UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC DEPARTAMENTO DE MEDICINA

JULIANO URBANO BOMBASSARO

ANLISE GENOTXICA DO COMPLEXO FOSFATASE CIDA PRPURA SMILE FeCuOHH2BPBPMP EM LEUCCITOS TOTAIS E SANGUE TOTAL HUMANO

CRICIMA, 2007

1 JULIANO URBANO BOMBASSARO

ANLISE GENOTXICA DO COMPLEXO FOSFATASE CIDA PRPURA SMILE FeCuOHH2BPBPMP EM LEUCCITOS TOTAIS E SANGUE TOTAL HUMANO

Trabalho de concluso de curso, apresentado para obteno do grau de Mdico no curso de Medicina da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC. Professor Orientador: Claus Trger Pich.

CRICIMA, 2007

2 JULIANO URBANO BOMBASSARO

ANLISE GENOTXICA DO COMPLEXO FOSFATASE CIDA PRPURA SMILE FeCuOHH2BPBPMP EM LEUCCITOS TOTAIS E SANGUE TOTAL HUMANO

Trabalho de concluso de curso, apresentado para obteno do grau de Mdico no curso de Medicina da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC. Cricima, 28 de novembro de 2007

BANCA EXAMINADORA

Prof. Claus Trger Pich- Mestre-(UNESC)-Orientador

Srgio Costa Leal - Mdico - (UNESC)

Roberto Herzel Jnior- Especialista Obstetrcia (UNESC)

Ao Vento, que me trouxe at aqui, onde pude passar pelas folhas e sentir o cheiro bom, e ver como bom viver..... Creio que este seja a minha vontade.....Aos meus pais que com a Herclea fora de ver minha vitria tudo fizeram para que isso acontecesse, e a todos aqueles que de alguma forma passaram por mim e bem ou mal, fizeram me viver cada momento nico, tornando este momento especial.

4 AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente aos meus pais pela dedicao inabalvel em prol de minha vitria, no apenas pelo patrocnio financeiro, mas moral e afetivo, a eles agradeo simplesmente o fato de existir. Ao meu professor Claus Trger Pich, que pacientemente me orientou, apesar de meus atrasos e falta de padronizao de alguns experimentos, creio que tem sido como um pai para mim aqui em Cricima.... agradeo de corao por incentivar-me em busca da curiosidade, caracterstica essencial de todo pesquisador. Aos meus colegas de laboratrio, Tiago Bortolotto (gold, ou gordinho da balana), Jean Bertoldo (Dedo), Luceli Ficagna, Fernanda (Nanda), Tamires (TATA box), Geverson (Logan), e aos amigos que j deixaram o GPIG, Bruno Castro Caurio, Rodrigo Costa Zeferino (nhonho), Willian Bonelli de Almeida (Calouro), pelos momentos nicos na viagem do conhecimento cientfico. Aos meus colegas de aula, principalmente ao Sandro Bichofe, meu colega de internato que me ajudou a agentar as pontas em pocas difceis da minha vida.... A minha namorada e a sua famlia que me acolheram e viram a confeco deste trabalho.. A eles meu respeito... A ela todo meu AMOR....

Queira, basta ser sincero e desejar profundo, voc ser capaz de sacudir o mundo..vai, tente outra vez Raul Seixas

6 RESUMO

O cncer uma afeco progressiva debilitante e geralmente fatal. Para tanto novos complexos, cada vez mais prximos da fisiologia humana esto sendo preparados para agirem de forma a impedir esta doena de progredir ou em busca da cura. Justificativa: Metalonucleases, como o complexo FeCUoHH2BPBPMP, semelhantes a fosfatases cidas prpuras podem ter ao genotxica, impedindo o crescimento celular, por clivagem do DNA em sua base fosfato. Objetivo geral: Avaliar a genotoxicidade do complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP em leuccitos totais e em sangue total humano. Metodologia: Incubao do complexo com sangue humano total e em leuccitos humanos totais por 1h 30 min, e aps realizao de teste cometa, sendo avaliado estatisticamente por GraphPad 5.0 em ANOVA one way, tcnica de NeuwmanKeuls. Resultados: Genotoxicidade nas concentraes de 10 e 20M em leuccitos, havendo decrscimo da signifincia em concrentraes maiores, assim como observao de nmero crescente de apoptoses conforme aumento da concentrao. Em sangue humano total, genotoxicidade apresentada em 10M no sendo evidenciado em outras concentraes, com aumento do nmero de visualizao de apoptoses quanto maior a concnetrao. Concluso: O complexo FeCUoHH2BPBPMP possui genotoxicidade em baixas concentraes tanto em sangue quanto em leuccitos totais humanos, porm com aumento da citotoxicidade em concentraes maiores devido ao aumento de apoptoses dose dependente.

Palavras Chave: Complexo Heterobinuclear Fosfatase FeCUoHH2BPBPMP, Genotoxicidade, Citotoxicidade, Teste cometa.

cida

smile

Lista de tabelas

Tabela 1: ngulos (angles) e distncias (Bond length) entre terminais do complexo FeIIICuII(BPBPMP)(OAc)2[ClO4]*H2O.(LANZNASTER et al. 2005) .............................18 Tabela 2: ndice e freqncia de dano ao DNA de leuccitos totais isolados incubados com complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP. ...37 Tabela 3 ndice e freqncia de Dano em clulas de sangue total incubados com complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP............40

Lista de figuras

Figura 1 O complexo FeIIICuII(BPBPMP)(OAc)2[ClO4]*H2O. os elipsdies

so

demonstrados com uma probalidade de 40% de acerto. Os tomos de hidrognio foram omitidos para clarificar a estrutura (LANZNASTER et al., 2005)....................................18 Figura 2: Anlise de resduos de espectometria, evidnciando os resduos (1)-723 {[(C34H33N5O2)FeIIICuII(CH3CH2OH)(OH); (2)-692 {[(C34H33N5O2)FeIIICuII(CH3O)-H]+}; (3)677 {[(C34H33N5O2)FeIIICuII(OH)-H]+}; e (4)-661 [(C34H33N5O2)FeIICuII-H]+ O; no demonstrando impurezas de demais complexos.-H]+}LANZNASTER ET AL., 2005. ....20 Figura 3: Classificao de dano ao DNA (De 0, sem fragmentao, seguindo fragmentao dano 4, mxima fragmentao). ...........................................................36 Figura 4: Grfico indicando o indice de dano em Leuccitos totais;...............................38 Figura 5: Grfico representando a freqncia de dano em leuccitos totais..................39 Figura 6: Grfico representando o ndice de dano a leuccitos totais em sangue. ........41 Figura 7 Grfico representando a freqncia de Dano em Leuccitos Totais em sangue total humano aps incubao com o complexo..............................................................42

