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APPROCHE BIOMIMTIQUE DE LA
VASO-OCCLUSION
DANS LA DRPANOCYTOSE :
PRODUCTION DE VSICULES ET MICROFLUIDIQUE
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g
T=37C
gonflement spontan
lectroformation
double mulsion+vaporation
"jetting" au travers
d'une membrane
"zipping" par passage
d'interface
Fig. 1.1: Principales mthodes de fabrication de vsicules. a. Gonement spon-
tan : le lm de lipide rhydrat gone pour former des vsicules qui restent lies
au substrat par un tube lipidique [20]. b. Electroformation : la croissance des v-
sicules est contrle par un champ lectrique alternatif externe [21]. c. Emulsion
inverse : passage forc dune interface huile-eau par centrifugation dune mulsion
deau dans lhuile stabilise par des lipides [22] et [23]. d. Double mulsion deau
dans huile dans leau fabrique par technique microuidique. Les vsicules sont
obtenues aprs vaporation du solvant [24]. e. Microjet puls contre une bicouche
dj forme [26] et [25] .
1.1. MTHODES PAR HYDRATATION DUN FILM DE LIPIDE 9
1.1 Mthodes par hydratation dun lm de lipide
1.1.1 Gonement spontan
Ds 1965, Bangham et al. utilisent des vsicules obtenues par gonement spon-
tan pour ltude de la diusion dions travers les membranes [19]. Cependant,
la premire tude complte dcrivant la prparation de telles vsicules ainsi que
leur caractrisation est mene par Reeves et Dowben [20] en 1969.
La prparation est simple, dans une bouteille en verre, une solution de lipides
dissous dans un mlange chloroforme-mthanol est vapore sous un ux dazote
rsultant en un lm de lipide sur la surface de verre. Une solution aqueuse est alors
verse sur le lm et le tout est laiss au repos pendant plusieurs heures 37
C. Au
cours du temps, le lm de lipide hydrat gone et donne naissance des structures
lipidiques dont des vsicules ( gure 1.1 a). Les vsicules ainsi obtenues ont des
tailles comprises principalement entre 0.5 et 10 m, certaines sont multilamellaires
et les plus grosses ont tendance renfermer de plus petites vsicules.
Facile mettre en uvre, cette mthode soure de nombreuses limitations ; la
taille nest pas contrle, il est dicile de travailler en conditions physiologiques,
lencapsulation est trs limite et le rendement est faible : peu de vsicules unila-
mellaires.
1.1.2 Electroformation
La mthode de llectroformation dveloppe par Angelova et Dimitrov en 1986
[21] permet grce lapplication dun champ lectrique extrieur de mieux contr-
ler la croissance des vsicules. Ici, le lm de lipide est form sur deux plaques
semiconductrices dITO (Indium Tin Oxyde) agences face face et espaces de 1
2 mm. Une fois ltanchit entre les deux plaques eectue, la chambre dlec-
troformation ainsi forme est remplie avec la solution aqueuse que lon souhaite
encapsuler. On applique alors une tension alternative (10 Hz) aux bornes des deux
plaques, dont on augmente graduellement lamplitude (de 0,1 2 V) tout au long
de la croisssance des vsicules sur plusieurs heures (gure 1.1b).
Dans le lm hydrat, les lipides sauto-arrangent en bicouches superposes.
Au dbut de la formation, on observe sur les plaques des domaines comportant
des milliers de vsicules micromtriques. Puis, sous leet de lagitation lectro-
osmotique produite par la tension alternative, ces vsicules fusionnent entre elles.
Le processus de croissance se fait donc par fusions successives de vsicules de plus
en plus grosses au fur et mesure que lintensit du champ augmente. Les vsicules
sont toujours relies au lm par un tube lipidique.
Contrairement au gonement spontan, les vsicules lectroformes peuvent
atteindre des tailles de plus de 100 m et le rendement est important. De plus
10 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
les vsicules obtenues sont en trs grande majorit unilamellaires [29] et sans d-
faut membranaire. Par contre, la taille nest pas contrle. Il nest pas possible de
travailler en condition physiologique
1
et, de part le processus mme dhydratation
dun lm de lipide, lencapsulation est inecace car elle implique que les mol-
cules passent au travers de pores, ce qui rduit la probabilit dencapsulation de
macromolcules.
1.1.3 Mthodes drives
Vsicules en conditions physiologiques
Lutilisation des vsicules comme systme modle de membranes biologiques est
une motivation forte pour former des vsicules en solution physiologique (milieu
fortement salin). En eet, des processus comme linteraction lectrostatique entre
membrane et protine, la fusion de vsicules ou encore les proprits de conduc-
tance de canaux ioniques sont dpendants de la force ionique du milieu. Plusieurs
pistes ont ainsi t dveloppes pour lever cette limitation. La technique propose
par Horger et al. [30] consiste en un gonement spontan ralis sur un lm daga-
rose. Le principe serait le suivant : la prhydratation du lm de lipide due au lm
dagarose permet lauto-organisation des lipides en bicouches avant lajout de la
solution ionique ; puis le gonglement du lm dagarose gnre une force normale
aux bicouches, ce qui favorise la croissance des vsicules ; enn la forte densit de
vsicules serait responsable des fusions entre vsicules adjacentes.
Deux autres mthodes sont des modications de llectroformation. La pre-
mire propose par Estes et Mayer [31] est une lectroformation dans une chambre
ux ; la chambre dlectroformation est semblable celle dcrite prcdemment
mais avec une entre et une sortie permettant de changer continuellement le uide
lintrieur de la chambre. La croissance des vsicules se fait de faon analogue
une lectroformation classique, une fois la taille souhaite obtenue, la solution non
ionique est alors remplace progressivement par une solution saline physiologique.
Au cours de cet change, la solution ionique diuse lintrieur des vsicules par
les tubes lipidiques les rattachant au substrat. La deuxime mthode dcrite par
Pott et al. [32] modie plus en profondeur le protocole standard. La croissance des
vsicules ne se fait plus sur des plaques dITO mais sur des lectrodes de platine.
Le dpt de lipides sur les lectrodes se fait partir dune solution aqueuse concen-
tre en vsicules submicroniques (on parle de LUV) prpares par des techniques
usuelles (sonication, extrusion ...). Aprs vaporation, la chambre est remplie avec
une solution physiologique et mise sous tension. Compar une lectroformation
classique, le champ lectrique appliqu est plus fort et la frquence plus leve
1
Lorsque la tension est trop importante, ou bien la solution trop saline, un courant stablit
dans la chambre perturbant la formation des vsicules.
1.1. MULSION INVERSE ET TRANSFERT SPONTAN 11
pour prevenir la formation de courant dans la chambre (500 Hz contre 10 Hz habi-
tuellement). Il est noter que ce protocole permet aussi la formation de vsicules
gantes partir de dpts sur les lectrodes de globules rouges fantmes (globules
vids de leur hmoglobine) qui sous leet du champ fusionnent [33].
Contrle de la croissance, inuence sur la taille des vsicules
Un autre axe dinvestigation concerne ltude de linuence du substrat sur
lequel est form le lm de lipide et du contrle de lpaisseur de celui-ci. Estes et
al. [34], en talant par tournette une solution de lipides sur les plaques ITO ont
montr quune paisseur de lm dans la gamme 25-50 nm est optimale pour obtenir
une croissance homogne sur toute la surface des plaques. De plus, les vsicules
ainsi formes sont plus nombreuses et en majorit plus grandes que celles obtenues
par lectroformation classique. Toujours dans loptique de contrler lpaisseur et
lorganisation du lm de lipides, des expriences ont t menes sur linuence de
dirents traitements de surface sur des wafers de silicium [35] ; le dpt vitesse
xe sur des substrats composs dune structure de puits circulaires [36] permet
de contrler la vitesse dvaporation du solvant, inuant ainsi sur lorganisation
interne du lm. Ces tudes montrent que la gamme de tailles des vsicules obtenues
partir de ces dpts est plus troite que dans le cas du protocole standard.
