holoenzym. Rdze polimerazy skada si z 2 podjednostek identycznych (; 36,5 kDa; funkcja: monta rdzenia) oraz z 2 podobnych, cho nieidentycznych: (151 kDa; wie rybotydy) i (155 kDa; wie DNA); zawiera rwnie 2 atomy cynku. Czynnik biakowy odpowiada za rozpoznanie promotora i zwizanie z nim rdzenia RNAP, po czym przestaje by potrzebny i odcza si od rdzenia, mogc przyczy si do innego. Dziki temu transkrypcja moe zachodzi z tak sam szybkoci nawet gdy czynnikw jest mniej ni rdzeni. Czynniki dziaaj ponadto jako biaka regulatorowe transkrypcji pojawiaj si w komrce w odpowiedzi na szkodliwe czynniki zewntrzne (np. bakteriofagi, wstrzs cieplny; sporulacja), przyczaj si do odpowiednich rdzeni i modyfikuj swoisto rozpoznawania promotorw przez RNAP, przez co stymuluj ekspresj okrelonych genw i w konsekwencji uruchamiaj mechanizmy obronne. Rne bakterie posiadaj rne swoiste gatunkowo czynniki , np. u E. coli jest to 70. inicjacja

Podjednostka rozpoznaje w promotorze sekwencj -35 bp, co umoliwia zwizanie z nim RNAP i utworzenie kompleksu zamknitego; czynnik ulega wwczas odczeniu. Gdy polimeraza rozpoznaje sekwencj -10 bp, zmienia swoj konformacj i zaczyna przesuwa si po nici. Dostp do nukleotydw pasma matrycowego wymaga rozdzielenia pasm i rozkrcenia podwjnej helisy. Topnienie DNA nastpuje na staym odcinku ok. 17 bp na czsteczk polimerazy i nie zaley od sekwencji DNA, co sugeruje, e RNAP wykazuje aktywno rozwijajc. Zaraz za polimeraz postpuje topoizomeraza, zapobiegajca tworzeniu kompleksw helisy wyszego stopnia. Udostpnienie pasma pozwala na utworzenie kompleksu otwartego i bbla transkrypcyjnego. Etap ten jest krytyczny dla powodzenia caego procesu albo dochodzi do inicjacji poronnej (zsyntetyzowanych jest tylko kilka nukleotydw, ktre odrywaj si od kompleksu) albo RNAP osiga punkt +1 i niemal z pewnoci ukoczy transkrypcj genu.

148 - -

elongacja

Elongacja transkrypcji jest bardzo podobna do elongacji replikacji. Gdy RNAP dojdzie do miejsca +1, wstawia pierwszy (5-kocowy) rybotyd, przy czym substratem jest jego trjfosforan (NTP), wicy si do podjednostki . W wyniku odczenia pirofosforanu (PPi) pozostaje NMP. Nastpnie RNAP przemieszcza si (ulega translokacji) do kolejnej zasady na matrycy, wie i wstawia kolejny rybotyd, ktry tworzy z poprzednim wizanie 3,5-fosfodwuestrowe, czemu towarzyszu uwolnienie PPi. Cykl ten powtarza si wielokrotnie, zalenie od dugoci jednostki transkrypcyjnej. Elongacja biegnie antyrwnolegle pasmo matrycowe czytane jest w kierunku 35, a nowe RNA wydua si w stron 53. Nowo syntetyzowany RNA zwizany jest z podjednostk RNAP. W tym samym czasie jedno pasmo matrycowe genu moe by przepisywane przez wicej ni jedn czsteczk RNAP, jednak jest to proces tak zsynchonizowany, e w danej chwili przepisywaniu ulegaj odmienne sekwencje DNA. Bakteryjny RNA jest policistronowy, gdy kilka pobliskich genw moe znajdowa si pod kontrol wsplnego promotora i ulega jednoczesnej transkrypcji. U Eucariota natomiast kady gen posiada wasny promotor i ulega niezalenej ekspresji, std RNA jest monocistronowy. terminacja

Terminacja transkrypcji moe by dwojakiego rodzaju: tzw. -zalena lub -niezalena. Terminacja -zalena wyznaczona jest przez odpowiedni sekwencj na pamie matrycowym, ktr rozpoznaje i z ktr wie si heksameryczne (3 dimery) biako terminacji czynnik . Wykazuje on aktywno RNA-DNA helikazy zalenej od ATP, dziki czemu rozrywa kompleks DNA i RNA. Rdze polimerazy odcza si od DNA, czekajc na pojawienie si kolejnego czynnika , aby znw rozpozna promotor i zainicjowa transkrypcj. Terminacja -niezalena, zwana rwnie spontaniczn, wyznaczana jest przez sekwencj terminatora. Ma on dugo ok. 40 bp i zawiera sekwencj palindromow (przerwana odwrcona sekwencja powtrzona orientacja: ...), po ktrej wystpuje wiele reszt A. Gdy polimeraza przejdzie przez sekwencj palindromow, powstay odcinek RNA wykazuje komplementarno z samym sob, dochodzi wic do parowania zasad, w wyniku czego powstaje struktura II-rz. o ksztacie szpilki lub spinki do wosw (s to synonimy). Struktura ta oddziauje z kompleksem transkrypcyjnym, tak e RNAP zatrzymuje si i odcza. Za sekwencj palindromow reszty A matrycy ulegaj przepisaniu na U w RNA dziki temu kompleks DNARNA jest za struktur szpilki utrzymywany przez sabe pary A=U, atwo wic ulega destabilizacji i transkrypt odcza si od matrycy. W czasie terminacji -niezalenej struktura szpilki pojawia si zawsze, natomiast w czasie -zalenej zazwyczaj nie, cho moe wystpi dodatkowo. b) rnice w transkrypcji u Eucariota promotory eukarotyczne

Generalnie promotory eukariotyczne s bardziej zoone. Przed jednostk transkrypcyjn wystpuj 2 lub 3 typy sekwencji sygnalnych jedna okrela miejsce przyczenia polimerazy, druga podstawow czsto transkrypcji, za trzecia determinuje dodatkow czsto transkrypcji, stanowic gwny mechanizm regulacyjny. Wikszo genw ssakw zawiera mniej wicej w pozycji -15 bp sekwencj TATA (g. TATAAT, cho ukad A i T moe si rni) jest to tzw. ramka Haggesa. Przycza si do niej odpowiednie biako wice (ang. TATA binding protein TBP), do ktrego z kolei przyczaj si biakowe czynniki asocjujce (ang. TBP associated facors TAF). Powstanie kompleksu TBP i TAF (dawniej okrelanego jako TFIID por. dalej) jest pierwszym etapem tworzenia kompleksu transkrypcyjnego na promotorze. Pewne geny nie posiadaj sekwencji TATA wwczas polimeraza kieruje si sekwencj inicjacyjn (Inr), obejmujc punkt startu (-3 +5) i o budowie: Py2A*NT/APy2, gdzie A* to nukleoyd +1, a Py pirymidyna. Promotory mog zawiera zarwno sekwencj TATA, jak i Inr s wwczas silniejsze od zawierajcych tylko jedn z nich. Sekwencje pooone jeszcze wczeniej przed promotorem (ok. -80 bp) okrelaj podstawow czsto transkrypcji danego genu. S to tzw. kasety GC oraz CAAT, wice odpowiednio biaka: Sp1 oraz CTF, C/EBP, NF1, NFY i inne. S to elementy cis mogce funkcjonowa w pooeniu o odwrconej polarnoci ( lub ), cho lepszy efekt wywieraj gdy s zorientowane zgodnym z genem (). Istnieje rwnie 3. klasa sekwencji sygnalnych, regulujcych inicjacj transkrypcji genw eukariotycznych s to tzw. wzmacniacze (ang. enhancers) lub wyciszacze (silencers). Mog one wystpowa po obu stronach punktu +1, funkcjonuj niezalenie od polarnoci i nawet bdc w duej (rzdu setek tysicy bp) odlegoci od jednostek transkrypcyjnych. Mog wiza jedno lub wicej biaek, ktre z kolei mog si wiza z jednym lub wiksz liczb takich elementw. Elementy