9 Sumrio

1 INTRODUO .................................................................................................. 11 1.1 rea/Tema................................................................................................................12 1.2 Delimitao do Tema ...............................................................................................12 1.3 Problema ..................................................................................................................12 1.4 Justificativa...............................................................................................................12 1.5 Objetivos ..................................................................................................................13 1.5.1 Objetivo Geral.............................................................................13 1.5.2 Objetivos Especficos..................................................................13 2 FUNDAMENTAO TERICA......................................................................... 15 2.1 Complexos contendo metais de transio................................................................15 2.2 Fosfatases cidas Prpuras e complexos Heterobinucleares..................................15 2.2.1 Fosfatases cidas Prpuras Naturais.........................................16 2.2.2 Fosfatase cida Prpura smile, Heterobinuclear, com Ncleo de Fe3Cu2 17 2.2.2.1 Sntese .................................................................................17 2.2.2.2 Anlise Cristalogrfica por Raio X........................................17 2.2.2.3 Espectrometria de Massa.....................................................19 2.2.2.4 Anlise de Clivagem de DNA ...............................................20 2.2.2.5 Clivagem anaerbica de DNA ..............................................21 2.3 Genotoxicidade e Mutagnese.................................................................................22 2.3.1 Mecanismo de Reparo ao DNA ..................................................23 2.3.2 Antimutagnese..........................................................................24 2.4 Avaliao da Genotoxicidade e Mutagnese ...........................................................25 2.4.1 Ensaio Cometa ...........................................................................25 2.4.2 Teste de Microncleos................................................................25 2.4.3 Teste de ames; -Teste Salmonela I Microssoma........................26 3 Materiais e Mtodos.......................................................................................... 27 3.1 Obteno do Complexo;...........................................................................................27 3.1.1 Obteno das Concentraes do Complexo ..............................27 3.2 Anlise da Genotoxicidade-Ensaio Cometa .............................................................28 3.2.1 Obteno do Sangue Total .........................................................28 3.2.2 Obteno dos Leuccitos Totais.................................................28 3.2.3 Preparao das incubaes com Sangue total...........................29 3.2.4 Preparao das incubaes com Leuccitos Totais...................30 3.2.5 Teste Cometa .............................................................................31 3.2.5.1 Preparao das Lminas .....................................................31 3.2.5.2 Confeco das Lminas.......................................................32 3.2.5.3 Lise da Membrana Celular, Citoplasma, e Carioteca ...........33 3.2.5.4 Imerso em tampo alcalino e Eletroforese .........................33 3.2.5.5 Fixao das Lminas ...........................................................34 3.2.5.6 Colorao das Lminas........................................................34 3.2.5.7 Leitura do teste cometa........................................................34 3.2.5.8 Anlise dos Dados ...............................................................35

10 4 Resultados ........................................................................................................ 37 4.1 ndice e frequncia de Dano ao DNA em lecuccitos Totais humanos ....................37 4.2 ndice e freqncia de Dano ao DNA presente em Sangue total humano ...............39 5 Discusso.......................................................................................................... 43 5.1 ndice e freqncia de dano ao DNA em leuccitos totais isolados em tampo PBS 43 5.2 ndice e freqncia de dano ao DNA em leuccitos totais em sangue humano total 44 5.3 Mecanismos de genotoxicidade/ Citotoxicidade.......................................................44 6 Concluso ......................................................................................................... 46

11

INTRODUO Fosfastases cidas prpuras so produtos encontrados em diversos tipos de

tecidos de animais e vegetais, cuja funo principal realizar a retirada de radicais fosfatos de protenas e demais molculas , podendo interferir de forma direta, via deprotonao da gua em pontes fosfatos presentes no DNA. Tambm possui ao na via das protenas cinases, agindo de maneira antagonista conseqentemente diminuindo a ao metablica e funo celular. As fosfatases cidas podem ser de diversos tipos, sendo as mais conhecidas as metalofosfatases, que por sua vez, possui um ncleo central de ons metlicos, sendo considerado um possvel mecanismo hidroltico por desprotonao da gua e protonao de pontes fosfatos, desestabilizando-as, sendo considerada uma potencial metalonuclease. De acordo com Amboni (2005), bons resultados na luta contra o cncer esto sendo conseguidos com diversos metalofrmacos. As metalonucleases so metalofrmacos que possuem utilizao clnica ao clivar o DNA, como a cisplatina, que utilizada no tratamento dos cnceres de pulmonares. Sua ao sobre este impede a proliferao da clula tumoral que sem carga gentica a acaba entrando em apoptose ou necrose. (RANG, DALE, 2002). Atualmente procura-se frmacos que possuam uma ao semelhante a enzimas, e molculas prprias ao organismo humano, de maneira que possa ser evitando a formao de rejeio por parte do sistema imune (RANG, DALE, 2002). Neste quadro encontra-se as fosfatases cidas prpuras com diversos ncleos, tanto homo, quanto heterobinuclear, como o complexo FeCuOHH2BPBPMP. Portanto, justifica-se a realizao deste trabalho em busca de frmacos que agem contra esta doena e caracterstica debilitante, progressiva e geralmente fatal.

12 1.1 REA/TEMA

Este projeto se encontra na rea de Gentica e Citologia havendo como tema a genotoxicidade de um complexo organometlico baseado em uma fosfatase cida prpura.

1.2 DELIMITAO DO TEMA

Este tema se delimitar a atividade genotxica de um complexo organometlico baseado em uma fosfatase cida prpura.

1.3 PROBLEMA

complexo

FeCuOHH2BPBPMP

apresenta

atividade

genotxica

exposio a leuccitos totais e em sangue total humano in natura?

1.4 JUSTIFICATIVA

Complexo

Heterobinuclear

Fosfatase

cida

prpura

smile

FeCuOHH2BPBPMP fornecido gentilmente pelo professor Hernn Terenzi, do Laboratrio de Expresso Gnica do Departamento de Bioqumica da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), tm demonstrado ao contra o DNA plasmidial em baixas concentraes (2,5M 320M) em condies Fisiolgicas (pH 7,0). Drogas

13 antitumorais normalmente apresentam atividade sobre molculas de DNA, tornando-se interessante analisar o potencial genotxico do complexo aprentado frente exposio ao DNA em leuccitos totais e em sangue total atravs do teste cometa, uma vez que estas leses podem inibir a proliferao celular (ASSIM, 1990; LANZNASTER et al, 2005).

1.5 OBJETIVOS

1.5.1 Objetivo Geral

Avaliar a genotoxicidade do complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP em leuccitos totais e em sangue total humano

1.5.2 Objetivos Especficos

Analisar a genotoxicidade, em DNA de clulas de sangue perifrico, promovida pelo complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP, por meio do teste de fragmentao de DNA (Teste Cometa), em diferentes concentraes.

Analisar a genotoxicidade, em DNA de leuccitos totais isolados, promovida pelo complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP, por meio do teste de fragmentao de DNA (Teste Cometa), em diferentes concentraes.