1.2 Mthode de lmulsion inverse et transfert
spontan
La mthode dite de lmulsion inverse dveloppe par Pautot et al. en 2003
[22] est une ide lgante qui propose dans un premier temps la formation spare
de chaque feuillet de la bicouche, les vsicules obtenues rsultant de lassemblage
nal des deux monocouches (gure 1.1 c). La mise en uvre est simple, une mul-
sion deau dans lhuile stabilise par des lipides est prpare par sonication ou
vortex puis dpose dans un tube centrifuger sur une solution aqueuse crant
ainsi une seconde interface huile-eau recouverte son tour par les lipides. Ltape
nale consiste centrifuger le tout pendant quelques minutes ; les gouttelettes plus
denses que lhuile sdimentent et au passage de linterface les deux monocouches
sassemblent ( zippent ) pour former une bicouche se refermant sur elle mme.
Sous leet de lacclration, les vsicules se dtachent de linterface huile-eau et
sont rcupres la n dans la phase aqueuse.
Cette technique de passage dinterface par des gouttelettes prsente potentiel-
lement de nombreux avantages en plus de ceux dtre simple et rapide : lencapsu-
lation est ecace, il sut dincorporer la substance que lon souhaite encapsuler
dans la solution aqueuse destine lmulsion ; seulement quelques microlitres sont
12 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
ncessaires pour former lmulsion permettant ainsi de prserver des produits rares
et/ou coteux. De plus la production de vsicules en conditions physiologiques est
facile et il est aussi possible de confectionner des membranes assymtriques [28].
Cependant, en raison de la grande polydispersit de taille des mulsions prpares
par sonication ou vortex, cette mthode ne permet pas un contle de la taille des
vsicules.
La dicult dissoudre les lipides dans lhuile est la principale source dir-
reproductibilit sans quune solution soit propose pour matriser ce point. De
plus, les vsicules obtenues (voir gure 1.2) sont en majorit petites (<5 m) [22]
et rsultent en partie de formation spontane linterface huile-eau. Centrifuger
une mulsion entire perturbe le passage de chaque goutte, attnuant sans doute
lecacit de production des vsicules.
Fig. 1.2: Image en contraste de phase de vsicules de POPC prpares par mulsion
inverse (Pautot et al. [22]).
Une autre mthode reposant sur le mme principe du passage une interface
huile/eau dune mulsion stabilise a t propose par Yamada et al. en 2006 [23].
La principale dirence rside dans le fait que la sdimentation de lmulsion se
fait sous laction de la pesanteur sans centrifugation. Au passage de linterface
lors de la formation de la bicouche, lacclration nest gnralement pas susante
pour dcrocher les vsicules qui restent donc attaches linterface. Pour cette rai-
son le montage exprimental se fait dans de petites chambres hautes de quelques
milimtres pour pouvoir observer les vsicules sous microscope (gure 1.3). Nan-
moins, Hamada et al. [37] ont observs quaugmenter la dirence de densit entre
la solution encapsule et la solution aqueuse externe favorise le dtachement de
linterface. Il est galement possible de fabriquer des vsicules assymtriques [37]
et plus gnralement les principaux points forts, mais aussi les limitations de la
mthode de lmulsion inverse sont aussi valable dans le cas du transfert spontan.
1.3. MTHODES EN MICROFLUIDIQUE 13
Fig. 1.3: Chambre de production et dobservation pour la mthode du transfert
spontan. A droite, image en contraste de phase des vsicules formes et attaches
linterface (Yamada et al. [23]).
1.3 Mthodes en microuidique
1.3.1 Jetting au travers dune bicouche prforme
Fig. 1.4: Schma de principe et squence dimages illustrant la formation dune
vsicule par la mthode de jetting : une bicouche est pralablement forme en
mettant deux gouttes de uide au contact dun lm de solvant contenant des
lipides puis un jet est puls contre la bicouche. Si la force et la vitesse du jet
ne sont pas parfaitement contrls, la formation dun long cou de uide et la
dstabilisation de celui-ci entranent la formation de vesicules satellites de plus
petite taille. (Funakoshi et al. [26]).
Dans la mthode du jetting rapporte en 2006 par Funakoshi et al. [26] puis
amlior par Stachowiak et al. en 2008 [25], un jet du uide encapsuler est puls
au travers dune bicouche dj forme dans une chambre microuidique (gure
1.4). Le montage exprimental est dlicat matriser, bien que permettant la pro-
duction de vsicules monodisperses. Il est cependant dicile datteindre des tailles
14 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
infrieures 100 m. Le rendement est bon mais la frquence de production des
vsicules est faible (quelques Hertz) car il est ncessaire dattendre que la bicouche
se reforme aprs la formation de quelques vsicules. Lencapsulation est ecace
et le travail en conditions physiologiques ne pose pas de problme. Si le processus
de gnration du jet nest pas parfaitement contrl, la quantit dhuile rsiduelle
dans la bicouche peut tre importante (jusqu plusieurs microns dpaisseur [26]).
De plus, de part la formation de ces vsicules en rgime inertiel, la membrane des
vsicules est tendue, rsultant en une stabilit limit dans le temps.
1.3.2 Double mulsion
La technique permettant de gnrer des double mulsions monodisperses [38]
a t propose comme tape intermdiaire pour la fabrication de vsicules [24]. Le
principe consite former dans un systme de capillaires imbriqus une gouttelette
de la solution encapsuler dans une goutte dhuile contenant des lipides, le tout
tant dispers dans une solution aqueuse (gure 1.5). La double mulsion ainsi
obtenue est stabilise par les lipides et toute la dicult rside dans lvaporation
du solvant. Lencapsulation, la formation en conditions physiologiques et le contrle
de la taille ne prsentent pas de dicult particulire. En revanche, lvaporation
du solvant gnre de nombreux dfauts membranaires et le rendement est faible.
En eet, la production de double mulsion est ecace mais lors de lexpulsion du
solvant beaucoup de ces capsules clatent. Il parat par ailleurs dicile denvisager
de construire des membranes assymtriques par cette mthode.
Fig. 1.5: Formation dune double mulsion stabilise par des lipides : des goutte-
lettes de solution aqueuse encapsuler sont entoures par une couche de solvant
contenant des lipides, le tout est dispers dans une solution aqueuse. Les lipides
migrent aux deux interfaces solvant/solution aqueuse, le point limitant tant lva-
poration complte du solvant. (Shum et al. [24])
1.3. MTHODES EN MICROFLUIDIQUE 15
1.3.3 Autres mthodes
a.
b.
Fig. 1.6: a. Une bicouche est forme la jonction de deux canaux microuidiques
en faisant circuler successivement une solution aqueuse, une solution dhuile conte-
nant des lipides puis de nouveau une solution aqueuse. La bicouche tant forme,
on injecte la solution aqueuse du bas dans le canal suprieur sous coulement, les
vsicules sont dtaches sous cisaillement hauteur dun plot dans le canal princi-
pal. (Ota et al. [27]). b. Une mulsion monodisperse deau dans lhuile est produite
dans une branche de la puce microuidique, les lipides prsents dans lhuile sta-
bilisent les gouttelettes. Lmulsion forme et une solution aqueuse se rejoignent
dans le canal principal et les lipides couvrent la nouvelle interface huile/eau. Le
passage des gouttelette de linterface huile/eau est forc par un obstacle dans le
canal. (Matosevic et al. [39]).