149 - -

odpowiedzi hormonalnej (HRE; patrz punkt VII-1-a) dziaaj albo jako takie wanie sekwencje albo s z nimi sprzone. Inne czynniki wpywajce na ekspresj genw (wstrzs cieplny, metale Zn, Cd, dioksyny) dziaaj przez swoiste elementy regulatorowe. Podobnie swoista tkankowo ekspresja genw zachodzi przez swoiste sekwencja DNA. polimerazy eukariotyczne

W przeciwiestwie do Procariota, komrki ssakw zawieraj kilka DNA-zalenych polimeraz RNA: I (A), II (B) i III (C). Wszystkie maj podobn mas (500 600 kDa) i zbudowane s podobnie jak bakteryjna RNAP (2 due podjednostki + kilka mniejszych). Rni si natomiast rodzajem przepisywanych genw oraz wraliwoci na -amanityn. Polimeraza I, II i III przepisuje odpowiednio geny klasy I (rRNA), II (mRNA lub hnRNA) i III (tRNA i 5S rRNA). -amanityna jest toksyn grzyba Amanita phalloides, dziaajc jako swoisty inhibitor eurakriotycznej nukleoplazmatycznej DNA-zalenej polimerazy RNA II, blokujcym jej translokacj. Polimeraza I jest niewraliwa na -amanityn, II bardzo wraliwa (wraliwa na mae stenia), a III sabo wraliwa (wraliwa na due stenia). kompleks transkrypcyjny; regulacja transkrypcji

U Eucariota kompleks transkrypcyjny zoony jest z ok. 50 biaek. Polimerazy nie rozpoznaj same promotorw, lecz s na nakierowywane przez inne biaka. Dla genw klasy II funkcje prokariotycznego czynnika przejmuj inne biaka, tak i podstawowa transkrypcja, oprcz polimerazy RNA II, wymaga obecnoci czynnikw A, B, D, E, F, H i J. Okrela si je symbolami TFIIX czynnik transkrypcyjny (ang. transcription factor) X dla genu klasy II, gdzie X to jedna z powyszych liter. Spord nich jedynie TFIID (czyli TBP i 8 10 TAF, por. wyej) ma zdolno wizania si ze swoistymi sekwencjami DNA tu z sekwencj TATA. TBP wie si z TATA w rowku mniejszym DNA (inaczej ni wikszo czynnikw transkrypcyjnych por. punkt VIII-1-j) powodujc zgicie lub zamanie helisy o kat 100o, co uatwia integracj TAF i innych skadnikw kompleksu inicjacyjnego, a prawdopodobnie rwnie czynnikw wicych si z sekwencjami cis. TBP jest take skadnikiem kompleksw inicjacyjnych transkrypcji genw klas I i III, cho ich promotory nie zawieraj sekwencji TATA nie wiadomo zatem gdzie dokadnie przycza si TBP. Zwizanie TBP z promotorem genu oznacza go jako gotowy do transkrypcji jest to jedyny etap cakowicie zaleny od interakcji typu biako-DNA. Nastpnie do kompleksu TBP-promotor docza si TFIIB powstay trjskadnikowy kompleks dokadniej umieszcza si na promotorze i wie do niego kompleks polimerazy II i TFIIF (podobny do niezbdny do poczenia polimerazy z promotorem). Doczenie TFIIA stabilizuje kompleks TBP z promotorem oraz umoliwia mu odpowied na aktywatory. Dodanie do kompleksu polimeraza II TFIIF czynnikw TFIIE i H finalizuje formowanie kompleksu preinicjacyjnego (ang. preinitiation complex PIC). Kade z opisanych zdarze powiksza rozmiar kompleksu, ktry ostatecznie pokrywa obszar ok. 60 bp (30 bp po kadej stronie punktu +1) i jest gotowy do rozpoczcia podstawowej transkrypcji. W genach zawierajcych zamiast sekwencji TATA sekwencj Inr niezbdne s te same skadniki. Eukariotyczna polimeraza RNA II skada si z 14 podjednostek, z czego 2 najwiksze (ok. 200 kDa) s homologiczne do bakteryjnych i . Na C-kocu najwikszej podjednostki obecne s 7-aa powtrzenia (TyrSer-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) tzw. powtarzajca domena koca karboksylowego (ang. carboxyl termical repeat domain CTD), u ssakw w licznie 52. CTD stanowi substrat dla wielu kinaz, w tym THIIF oraz miejsca wizania biaek mediatorowych Srb (supresory polimerazy RNA B), ponadto bior udzia w obrbce RNA i poliadenylacji 3-koca. TFIIE zwiksza aktywno kinazow TFIIH. Fosforylacja reszt Ser i Thr w obrbie CDT aktywuje polimeraz II; polimeraza nie moe funkcjonowa bez sprawnych CDT. TFIID (nie sam TBP) podtrzymuje zarwno transkrypcj podstawow (jak TBP), jak i nasilon dziaaniem innych czynnikw aktywatorw. Te ostatnie przyczaj si do odpowiednich sekwencji: CAAT (C/EBP, NF-Y), GC (Sp1, MyoD, NF1), oktamer Ig (Oct-1, 2, 4, 6), AP1 (Jun, Fos, ATF), SRF ( surowica), HSF ( szok cieplny). TAF s niezbdne w tym drugim przypadku, tj. do aktywnoci aktywatorw, dlatego okrela si je jako koaktywatory. Istniej wic 3 klasy czynnikw transkrypcyjnych, biorcych udzia w regulacji genw klasy II: podstawowe (TBP i czynniki TFIIX), koaktywatory (TAF) oraz powysze aktywatory. Kolejno organizacji PIC wyjaniaj 2 modele: stopniowego montowania PIC (skadniki kompleksu przyczaj si kolejno, a aktywatory stymuluj formowanie lub funkcje PIC) oraz hipoteza rekrutacji (koaktywatory i aktywatory doprowadzaj wczeniej preformowany PIC do promotora). Hormony i inne czsteczki sygnaowe moduluj ekspresj genw przez wpyw na gromadzenie i aktywno aktywatorw i koaktywatorw oraz nastpowe formowanie si PIC na promotorze danego genu. Terminacja transkrypcji u Eucariota jest sabo poznana, jednak przypuszczalnie sygnay terminacji znajduj si z znacznej odlegoci za (np. 1 2 kbp w stron 3) jednostkami transkrypcyjnymi.