14 Comparar o potencial genotxico do complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP em ambos os experimentos para uma melhor compreenso dos mecanismos envolvidos

15

FUNDAMENTAO TERICA

2.1 COMPLEXOS CONTENDO METAIS DE TRANSIO

A medicina tem se beneficiado com complexos base de metais de transio, entre, os quais o pioneiro e mais utilizado para fins teraputicos a Cisplatina, utilizada em larga escala para tratamento oncolgico de neoplasia pulmonar (CLARkE, 2003). Complexos metlicos, por apresentarem estruturas tridimensionais, carter catinico e tendncia para fazer reaes de redox, de hidrlise, ou fotorreaes. Apresentam a caracterstica da aptido natural em interagir com DNA, proporcionando a estes, capacidade de catalisar e consertar danos celulares (BOERNER, ZALESKI, 2005) O uso de metais de carter cido na confeco de molculas de ao biolgica de interesse, pois esses interferem em diversos processos celulares fundamentais, atravs de sua afinidade com nitrognio bsico e com ligantes doadores de oxignio, bem como devido a caracterstica de suportar estruturas aromticas maiores, propcias para atuar com o cido nuclico (BOERNER, ZALESKI, 2005; CLARKE, 2003)

2.2 FOSFATASES CIDAS PRPURAS E COMPLEXOS HETEROBINUCLEARES

16 Atualmente existe um grande interesse na sntese de complexos FeIIIMII devido a estes complexos terem grande utilidade como complexos modelos na explicao de como age o stio de ativao de metaloenzimas dinucleares como as fosfatases cidas prpuras (BATISTA et al, 2003) As fosfatases cidas prpuras constituem uma classe de metaloenzimas que possuem a capacidade de hidrolisar uma grande variedade de steres cidos e anidridos em um pH variando de 4 a 7, podendo ser isoladas em vrios mamferos, como o boi, o rato, o camundongo e em diversos tecidos humanos, sendo resistentes inibio do tartarato, sendo uma fosfatase tartarato cido resistente(LANZNASTER et al., 2005)

2.2.1

Fosfatases cidas Prpuras Naturais

Tem se identificado diversas fosfatases cidas prpuras, principalmente contendo ncleo ativo FeIIIFeII(III) com ao cataltica ativa (LANZNASTER et al., 2005) Nos vegetais, como no feijo vermelho e no tomate doce, encontramos isoformas com centro metlico heterobinuclear complexo de FeIIIZnII, assim como isoformas com centro FeIIIMnII. Nos fungos, como no Aspergillus niger, tambm encontramos fosfatases cidas prpuras, porm seu centro metlico ainda no foi elucidado. Nenhuma bactria foi estudada, com relao a sua capacidade de produo de fosfatases cidas prpuras, porm devido a estudos homlogos possvel que se encontrem estas molculas em um nmero limitado de espcies bacterianas.( LANZNASTER et al., 2005). No rato e no porco, temos encontrado principalmente complexo

heterobinuclear complexo de FeIIIMnII (LANZNASTER et al., 2005).

17 2.2.2 Fosfatase cida Prpura smile, Heterobinuclear, com Ncleo de Fe3Cu2

2.2.2.1 Sntese

O complexo foi sintetizado pela adio de Cu(oAC)2*2H2O na quantidade de 0,5 mmol, em soluo metanlica de ligante H2BPBPMP, tambm na concentrao de 0,5 mmol, esta soluo submetida a adio por gotejamento de soluo metanlica de Fe(ClO4)3*9H2O na concentrao de 0,5 mmol, acrescida de 0,5 mmol de NaOAc*3H2O obtendo-se a soluo prpura aps aquecimento em 50o Celsius por 30 minutos. Aps alguns dias em temperatura ambiente, se obteve um slido de cor prpura quando de seu isolamento em acetona/etil acetato 1:1 cristalizando-se em um slido para anlise em raio X (LANZNASTER et al., 2005)

A frmula obtida e calculada foi a seguinte: ( C38H41ClCuFeN5O11) com um peso molecular de 898.60g mol-1. (LANZNASTER et al., 2005)

2.2.2.2 Anlise Cristalogrfica por Raio X

Aps a formao de cristais prpuras pela evaporao lenta do solvente de acetona/etil acetato (1:1) a estrutura como podemos ver na gravura abaixo(fig. 1), foi obtida pelo mtodo de anlise cristalogrfica de Raio X, mtodo este que obteve tambm, os ngulos de ligaes atmicas, como o exposto na tabela 1. (LANZNASTER et al., 2005).

18

Figura 1 O complexo FeIIICuII(BPBPMP)(OAc)2[ClO4]*H2O. os elipsdies para clarificar a estrutura (LANZNASTER et al., 2005)

so

demonstrados com uma probalidade de 40% de acerto. Os tomos de hidrognio foram omitidos

Tabela 1: ngulos (angles) e distncias (Bond length) entre terminais do complexo FeIIICuII(BPBPMP)(OAc)2[ClO4]*H2O.(LANZNASTER et al. 2005)

19 A estrutura analisada pelo raio-X revela um arranjo binuclear de [FeIIICuII(BPBPMP)(OAc)2 onde os ions ferro(FeIII) e cobre(CuII ) esto realizam uma ponte de oxignio fenolato, observado na figura 1 como O1 do BPBPMP2-e dois grupos carboxilatos de ligantes acetato. Da mesma maneira como em outros complexos MIIIMII utilizando ligante assimtrico BPBPMP2-, a esfera de N2O4 do Fe1 completada com 2 tomos de nitrognio (respectivamente na estrutura N1 e N32) de uma amina terciria e um grupo pirimidina, sucessivamente, e o Oxignio O20 do terminal fenolato. Uma esfera de coordenao em octaedro N3O3 do Cu1 complementado pelos tomos de nitrognio N4, N42 e N52 da adjacncia do brao bis(2-pirimidil-metil)amina do ligante BPBPMP2-. (LANZNASTER et al., 2005).

2.2.2.3 Espectrometria de Massa

O complexo dissolvido em uma mistura de etanol/gua(70%, 30%), foi submetido a uma ionizao em spray para anlise em espectrometria de massa. A anlise do istopo padro revelou quatro grupos dissociados, representados pelas massas 723, 696, 677 e 661 como pode ser analisado no grfico abaixo (fig 2).(LANZNASTER et al, 2005)

20

Figura 2: Anlise de resduos de espectometria, evidnciando os resduos (1)-723 {[(C34H33N5O2)Fe Cu (CH3CH2OH)(OH);

III II + III II

(2)-692

{[(C34H33N5O2)Fe Cu (CH3O)-H] };
+

III

II

(3)-677

{[(C34H33N5O2)Fe Cu (OH)-H] }; e (4)-661 [(C34H33N5O2)FeIICuII-H] O; no demonstrando impurezas de demais complexos. H]+}LANZNASTER ET AL., 2005.

No fragmento de peso 661 vemos o ferro reduzido formando a seguinte frmula: [(C34H33N5O2)FeIICuII-H]+. O segundo grupo, de massa 677, e com o qual trabalhamos, o que possui um ligante hidroxil {[(C34H33N5O2)FeIIICuII(OH)-H]+}. O grupo 692 possui um grupo metoxi associado {[(C34H33N5O2)FeIIICuII(CH3O)-H]+}; e o ltimo fragmento, de peso 723, possui como ligante um etanol e um hidroxil ligado a sua molcula, {[(C34H33N5O2)FeIIICuII(CH3CH2OH)(OH)-H]+}. Nenhum resduo impuro derivado de outros complexos heterobinucleares ou mesmo homobinucleares foi encontrado. Todos os complexos tiveram seus ligantes carboxilatos retirados e ao ncleo, havendo ligantes base de gua se ligando ao centro metal. (LANZNASTER et al., 2005).