Dautres techniques utilisant la microuidique comme moyen de produire des
gouttelettes monodisperses deau dans lhuile stabilises par des lipides sont pro-
poses [27, 39, 40]. La plus rcente, dveloppe par Matosevic et al. [39] propose
de forcer le passage une interface huile/eau dune mulsion stabilise dans un
canal microuique (gure 1.6b). La mthode rapporte par Ota et al. [27] est une
implmentation ingnieuse de la formation de vsicules partir dune bicouche
dj forme (gure 1.6a) et soure des mme limitations concernant le renouvel-
lement de la bicouche. Enn, Tan et al. [40] plongent une mulsion monodisperse
stabilise pralablement fabrique en microuidique, dans une solution dthanol.
16 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
Un rarrangement des lipides conduit alors la formation dune bicouche. Toutes
ces mthodes napportent pas de grand changement, la taille est certes contrle
mais le rendement est faible et le problme de dissolution des lipides dans lhuile
nest pas rsolu.
1.4 Quelles techniques pour quelles applications ?
Et aprs ?
Chacune des mthodes dcrites prcdemment possde ses propres avantages
et limitations, ainsi suivant lapplication envisage une technique particulire sera
prfrentiellement choisie. Pour des tudes portant sur les transitions de phases ou
la dynamique des lipides dont la qualit de la bicouche est essentielle, on prfrera
llectroformation [21] qui donne des vsicules unilamellaires sans dfaut mem-
branaire. Pour des applications ncessitant lencapsulation de protines (recons-
titution du cytosquelette [16, 17], expression de GFP [15] ...), lmulsion inverse
[22] et le transfert spontan [23] seront les mthodes de choix ; simples mettre en
uvre et rapides, elle permettent de plus la fabrication de bicouches assymtriques
[28, 37]. Nanmoins leur principale limitation reste leur faible reproductibilit. Si
le contrle de la taille est recherch alors les techniques en microuidiques sont
toutes indiques [24, 39, 40], par contre les rsidus de solvant dans la bicouche
et/ou le faible rendement en limitent leur utilisation.
Dans la suite, nous prsenterons comment runir le maximum davantages en
une seule technique. Nous discuterons des possibilits quore cette nouvelle m-
thode ainsi que de ses limitations.
Chapitre 2
Mthodes exprimentales
Nous prsentons dans ce chapitre les direntes techniques exprimentales.
Nous dcrivons dabord le dispositif utilis pour la fabrication des vsicules, puis
le protocole pour dissoudre les lipides dans lhuile minrale ainsi que le moyen
pour caractriser la solution de lipides. Enn, nous terminons par expliquer la
technique danalyse dimage employe pour obtenir les distributions de tailles des
gouttelettes et des vsicules.
2.1 Montage exprimental
La chambre dans laquelle sont produites les vsicules est constitue de deux
couvercles
1
de bote de ptri (35 mm de diamtre) colls entre eux et dont lun
comporte en son centre un trou de 1 cm de diamtre (gure 2.1). Cette chambre est
alors xe sur un moteur dont on contrle la vitesse de rotation (typiquement entre
10 et 40 Hz). Une fois en rotation, la chambre est successivement remplie avec :
1 ml de la solution aqueuse dans laquelle on rcuprera les vsicules, 3.5 ml de la
solution dhuile contenant les lipides et 1 ml de la phase continue dans laquelle
sera introduit le capillaire pour la production de gouttelettes monodisperses. Le
capillaire de verre, rempli de la solution que lon souhaite encapsuler est connect
un systme de pression (mfcs-4c de Fluigent) pilot par ordinateur permettant
de xer la pression dinjection et donc la frquence de production des gouttelettes.
Il est ensuite introduit dans la phase continue tout en restant au plus prs de
linterface avec lair. Aprs quelques minutes de production, le capillaire est retir
et la rotation de la chambre stoppe progressivement pour limiter le cisaillement
linterface. Les vsicules sont rcupres en aspirant dlicatement la solution
aqueuse externe avec une micropipette.
1
Lutilisation de deux couvercles permet de limiter la hauteur de la chambre et donc le volume
de solution de lipides ncessaire.
17
18 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
Fig. 2.1: a. La chambre est xe sur le moteur. Le capillaire en verre contenant
la solution encapsuler est connect sur un tuyau de silicone lui mme reli au
contrleur de pression. Dans lencart, la chambre de production est compose de
deux couvercles de boite de ptrie de 35 mm de diamtre colls ; un trou de 15
mm de diamtre est eectu avec une perceuse de prcision sur lun des couvercle
avant dtre assembl. b. Vue rapproche du capillaire introduit dans la couche de
phase continue.
2.2. DISSOLUTION DES LIPIDES 19
2.2 Dissolution des lipides
La dissolution des lipides dans lhuile minrale est un point cl pour le succs de
la mthode et ncessite une attention particulire tout au long de la prparation.
En particulier, le contrle de lhumidit est critique et toute la dissolution est faite
dans une boite gants en plastique alimente par de lazote pour stabiliser le
taux dhumidit entre 8 et 12 %. Les lipides proviennent indiremment de chez
Sigma Aldrich ou Avanti Polar Lipids. Ds leur rception, ils sont dissous 50
mg/ml dans un mlange chloroforme/mthanol (proportion 9:1, v/v). On laisse
la solution mre reposer pendant trois semaines au conglateur avant de pouvoir
lutiliser durant cinq mois.
Une bouteille en verre de 25 ml, hermtique, pralablement sche lazote est
ouverte dans la boite gants. 160 l de la solution mre de lipides sont ajouts
200 l du mlange chloroforme/mthanol (9:1) de faon recouvrir compltement
le fond de la bouteille. Le solvant est alors vapor sous vide pendant une vingtaine
de minutes, rsultant en un lm de lipides trs blanc, opaque, sur le fond de la
bouteille. Le vide est alors cass dans la boite gants (toujours 8-12% dhumidit)
et 20 ml dhuile minrale (sigma aldrich #M3516) sont ajouts pour atteindre une
concentration nale en lipide de 0,5 mM. La bouteille, ferme hermtiquement est
laisse au repos sur la paillasse pendant une heure. Lhuile minrale imprgne alors
le lm de lipides que lon voit apparatre au cours du temps lgrement blanc sur
le fond. Finalement, la solution est vortexe durant une vingtaine de seconde avant
de la soniquer pendant une heure en maintenant la temprature du bain infrieure
40
C.
2.4 Mesure de tension de surface
2.4.1 Exprience de goutte pendante
La mthode dite de la goutte pendante est la solution retenue pour mesurer la
tension de surface entre la solution encapsuler et la solution dhuile contenant
les lipides. Pas trop dicile mettre en uvre, elle donne des rsultats prcis (de
lordre de quelques mN/m). Lors dune exprience de mesure, une goutte du uide
le plus dense est gone au bout dun capillaire dans le uide le moins dense. La
forme de la goutte dpend alors de la comptition entre les forces de tension de
surface qui tendent garder la goutte sphrique et le poids de la goutte qui la
dforme.
En pratique, une goutte de 15 l est gone un dbit de 5500l/h dans une
solution dhuile avec des lipides. Au cours du temps, les lipides sadsorbant sur
la surface de la goutte, la tension de surface dcrot et la goutte se dforme jus-
qu casser lorsque le poids devient trop important. Pour viter des problmes de
mouillage, le capillaire est trait au silane (voir protocole prcdent). Lvolution
de la forme de la goutte est enregistre avec une camra sur laquelle est mont
un objectif macro sur souet pour obtenir une meilleure rsolution (idalement la
goutte dforme occupe la surface entire du capteur de la camra soit 600x800
pixels). La goutte est claire par derrire travers un matriaux diusant rsul-
tant ainsi en un fort contraste entre la goutte et larrire plan. Pour obtenir une
chelle de longueur et viter les aberrations optiques, une bille dacier de diamtre
connu est prise en photo dans la solution dhuile. Enn, lvolution de la tension
de surface est dtermine par analyse dimage du contour de la goutte.