150 - -

c)

geny podzielone; snRNA; skadanie mRNA

U Procariota pierwotne transkrypty genw klasy II stanowi gotowe matryce do translacji, nawet jeszcze przed ukoczeniem transkrypcji. Transkrypcja i translacja s ze sob sprzone, co jest zwizane m. in. z brakiem jdra komrkowego. Prokariotyczne mRNA nie ulega wic praktycznie adnym modyfikacjom od chwili powstania do chwili podjcia funkcji matrycy dla syntezy biaek. rRNA i tRNA s przepisywane w formach duszych ni ostateczna, a liczne jednostki transkrypcji tRNA zawieraj wicej ni jedn czsteczk wymagaj one wic przeksztacenia do form dojrzaych. U Eucariota natomiast transkrypcja i translacja s rozdzielone przestrzennie (jdro / cytoplazma) i w konsekwencji czasowo. Pomidzy czasem syntezy a rozpoczcia penienia funkcji wszystkie typy eukariotycznego RNA przechodz szereg przeksztace (ang. processing). Jest to konsekwencj wystpowania wikszoci genw eukariotycznych w formie genw podzielonych oznacza to, e sekwencje kodujce aa w produktach biakowych (tzw. eksony) s w nich porozdzielane dugimi sekwencjami niekodujcymi (tzw. intronami sekwencjami wtrconymi), tj. nioscymi informacje odrzucane w procesie obrbki RNA. Introny mog by nawet dusze od eksonw; cigo pojedynczego gen jest zazwyczaj przerwana przez co najmniej 1 intron, a czasami moe ich by nawet 50. Dokadna znaczenie intronw nie jest poznane, jednak przypuszczalnie ich obecno przyspiesza reanaracje genetyczne przez rekombinacj, co przekada si na przyspieszenie ewolucji funkcji biologicznych. Eukariotyczne transkrypty pierwotne maj posta hnRNA, zawierajcego odcinki komplementarne do intronw, natomiast transkrypty ostateczne (mRNA), bezporednio podlegajce translacji, s ich pozbawione. Produkty transkrypcji ulegaj wic jeszcze przed opuszczeniem jdra komrkowego obrbce nukleolitycznej, okrelanej jako skadanie (ang. splicing) RNA, a polegajcej na usuniciu intronw i spojeniu eksonw. W wyniku skadania dua cz ( ) syntetyzowanego w jdrze RNA nie opuszcza tego organellum i nie dostaje si do cytoplazmy, lecz ulega wyciciu i strawieniu. Oglnie istniej 4 mechanizmy reakcji skadania RNA, ale u Eucariota wystpuje gwnie jeden. Sekwencje intronw, cho generalnie bardzo heterogenne, zawieraj konserwatywne sekwencje w miejscach spojenia z eksonami oraz w miejscach rozgazienia, zlokalizowanego 20 30 nukleotydw od miejsca spojenia 3 (granicy intron / ekson). W procesie skadania RNA bierze udzia maoczsteczkowe jdrowe RNA (snRNA). Ta klasa RNA wystpuje gwnie w poczeniach z biakami jako kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP), zlokalizowane zarwno w jdrze, jak i w cytoplazmie. Jego funkcj jest wspomaganie przeksztace mRNA oraz regulacja ekspresji genw. snRNA U1-2 i 4-6 bior udzia w procesie skadania RNA, U4 i 6 dodatkowo w obrbce ogona poli(A), a U7 w tworzeniu prawidowego koca 3 histonowego mRNA (brak ogona poliadenylowego). Skadanie RNA zachodzi w strukturze zwanej spliceosomem. Skada si ona z pierwotnego transkryptu, 5 rodzajw snRNA (U1, 2, 5, 4/6) oraz ponad 50 biaek cao tworzy kompleks zwany maym kompleksem nukleoproteinowym (snRNP, snURP), ktry ustawia hnRNA w taki sposb, aby mogo zaj spajanie eksonw. Czsteczki snRNA i biaek pomagaj w tworzeniu pproduktw i peni funkcje katalityczne (rybozymy). Wpierw U1 wie si z 5-kocem granicy ekson / intron (dawca, strona lewa) i nacina to miejsce. Nastpnie U2 wie si do miejsca rozgazienia, zlokalizowanego nieco przed kocem 3 tego intronu i zawierajcego sekwencj: PyNPyPyPuAPy (Py to pirymidyny, a Pu puryny), eksponujc wystpujc w tej sekwencji nukleofilow reszt A. Jest ona zwykle pooona 28 37 nukleotydw w gr od 3 koca danego intronu. Dalej przycza si kompleks U5/4/6, po czym nastpuje zalene od ATP rozplecenie i dysocjacja U4/6 U4 uwalnia si, a U6 wchodzi w interakcj z U2 i U1, zbliajc je do siebie. Reaktywna reszta adenylylowa, zbliajc si do 5-koca, przeprowadza na nukleofilowy atak, w wyniku czego tworzy si ptla (struktura lassa), zawierajca wyjtkowe wizanie 5,2-fosfodwuestrowe; reakcj t wzmacnia U5. Nastpnie dochodzi do drugiego nacicia, tym razem na 3-kocu granicy intron / ekson (biorca lub strona prawa). W tej drugiej reakcji transestryfikacji grupa 3OH poprzedniego eksonu atakuje reszt 5{P} na granicy ekson / intron. Struktura lassa zostaje wwczas odrzucona i ulega rozkadowi. Wolne koce najbliszych eksonw utrzymywane s przez kompleks U2/6, a ostatecznie ulegaj ligacji (spojeniu), dajc cige pasmo. W genach zawierajcych liczne introny powyszy cig reakcji ulega powtrzeniu, przy czym introny nie musz by wycinane kolejno w kierunku 53. W procesie skadania pierwotnego transkryptu genu podzielonego mog powstawa rne czsteczki mRNA. Zjawisko o okrela si jak alternatywne skadanie (alternatywny splicing) i jest zwizane ze swoistoci tkankow i rozwojow ekspresji genw. Zoono procesu skadania sprzyja zaburzeniom hierarchicznego porzdku relacji ekson intron i powstawaniu rnych form mRNA z tego samego transkryptu. Dochodz do tego alternatywne punkty donorowe (5) i akceptorowe (3), moliwoci selektywnego wyboru eksonw, miejsca terminacji, przecinania i poliadenylacji, powikszajce heterogenno mRNA. Tkankowo-swoista regulacja ekspresji genw moe by osignita przez sekwencje kontrolne w promotorach albo przez uyciu alternatywnych promotorw. Przykadowo geny glukokinazy (GK) w wtrobie i w komrkach trzustki rni si skadem produktw i lokalizacj promotorw: promotor genu GK komrek i

