Zwalczanie biofilmu - otwarty problem wspczesnej medycyny

Elbieta A. Trafny Zakad Mikrobiologii i Epidemiologii WIHiE, Warszawa

Plan wykadu
I. Biologia biofilmu: powstawanie, cykl rozwojowy, sposoby rozprzestrzeniania si, tolerancja na rodki przeciwdrobnoustrojowe. II. Dekontaminacja endoskopw czy obecno biofilmu stwarza realne zagroenie dla pacjentw? III. Jak wykorzysta wiedz o biologii biofilmu w zwalczaniu tych populacji bakterii?

Biofilm - definicja
Populacja/konsorcjum drobnoustrojw speniajca nastpujce kryteria: 1. przyleganie do powierzchni i/lub siebie nawzajem w sposb nieodwracalny, 2. wydzielanie substancji (w tym polisacharydw) tworzcych macierz pozakomrkow EPS, 3. zwikszona tolerancja na rodki przeciwdrobnoustrojowe.
50 m

Uropatogenny szczep Escherichia coli 20 m

Na podstawie: Anderson i wsp., Science, 2003

Biofilm powstawanie
1. Adhezja

2. Powstawanie mikrokolonii
Vibrio cholerae

3. Dojrzewanie biofilmu

Na podstawie: Watnick i Kolter, J. Bacteriol., 2000, 182, 2675 Bacteriol.,

Biofilm - cykl rozwojowy

Pseudomonas aeruginosa

50 m 50 m

A.
A. 3 godz. B. 3 dni C. 7 dni

B.

C.

25 m

Na podstawie: Webb i wsp. 2003, J. Bacteriol.;185:4585

Porozumiewanie si komrek
Quorum sensing system porozumiewania si za pomoc autoinduktorw

Odlego od powierzchni

Szczep dziki Pseudomonas aeruginosa

Szczep mutanta: autoinduktor (-)

Szczep mutanta: autoinduktor (+)

Na podstawie: Davies i wsp. Science, 1998, 280, 295 Science, 280,

Skad biofilmu
1. Woda 75-90% masy biofilmu; 2. Mikrokolonie drobnoustrojw jednego lub wielu gatunkw (rodzajw); 3. Macierz pozakomrkowa EPS o skadzie: polisacharydy, 1000 900 biaka, planktonic biofilm kwasy nukleinowe, 800 700 lipidy. 600
500

ng/106 CFU

400 300 200 100 0 1

Biaka

Polisacharydy

Campanac C. i wsp. (2002) Antimicrob. Agents Chemother., 46, 1469

Biofilm grzybw- cykl rozwojowy

Biofilm C. albicans na powierzchni silikonu hodowany in vitro blastospory, strzpki i pseudostrzpki.
450 m

(0-2 h) Blastospory

(3-4 h) Mikrokolonie

(12-14 h) Pozakomrkowa macierz

Dojrzay biofilm (24-48 h)

Biofilm grzybw faza dojrzaego biofilmu

Kanay wodne Mikrokolonie
25 m

Wielogatunkowe biofilmy
(1985 r.) Staphylococcus epidermidis i C. albicans: biofilm na powierzchni cewnika centralnego typu Hickman; te same drobnoustroje izolowano z krwi pacjenta z zakaeniem uoglnionym. (2002 r.) EPS S. epidermidis hamuje penetracj flukonazolu w obrbie biofilmu. Obecno C. albicans chroni komrki gronkowcw, ktre nie wytwarzaj EPS, przed dziaaniem wancomycyny.
Berit i wsp. (2002) J. Med. Microbiol., 51, 344-349

Wielogatunkowe biofilmy
Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans
P. aeruginosa przylega jedynie do strzpek i pseudostrzpek, nie przylega natomiast do blastospor C. albicans. Oddziaywania te prowadz do mierci micelium natomiast nie maja wpywu na ywotno blastospor.
Biofilm P. aeruginosa

C. albicans

Na podstawie: Hogan D.A. i Kolter R. (2002) Science, 296, 2229.

Starzenie si biofilmu
Czas, w jakim dochodzi do starzenia si biofilmu i wzmoonego wydzielania komrek potomnych, uzaleniony od gatunku drobnoustroju i warunkw panujcych w danej niszy ekologicznej.