2.2.2.4 Anlise de Clivagem de DNA

21 Nos ltimos anos a procura por pequenas molculas que tem o poder de mimetizar a funo cataltica das nucleases tem atrado a ateno, principalmente ao fato de ser possvel produzir enzimas de restrio. Recentemente tem se demonstrado que os complexos heterobinucleares de FeIIINiII possuem a capacidade de lisar o DNA plasmidial. (LANZNASTER et al, 2005). Para verificar a clivagem de DNA plasmidial, o complexo foi incubado com substrato de DNA plasmidial em 25mMol de MOPS buffer, h 37 por 18h. As C concentraes de complexo variaram de 2,5M a 320M. (LANZNASTER et al, 2005). O complexo demonstrou atividade de lise do DNA em baixas concentraes (2,5M) em pH e temperaturas fisiolgicas. O DNA plasmidial teve 50% de lise na concentrao de 55M, um dos resultados mais baixos encontrados na literatura. A ao scavenger do glicerol sobre hidrxidos, assim como a ao de dimetil sulfoxido (DMSO) no interferiu na clivagem de DNA pelo complexo, o que sugere que as liberaes difusas de radicais hidroxil no estejam relacionadas com a reao de clivagem. (LANZNASTER et al, 2005)

2.2.2.5 Clivagem anaerbica de DNA

Para verificar se a clivagem de DNA ocorria de maneira hidroltica ou oxidativa, foi realizado teste sob condies anaerbicas. O teste foi realizado em paralelo com experimento usando um clivador oxidativo clssico [Fe(EDTA)]2 ditiotreitol, em condies aerbicas e em rigorosas condies anaerbicas. Sob condies anaerbicas, a degradao de DNA foi observada eficientemente para DMSO assim como para capturadores de radicais tipo scavengers. O complexo Heterobinuclear FeCu, clivou DNA na ausncia de oxignio, em condies aproximadas as condies aerbicas. A partir disto podemos concluir que o complexo Heterobinuclear FeCu, cliva o DNA de maneira hidroltica (LANZNASTER et al., 2005).

22 2.3 GENOTOXICIDADE E MUTAGNESE

Todos os organismos vivos esto em interao com o ambiente, de maneira que seu cdigo gentico se encontra exposto as alteraes que este ambiente sofre. Quando estas alteraes so positivas, levam a uma maior adaptao dos organismos ao ambiente, de uma maneira a explorar este de uma melhor forma, modificando-o tambm. (MINISSI, LOMBI, 1997; PASCALICCHIO, 2002). Os organismos esto freqentemente expostos a agentes ambientais que podem induzir modificaes qumicas ao DNA. Isto pode ocorrer com agentes qumicos endgenos ou exgenos as clulas, radiaes ultravioletas e raio X. Estas modificaes so geralmente prejudiciais s clulas, podendo prejudicar processos vitais como a duplicao do DNA, e a transcrio gnica. Podem, ainda, causar aberraes cromossmicas, que so fenmenos causadores de cncer e de morte celular. Estas alteraes podem causar diversos efeitos a sade humana podendo ser expressos imediatamente ou ocorrerem ao longo de vrios anos da exposio. O estudo destes aspectos sob a luz da gentica, o que perturba o organismo e o induz a morte, chamamos de genotoxicidade, subentendendo-se antigenotoxicidade de maneiras de impedir o que foi exposto acima(COSTA & MENK, 2000; ERDTMANN, 2003; MALUF & ERDTMANN, 2003). Os testes biolgicos utilizados para avaliar genotoxicidade e toxicidade so indispensveis para a anlise de reaes de organismos vivos poluio ambiental, enquanto anlises fsico-qumicas identificam a presena e as respectivas concentraes de diferentes poluentes.(MORAES et al, 2002)

23 Mutao qualquer dano ao cdigo gentico capaz de se expressar de alguma forma no fentipo. Embora a estabilidade do DNA seja vital, mudanas so necessrias e so elas que promovem a evoluo. Podem ser at reguladas geneticamente, e induzidas, e neste caso aumentadas, por agentes fsicos ou qumicos, denominados de agentes mutagnicos. Estes normalmente agem diretamente sobre o DNA, alterando uma base nucleotdea, ou incorporando-se ao mesmo (BORGESOSRIO & ROBINSON, 2001; BURNS, 1989; ERDTMANN, 2003). As mutaes so as responsveis por toda a variabilidade de espcies e de manifestaes genticas. Porm, na grande maioria das vezes, os resultados so malficos, incluindo mal formao, envelhecimento, cncer e morte. (ERDTMANN, 2003).

2.3.1

Mecanismo de Reparo ao DNA

Um sistema muito complexo de reparo ao DNA constitui uma barreira contra os danos que este possa sofrer. As leses que persistem acarretam em um funcionamento incorreto e mutagnese, devido ao maior tempo de multiplicao das clulas com informaes indesejveis. (PINTO RIBEIRO & FELZENSWALB, 2003) Diversos aparelhos enzimticos, capaz de reconhecer e eliminar leses foram inseridos no metabolismo celular, tanto para agir em alguma circunstancia de ameaa, quanto para momentos especficos do ciclo celular. (SAFFI & HENRIQUES, 2003).

24 As formas conhecidas de reparao do material gentico lesado so quase que universais; entretanto, apenas algumas destas estratgias temos conhecimento, a saber: reparao por fotorreativao enzimtica, reparao de bases alquiladas, reparao por exciso, sistema enzimtico de correo de erros e sistema de reparo por desvio. Podem existir tambm outros mecanismos que no esto totalmente elucidados. (ZAHA, 2001).

2.3.2

Antimutagnese

O uso de antimutgenos e anticarcingenos tem se delineado como provvel procedimento para evitar cncer e outras doenas genticas. Estes podem interferir na prpria leso do DNA, ou agir como interferncia ao metabolismo de um mutgeno de maneira especfica. Desta forma, para ter uma efetividade de um antimutgeno, este deve ser direcionado para uma linhagem especfica de mutgenos. (MALUF, 2003) As primeiras evidncias sobre antimutgenos provm da dieta humana, comprovada inicialmente pela epidemiologia. A vitamina C, quando em concentrao especfica, diminui a freqncia de troca de cromtides irms em linfcitos perifricos humanos, inibindo a mutagnese de maneira anti-oxidante. O Beta-caroteno possui ao anti-oxidante ao DNA, sugerindo que populaes que possuam alta incidncia de cncer deveriam utiliza-lo preventivamente. Fibras, por terem poder adsortivo, podem interferir na absorso intestinal de mutgenos. (MALUF, 2003) No caso de compostos sintticos com capacidade antimutagnica, tem-se os complexos derivados do rutnio, como o Rutnio eddp onde este tem uma ao antioxidante comprovada quando em sinergia com a vitamina C. (GRGURIC-SIPKA et al, 2003).