151 - -

ekson 1B s pooone ok. 30 kbp w gr (przed) od promotora wtrobowego i eksonu 1L. Kady z promotorw ma odmienn struktur i podlega odmiennej regulacji. Pozostae eksony (2 10) w obu genach s identyczne. Zaburzenia skadania RNA s przyczyn co najmniej jednej postaci -talasemii choroby, w ktrej gen -globiny jest silnie wytumiony i podlega zbyt maej ekspresji. d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA Wiele typw RNA ulega modyfikacjom potranskrypcyjnym. W przypadku mRNA jest to dodawanie czapeczki metylacyjnej na koniec 5 i ogona poli(A) na 3 oraz wtrne metylacje zasad. Na 5-kocu nowo syntetyzowanego mRNA obowizkowo tworzona jest czapeczka (ang. cap) metylacyjna w postaci 7-metylo-GTP poczonego przez 3 reszty {P} ze zmetylowanym nukleotydem purynowym. Proces ten zachodzi w obrbie jdra przed transportem do cytozolu. Czapeczka peni potrjn funkcj: chroni przed atakiem 5-egzonukleaz, umoliwia wytworzenie kompleksu RNP w procesie skadania hnRNA oraz bierze udzia w rozpoznawaniu transkryptu przez ukad translacji (por. punkt VIII-4-d i e). By moe ma rwnie udzia w transporcie RNA. Dodawanie ogona poliadenylowego do 3-koca jest fakultatywne (nieobowizkowe) i moe zachodzi albo w jdrze albo w cytoplazmie. Gdy polimeraza RNA II przekroczy region kodujcy koniec 3, endonukleaza RNA przecina pierwotny transkrypt w miejscu ok. 15-20 nukleotydw w kierunku 3 od sekwencji AAUAAA, ktra wydaje si by sygnaem dla przecicia transkryptw eukariotycznych. Nastpnie na tak powstay 3koniec dziaa polimeraza poli(A), dodajc krtki ogon, ktry nastpnie moe by wyduany do nawet 200 250 reszt A. Funkcja ogona obejmuje m. in. ochron przed atakiem 3-egzonukleaz, co nie ma wpywu na transport do cytoplazmy. W cytoplazmie dugo ogona moe by skracana lub wyduana, co nie ma jednak wpywu na stabilno mRNA. Wtrne metylacje zasad, gwnie grupy 2-OH lub atomu azotu N6 adeniny, zachodz w cytoplazmie. Informacja niesiona przez DNA moe by zmieniona na poziomie mRNA w procesie jego korekty tzw. redagowania (ang. editing) wwczas kodujca sekwencja mRNA rni si od odpowiadajcej sekwencji DNA. Przykadem jest synteza apoB w wtrobie gen podlega transkrypcji i translacji do biaka apoB100 (nazwa z powodu masy ok. 100 kDa), natomiast w jelicie deaminaza C katalizuje konwersj CU, co zmienia kodon CAA (Glu) na UAA (sygna terminacji translacji stop). W wyniku tego powstaje o wiele krtsze biako apoB48 (48 kDa). Podobnie zachodzi zamiana Gln Arg w receptorze Glu. e) transkrypcja genw tRNA i rRNA

DNA-zalena polimeraza RNA III przepisuje geny klasy III, tj. tRNA i 5S rRNA. Rozpoznaje ona promotor wewntrz genu podlegajcego transkrypcji, a nie przed nim. U Eucariota obecne s 2 oddzielne wewntrzne bloki sekwencji (A i B), funkcjonujce jako promotor wewntrzgenowy. Sekwencje te w dojrzaej czsteczce tRNA znajduj si w obszarach konserwatywnych ptli DHU i TC. Punkt startu transkrypcji znajduje si 10 16 bp przed blokiem A, za optymalna dla funkcji promotora odlego A-B wynosi 30 40 bp. Dla genu 5S rRNA istnieje swoisty biakowy czynnik transkrypcyjny, umoliwiajcy dopasowanie miejsca katalitycznego polimerazy III do miejsca startu transkrypcji na DNA. Zarwno u Procariota jak i Eucariota czsteczki tRNA transkrybowane s jako due czsteczki prekursorowe, ktre nastpnie poddawane s obrbce nukleolitycznej. Ponadto tRNA musi by precyzyjnie zoone z powodu obecnoci pojedynczego intronu w pobliu fragmentu docelowo tworzcego rami antykodonowe. Nukleazy przeksztacajce prekursory tRNA kieruj si prawdopodobnie jego struktur III-rz., a nie I-rz., dlatego przeksztacane s jedynie czsteczki zdolne do odpowiedniego sfadowania. Modyfikacje potranskrypcyjne tRNA obejmuj modyfikacje (alkilacj) nukleotydw oraz doczenie kocwki CCA do 3-koca przez transferaz nukleotydylow. Rybosomalny RNA (rRNA) stanowi niebiakowy skadnik rybosomw, odpowiedzialny za formowanie ich struktury, wizanie mRNA oraz udzia w translacji. Znane s 4 rodzaje rRNA: 5S, 5,8S, 18S oraz 28S, z czego wszystkie poza 5S powstaj w wyniku obrbki pojedynczej duej czsteczki prekursorowej 45 S. Geny rRNA zlokalizowane s w jderku, w liczbie setek kopii w kadym z nich tak dua liczba jest niezbdna do syntezy RNA dla ok. 10 mln rybosomw, potrzebnych do pojedynczego podziau komrkowego. O ile bowiem na pojedynczej czsteczce mRNA moe posta 100 tys. czsteczek kodowanego biaka, to rRNA jest produktem kocowym. Pierwotny transkrypt 45S jest silnie zmetylowany zawiera 65 grup metylowych na rybozach oraz 5 na zasadach (dla prekursora 28S); metylacji ulegaj tylko te jego fragmenty, ktre mog sta si stabilnym rRNA. Nastpnie, wci w obrbie jderka, ulega on hydrolizie (nukleolizie) w serii reakcji katalizowanych przez endoi egzonukleazy, w wyniku czego degradowana jest niemal poowa transkryptu. Rybonukleazy specyficzne dla rRNA odcinaj z 5-koca prekursora 45S fragment, dajc prekursor 32S; nastpnie w jego obrbie rozcinany

152 - -

jest odcinek czcy materia dla 18S oraz 5,8S, po czym eliminowane s jego pozostaoci. Ostatecznie rozdzielane s sekwencje 5,8S oraz 28S. W czasie przeksztacania rRNA zachodzi dalsza metylacja, 28S oraz 5,8S cz si na terenie jderka z biakami rybosomalnymi, tworzc du (60S) podjednostk rybosomaln, za 18S, po poczeniu z biakami, wchodz w skad podjednostki maej (40S). Rybosom ssakw (4,3 MDa, 80S) skada si z dwch podjednostek. Wiksza z nich (2,8 MDa, 60S) zawiera czsteczki rRNA: 5 S, 5,8 S i 28 S, a take ok. 50 acuchw polipeptydowych, za mniejsza (1,4 MDa, 40S) rRNA 18 S i ok. 30 acuchw biakowych. Rybosom bakteryjny jest mniejszy od eukariotycznego (70S), ale rwnie skada si z podjednostki mniejszej (30S) i wikszej (50S). Rni si rwnie pod wzgldem regulacji (por. punkt VIII-4-e ). 4. Translacja biosynteza biaek