2.4.2 Analyse dimage pour dterminer la tension
Pour une goutte pendante lquilibre, on peut crire en un point S(x,z) de la
surface lquation de Young-Laplace qui dcrit la dirence de pression linterface
due aux forces de tension de surface:
(P)
S
=
_
1
R
1
+
1
R
2
_
, (2.1)
o reprsente la tension de surface et R
1
= SM, R
2
= SN sont les deux rayons
de courbure principaux de la surface au point S (voir gure 2.2). A lapex (le point
le plus bas de la goutte) R
1
= R
2
= b et la dirence de pression scrit:
2.4. MESURE DE TENSION DE SURFACE 21
Fig. 2.2: a. Montage exprimental pour la mesure de tension de surface: une
seringue contenant la solution aqueuse est connecte un capillaire de verre trait
hydrophobe et xe sur un pousse seringue dispos verticalement; lextrmit du
capillaire trempe dans la solution dhuile contenant les lipides. Dans le cadre,
un zoom sur la goutte gone dans lhuile au bout du capillaire. b. Paramtres
gomtriques pour dcrire le contour dune goutte: R
1
= SM est le premier rayon
de courbure contenu dans le plan (xz), R
2
= SN est le second rayon de courbure
contenu dans le plan perpendiculaire (xz) passant par SN, ds est le dplacement
lmentaire le long de labcisse curviligne.
22 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
(P)
0
=
2
b
. (2.2)
En un point S(x,z) quelconque de la surface, on a la pression du ct de la
phase aqueuse P
a
= (P
a
)
0
+
a
gz et du ct de la phase huile P
h
= (P
h
)
0
+
b
gz,
avec (P
a
)
0
et (P
h
)
0
les pressions lapex dans chaque phase,
a
et
h
les densits
de la phase aqueuse et de la phase huile respectivement. Le saut de pression au
point S scrit alors:
(P)
s
=
2
b
+ gz. (2.3)
Par des condidrations gomtriques simples (voir gure 2.2), on peut crire
z = R
2
cos et dS = R
1
d, soit:
1
R
1
+
1
R
2
=
d
dS
+
cos
z
, (2.4)
o dS est llment innitsimal de dplacement de la coordonne curviligne. On
cherche exprimer R
1
et R
2
en coordonnes cartsiennes. On a (dS)
2
= (dx)
2
+
(dz)
2
, soit:
dS
dx
=
_
1 +
_
dz
dx
_
2
, (2.5)
de plus,
d
dS
=
d
dx
dx
dS
=
d
dx
1
(1 + z
2
)
1/2
. (2.6)
De dz = dS sin et dx = dS cos , on en dduit que
d
2
z
dx
2
=
d(tan )
dx
=
1
cos
2
d
dx
= (1 + z
2
)
d
dx
, (2.7)
soit en reportant dans 2.6:
d
dS
=
z
(1 + z
2
)
3/2
. (2.8)
Pour le rayon de courbure R
2
, il vient de dx = dS cos et de lquation 2.6:
1
R
2
=
cos
z
=
1
z(1 + z
2
)
1/2
. (2.9)
Finalement, en reportant 2.3, 2.8 et 2.9 dans lquation de Young-Laplace (2.1),
on obtient lquation direntielle suivante pour le contour de la goutte:
2.4. ANALYSE DIMAGE: DISTRIBUTION DE TAILLE 23
z
(1 + z
2
)
3/2
+
z
z(1 + z
2
)
1/2
=
2
b
+ gz; (2.10)
et g sont connu, le rayon de courbure lapex b est mesur sur les images et
la tension de surface est le paramtre dajustement.
Sur les images, le contour de la goutte ayant t extrait, on cherche une solution
polynomiale lquation 2.10 qui passe par les points du contour en utilisant une
mthode des moindres carrs.
2.5 Dtermination des distributions de taille par
analyse dimage
Les distributions de taille des gouttelettes et des vsicules sont obtenues par
traitement dimage partir de photos prises en champ clair pour les gouttelettes et
en contraste de phase pour les vsicules. Une variante pour faciliter le traitement
dimage dans le cas des vsicules consiste encapsuler une solution de billes uo-
rescentes de 20 ou 60 nm. Lors du traitement, un premier ltre sobel (un oprateur
qui calcule les variations dintensit) est appliqu pour dtecter les contours, ceux-
ci sont ensuite ans puis limage est binarise. Cette image constitue le point de
dpart pour la recherche des gouttes ou vsicules par la mthode de la transforme
de Hough. Le principe est le suivant: pour un cercle de rayon R connu, tous les
points (x,y) appartenant son primtre peuvent gnrer un cercle de centre (x,y)
et de rayon R, lintersection (a,b) commune tous ces cercles est le centre du
cercle recherch (voir gure 2.3); si le rayon est inconnu alors chaque point (x,y)
de limage appartenant un cercle, gnre un cne dans lespace paramtr de
dimension 3 (a,b,r); la recherche se ramne alors au problme prcdent en eec-
tuant une recherche dans chaque plan r = constante. En construisant pour chaque
valeur de r une matrice daccumulation (gure 2.3c) qui reprsente le nombre din-
tersections de cercles en chaque point et aprs un seuillage sur cette matrice, on
obtient nalement les triplets (a,b,R) pour chaque cercle de limage initiale. On
vrie la pertinence du traitement en superposant les cercles dtects avec limage
initiale (gure 2.3g).
24 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
Fig. 2.3: a. Chaque point de coordonnes (x,y) appartenant un cercle de rayon
R, gnre dans lespace paramtr un cercle de rayon R et de centre (x,y); le point
dintersection (a,b) de ces cercles correspond aux coordonnes du centre du cercle
recherch dans lespace gomtrique. b. Si les rayons ne sont pas connus, chaque
point du primtre gnre alors un cne dans lespace paramtr de dimension 3;
le problme se ramne deux dimensions pour chaque coupe r=R. c. Exemple
dune matrice daccumulation pour un R donn: en chaque point de lespace para-
mtr, le nombre dintersections est reporte. d. Image originale en champ clair de
gouttelettes. e. Dtection des contours aprs application du ltre sobel. f. Image
binaire et anage des contours. g. Superpositon de limage originale et des cercles
dtects
Chapitre 3
Continuous Droplet Interface
Crossing Encapsulation (cDICE):
des gouttelettes aux vsicules
Le principe du passage une interface huile/eau de gouttelettes stabilises par
des lipides, exploit dans la mthode de lmulsion inverse [41] et du transfert spon-
tan [23] est une ide lgante ncessitant dtre approfondie et sa mise en uvre
modie. En particulier, le manque de contrle de la production des gouttelettes,
du recouvrement en lipides des interfaces et du passage nal, est directement res-
ponsable du faible rendement et de la non reproductibilit de ces techniques de
passage dinterface. Partant de ce constat, nous proposons un dispositif expri-
mental simple permettant un contrle n de ces dirents points, levant ainsi les
principales limitations voques prcdemment.