Biofilm rozprzestrzenianie si

Aktywno metaboliczna biofilmu

P. aeruginosa wydzielanie AmpC -laktamazy Komrki bakterii aktywne metabolicznie

Komrki bakterii nieaktywne metabolicznie

Na podstawie: Bagge i wsp. Antimicrob. Agents Chemother. 2004;48:1168

Tolerancja na antybiotyki
Komrki przetrwae (ang. persisters)
12 10

12 10

Log10 CFU / sczek

Log10 CFU/ sczek

8 6 4 2 0

*
6 4 2
24 48

72

96

120

24

48

72

96

120

144

Czas hodowli (h)

Czas hodowli (h)

Biofilm Pseudomonas aeruginosa poddany dziaaniu ciprofloksacyny w steniu 4 mg/l (stenie rwne wartoci MBC dla komrek planktonowych).
Odak E., Trafny E.A. (2005) Antimicrob. Agents Chemother., 49, 3281-3288.

Tolerancja na rodki dezynfekcyjne

Wraliwo na chlor komrek M. avium i M. intracellulare wolnopywajcych, w populacji biofilmu i komrek potomnych
900 800 700 600 500 400

CT99.9

300 200 100 0

Wolnopywajce

Biofilm

Komrki potomne

Steed i Falkinham (2006) Appl. Environ. Microbiol., 72, 4001-4011

Gitkie endoskopy bakterie i grzyby

Analiza: dwa uniwesyteckie szpitale w Brazylii, 298 prb pobranych z bronchoskopw (n=40), EGDs (n=138) oraz kolonoskopw (n=120). Flora po myciu i dezynfekcji (2% glutaraldehyd, mycie rczne): Gram-ujemne paeczki 61% Gram-dodatnie ziarniaki 23% Gram dodatnie laseczki 9% Drodaki 7% Gatunki drobnoustrojw: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter sp., Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus, koagulazo-ujemne gronkowce, Micrococcus luteus, Candida albicans, C. tropicalis, C. glabrata, Bacillus sp., Corynebacterium sp.

Skaenie endoskopw po penym procesie dekontaminacji

W Stanach Zjednoczonych badaniom poddano: 1992 r. 71 endoskopw, skaonych 23,9%, wzrost bakterii > 105 CFU;
Kaczmarek R.G. i wsp. (1992) Am. J. Med., 92, 257-261.

1993 r. 60 endoskopw, skaonych 18%;

Frazer V.J. i wsp. (1993) Infect. Contr. Hosp. Epidemiol., 14, 383-389.

2006 r. 2 363 endoskopy, skaonych 2% (48) (paeczki jelitowe, Bacillus sp., P. aeruginosa, Streptococcus sp.)
Bisset L. i wsp. (2006) Am. J. Infect. Contr., 34, 274-280.

Jatrogenna transmisja patogenw

ENDOSKOPY
Wirusy: HBV(5), HCV (8), HIV (0), SARS-CoV(0), Prtki: Mycobacterium tuberculosis, M. chelonae (35), Gram-dodatnie, przetrwalnikujce: Clostridium difficile, C. botulinum, C. perfringens, C. tetani, Bacillus cereus, B. subtilis (pojedncze przypadki) Gram-ujemne: Pseudomonas aeruginosa (216), Salmonella sp.(48), Helicobacter pylori (12), Serratia marcescens i inne paeczki jelitowe (2) Priony? Przyczyny? Nieprawidowoci procesu dezynfekcji wysokiego poziomu
Nelson i Muscarella (2006) World J. Gastroenterol., 12, 3953-3964

Czy drobnoustroje bytuj w przewodach endoskopu w postaci biofilmu?

TAK,

metod SEM wykazano obecno biofilmu (mikrokolonii i EPS) w wietle przewodw endoskopw. Biofilm wystpowa w postaci skupisk o wymiarach ~ 122 m 90 m. najwyszy stopie skaenia obserwowano w wskich kanaach endoskopw (12/9/5), ktre nie s czyszczone mechanicznie. Biofilm wystpowa w postaci cigej warstwy, obserwowano przyleganie leukocytw do biofilmu (HIV i inne patogeny!).
Pajkos A. i wsp. (2004) J. Hosp. Infect., 58, 224-229