Translacja jest procesem syntezy biaka w oparciu o informacje zawarte w mRNA. Podczas translacji sekwencja nukleotydw w mRNA tumaczona jest na sekwencj aa w syntetyzowanym biaku; sposb w jaki odbywa si to tumaczenie okrela si kodem genetycznym. Poniewa w procesie tym matryca i aa nie maj ze sob bezporedniego kontaktu, musi istnie czsteczka poredniczca, kontaktujca si z jednej strony z nukleotydami, a z drugiej z aa czsteczk t jest tRNA. a) kod genetyczny

mRNA zawiera 4 rodzaje nukleotydw (A, U, G, C). Za pomoc pojedynczego nukleotydu mona wic zakodowa informacj o 4 czsteczkach, za pomoc dwu (dublet) o 42 = 16, trzech (tryplet) 43 = 64 itd. Poniewa kodowanych jest 20 aa biakowych, tote informacja o kadym z nich musi by zapisana przez 3 nukleotydy. Tryplet nukleotydowy kodujcy pojedynczy aa okrela si jako kodon. System przeoenia kodonu na aa okrelany jest kodem genetycznym; posiada on kilka istotnych cech: jednoznaczno, determinacja oznacza, e dany kodon koduje tylko jeden okrelony aa; cecha ta jest konsekwencj przyczania pojedynczej czsteczki aa do tRNA (por. dalej) nadmiarowo, degradacja, niejednoznaczno oznacza, e powysza regua jednoznacznoci nie dziaa w drug stron, tzn. rne kodony mog kodowa ten sam aa, np. Ser jest kodowana przez a 6 rnych kodonw; gwn przyczyn degradacji kodu jest niewielkie znaczenie ostatniego (3.) nukleotydu w determinacji kodowanego aa (por. dalej) brak nakadania si skrajne nukleotydy ssiadujcych kodonw stykaj si ze sob, lecz nigdy nie pokrywaj; innymi sowy ostatni nukleotyd kodonu poprzedniego nie moe by jednoczenie pierwszym nukleotydem kodonu nastpnego; zasada ta jest zamana jedynie u pewnych wirusw bezprzecinkowo pomidzy kodonami nie wystpuj przerwy, inaczej mwic: kady nukleotyd wchodzi w skad jakiego kodonu, nie wystepuj fragmenty niekodujce trjkowo poniewa jeden aa kodowany jest przez 3 nukleotydy kolinearno kodujce nukleotydy s uoone liniowo, a czsteczka mRNA nie zawiera rozgazie poredni charakter kodujce nukleotydy nigdy nie kontaktuj si z odpowiadajcymi im aa uniwersalno wszystkie ywe komrki tumacz kodony w ten sam sposb; zasada ta nie jest cisa, gdy istniej pewne rnice midzy kodem cytoplazmatycznym a mitochondrialnym, nawet tej samej komrki, jak rwnie midzy kodami poszczeglnych gatunkw por. tabela: kodon AUA, AUU cytoplazma Ile mitochondrium ssaki Met drode * bakterie Ile * Neurospora spp. i Aspergillus spp. UGA stop Trp AGA, AGG Arg stop Arg

Tabela kodu genetycznego (1, 2, 3 kolejne zasady kodonu):

1. 2. 3. U C A G U U Phe Phe Leu Leu C Ser Ser Ser Ser A Tyr Tyr stop stop G Cys Cys stop Trp U Leu Leu Leu Leu C Pro Pro Pro Pro C A His His Gln Gln G Arg Arg Arg Arg U Ile Ile Ile Met* C Thr Thr Thr Thr A A Asn Asn Lys Lys G Ser Ser Arg Arg U Val Val Val Val C Ala Ala Ala Ala G A Asp Asp Glu Glu G Gly Gly Gly Gly

* kodon startowy (por. dalej)

153 - -

b) budowa tRNA i aktywacja aa RNA transportujcy (tRNA) wyrnia si wrd wszystkich RNA najmniejsz czsteczk ok. 75 nukleotydw. Podobnie jak mRNA ulega on obrbce na terenie jdra. tRNA peni funkcje adaptacyjne odczytuje informacj zawart w sekwencji nukleotydw mRNA i tumaczy j na sekwencj aa syntetyzowanego biaka. Zdolno ta jest konsekwencj niejako dwubiegunowej budowy tRNA z jednej strony posiada on sekwencj komplementarn do kodonu mRNA (antykodon), z drugiej za wie odpowiedni aa. Poniewa do pojedynczego tRNA moe przyczy si tylko jeden okrelony aa, tote w komrce musi istnie co najmniej jeden rodzaj tRNA dla kadego aa, czyli cznie dla wszystkich aa co najmniej 20 rodzajw tRNA. Struktura Irzdowa tRNA warunkuje fadowanie czsteczki wewntrzna komplementarno zasad umoliwia im parowanie i tworzenie II-rzdowej struktury licia koniczyny, w obrbie ktrej mona wskaza 4 gwne ramiona. Kade z ramion posiada szypu z kilku sparowanych zasad oraz zakoczone jest ptl. Przyciganie si skrajnych ramion powoduje zgicie caej czsteczki, tak i przestrzennie przypomina ona odwrcon liter L (struktura III-rz.). Rami akceptorowe (szypua 7 bp) zakoczone jest sekwencj CCA, do ktrej kocowego nukleotydu przycza si swoj grup karboksylow swoista reszta aa. Rami DHU (szypua 3-4 bp) zawiera zmodyfikowany nukleozyd dihydrourydyn (std nazwa). Jest istotne dla waciwego rozpoznania danego rodzaju tRNA przez odpowiedni syntetaz aa-tRNA, gdy zawiera sekwencj rozpoznawaln przez t ostatni. Rami antykodonowe (szypua 5 bp) zawiera sekwencj 7 nukleotydw: 3-N-Pu*XYZPyPy-5 (N dowolny nukleotyd, Pu* zmodyfikowana puryna, Py pirymidyna), z ktrych 3 rodkowe (XYZ) stanowi antykodon, tj. sekwencj komplementarn do kodonu na mRNA. Odpowiada ona za swoisto mRNA. Kodon i antykodon s antyrwnolege pod wzgldem komplementarnoci. Degeneracja kodu genetycznego zwizana jest g. z ostatnim nukleotydem kodonu, co sugeruje jego mniej precyzyjne poczenie z komplementarnym nukleotydem antykodonu. Wyjania to tzw. hipoteza tolerancji, zgodnie z ktr w tym miejscu kodon i antykodon s w stanie rozchwiania, tak i kilka kodonw kodujcych ten sam aa moe si wiza z tym samym antykodonem, nawet pomimo braku midzy nimi komplementarnoci. Translacja kodonu jest wic mao wraliwa na zmiany w pozycji 3. Rami TC (szypua 5 bp) zawiera tymin, niespotykan normalnie w RNA oraz pseudourydyn, rnic si od urydyny wizaniem N-glikozydowym pomidzy atomem C5, a nie C1, uracylu. Bierze ono udzia w wizaniu aa-tRNA do powierzchni rybosomu. Rami dodatkowe jest najbardziej heterogennym fragmentem caej czsteczki, a jego dugo stanowi kryterium klasyfikacji tRNA na dwie kwasy: klasa 1 (75% tRNA) zawiera krtk (3-5 bp) ptl dodatkow, za klasa 2 dug ptl (13-21 bp) oraz struktur ptla szypua. Reakcje przenoszenia aa na odpowiedni tRNA katalizowane s przez 20 rnych enzymw, zwanych wsplnie syntetazami aminoacylo-tRNA (aa-tRNA). Reakcja rozpoznawania i doczania aa jest dwuetapowa: wpierw powstaje aktywny kompleks poredni aminoacylo-tRNA-enzym, ktry nastpnie rozpoznaje swoisty tRNA i przenosi reszt aa na jego grup 3OH: aa + ATP + enzym enzym-AMP-aa + PPi enzym-AMP-aa + tRNA enzym + AMP + aa-tRNA Powstae wizanie estrowe utrzymuje si a do czasu wprowadzenia reszty aa w sekwencj syntetyzowanego na rybosomie polipeptydu. c) budowa i funkcje rybosomw (patrz rwnie punkt VIII-3-e)