25 2.4 AVALIAO DA GENOTOXICIDADE E MUTAGNESE

2.4.1

Ensaio Cometa

Tambm conhecido como Single Cell Gel Electrophoresis Assay (SCGE), um teste capaz de detectar danos ao DNA realizados por materiais alquilantes, intercalantes e oxidantes. um teste bem flexvel, de maneira que pode ser realizado com qualquer organismo vivo ou tipo celular eucaritico, sendo um bom teste para biomonitoramento. Pode ser utilizado para detectar leses genmicas com grande sensibilidade, porm no sendo utilizado para detectar mutaes. (Ribeiro & felzenswalb, 2003; Collins et al. 1997; GUECHEVA, 2003) O teste consiste em inicialmente preparar lminas, embebendo-as em agarose 1,5% , e aps secagem desta agarose a disposio de clulas embebidas em agarose de baixo peso molecular, seguida de secagem com lamnula. Aps esta etapa, retira a lamnula, e as lminas foram embebidas em uma soluo detergente e salina hiperconcentrada de maneira que se lise as membranas celulares, restando apenas o nucleide, que so as alas supernoveladas de DNA desprovidos de histonas. Imersas em tampo alcalino, que detecta stios lcali lbeis, crosslinks (local de ligao de helicase, uma ponte inter e intra cadeia) e quebras de fita nica e dupla, criando assim um desenovelamento das alas de DNA, passado uma corrente eltrica contnua de maneira a induzir o carreamento dos fragmentos em direo do sentido da corrente eltrica, dispersando o nucleide e formando uma espcie de cauda de DNA, do qual proveniente o nome do teste. Por ltimo as lminas so coradas empregando substncias a base de nitrato de prata, com capacidade de corar material gentico. (SILVA et al., 2000; VILLELA et al., 2003; RIBEIRO, 2003; SPEIT, 1999)

2.4.2

Teste de Microncleos

26

O teste de microncleo consiste na deteco de microncleos, que so fragmentos do DNA envolvidos pela carioteca. Isto ocorre durante a mitose, quando o se forma o fuso e se criam dois ncleos da separao das cromtides irms. Quando algum fragmento ou, em alguns casos um cromossomo inteiro se separa do fuso por quebra ou por interferncia no fuso, se perdendo do material gentico principal, uma carioteca adicional formada em volta deste fragmento formando um pequeno ncleo, o microncleo. Este teste, ento, tem como objetivo detectar a genotoxicidade e a mutagnese cromossmica dos tipos clastognese (que a quebra de cromossomos), aneugnese (que a quantidade anormal de genes) e anormalidade de fuso mittico. (VILLELA et al 2003; MALUF, ERDTMANN, 2000).

2.4.3

Teste de ames; -Teste Salmonela I Microssoma

Teste que leva o nome de seu criador, Bruce Ames, testa a capacidade de produtos interferirem no DNA mutageneticamente em linhagens transformadas da bactria Salmonella thyphimurium. Usa-se, por exemplo, linhagens incapazes de produzirem histidina, mudando-se apenas um nucleotdeo. Desta maneira, produtos com capacidade mutagnica podem reverter este processo e a bactria voltar a produzir histidina. Teoricamente 25% das substituies (so 4 nucleotdeos) se repe o nucleotdeo correto, e a bactria volta a ser his+. Aps alguns dias de cultivo, aparecem na placa de cultura colnias de bactrias revertentes, cada uma originria teoricamente de uma bactria mutante. Conta-se o nmero de revertentes (colnias) e compara-se com o controle negativo. Usa-se tambm sempre um controle positivo, para conferir se o processo est correto. (PICADA, 1997)

27

MATERIAIS E MTODOS

Este trabalho, que possui por finalidade, alm de desvendar maiores informaes sobre o complexo heterobinuclear e ferro Cobre, tambm mantm a tradio de estudo sobre a genotoxicidade de complexos sintticos, uma das linhas de pesquisa do Grupo de Pesquisa em Imunologia e Gentica (GPIG). Para tanto nos utilizamos de metodologias atuais padronizadas e indexadas por este grupo de pesquisa.

3.1 OBTENO DO COMPLEXO;

Os complexos Heterobinucleares Ferro e Cobre, foram gentilmente fornecidos ao professor Claus Trgher Pich, pelo professor Hernn Terenzi, do Laboratrio de Bionorgnica e Cristalografia (LABINC) do departamento de qumica da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Estes complexos possuem aspecto granulado, cor prpura, e peso molecular de 915 gramas/l.

3.1.1

Obteno das Concentraes do Complexo

Baseados na literatura, onde o DNA plasmidial teve dano inicial na concentrao 2,5M e dano total em 320M, com cinqenta por cento (50%) de dano em 55M, sendo uma das mais baixas concentraes conhecidas (LANZNASTER et al..,2005), foram estabelecidas as concentraes do complexo no sangue e em leuccitos totais de 10M como concentrao 1; 20M como concentrao 2; 40M como 3; 80M como 4; 160M como 5.

28

3.2 ANLISE DA GENOTOXICIDADE-ENSAIO COMETA

3.2.1

Obteno do Sangue Total

Foi coletado o sangue total de 8 voluntrios, 4 do sexo feminino, 4 do sexo masculino, com idades entre 19 e 30 anos, no fumantes, hgidos, com hbitos de vida semelhantes mediante a coleta prvia de consentimento livre e informado (Ver Apndice 1). Foi coletado 5ml de sangue com seringa e agulha descartveis, em veia perifrica, aps prvia assepsia com lcool 70% do local de coleta. Este sangue foi colocado em tubos de ensaio, previamente identificados como indivduos A, B, C, D, E, F, G, H), heparinizados com 200l, e encapados com papel laminado para evitar dano ao DNA causado pela iluminao. Deste sangue total 2,5ml foram redistribudos para outros tubos de ensaio temem encapados para haver a separao entre o experimento com sangue total e com leuccitos.

3.2.2

Obteno dos Leuccitos Totais

29 Os tubos de ensaio separados para obteno de leuccitos totais foram colocados em centrifuga, onde foram submetidos a 2500rpm por 10minutos. Assim o sangue foi separado em trs fases, plasma superficial, nuvem de leuccitos (pellet), e concentrado de hemcias. Coleto-se o Pellet com leuccitos totais atravs de uma Pipeta de Pasteur, ressuspendendo-se este coletado em um tubo de ensaio pequeno (eppendorf) com PBS (PBS 10 X - 80g NaCl; 2g KCl; 2g KH2(PO4); 21,7g Na2HPO4 x 7H2O ou (28,12g Na2HPO4 x 12H2O) novamente centrifugado, em centrifuga nos mesmos parmetros da centrifugao anterior. O sobrenadante Aps este Eppendorf,

resultante foi descartado e novamente se realizou suspenso em PBS. passo foram feitas as incubaes para leuccitos totais.

3.2.3

Preparao das incubaes com Sangue total

Para ajustar as concentraes ao sangue total foi realizado uma soluo me, intitulada SMA, onde se utilizou 10mM do soluto, diluda em 25% de acetonitrila e 75% de tampo Pipes 25mM. Desta soluo foi realizada uma soluo de uso, denominada SD1 onde se utilizou 14L da soluo SMA e 86L de gua bidestilada. Foram preparadas solues a partir desta soluo SD1, diluindo-se sempre meio da soluo precedente com gua bidestilada. A soluo de Diluio um foi preparada com 28l de soluo me e 172l de gua bidestilada, resultando em uma concentrao de 1600M, para a soluo de uso 2 (SD2) sendo utilizado 100 da soluo de diluio 1 (SD1) e 100L de gua bidestilada, resultando em uma concentrao de 800M. Para a soluo de diluio 3(SD3) foi utilizado 100L da soluo de diluio 2 (SD2) e 100L de gua bidestilada e concentrao de 400M. Para a soluo de diluio 4 (SD4) de concentrao de 200M, foi utilizado 100L da soluo de diluio 3 (SD3) e 100L de gua bidestilada. Para a soluo de diluio 5 (SD5) e de concentrao de 100M foi utilizado 100L da soluo de diluio 4 e gua bidestilada.