3.1 Principe de fonctionnement
Lastuce est de concilier en une seule tape et sur un seul montage, la pro-
duction de gouttelettes monodisperses, la stabilisation de cette mulsion par des
lipides et le passage une interface huile/eau couverte de lipides pour lassemblage
nal de la bicouche. Le dispositif exprimental reprsent sur la gure 3.1, consiste
en une chambre cylindrique en rotation autour de son axe vertical dans laquelle
trois solutions sont successivement introduites: une solution aqueuse qui sera la so-
lution de suspension des vsicules produites (dans la suite on la notera DAS pour
Dispersing Aqueous Solution), une solution moins dense de lipides dissous dans
de lhuile (note LOS pour Lipid in Oil Solution) et un alcane servant de phase
continue (le plus souvent du dcane) de faible viscosit et de densit plus faible
que les solutions prcdentes et servant la production contrle des gouttelettes
25
26 CHAPITRE 3. CDICE
Fig. 3.1: Vue de ct de la chambre, le capillaire est xe et la chambre tourne la
vitesse angulaire . Les gouttelettes monodisperses de la solution encapsuler sont
produites dans la couche de dcane faible nombre capillaire C
a
et sous laction de
la force centrifuge transitent dans la LOS vers linterface LOS/DAS. Le temps
s
ncessaire pour que les lipides saturent la surface dune gouttelette doit tre plus
petit que le temps de vol
F
dans la LOS. Le passage linterface a lieu dans
un rgime pour lequel les forces inertielles sont faibles devant les forces de tension
de surface.
monodisperses. Ces trois couches de uides immiscibles, sous laction de la force
centrifuge, forment entre elles des interfaces verticales. Un capillaire contenant
la solution aqueuse que lon souhaite encapsuler (note EAS pour Encapsulated
Aqueous Solution) est introduit dans la phase continue (CP) en restant au plus
prs de linterface avec lair. LEAS est alors injecte dbit constant. Lorsque
les forces de tension de surface dominent les forces visqueuses, dnissant ainsi le
rgime dcoulement faible nombre capillaire C
a
=
cp
v
cp
d/d
i
1 (
cp
et v
cp
sont la viscosit et la vitesse de la phase continue, d et d
i
les diamtres respectifs
des gouttelettes et du capillaire et la tension de surface EAS/CP), les goutte-
lettes arraches de la pointe du capillaire ont une distribution de taille trs troite
(gure 3.5). Ces gouttelettes sont immdiatement soumises la force centrifuge
qui les pousse radialement vers linterface LOS/DAS. Durant leur trajet dans la
couche de LOS, les lipides sadsorbent sur la surface des gouttelettes. Lors de cette
tape, le temps
F
ncessaire aux gouttelettes pour traverser la couche de LOS
dpaisseur e, doit tre plus grand que le temps caractristique
s
pour saturer les
interfaces en lipides. Dans le rgime des faibles nombres de Reynolds, pour lequel
les forces inertielles sont ngligeables devant les forces visqueuses,
F
se dtermine
partir de lquilibre atteint en rgime stationnaire entre la force de Stokes et
la force centrifuge agissant sur la gouttelette:
F
= 9/(2R
2
2
) ln(1 + e/r
0
)
1
,
1
A faible nombre de Reynolds, lquiblibre entre la force de Stokes et la force centrifuge revient
rsoudre lquation direntielle du premier ordre suivante:
4
3
R
3
2
r(t) 6R
dr
dt
= 0
3.2. PRODUCTION DES GOUTTELETTES 27
o est la viscosit de la LOS, la dirence de densit entre EAS/LOS, R
le rayon des gouttelettes, la vitesse angulaire de la chambre et r
0
la distance
au centre do sont produites les gouttelettes. Lorsque les gouttelettes atteignent
linterface LOS/DAS galement sature en lipides, les deux monocouches de lipides
sassemblent au cours du passage au travers de linterface pour former la bicouche
lipidique renfermant la solution encapsule. Les vsicules ainsi formes sont sus-
pendues dans la DAS. Nous dcrivons par la suite les dirents mcanismes qui
sous-tendent ces trois tapes.
3.2 Production des gouttelettes
3.2.1 Contrle de la taille
Le dispositif dinjection dans la chambre en rotation consiste en un capillaire
de verre introduit radialement dans la phase continue non aqueuse, lapplication
dune dirence de pression P permet alors dinjecter lEAS dans la CP (gure
3.2). Grce ce systme, des gouttelettes sont formes de faon continue: chaque
fois que les forces visqueuses lemportent sur les forces de tension de surface qui
maintiennent la goutte sur le capillaire, une gouttelette se dtache.
Fig. 3.2: a. Vue de dessus de la chambre, le capillaire est introduit dans la phase
continue (CP) et une gouttelette est sur le point dtre dtache (ux de la droite
vers la gauche). b. Exemple dmulsion produite avec le montage dcrit prcdem-
ment. Lchelle reprsente 30m dans les deux cas.
28 CHAPITRE 3. CDICE
Dans le cas du rgime C
a
1, les gouttelettes retenues la pointe du capillaire
par la tension de surface, gonent puis se dtachent au niveau de la pointe, formant
ainsi des gouttelettes monodisperses (gure 3.3a.). Au contraire, lorsque C
a
1,
les forces visqueuses tirent la goutte en formation en un long cou instable donnant
lieu un mcanisme de pincement loign de la pointe et alatoire (gure 3.3b.).
Forces de tension de surface
Forces visqueuses
flux
flux
polydispersit < 10 % C
a
1
polydispersit importante C
a 1
a.
b.
Fig. 3.3: a. A bas nombre capillaire, les gouttelettes grossissent sans grande d-
formation et se dtachent de la pointe du capillaire quand les forces visqueuses
excdent les forces de tension supercielles, rsultant en la production de gout-
telettes monodisperses. b. Lorsque le nombre capillaire nest plus susamment
faible, les forces visqueuses tirent la gouttelette dont la surface se dstabilise et
se dtache de faon irrgulire.
En crivant lquilibre des forces de tension de surface ( d
i
) et des forces
visqueuses ( 3dv), la taille des gouttelettes peut tre exprime en fonction du
nombre capillaire:
d
d
i
= A
1
C
a
, (3.1)
o d et d
i
sont respectivement le diamtre de la gouttelette et le diamtre interne
du capillaire. En considrant la force visqueuse gale, en premire approximation,
3.2. PRODUCTION DES GOUTTELETTES 29
la force de Stokes sappliquant sur une sphre de diamtre d, F
stokes
= 3
cp
dv
cp
,
alors A = 1/3. Nous avons mesur le rapport d/d
i
pour une grande gamme de
valeur de C
a
, les rsultats sont reprsents sur la gure 3.4 et lon trouve une
dcroissance en 1/C
a
avec une amplitude A
t
= 0, 11; du mme ordre de grandeur
que la valeur thorique donne par la loi de Stokes. La formule donne par Stokes
est valable pour un coulement autour dune sphre loigne de parois ce qui nest
pas le cas dans notre systme o les gouttelettes sont retenues la pointe dun
capillaire, modiant ainsi lcoulement autour de celles-ci. De plus langle des forces
capillaires nest pas forcment selon la verticale et il y a un coulement dans la
gouttelette.
Fig. 3.4: Diamtre des gouttelettes produites normalise par le diamtre interne
du capillaire en fonction du nombre capillaire. La courbe passant par les points
exprimentaux est un ajustement de la fonction
d
d
i
= A
1
C
a
avec A=0,11.