Organellum komrkowym, w ktrym odbywa si translacja, jest rybosom. Spotykaj si tu rne czsteczki, aby ostatecznie da produkt w postaci nowo zsyntetyzowanego biaka. Pojedyncza czsteczka mRNA moe by jednoczenie uywana przez wiele rybosomw zespoy takie okrela si jako polirybosomy (polisomy). Poszczeglne rybosomy wi si do mRNA w odlegociach nie mniejszych ni 80 nukleotydw. Wielko polisomw, tj. liczba rybsomw zwizanych z mRNA, zaley bezporednio od dugoci tego ostatniego. Polisomy przyczone do bon tworz szorstk siateczk rdplazmatyczn (ang. rough endoplasmatic reticulum RER), suc do syntezy integralnych biaek bonowych oraz biaek eksportowanych poza komrk lub magazynowanych jako zymogeny w aparacie Golgiego, czekajc na eksport. Rybsomy wolne, tj. obecne w cytoplazmie i niezwizane z bonami, uywane s do syntezy wasnych biaek cytoplazmatycznych komrki.

154 - -

d) etapy translacji Proces translacji skada si z inicjacji, elongacji i terminacji. Informacja genetyczna odczytywana jest w kierunku 53, a polipeptyd syntetyzowany od N do C-koca. Polarno procesu translacji umoliwia organizmom prokariotycznym na rozpoczcie translacji jeszcze przed ukoczeniem transkrypcji do powstaego fragmentu 5 mRNA szybko przyczaj si rybosomy i rozpoczynaj syntez polipeptydu. inicjacja i regulacja translacji

Inicjacja translacji obejmuje zoenie aparatu translacyjnego, w skad ktrego wchodz: mRNA, tRNA, rRNA i biaka rybosomalne oraz czynniki inicjujce. Podczas translacji zuywane s: ATP, GTP i aa. U Procariota istniej 3 czynniki inicjujce (ang. initiation factors IF): IF1, IF2 i IF3. W pierwszym etapie inicjacji czynniki te przyczaj si do mniejszej podjednostki rybosomu (30S), przy czym IF2 zwizany jest z GTP. Czynniki 1 i 3 uniemoliwiaj przyczenie podjednostki wikszej (50S), za 2 (+ GTP) odpowiada za przyczenie formylo-Met-tRNA. Nastpnie IF3 i Mg2+ uatwiaj przyczenie mRNA. Do kodonu startowego (AUG, GUG, UUG wszystkie 3 koduj formylometionin) przycza si formylo-Met-tRNA, po czym czynnik IF3 oddysocjowuje, co pozwala na przyczenie si podjednostki wikszej i powstanie kompletnego rysobomu (70S). Tak przygotowany aparat jest gotowy do elongacji. U Eucariota natomiast wystpuje co najmniej 10 eukariotycznych czynnikw inicjacji (ang. eucariotic IF eIF), zoonych z licznych podjednostek. Proces inicjacji skada si tu z 4 faz. W pierwszej fazie rybosom (80S) dysocjuje na dwie podjednostki (40S i 60S). Do mniejszej (40S) wi si eIF3 i eIF1A, co sprzyja dysocjacji oraz zapobiega reasocjacji. Podobny efekt wywiera zwizanie eIF3A z wiksz (60S). W drugiej fazie tworzy si kompleks preinicjacyjny (PIC). eIF2 wie GTP powstay kompleks startowy inicjacji wie Met-tRNA Si, ktry z kolei czy si z kodonem startowym AUG (kodujcym Met). Symbol Si (start inicjacji) oznacza startowy tRNA dla Met, ktry rni si od tRNA dla Met wprowadzanej do polipeptydu podczas elongacji. Potrjny kompleks czy si z podjednostk mniejsz (40S), tworzc PIC 43S, stabilizowany przez eIF3 i eIF1A. eIF2 bierze udzia w regulacji syntezy biaka jego podjednostka jest fosforylowana (reszta Ser51) przez rne kinazy biakowe (HRC, PKP, GCN2) aktywowane pod wpywem stresu komrki, kiedy przeciwwskazany jest wydatek energetyczny na biosyntez biaek. Do czynnikw stresowych komrki nale: brak aa lub glukozy, infekcja wirusowa, brak surowicy, hiperosmolalno, szok cieplny). Ufosforylowana podjednostka wie , nie pozwalajc na wymian GTP / GDP i utworzenie PIC. W fazie trzeciej powstaje waciwy kompleks inicjacyjny. Czapeczka metylacyjna na kocu 5 mRNA uatwia jego wizanie do PIC 43S. Do niej bezporednio przycza si kompleks eIF4F, zoony z eIF4E (miejsce wizania), 4G i 4A. Nastpnie eIF4A i 4B redukuj struktur II-rzdow kompleksu na 5 kocu mRNA dziki swojej aktywnoci ATPazy i helikazy zalenej od ATP. Kompleks przeszukuje mRNA w poszukiwaniu kodonu inicjacyjnego AUG (dokadniej: sekwencja Kozaka o skadzie GCCA/GCC-AUG-G). eIF3 wie si do eIF4G i czy cay kompleks z podjednostk 40S w kompletny kompleks inicjacyjny 48S. Ostatecznie w czwartej fazie eIF5 hydrolizuje GTP zwizan eIF2, co uwalnia czynniki inicjacyjne zwizane z kompleksem inicjacyjnym (podlegaj one recyrkulacji) i prowadzi do spontanicznej asocjacji podjednostek rybosomalnych 40S i 60S w 80S. Met-tRNA znajduje si w miejscu P rybosomu i jest gotowy do rozpoczcie cyklu elongacji. Szczeglne znaczenie w regulacji inicjacji (i caoci transkrypcji) ma kompleks eIF4F, a waciwie jego dwa skadniki 4E i 4G. eIF4E rozpoznaje i wie si z czapeczk metylacyjn, co ogranicza tempo translacji. Proces ten jest podwjnie regulowany. Po pierwsze grupa biaek wicych ten czynnik 4E-BP1 (PHAS1), BP2 i BP3 uniemoliwia mu poczenie si z 4G i utworzenie kompleksu 4F (regulacja negatywna). Po drugie liczne mitogeny (insulina, IGF-1, PGDF, IL-2, angiotensyna II) aktywuj kinazy zwikszajce aktywno eIF4E (regulacja pozytywna): z jednej strony aktywuj komponent szlaku MAPK, ktra fosforyluje sam 4E (Ser209 lub Thr210), tak i ma wiksze powinowactwo do czapeczki 5, a z drugiej aktywuj serynow kinaz biakow aktywn w szlaku mTOR, ktra fosforyluje 4E-BP w 5 unikatowych miejscach, przez odcza si ono od 4E i nie przycza ponownie a do cakowitej defosforylacji. eIF4G wie si natomiast do eIF3, ktry czy kompleks do 40S oraz do 4A i 4B, czyli kompleksu ATPaza ATP-zalena helikaza, uniemoliwiajc rozplecenie mRNA (regulacja negatywna).