30 Para a incubao com sangue foram numerados pequenos tubos de ensaio, com numerao de 1 8 onde foram colocadas as amostras de sangue e as amostras das solues diluentes. Para atingir a concentrao de 10M foi utilizado 10L de soluo de diluio 5 (SD5) e 90L de sangue total humano. Para atingir a concentrao de 20M foi utilizado 10L da soluo de diluio 4 e 90L de sangue total. Para atingir a concentrao de 40 M foi utilizado 10L da soluo de diluio 3(SD3), e 90L de sangue total. Para atingir a concentrao de 80M foi utilizado 10L da soluo de diluio 2 (SD2) e 90L de sangue total. Para atingir a concentrao de 160M foi utilizado 10L da soluo de diluio 1 (SD1) e 90L de sangue total. Como controle negativo para cada indivduo, utilizou-se de gua destilada e tampo Pipes 25mM o qual foi utilizado para dissoluo do complexo. Como controle positivo, seguiu-se o protocolo do grupo de pesquisa em imunologia e gentica - GPIG, utilizando a substncia perxido de hidrognio na concentrao de 150 M. As incubaes em Sangue total seguiram o mesmo padro da utilizada para leuccitos totais tendo a durao de 1h e 30 min, seguindo a padronizao do grupo de pesquisa em imunologia e gentica - GPIG, seguindo ANTONELLI, 2005.

3.2.4

Preparao das incubaes com Leuccitos Totais

Para se ter uma comparao entre leuccitos e sangue utilizou-se o mesmo protocolo de solues de diluio (SD1, SD2, SD3, SD4, SD5), assim como o mesmo nmero de concentraes (1,2,3,4,5) o mesmo nmero de controles negativos e o mesmo controle positivo.

31 Para a incubao com sangue foram numerados pequenos tubos de ensaio, com numerao de 1 a 8 onde foram colocadas as amostras de sangue e as amostras das solues diluentes. Para atingir a concentrao de 10M foi utilizado 10L de soluo de diluio 5 (SD5) e 90L de Leuccitos totais humano. Para atingir a concentrao de 20M foi utilizado 10L da soluo de diluio 4 e 90L de Leuccitos totais. Para atingir a concentrao de 40 M foi utilizado 10L da soluo de diluio 3(SD3), e 90L de Leuccitos totais humanos. Para atingir a concentrao de 80M foi utilizado 10L da soluo de diluio 2 (SD2) e 90L de leuccitos totais humanos. Para atingir a concentrao de 160M foi utilizado 10L da soluo de diluio 1 (SD1) e 90L de Leuccitos totais humanos. Utilizou-se os mesmos compostos utilizados para controle negativo, como usando o diluente Pipes 25mM e gua destilada, utilizando de 10L de soluo Pipes ou de gua bidestilada e 90L de leuccitos totais humanos. Para controle positivo seguiu-se a utilizao de perxido de hidrognio 150 M As incubaes em leuccitos totais tiveram a durao de 1h e 30 min, seguindo a padronizao seguindo AMBONI (2003).

3.2.5

Teste Cometa

3.2.5.1 Preparao das Lminas

32 Foram preparadas 2 lminas para cada incubao, sendo dezesseis lminas para cada um dos oito indivduos (5 lminas e 5 lminas replicadas, para as amostras de complexo para cada indivduo; 4 lminas replicadas para os controles negativos e 2 lminas replicadas de controle positivo para cada indivduo). Aps a marcao estas lminas foram pr-cobertas com um polmero, a agarose 1,5%, constituda de 20ml de PBS 10X (80g NaCl; 2g KCl; 2g KH2(PO4); 21,7g Na2HPO4 x 7H2O ou (28,12g Na2HPO4 x 12H2O), Agar noble e gua destilada, mantidos em banho-maria a 60 a fim de formar uma rede sustentao para a C, amostra a ser inserida na lminas. Estas lminas foram colocadas para secagem por 24h.

3.2.5.2 Confeco das Lminas

Com as lminas com pr-cobertura seca estas foram colocadas em estufa 37 para manter a secagem. Aps as incubaes, de cada sangue ou leuccito C incubado com testes e controles, foi retirada uma amostra de 10l, ressuspendidas em 90l de agarose Low Melting 0,75%, 37 em banho-maria (agarose Low Melting, C PBS 10X, e gua destilada) que uma soluo de um polmero de baixa densidade, a fim de formar uma malha para realizar uma ancoragem nas malhas. As lminas com pr-cobertura receberam a amostra. Foram cobertas a lmina e sua rplica com a mesma amostra. Logo aps a cobertura com a amostra foi colocada uma lamnula por lmina, para que se distribuisse a amostra pela lmina. Assim cobertas as lminas foram para a geladeira, temperatura de 4 por 10 minutos, para o endurecimento e C ancoragem das clulas na lmina. Toda esta etapa do processo foi realizada na penumbra com iluminao de espectro amarelo, ou vermelho, para evitar dano gentico causado pela iluminao de espectro convencional (solar e artificial).

33 3.2.5.3 Lise da Membrana Celular, Citoplasma, e Carioteca

Como o interesse pelo material gentico, procedeu-se a eliminao das demais estruturas que compe a clula. Para isso foram preparadas cubetas para lminas contendo soluo de lise de uso (10ml de Dimetil sulfxido, 1ml de Triton X100, em 89ml de soluo pr preparada de NaCl, EDTA, e TRIS). Esta soluo composta por detergentes e soluo hipertnica salina, com potencial de lise de todo material celular, deixando o contedo nuclear livre na agarose. Desta maneira as lminas, com a agarose j endurecida, foram retiradas da geladeira, e as lamnulas foram retiradas. Assim as lminas foram colocadas na soluo de Lise de uso, onde ficaram por m tempo, variando de 1h e no mximo por 14 dias de espera. Este processo tambm ocorreu na penumbra com iluminao de espectro amarelo, sendo que as cubetas onde foram colocadas as lminas foram revestidas de papel alumnio.

3.2.5.4 Imerso em tampo alcalino e Eletroforese

Aps a lise, e com o nucleide exposto, as lminas foram colocadas em tampo alcalino (NaOH, EDTA, gua destilada com pH 13 13,5) j dentro da cuba de eletroforese, circundada por gelo(temperatura controlada de at 4 C), por 20 minutos. Aps este perodo a eletroforese foi passada uma corrente eltrica contnua de 25 volts, mantendo 300 micro ampares, acrescentando-se ou retirando-se tampo da cuba na variao de mA. A corrida eletrofortica foi de 15 minutos, aps os quais se trabalhou com as luzes acesas. Em seguida as lminas foram retiradas da cuba de eletroforese, neutralizando o tampo e com soluo neutralizadora (Tris, e gua destilada com ajuste de pH a 7,5), por 3 vezes, com cinco minutos de intervalo entre cada gotejamento. Aps este processo as lminas foram lavadas com gua destiladas e postas para secagem em estufa a 37 por 1h. C

34 3.2.5.5 Fixao das Lminas

Retiradas da estufa, as lminas foram colocadas por 10 minutos em soluo Fixadora (cido tricloroactico, sulfato de zinco heptahidratado, glicerol e gua destilada) por dez minutos, para que esta realizasse uma desidratao da agarose. Em seguida a este processo as retornaram estufa a 37 onde permaneceram por um C tempo de no mnimo de 1h e 30 minutos.

