Practica #4 Mtodos de cultivo y aislamiento de bacterias

Introduccin: Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para caracterizar su crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus actividades metablicas. Un medio de cultivo es una solucin acuosa de diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los microorganismos para crecer. Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios lquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin, as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es importante recordar que la inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre debern realizarse en zona asptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. Las tcnicas de aislamiento, permiten la obtencin de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, as como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros estn formados por solo un tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades de tincin, actividad bioqumica, patogenidad, sensibilidad a antibiticos e identificacin de las especies microbianas. El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de dilucin, en medios slidos por estra en placa o en medios lquidos. En el primer caso se considera que cada clula bacteriana que se separa dar origen a una poblacin que formara una colonia caracterstica, visible a simple vista. La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin, es que no es prctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de interes se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se obtendrn las bacterias dominantes. Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican mtodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y se conocen como selectivos o de enriquecimiento. En ocasiones se pueden agregar los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorante, indicadores, etc. Para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiestan por cambios en la apariencia o modificacin del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterizacin e identificacin de especies bacterianas. Materiales 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo 2 Cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno

2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 1 tubo con agua destilada estril 2 tubos con caldo nutritivo 4 tubos con Agar Nutritivo 1 Mechero 1 Asa de Inoculacion 1 Parrilla de agitacin 1 Autoclave Procedimiento El profesor proporcionara cultivos puro de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas flurorescens, Klebsiella sp. Y Streptococcus sp. Tcnica de estra cruzada a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cierra la caja. b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin hechas. c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras en el segundo cuadrante como en el caso anterior. d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el ultimo cuadrante, no se deber flamear el asa de siembra y se har una estra mas abierta (simple).

Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo 1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar nutritivo inclinado. 2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en forma recta. Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos 1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte un cultivo puro diferente por estra simple. 2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estra cruzada la muestra problema.

Condiciones de incubacin 1. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24-48 horas. De las cajas inoculadas por estra cruzada, seleccionar la colonia ms aislada (generalmente del cuarto cuadrante9. Transferir una pequea muestra de esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo. 2. Incubar los tubos a 35C durante 24-48 horas. Observar la aparicin de colonias y reportar la forma en que se distribuyen a lo largo del tubo. Resultados A. Recopilar la informacin de la caracterizacin colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5. B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema. Cuadro 4 Escherichia coli Aislamiento por estra cruzada Forma: Color: Tamao (mm): Borde: Superficie: Aspecto: Elevacin: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: MEDIO EMB Siembra en medios selectivos y diferenciales MEDIO 110 MEDIO MINIMO Streptococcus sp. Muestra Problema

Microorganismo 1: Forma: Color: Tamao (mm): Elevacin: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia:

Nota: La descripcin colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios.

Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide Borde: entero, lobulado, aserrado Superficie: lisa o rugosa Aspecto de la colonia: hmeda, seca, butirosa Elevacin: convexa, plana, hundida Luz transmitida: Translucida, opaca Luz reflejada: brillante, mate Consistencia: dura, blanda, mucoide. Cuadro 5 Descripcin morfolgica de cultivos puros en tubos de cultivo Escherichia coli Tubos inclinados de Agar nutritivo Streptococcus sp Muestra Problema

Crecimiento: arborescente, filiforme, rizoide, disperso, puntiforme Color: Cultivo en tubo de caldo nutritivo

Crecimiento: superficie como pelcula, como sedimento, turbidez en todo el tubo Color:

Tubos rectos con Agar nutritivo

Crecimiento: en forma de pelcula superficial, a lo largo de la picadura, solo en el fondo Color:

Cuestionario 1. Qu es el agar y de donde se obtiene? Cules son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos? 2. Cul es la composicin qumica de los medios EMB, 110 y MM? Cules son los componentes o propiedades responsables de su funcin como medios selectivos o diferenciales? 3. Por qu el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregaran para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas 4. Cul es la informacin que se obtiene de las siembras de cultivos bacterianos en tubos con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta? 5. Bibliografa consultada