La taille des gouttelettes est donc contrle par deux paramtres: d
i
et C
a
. An
dobtenir une taille donne d, il est donc possible de faire varier les trois paramtres
cp
, v
cp
et d
i
(la tension de surface variant assez peu) tout en se plaant toujours
un C
a
faible. Changer la viscosit
cp
implique de trouver un uide non aqueux, de
densit infrieure la LOS et avec un contraste de viscosit important par rapport
la LOS pour ralentir leur mlange. La vitesse v
cp
est xe entre autre par , la
vitesse de rotation; celle-ci ayant galement une inuence sur la force centrifuge
30 CHAPITRE 3. CDICE
agissant sur les gouttelettes et donc sur les autres tapes de la formation, nous
viterons par la suite dutiliser ce paramtre pour le contrle de la taille. Le plus
simple reste dajuster la taille du capillaire d
i
. Ainsi pour des tailles de capillaires
comprises entre 4 et 30 m, des gouttelettes monodisperses peuvent facilement tre
produites dans lintervalle 4-100 m de diamtre (gure 3.5). Dans notre gomtrie
dinjection avec le capillaire introduit radialement la phase continue, le dbit ne
joue pas de rle sur la taille des gouttelettes. Des variations sont observes lorsque
le capillaire nest plus radial, il faut alors tenir compte de la vitesse relative entre
EAS et CP, et le rapport d/d
i
Q
1/3
avec Q le dbit dinjection [42].
Diamtre
Fig. 3.5: Distribution de taille des gouttelettes produites dans la gamme 4-70
m. La densit de probabilit (d) est reprsente en fonction du diamtre. Les
courbes correspondent des ajustements gaussiens avec d) = 3, 8 m et =
0, 2 m (triangles renverss orange); d) = 8, 5 m et = 0, 6 m (cercles bleu);
d) = 18, 2 m et = 1, 8 m (carrs vert); d) = 38 m et = 2 m (triangles
roses); d) = 67, 9 m et = 1, 2 m (losanges violet). Les gouttelettes ont t
produites dans lordre croissant des tailles, un nombre capillaire C
a
= 0, 2 et un
capillaire de 4 m; C
a
= 0, 06 et d
i
= 5 m; C
a
= 0, 035 et d
i
= 6 m; C
a
= 0, 035
et d
i
= 13 m et C
a
= 0, 04 et d
i
= 27 m.
3.2. PRODUCTION DES GOUTTELETTES 31
3.2.2 Frquence de production
Pour un nombre capillaire donn xant le diamtre des gouttelettes, la fr-
quence de production f
drop
est dtermine par le dbit dinjection Q qui dpend
de la dirence de pression applique:
Q =
P
R
H
, (3.2)
o P est la dirence de pression et R
H
la rsistance hydrodynamique du capil-
laire donne par la relation R
H
= 8L/R
4
dans le cas dun capillaire cylindrique
de rayon R et de longueur L avec la viscosit du uide inject.
Par ailleurs, pour des petits diamtres de capillaire, la pression de Laplace
P
L
= 4/d
i
sopposant la sortie du uide est non ngligeable: pour des pressions
dinjections infrieures la pression de Laplace, la production de gouttelettes cesse;
des pression suprieures P
L
, le dbit est proportionnel P et la frquence
de production des gouttelettes augmente linairement avec P.
Fig. 3.6: Frquence de production des gouttelettes en fonction de la dirence de
pression applique. Les gouttelettes sont produites dans du dcane avec un capil-
laire de 10,8 m et une vitesse de 30 trs/s, la tension de surface entre la solution
de sucrose 400 mM et le dcane est gale 52 mN/m. La ligne verticale 193 mbar
reprsente la pression de Laplace calcule, en bonne adquation avec la pression
de coupure P
c
= 190 mbar. La frquence de production crot linairement avec
la pression au dessus de P
c
.
32 CHAPITRE 3. CDICE
Exprimentalement, la pression de coupure P
c
en dessous de laquelle la pro-
duction de gouttelettes est stope, correspond comme attendu, la pression de
Laplace calcule (gure 3.6). La frquence de production sexprime donc F
drop
=
Pd
3
/6R
H
3.3 Dispersion des lipides et lipides aux inter-
faces
Le contrle de la couverture en lipides des interfaces eau-huile et en particulier
des gouttelettes durant leur traverse de la solution dhuile contenant les lipides
(LOS), est un point primordial pour le succs de la production de vsicules. La
surface des gouttelettes doit tre sature en lipides avant datteindre linterface
LOS/DAS en un temps
s
infrieur
F
, le temps pour traverser la couche dhuile.
3.3.1 Cintique dadsorption
Nous avons mesur la cintique dadsorption des lipides linterface eau-huile
par des expriences de goutte pendante [43]. Lvolution au cours du temps de la
tension de surface entre la solution aqueuse encapsuler (EAS) et la LOS est
reprsente sur la gure 3.7 pour direntes concentrations en Egg-PC.
Pour chaque concentration, dcroit pour atteindre une valeur nale de 11
mN/m lorsque, les forces de tension de surface ne pouvant plus contrebalancer le
poids de la goutte, celle-ci se dtache du capillaire. Pour chaque concentration,
il est possible dajuster les valeurs mesures par une exponentielle dcroissante,
cette fonction na quune valeur empirique mais permet nanmoins dextraire un
temps caractrisque
s
pour saturer linterface:
s
= 14 s 0,5 mM;
s
= 25 s
0,25 mM et
s
= 55 s 0,125 mM. Les modles dvelopps dans le cadre de la
cintique dadsorption contrle par la diusion molculaire des phospholipides
linterface chloroforme-eau [44, 45] ne permettent pas de dcrire nos expriences,
probablemant parce que les lipides disperss dans lhuile minrale forment des
agrgats micromtriques que nous allons dcrire dans le paragraphe suivant.
Les rsultats des expriences de goutte pendante montrent la forte dpendance
la concentration en lipides de la cintique dadsorption linterface eau-huile. La
cintique relativement rapide obtenue pour la concentration de 0,5 mM (
s
= 14 s),
est bien adapte aux contraintes gomtriques de notre chambre de production. En
eet, la taille restreinte de la chambre ne permet pas davoir une paisseur de LOS
importante (2-3 mm), le temps
F
tant par consquent court, il est ncessaire
dobtenir une cintique dadsorption rapide. Pour une taille de goutte donne, il
faut sassurer que la condition
F
>
s
est bien respecte.
F
peut tre ajust en
3.3. DISPERSION DES LIPIDES ET LIPIDES AUX INTERFACES 33
t=0s t=10s t=15s t=20s
t=25s t=30s t=33s t=33.4s
Temps
Fig. 3.7: Evolution de la tension de surface entre une solution de sucrose 400 mM
et des solutions direntes concentrations dEgg-PC dissous dans lhuile minrale:
0,5 mM (ronds rouge); 0,25 mM (carrs bleu); 0,125 mM (losanges vert) et huile
minrale seule (triangles noir). Les donnes sont ajustes par des exponentielles
dcroissantes desquelles on extrait le temps caractristique
s
pour saturer linter-
face:
s
(0, 5mM) = 14s;
s
(0, 25mM) = 25s;
s
(0, 125mM) = 55s. Le dcalage au
temps t=0 entre lhuile seule et les autres courbes est d au dbut dadsorption
des lipides durant le gonement de la goutte. Dans le cadre, les photos illustrent
la dformation de la goutte sous laction de son poids lorsque la tension de surface
diminue; cette srie correspond la dynamique pour une concentration de 0,5 mM
dEgg-PC (courbe rouge gauche).
modiant certains des paramtres dont il dpend: , , e (paisseur de la couche
de LOS) et
2
.