3.2.5.6 Colorao das Lminas

Nesta etapa as lminas foram lavadas, colocadas em cubetas, encapadas com papel alumnio (para evitar interferncia da iluminao na colorao. Nestas, foram misturadas as solues corantes 1( carbonato de sdio e gua destilada) e 2 (nitrato de amnio, nitrato de prata, cido tunstosilcico, formaldeido e gua destilada) na proporo de 66ml de soluo 1 para 34ml de soluo 2 respectivamente. Em seguida as cubetas foram colocadas em banho-maria por 15 minutos. Retiradas do banho-maria e lavadas em gua destilada estas lminas foram submersas em soluo de parada de colorao(cido actico e gua destilada), por 5 minutos. Novamente lavadas, fpram para a secagem, onde, aps este perodo foram lidas.

3.2.5.7 Leitura do teste cometa

Os dados obtidos foram analisados com microscpio ptico sempre com o mesmo aumento (400X) e em comparao com a figura de referncia (Figura 2). Para

35 evitar induo de resultados lminas replicadas e normais foram analisadas por diferentes observadores que desconheam a maneira de marcao das lminas. Com os resultados obtidos feito a analise o ndice de dano ao DNA, o qual pode variar de 0 [0 (classificao de dano ao DNA)x 100 (referente ao nmero de clulas observadas)] a 400 [100 (quantidade de clulas observadas) x 4 (dano ao DNA)]. Tambm analisado a freqncia do ndice de dano ao DNA, que pode variar de 0 (nenhuma clula com dano ao DNA) a 100 (todas as clulas observadas com dano ao DNA independente de qual for este dano).

3.2.5.8 Anlise dos Dados

As anlises estatsticas dos resultados foram realizadas atravs de Anlise de Varincia (ANOVA), completada pelos testes de Student Newman-Keulls (SNK). Para tanto, foi utilizado o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc. San Diego, CA, USA), admitindo-se um nvel de significncia de *(p<0,05), **(p<0,01) e ***(p<0,001).

36

Figura 3: Classificao de dano ao DNA (De 0, sem fragmentao, seguindo fragmentao dano 4, mxima fragmentao).

37

RESULTADOS

4.1 NDICE E FREQUNCIA DE DANO AO DNA EM LECUCCITOS TOTAIS HUMANOS

Na anlise por teste cometa de Leuccitos totais isolados em PBS 1X por centrifugao a 2500rpm em 10 minutos, obteve-se, numa escala de 0 a 400, os dados de ndice de dano representados na tabela 2. Eses dados tambm esto representados sob a forma de grfico na figura 3.

Tabela 2: ndice e freqncia de dano ao DNA de leuccitos totais isolados incubados com complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP.

Concentrao 10M 20M 40M 80M Tampo PIPES H2O dest H2O2

ndice de Dano 12,63 6,05 abc 33,13 13,62 ab 19,75 8,36c 14,13 15,07c 6,50 2,20c 5,00 3,25c 34,88 15,93ab

Feqncia de dano 10,50 5,45 bc 23.38 14,04ab 14,00 5,07bc 12,38 14,45bc 4,75 0,46c 4,00 1,51c 24,88 5,51ab

a diferena significativa p<0,05 em relao ao contorle negativo PIPES b diferena significativa p<0,05 em relao ao contorle negativo H2O dest c diferena significativa p<0,05 em relao ao contorle positivo H2O2

38 Quando da anlise estatstica dos resultados referentes ao ndice de bdano por ANOVA one way tcnica de Newman-Keuls e mltipla comparao em software GrafPad 6.0, observa-se diferena significante entre o controle negativo PIPES e o controle positivo Perxido, entre o controles negativos gua destilada e tampo PIPES comparados com o controle positivo perxido de hidrognio, entre os controles negativos gua destilada e PIPES comparados com a incubao de 20M de 10, 40 e 80M e o controle positivo perxido de complexo, entre as incubaes de 10 40 e 80M comparadas com a incubao de 20M, entre as incubaes de admitindo-se p<0,05. hidrognio, no sendo significativamente diferente nas demais concentraes,

60,00

50,00

40,00

30,00 MDIA Seqncia1 Polinmio (Seqncia1) 20,00

10,00

0,00 1 2 3 4 5 6 7

-10,00

Figura 4: Grfico indicando o indice de dano em Leuccitos totais;

39 Na anlise por teste cometa de Leuccitos totais isolados em PBS 1X por centrifugao a 2500rpm em 10 minutos, obteve-se os dados de freqncia de dano representados na tabela 2. Eses dados tambm esto representados sob a forma de grfico na figura 4. Quando da anlise estatstica dos resultados referentes freqncia de dano por ANOVA one way tcnica de Newman-Keuls e mltipla comparao em software GrafPad 5.0, repetiram-se os resultados encontrados na anlise de ndice de dano.
40,00

35,00

30,00

25,00

20,00 MDIA Seqncia1 Polinmio (Seqncia1) 15,00

10,00

5,00

0,00 1 2 3 4 5 6 7

-5,00

Figura 5: Grfico representando a freqncia de dano em leuccitos totais

4.2 NDICE E FREQNCIA DE DANO AO DNA PRESENTE EM SANGUE TOTAL HUMANO

40 Na anlise por teste cometa em leuccitos totais incubados com o complexo por 1 hora e 30 minutos em sangue total humano, obteve-se, numa escala de 0 a 400, os dados de ndice de dano representados na tabela 3. Eis dados tambm esto representados sob a forma de grfico na figura 5.

Tabela 3 ndice e freqncia de Dano em clulas de sangue total incubados com complexo heterobinuclear fosfatase cida prpura smile FeCuOHH2BPBPMP.

Concentrao 10M 20M 40M 80M Tampo PIPES H2O dest H2O2

ndice de Dano 10,38 2,97abc 5,00 3,16c 7,63 4,50c 7,38 3,78c 3,25 1,91c 4,13 2,70c 18,00 3,12ab

Freqncia de dano 10,13 2,53abc 5,38 3,07c 7,75 4,37bc 8,50 4,57bc 2,88 1,25c 4,50 2,88c 18,88 4,02ab

a diferena significativa p<0,05 em relao ao controle negativo PIPES b diferena significativa p<0,05 em relao ao controle negativo H2O dest c diferena significativa p<0,05 em relao ao controle positivo H2O2

A anlise estatstica em GrafPad 5.0, por ANOVA one way, mtodo NewmanKeuls, foram encontrados resultados significativamente diferentes, admitindo-se p<0,05, entre os controles negativos e o controle positivo e entre a concentrao de 10M e tas outras incubaes excetuando-se as concentraes de 40 e 80M. As outras incubaes com complexo no apresentaram resultados significativos quando comparadas aos controles negativos. Tambm foram encontradas diferenas significativas entre o controle positivo e todas incubaes.