155 - -

elongacja

U Procariota wystpuj 3 czynniki elonacyjne: EF-Tu, EF-Ts oraz EF-G. Na pocztku elongacji pojawiaj si one kolejno, przy czym pierwszy zwizany jest z GTP i wie aa-tRNA, a funkcj drugiego jest regeneracja pierwszego. W kompleksie translacyjnym wyrnia si miejsce P (peptydowe), w ktrym pocztkowo obecny jest formylo-Met-tRNA oraz A (akceptrowe), do ktrego przycza si na zasadzie komplementarnoci odpowiedni aa-tRNA. Nastpnie EF-Tu zwizany z GDP zostaje wyparty z kompleksu przez EF-Ts, tak e moe wymieni GDP na GTP i powrci. Aktywno peptydylotransferazy przenosi 1. aa formylo-Met na 2., wytwarzajc midzy nimi wizanie peptydowe. Powstay dwupeptyd zwizany jest z tRNA w miejscu A, za wolny tRNA z miejsca P usuwa si z kompleksu. Translokaza (EF-G) przesuwa wwczas tRNA z przyczonym dwupeptydem w miejsce P, a do miejsca A wchodzi nastpny odpowiedni aa-tRNA. Cykl ten powtarza si tyle razy, ile kodonw zawiera mRNA. U Eucariota elongacja przebiega analogicznie jak u Procariota, z tym e katalizowana jest przez eukarotyczne czynniki elongacji (eEF) eEF1, eEF1 oraz eEF2. Rybosom eukariotyczny rwnie posiada miejsce P, zajte pocztkowo przez Met-tRNA Si oraz A, pocztkowo wolne. eEF1, tworzc kompleks z GTP, umoliwia wejcie odpowiedniego aa-tRNA w wolne miejsce A. Jednoczenie od GTP odcza si fosforan, pozostawiajc eEF1-GDP, ktry odcza si, ale wraca po wymianie GDP na GTP. Gdy w miejscach A i P rybosomu znajduj si aa-tRNA, tworzone jest wizanie peptydowe: grupa -aminowa nowego aa-tRNA przeprowadza nukleofilowy atak na estryfikowan grup -karboksylow peptydylo-tRNA. Reakcja ta katalizowana jest przez komponent biakowy podjednostki 60S peptydylotransferaz albo przez skadnik RNA (by moe 23S rybozym). Rosncy acuch peptydowy zostaje przeniesiony na tRNA w miejscu A. W miejscu P znajduje si wwczas czsteczka tRNA pozbawiona reszty aa, ktra szybko stamtd oddysocjowuje. eEF2 i GTP odpowiadaj za translokacj nowo utworzonego peptydylo-tRNA z miejsca A do zwolnionego P, co wie si z hydroliz GTP GDP + {P}. Jednoczenie miejsce A zostaje zwolnione i moe si z nim zwiza kolejny aa-tRNA. Translokacji towarzyszy przesunicie rybosomu wzgldem mRNA o 3 nukleotydy, tak i w miejscu A znajduje si kolejny kodon. Elongacja prowadzona jest z prdkoci 6 aa/s u Eucariota i 3 x szybciej u Procariota. Bilans energetyczny jednego cyklu elongacji: zwizanie reszty aa z tRNA: ATP AMP = 2 ATP 2 ADP wejcie aa-tRNA w miejsce A: GTP GDP translokacja: GTP GDP Zatem synteza jednego wizania peptydowego zuywa cznie 4 wizania wysokoenergetyczne. terminacja

Terminacja translacji zachodzi, gdy w miejscu A znajdzie si jeden z kodonw nonsensownych (stop: UAG amber, UGA opal lub UAA orche). Dla takich kodonw nie istniej adne swoiste tRNA, sygna ten jest natomiast rozpoznawany przez czynniki uwalniajce (ang. releasing factors RF). U bakterii s to: RF1 (dla UAA lub UAG), RF2 (dla UAA lub UGA) oraz RF3, aktywujcy oba poprzednie, u Eucariota za eukariotyczne czynniki uwalniajce (ang. eucariotic RF eRF). Wchodz one w miejsce A i, wraz z GTP i peptydylotransferaz, przenosz na peptydylo-tRNA w miejscu P czsteczk wody, przez co powoduj hydroliz wizania pomidzy peptydem a tRNA, ktre ulegaj uwolnieniu. Ostatecznie czynniki uwalniajce i translokaza powoduj rozpad kompleksu na elementy skadowe podjednostki rybosomalne, mRNA i tRNA, ktre mog ponownie wchodzi do cyklu. e) regulacja i inhibitory translacji

Ukad translacyjny gospodarza wykorzystywany jest przez wirusy do syntezy wasnych biaek. Czasem wirusowe mRNA ulega bardziej wydajnej translacji ni gospodarza (np. mengovirus), a czasem powstaje w nadmiernych ilociach, konkurujc z mRNA gospodarza o dostp do aparatu translacyjnego (np. HSV1, reowirusy). Niektre wreszcie hamuj syntez biaek komrkowych przez blokad poczenia mRNA i 40S. Pikornawirusy (piko-RNA-wirusy czyli bardzo mae wirusy RNA; np. wirus polio) zaburzaj funkcje kompleksu 4F, a ich mRNA nie posiada czapeczki 5, lecz miejsce IRES (ang. initial ribosomal entry site), wymagajce 4G zamiast 4E. Proteaza wirusowa atakuje 4G i 4E, dlatego nie powstaje kompleks 4F i 40S nie czy si z komrkowymi mRNA (z czapeczk). 4G czy si za to z miejscem IRES wirusowego mRNA, ktrego translacja jest w tej sytuacji promowana. Ponadto wirusy te pobudzaj defosforylacj BP1, dodatkowo zmniejszajc translacj komrkowego mRNA. Egzotoksyna maczugowca bonicy (Corynebacterium diphtheriae) katalizuje ADP-rybozylacj eEF2, wykorzystujc jako donor NAD+, przez co blokuje translacj.