La dirence de densit entre EAS et LOS nest pas un paramtre que lon
peut faire varier de faon consquente car le gain sera trs faible au regard de la
dpendance linaire. An daccrotre
F
, il est possible daugmenter la viscosit
de la LOS. Pour cela, il faut soit dissoudre des lipides dans une huile plus visqueuse
que lhuile minrale ( = 30 mPas) tout en sassurant dune cintique dadsorp-
tion rapide, ou bien eectuer un mlange entre une solution dhuile minrale plus
concentre en lipides avec un autre alcane plus visqueux. Il est donc galement
dicile dobtenir une forte augmentation de
F
partir de la viscosit. La vitesse
de rotation est en revanche un levier important du fait de la dpendance en
2
de
F
. Cependant il faudra alors adapter en consquence le diamtre du capillaire
34 CHAPITRE 3. CDICE
et/ou la viscosit de la phase continue pour conserver le nombre capillaire initial
qui xe la taille des gouttelettes produites (se reporter la gure 3.4). Enn, on
peut galememt ajuster lpaisseur de la couche de LOS mme si la marge est faible
du fait des contraintes gomtriques. Enn, la stratgie consistant augmenter la
concentration de lipides pour diminuer
s
nest pas recommande. En eet, il est
prfrable de ne pas travailler des concentrations plus leves que 0,5 mM. Au
del, la vsiculation spontane aux interfaces eau-huile devient importante [41],
entranant par la mme, une dgradation de la qualit des vsicules.
Nous avons galement ralis des expriences de goutte pendante pour dautres
lipides ou mlange de lipides (gure 3.8). Pour 0,5 mM de POPS (lipide charg
ngativement) la dcroissance au cours du temps de la tension de surface nest plus
monotone. Nous observons une premire marche suivie dun long plateau avant de
dcrotre nouveau par une marche. Ce comportement pourrait sexpliquer par
la prsence dagrgats de lipide de taille importante (> 30m) dans la solution
dhuile: quand lun de ces agrgats rencontre la surface de la goutte, la grande
quantit de lipides prsents rsulte en une dcroissance soudaine de la tension
de surface qui stagne alors jusqu ce quun nouvel agrgat sadsorbe. Ce com-
portement peut certainement tre corrig en utilisant un protocole de dissolution
adquat (voir discussion de la section suivante).
Fig. 3.8: Evolution de la tension de surface pour 0.5 mM de lipides: Egg-PC
(cercles rouges), 95% Egg-PC et 5% Peg-PE (carrs bleu), POPS (losanges vert).
Idalement il serait ncessaire de mesurer la cintique dadsorption pour tous
3.3. DISPERSION DES LIPIDES ET LIPIDES AUX INTERFACES 35
nouveaux lipides ou mlange de lipides an de sassurer que la condition
F
>
s
puisse tre vrie. Le tableau 3.1 liste les dirents systmes prpars sans
modication du protocole dcrit dans la partie mthodes exprimentales, et avec
lesquels nous avons produit avec succs des vsicules avec la mthode cDICE.
Lipides seul Mlanges de lipides
Egg-PC Egg-PC + 10% POPS
DOPC Egg-PC + 10% DOPG (une charge -)
POPS (une charge -) Egg-PC + 10% PIP2 (3 charges -)
Egg-PC + 5% PEG-PE
Tab. 3.1: Lipides et mlanges de lipides utiliss pour la production de vsicules.
3.3.2 Dispersion des lipides
La dispersion des lipides dans lhuile minrale est une tape critique pour obte-
nir une cintique dadsorption rapide mais aussi pour dterminer la qualit nale
des vsicules (prsence de dfauts sur la membrane ou encapsulation de dbris
lipidiques). Dans les solutions dhuile minrale les lipides ne sont pas dissous indivi-
duellement, si tel tait le cas, la cintique dadsorption des lipides serait beaucoup
plus lente. La diusion des molcules de lipide (quelques nanomtres) dans lhuile
minrale (viscosit 30 mPas) engendrerait des temps de saturation suprieur la
minute [45], en dsaccord avec les cintiques dadsorption (15 s) obtenues. En
eet, pour les modles dadsorption limit par la diusion, le temps de saturation
s
1/D [46] avec D le coecient de diusion ( 1/). Il est trs probable que
la prsence en solution dagrgats micromtriques, vritables rservoirs de lipides,
permette les cintiques rapides mesures.
Lors de la dispersion des lipides dans lhuile minrale, une attention particu-
lire doit tre porte aux conditions dhumidit. Lobtention de solutions repro-
ductibles est conditionne par la dissolution des lipides sous atmosphre controle
10 % dhumidit tout au long de la prparation comme dcrit dans le chapitre
mthodes exprimentales . Ltat nal du lm de lipides aprs vaporation du
solvent est grandement dpendant de la teneur en eau due lhumidit (gure 3.9)
mais aussi de la cintique dvaporation: modier le rapport chloroforme/mthanol
rsulte en un aspect du lm dirent donc dorganisation interne dirente, res-
ponsable dun tat de dispersion dans lhuile minrale modi.
La taille des agrgats de lipides en solution a une rpercussion directe sur la qua-
lit des vsicules. La gure 3.10 illustre les dirences entre des vsicules produites
partir de trois LOS de 0,5 mM dEgg-PC. La solution contenant des agrgats de
taille infrieure 5 m donne les meilleurs rsultats, les vsicules ne comportent
36 CHAPITRE 3. CDICE
Fig. 3.9: Motifs de lm de lipides prpars dirent taux dhumidit: a. 10 %;
b. 23 % et c. 40 %. Lchelle reprsente 20 m.
pas de dfaut et sont stables plus dun mois temprature ambiante. Avec des
agrgats dont la taille est comprise entre 5 et 10 m, des dfauts apparaissent,
quelques vsicules renferment des rsidus de lipides ou possdent des dfauts sur
la membrane; quand les agrgats mesurent plus de 10 m, la plupart des vsicules
prsentent des dfauts sur leur membrane ou renferment des structures lipidiques.
Les dispersions de lipides dans lhuile minrale sont des systmes qui voluent
dans le temps. Les premiers agrgats micromtriques apparaissent une nuit aprs
la sonication et grossissent au cours du temps pour un chantillon laiss au repos.
Cest pour cette raison quil est prfrable dutiliser la LOS durant les quelques
jours qui suivent sa prparation.
3.3.3 Couverture continue des interfaces
Le renouvellement en lipides des interfaces est une condition essentielle lob-
tention dun rendement important (le nombre de gouttelettes produites qui de-
viennent eectivement des vsicules). La production de gouttelettes par goutte
goutte et le contrle de la frquence de production que nous autorise ce systme,
permet dindividualiser la trajectoire de chaque gouttelette dans la LOS jusquau
passage de linterface, optimisant ainsi la couverture en lipides des interfaces eau-
huile et le renouvellement des endroits dplts en lipides. En eet, aprs le passage
dune gouttelette linterface LOS/DAS, toute une zone se retrouve dplte en li-
pides. Si une gouttelette arrive sur linterface cet endroit avant que la zone aie eu
le temps de se regnrer en lipides, alors le zipping complet des deux monocouches
choue et la gouttelette se dilue dans la DAS (gure 3.11).
En plus dimpacter le rendement, le passage rt dune gouttelette laisse sur
linterface de nombreux dbris lipidiques qui sont lorigine de dfauts: lorsquune
gouttelette atteint linterface en un endroit prsentant des dbris, la majorit des
3.3. DISPERSION DES LIPIDES ET LIPIDES AUX INTERFACES 37
Fig. 3.10: Inuence de la taille des agrgats de lipides sur la qualit des vsicules.
Sur la range suprieure, photos de solutions contenant 0,5 mM dEgg-PC: agrgats
de 2 5 m en A, de 5 10 m en B et suprieur 10 m en C. Les photos de la
range infrieure correspondent aux vsicules produitent avec chaque solution: pour
les plus petits agrgats, les vsicules ne prsentent pas de dfauts; pour les agrgats
de taille suprieure en B, quelques vsicules possdent des dfaut sur la membrane
ou renferment des objets lipidiques (petits points noir); quand les agrgats sont
trop gros C, la plupart des vsicules comportent des dfauts. Lchelle reprsente
50 m et la densit de vsicule nest pas reprsentative de lecacit.
dbris se retrouvent encapsuls dans la nouvelle vsicule ou bien sur sa membrane
(gure 3.12).