41

25,00

20,00

15,00 MDIA Seqncia1 Polinmio (Seqncia1) 10,00

5,00

0,00 1 2 3 4 5 6 7

Figura 6: Grfico representando o ndice de dano a leuccitos totais em sangue.

Na anlise por teste cometa em leuccitos totais incubados com o complexo por 1 hora e 30 minutos em sangue total humano, obteve-se os resultados em Freqncia de dano: Na anlise estatstica por ANOVA one way mtodo de Newman-Keuls, reparim-se os resultados da anlise de ndice de dano acrescentados de valores significativamente relevantes na comparao das concentraes de 40 e 80 M quando comparadas ao controle negativo gua destilada..

42

25,00

20,00

15,00 Seqncia2 Seqncia1 Polinmio (Seqncia1) 10,00

5,00

0,00 1 2 3 4 5 6 7

Figura 7 Grfico representando a freqncia de Dano em Leuccitos Totais em sangue total humano aps incubao com o complexo

43

DISCUSSO

5.1 NDICE E FREQNCIA DE DANO AO DNA EM LEUCCITOS TOTAIS ISOLADOS EM TAMPO PBS

Em relao ao ndice de dano em Leuccitos observamos diferenas significativas entre os grupos expostos ao complexo FeCuOHH2BPBPMP, nas suas concentraes mais baixas (10 e 20M), contra os controles negativos (H2O e Pipes), no havendo alterao no ndice de dano significantes nas demais concentraes. Em relao ao controle positivo perxido de hidrognio, encontramos diferena estatstica nas concentraes, mais altas, demonstrando estas no serem genotxicas, pois no foram significativamente diferentes dos controles negativos. Este efeito se deve principalmente a ao aumento de clulas apoptticas, no sendo avaliadas neste trabalho, mas presente em escala crescente, conforme aumentava a concentrao do complexo. Baseado nestas informaes pode-se afirmar que a citotoxicidade do complexo interfere de maneira importante na avaliao da genotoxicidade, conforme explicita Ribeiro e colaboradores (2003).

Em relao freqncia de dano em Leuccitos observamos diferenas significativas entre os grupos expostos ao complexo FeCuOHH2BPBPMP, nas concentraes de 10 a 20M, contra os controles negativos (H2O e Pipes) no havendo alterao na freqncia de dano significante nas demais concentraes. Salienta-se que h diferena significativa entre o controle positivo e o grupo exposto ao complexo na concentrao de 20M, corrobora com a quantidade de clulas apoptticas observadas, porm no quantificadas neste trabalho, revelando aumento da citotoxicidade em leuccitos totais isolados.

44 5.2 NDICE E FREQNCIA DE DANO AO DNA EM LEUCCITOS TOTAIS EM SANGUE HUMANO TOTAL

Para a anlise em sangue total, avaliamos a genotoxicidade em apenas 10M estatisticamente significante, no havendo dados para as demais concentraes. Estes dados podem estar correlacionados com a presena de maior citotoxicidade, por associao do complexo de FeCuOH com enzimas sangneas, aumentando sua ao citotxica (GRIFFITHS, et al, 2002). Pode-se tambm haver maior dano ao DNA de leuccitos devido a estes estarem em sangue total, no havendo estabilizao do DNA em G0 como quando em colocao em tampes, como PIPES, PBS, entre outros. (ASSIM, 1990). importante ressaltar que, segundo Collins (1997), para evitar que outras clulas nucleadas interfiram no teste cometa, recomenda-se o isolamento de linfcitos, assim como se deve excluir a presena de indivduos coletados com alergias, doenas crnicas e tabagismo, algo que no foi avaliado por questionrio padronizado, j que o teste cometa extremamente sensvel, podendo detectar at 100-150 quebras por clula somtica humana. (TICE et al, 2000).

5.3 MECANISMOS DE GENOTOXICIDADE/ CITOTOXICIDADE

De acordo com Lanznaster (2005), a procura de possveis molculas com potencial de enzimas de restrio tem se demonstrado promissoras, em especial as enzimas derivadas de complexos heterobinucleares como FeIIINiII, que possui a capacidade de lesar o DNA plasmidial. Demonstrou-se que o DNA plasmidial foi tratado com o complexo FeCuOH por 18h demonstrou atividade nuclesica nas concentraes de 2,5M a 320M, com 50% de lise na concentrao de 55 M.

45 Segundo o mesmo autor, a anlise de clivagem anaerbica do DNA demonstrou quebra de DNA em condies semelhantes s ocorridas em presena de oxignio, o que demonstra um provvel mecanismo hidroeletroltico de dano ao DNA quando em comparao com Fe-EDTA. Isso demonstra um modelo semelhante a outros grupos de fosfatases, como as fosfatases dependentes de cistena, onde o local nuclefilo, composto deste aminocido, liga-se a ao fosfato da cadeia, protonando-o e levando a quebra da ligao por hidrlise, conforme descrito por Bardford em 1996. Um possvel mecanismo, utilizando os centros metlicos do complexo podem agir por meio semelhante. Este mecanismo hidroltico encontrado em diversas estruturas

semelhantes, como no complexo bi-cobre formado de por pontes hidrxido, proposto por Rey e colaboradores em 2006, onde o modelo de hidrolise se realiza por hidrolise de ponte diester. O mecanismo de apoptose e de citotoxicidade pode-se dar porque de acordo com Seger, Krebs em 1995 as fosfatases agem inibindo a via das quinases, importantes para o metabolismo e sinalizao celular, agindo defosforilando molculas destas cadeias, como a via de ativao de mitognica das protenas quinases, responsveis pela ativao seqencial de seis outras cadeias vitais para o funcionamento celular. Outro mecanismo possvel de citotoxicidade a atividade sobre stios ativos de protenas catalticas dependentes de fosfato, como descrita atividade nos receptores proticos Src para fator de crescimento epidermal (LADBURRY, 2007). Outras metalonucleases tambm possuem ao hidroltica, como o complexo polipiridinico de rutnio, que utiliza um stio glicuronil-bipiriridina para realizar ligao com o DNA e assim provocar ao hidroltica por ction em reao aninica protonando stios fosfatos, e por clivagem de ligaes N-H. (DESPHANDE, M. S. KUMMBHAR, A. A. KUMBHAR, A., 2007)

46

CONCLUSO

Baseado nos dados colhidos pelo teste cometa, demonstra-se que o complexo FeCuOHHBPBPMP promove dano ao DNA em leuccitos totais humanos isolados e em sangue total, nas concentraes mais baixas. Este resultado pode ser devido a provvel mecanismo hidroltico conforme relatado anteriormente por Lanznaster et al (2005). Fica evidenciada, tambm, uma possvel citotoxicidade deste complexo pelo aumento do nmero de clulas apoptticas observadas durante a realizao da leitura dos resultados do teste cometa. Esta citotoxicidade devido provvel interferncia do mecanismo de fosfatase agindo como antagonista de protena quinase na cascata de transduo de sinais, onde a deslocamento de protenas fosforiladas, inativando-as, porm este mecanismo no totalmente elucidado e maiores investigaes devem ser realizadas com o intuito de se evidenciar esta hiptese.

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REFERNCIAS

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