Gitkie endoskopy - dezynfekcja

Dezynfekcja wysokiego poziomu (ang. high level disinfection) Aldehyd glutarowy Aldehyd bursztynowy Aldehyd orto-ftalowy Kwas nadoctowy Nadtlenek wodoru Dwutlenek chloru Kwas podchlorawy, podchloryn sodu Woda zawierajca wolne rodniki Czwartorzdowe zwizki amoniowe
, zwizki o potencjalnej aktywnoci wobec biofilmw
Marek T., Dziurkowska-Marek A. (2006) Zakaenia, 2,6-10

Tolerancja na rodki dezynfekcyjne

Biofilm szczepu E. coli CIP 54127, hodowany w probwkach, masa bakterii (biofilm) oznaczana metod kolorymetryczn (Crystal Violet).
2.5 2 O D 600 1.5 1 0.5 0

A Q + PA A

od a

hy

PA

PA

uc

(2

(2

-s

Bi

of il

Loukili N. i wsp. (2004) J. Hosp. Infect. 58, 151-154

PA

Tolerancja na rodki dezynfekcyjne

Biofilm klinicznego szczepu P. aeruginosa, hodowany w pytkach polistyrenowych w cigu 24, 48 i 72 h i poddany dziaaniu Perasafe. Oznaczane: 1. Masa bakterii (biofilm) metod kolorymetryczn (Crystal Violet) 2. Aktywno metaboliczna ywych bakterii metod MTT.
1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00

Kontrola - MTT PAA - MTT

1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00

Kontrola - Crystal Violet PAA - Crystal Violet

24h-biofilm

48h-biofilm

72h-biofilm

24h-biofilm

48h-biofilm

72h-biofilm

Badania wasne: Wielechowska A. i Trafny EA. (2007)

Wpyw detergentw na biofilm

Biofilm szczepu klinicznego E. coli hodowany na powierzchni teflonu i PCV w cigu 6 dni, liczba bakterii w biofilmie oznaczana ilociowo: CFU/cm2, SEM.
3M Epizyme Rapid EndoKleen Medizyme Cidezyme 1/100

- 2 log

1/50 1/25 1/12.5 1/5 0 20 40 60 80

SEM redukcja biofilmu (%)

Vickery K. i wsp. (2004) Am. J. Infect. Control,. 32, 170-176

Brak aktywnoci Wzrost aktywnoci enzymatycznej enzymatycznej

Matrix rozc.

Wpyw detergentw na biofilm

Propozycja: Optymalna procedura reprocesowania endoskopw o wysokim stopniu skaenia (biofilm w przewodach wewntrznych 9,6 107 CFU/cm2): 1. Oddziaywanie za pomoc preparatw o wysokiej aktywnoci enzymatycznej (zawierajcych proteazy, amylazy, lipazy); 2. Oddziaywanie za pomoc roztworw detergentw; 3. Oddziaywanie za pomoc rodkw dezynfekcyjnych, np. kwasu nadoctowego. Efektywno tej procedury wobec sztucznie skaonych endoskopw (zawiesina drobnoustrojw: P. aeruginosa, S. epidermidis, E. cloaceae, K. pneumoniae) potwierdzona dowiadczalnie z uyciem SEM.
Marion K. i wsp. (2006) Using an efficient biofilm detaching agent: an essential step for the improvement of endoscope reprocessing protocols. J. Hosp. Infect. 64, 136-142.

Czy obecne techniki dekontaminacji endoskopw s skuteczne?

NIE, 1. w kanaach endoskopw wystpuj miejsowe uszkodzenia powierzchni, co zwiksza wydajno adhezji drobnoustrojw; 2. budowa endoskopw uniemoliwia dostp mechaniczny do niektrych wskich kanaw; 3. istnieje potrzeba opracowania nowych substancji przeznaczonych do mycia endoskopw, efektywnie usuwajcych osiade populacje bakterii i grzybw.

Pajkos A. i wsp. (2004) J. Hosp. Infect., 58, 224-229

Praktyczne zapobieganie powstawaniu biofilmu

Sprzt medyczny powinien by przekazany do dekontaminacji w jak najkrtszym czasie po zabiegu zapobiega to adhezji biaek do powierzchni, ogranicza namnaanie si drobnoustrojw, a poprzez to ich wzrost w postaci biofilmu.

Po procesie dezynfekcji sprzt medyczny powinien by prawidowo wysuszony rodowisko wilgotne sprzyja wzrostowi tych drobnoustrojw, ktre przeyy proces dezynfekcji, w postaci biofilmu.