156 - -

Rycyna (toksyna nasion rcznika) inaktywuje eukariotyczny 28S rRNA albo przez rozcicie wizania Nglikozylowego albo przez odczenie reszty A. Rnica midzy rybosomami bakteryjnymi (70S) a eukariotycznymi (80S) umoliwia opracowanie i syntez kilku klas antybiotykw bakteriostatycznych, hamujcych syntez biaek bakteryjnych i uniemoliwiajcych ich rozwj. Hamowanie podjednostki mniejszej (30S) to zasada dziaania aminoglikozydw i tetracyklin, za wikszej (50S) makrolidw i ketolidw, linkozamidw, streptogramin, oksazolidynonw i chloramfenikolu. Zwizkami blokujcymi podjednostki rybosomalne, ktre pozbawione s znaczenia klinicznego, s puromycyna i cykloheksamid. Puromycyna jest analogiem Tyr-tRNA powoduje przedwczesne uwolnienie syntetyzowanego peptydu, hamujc translacj zarwno na rybosomach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Cykloheksamid natomiast blokuje syntez biaek tylko u Eucariota przez hamowanie aktywnoci peptydylotransferazy w podjednostce 60S. Translacja moe by mechanizmem obronnym organizmu. Przykadowo obecno elaza uwalnia biako cytozolowe, ktre wie si z sekwencj nie tumaczc blisko koca 5 mRNA ferrytyny, stymulujc jego translacj. Konsekwentny wzrost ferrytyny wie jony elaza, nie dopuszczajc do osignicie przeze poziomu toksycznego (por. punkty III-7 RFT oraz VII-3 gospodarka elazem). f) potranslacyjne modyfikacje biaek

Wiele biaek powstaych w wyniku translacji odpowiednich mRNA stanowi dopiero nieaktywne czsteczki prekursorowe, wymagajce do aktywacji obrbki potranslacyjnej. Modyfikacje potranslacyjne mona podzieli na strukturalne i regulacyjne, w zalenoci od zmienianych waciwoci biaek. Do pierwszej grupy nale m. in.: glikozylacja (patrz punkt IV-7-b), hydroksylacja (por. VII-8-b) i acylacja, do drugiej za obrbka proteolityczna i fosforylacja (por. II-4-b), acetylacja, metylacja i ADP-rybozylacja (por. punkt VIII-1-d). Do biaek mog by rwnie doczane atomy metali (por. II-2-f) czy grupy barwnikowe (por. I-3-e). 5. Mitochondrialne DNA (mtDNA)

Niemal cay materia genetyczny komrki znajduje si na terenie jej jdra. Istniej jednak organella posiadajce wasny DNA s to mitochondria, zawierajce mtDNA, a u rolin rwnie chloroplasty (chlDNA). Obecno wasnego materiau pozwala im na niezalene podziay, dlatego okrela si je mianem organelli autonomicznych. Teoria endosymbiozy gosi, e powstay one w wyniku wniknicia probakterii do komrek prokariotycznych. Czsteczki mtRNA w rnych mitochondriach tej samej komrki, a nawet w tym samym mitochondrium, mog si od siebie rni, co okrela si jako heteroplazmia. U ssakw mtDNA dziedziczony jest niemal wycznie w linii eskiej (dziedziczenie matczyne), a mitochondria plemnika s niszczone we wczesnych fazach rozwoju zygoty. Podczas podziau komrki mitochondria s losowo rozdzielanie do komrek potomnych (tzw. przypadkowa segregacja mitotyczna). Pozajdrowy DNA wystpuje jako dwuniciowe czsteczki koliste, czyli genofory. Pojedyncze ludzkie mitochondrium zawiera 4 10 kolistych czsteczek DNA. Kada z nich ma dugo 16569 bp i zawiera 37 genw, z czego 13 koduje enzymy acucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej (podjednostki syntazy ATP, dehydrogenazy NADH oraz oksydazy cytochromu c; por. punkty III-5 i 6), 22 tRNA, a 2 rRNA. Jest to o wiele za mao, aby pozwoli na w peni samodzielne funkcjonowanie wikszo biaek w obecnych w mitochondriach kodowanych jest przez genom jdrowy, syntetyzowanych w cytoplazmie i importowanych do miejsc docelowych. Z tego wzgldu poprawniejsze byoby okrelenie mirochondriw jako organella pautonomiczne. Z dwu pasm mtDNA jedno okrela si jako cikie (H), drugie za lekkie (L). Na obydwu z nich zlokalizowane s geny, przy czym na nici L transkrypcja rozpoczyna si z jednego promotora, a na H z dwch. Geny mitochondrialne nie s podzielone, tj. nie zawieraj intronw, a powstay na nich RNA nie musi by skadany. Mitochondrialny kod genetyczny rni si nieco od jdrowego (patrz punkt VIII-4-a). mtDNA ma znacznie wysze tempo mutacji ni DNA jdrowy. Przyjmuje si, e wynika to z braku systemw naprawy mitchondrialnego DNA, z braku histonw oraz z obecnoci duej iloci wolnych rodnikw (RFT por. punkt III-8). Mutacje pojawiajce si w mitochondrialnym DNA komrek linii pciowej mog powodowa choroby wystpujce w rodzinie, za mutacje pojawiajce si w komrkach somatycznych mog by zwizane ze spadajc z wiekiem wydolnoci ukadu fosforylacji oksydacyjnej. W tym pierwszym przypadku s to choroby genetyczne dziedziczone w linii matczynej, uderzajce gwnie w tkanki rzadko dzielce si, a o wysokim zapotrzebowaniu energetycznym g. miniow i nerwow. Mutacje czsto nie s jedyn przyczyn chorb, a na ich efekty wpywaj inne, nieznane jeszcze czynniki, najprawdopodobniej sekwencja samego mtDNA, proporcje i dystrybucja do rnych tkanek zmutowanych czsteczek DNA oraz genotyp jdrowy. Niektre choroby mitochondrialne mog by spowodowane wanie mutacjami genomu jdrowego genw kodujcych biaka strukturalne mitochondriw bd regulujce ich prac. Objawy chorb obejmuj najczciej: parali, miopati, utrat siy miniowej, sztywno mini, neuropati, encefalopati,

157 - -

degeneracj jder podstawnych, w niektrych chorobach rwnie cukrzyc, guchot i lepot. Diagnostyka jest trudna, a postpowanie i leczenie wycznie objawowe. Przykady: LHON (dziedziczna neuropatia n. wzrokowego, z. Lebera), NARP (neuropatia obwodowa, ataksja i barwnikowe zwyrodnienie siatkwki), MERRF (padaczka miokloniczna z poszarpanymi tzw. szmatowanymi wknami mm.), MELAS (encefalopatia mitochondrialna, kwasica mleczanowa, napady udaropodobne), CPEO (przewleky postpujcy parali mm. oka), KSS (z. Kearsa Sayrea), z. Paersona (szpikowo trzustkowy), z. Leigha. mtDNA wykorzystuje si w antropologii, genetyce populacyjnej i medycynie sdowej. Umoliwia to obecno tzw. nadzmiennych (hiperzmiennych) obszarw mtDNA, czyli fragmentw niekodujcych, rnicych si u poszczeglnych ososbnikw. Wyrnia si 2 regiony hiperzmienne pierwszy (HVR1) obejmuje sekwencj 16024-16365, a drugi (HVR2) 73-340. W antropologii mtDNA suy analizie rozprzestrzeniania si gatunku ludzkiego ze swej pierwotnej kolebki Afryki rodkowej na pozostae kontynenty. Ponadto badanie mtDNA pochodzcych od ludzi w rnych grup etnicznych pozwolio na obliczenie, e kobieta, od ktrej pochodzi genom mitochondrialny wszystkich yjcych obecnie ludzi (tzw. mitochondrialna Ewa) ya ok. 200 tys. lat temu. Podstaw bada nt. neandertalczyka s rwnie prbki mtDNA. W medycynie sdowej suy ono natomiast identyfikacji osb (rwnie nieznanych zwok) i ustalaniu midzy nimi pokrewiestwa.

158 - -