Le renouvellement continu de la couverture en lipides des interfaces eau-huile,
directement responsable dun bon rendement, passe dabord pas lutilisation dune
LOS dont la cintique dadsorption des lipides est rapide (typiquement une quin-
zaine de secondes) et par le contrle de la frquence de production des gouttelettes.
Une frquence trop leve engendre invitablement une diminution du rendement
(voir donne carr bleu sur la gure 3.17).
38 CHAPITRE 3. CDICE
a
b
c
d
Fig. 3.11: a. Une gouttelette arrive sur linterface un endroit dplt en lipide
d la formation dune vsicule peu de temps auparavant. b. Dans ces conditions
le zipping des deux monocouches na pas lieu et la gouttelette fusionne avec la
DAS. c. Deux gouttelettes produites trop proche fusionnent dans la LOS. d. Le
succs du passage de cette gouttelette issu dune fusion rsulte en la formation
dune vsicule de plus grosse taille et une dpltion en lipide plus importante.
Fig. 3.12: Exemple extrme de vsicules renfermant des dbris lipidique. Ces v-
sicules ont t prpares par la mthode de lmulsion inverse, la photo illustre
bien un des principal dfaut de cette technique: des centaines de gouttelettes fran-
chissent linterface en mme temps et environ 99 % ne deviennent pas des vsicules,
linterface se retrouve alors tapisse de dbris qui sont leur tour encapsuls
lors de passages russis.
3.4. PASSAGE DE LINTERFACE 39
3.4 Passage de linterface
3.4.1 Approche et zipping
Approche de linterface
La dynamique dapproche et de passage de linterface est le point le moins ap-
profondi, en partie d au fait que lobservation sous microscope nest pas vidente.
Cependant des tudes thoriques [47, 48] et exprimentales [49] de lapproche dune
goutte une interface, nous permettent de mieux apprhender les paramtres phy-
siques importants qui gouvernent cette tape.
Fig. 3.13: Eet du nombre de Bond sur la dformabilit dune gouttelette lors du
son passage une interface uide/uide (Manga et al. [50]).
Le nombre sans dimension B
o
= aR
2
/ appel nombre de Bond (ou nombre
de Etvs), compare les forces inertielles aux forces de tension de surface, avec
la dirence de densit entre les deux uides, a lacclration, R le rayon de la
gouttelette et la tension de surface. Ce nombre est un bon critre pour valuer
la dformabilit des interfaces uides. Lorsque les forces de tension de surface
dominent, ce qui est le cas dans notre systme pour lequel B
o
= 10
4
10
3
pour des gouttelettes de taille comprise dans la gamme 10-100 m de diamtre, les
gouttelettes restent sphriques. Les simulations numriques du travail de thse de
Manga [47, 50] illustrent la relation entre nombre de Bond et dformation dune
goutte lapproche et pendant le passage dune interface uide, plus ce nombre
est faible et moins la goutte se dforme (gure 3.13).
A lapproche de linterface LOS/DAS, pour des distances gouttelette-interface
susament petites (de lordre du rayon de la gouttelette), la prsence de linterface
40 CHAPITRE 3. CDICE
Rgime de Stokes Rgime de Taylor
zipping
R
h
drainage
h<R h>R
v
stokes
R
2
v
TA
Rh
Fig. 3.14: Pour des distances linterface suprieures R, la gouttelette est dans
le rgime de Stokes caractris par une vitesse v
Stokes
R
2
. A des distances inf-
rieures R, la force visqueuse augmente due au drainage du lm dhuile entre la
gouttelette et linterface. Cette dissipation engendre un ralentissement de la gout-
telette et v
TA
Rh. Enn, lorsque le lm atteint un paisseur critique, les deux
monocouches de lipides zippent ensemble pour former la membrane.
gnre des modications de lhydrodynamique. La vitesse de la gouttelette diminue
due laugmentation de la friction visqueuse lors du drainage de lhuile entre
linterface et la gouttelette. Le rgime de Stokes caractris par la vitesse v
Stokes
=
2aR
2
/9 nest plus valide et la gouttelette entre dans le rgime dit de Taylor
2
avec une vitesse corrige [48] (calcul dtaill en annexe):
v
TA
=
2aRh
9
, (3.3)
o h est la distance entre la gouttelette et linterface. Le temps de drainage
d
est
dtermin en calculant lintgrale:
d
=
_
h
in
h
c
dh
v
TA
(h)
, (3.4)
o h
c
est lpaisseur critique du lm avant que le rgime de zipping ne commence
(de lordre dune dizaine de nanomtres) et h
in
est la distance initiale linterface
lorsque la gouttelette commence ralentir (typiquement h
in
= R). Lexpression
du temps de drainage est alors donne par:
d
=
9
2aR
ln
_
h
in
h
c
_
. (3.5)
2
Lorigine du nom de ce rgime reste mystrieuse, les papier faisant rfrence au rgime de
taylor citent tous une rfrence qui nexiste pas.
3.4. PASSAGE DE LINTERFACE 41
Dans notre systme, pour une gouttelette de 10 m de rayon subissant une acc-
lration de 40g, le temps de drainage
d
= 1, 2 s, que lon peut comparer aux 0,2
s ncessaire cette gouttelette pour parcourir la mme distance dans le rgime de
Stokes.
Temps caractristique de Zipping
On dcrit le rgime de zipping de la faon suivante: la gouttelette rentre en
contact avec linterface, lchelle macroscopique, elle est soumise aux forces de
tension interfaciale F
+
F
centri
+
F
friction
=
0. (3.6)
Avec F
EAS/LOS
+
2
EAS/DAS
)a o
1
et
2
sont les fractions de volume de la goutte immerge dans lhuile mi-
nrale et dans la DAS respectivement et a le vecteur acclration. Aprs un
peu de gomtrie daprs la gure 3.15, cette force sexprime comme F
centri
=
4
3
R
3
a(
1
2
(1 +cos )
DAS/LOS
+
EAS/DAS
). Il faut alors choisir la bonne expres-
sion pour la dissipation visqueuse. En premire approximation nous avons consi-
dr la force de Stokes sur une sphre dans de lhuile minrale
F
Stokes
= 6R
Z e
z
mais dans ce cas le temps caractristique de zipping est trs largement sous-
estime (gure 3.16). Nous avons donc considr la friction de la ligne de contact
value par Huh et Scriven [51]. La gomtrie du problme rend lestimation de
la friction complique, nous avons choisis de ne considrer leet de la gomtrie
que sur la variation du primtre, mais nous utilisons lexpression de la force sur
un coin comme si la sphre tait un cylindre et la force navait quune composante
verticale selon z. Dans ces conditions, une estimation grossire de cette force est
donne par:
F
friction
2r
3l
Z e
z
, (3.7)
avec l un facteur logarithmique l = ln(R/b) qui dpend dune longueur de coupure
maximale R (rayon de la gouttelette) et dune longueur de coupure aux tailles
molculaires pour viter la divergence du gradient de vitesse quand lpaisseur du
uide tend vers zro. Dans lapproximation des petit angles,
D
= (6l
Z/)
1/3
(loi
dHomann), et en remplaant dans lquation 3.7, nous obtenons:
42 CHAPITRE 3. CDICE
F
friction
3
6
1/3
2r(l
1/2
)
2/3
Z
2/3
e
z
(3.8)
R
Z
r
0
z
LOS
DAS
LOS
DAS
D
Dissipation visqueuse
EAS
EAS
F
friction
Fig. 3.15: Gomtrie du passage de la gouttelette linterface huile/eau.
Nous adimensionnalisons lquilibre des forces en posant X(t) = Z(t)/R et
=
R
t. Dans le terme de la force centrifuge, il y a un nombre de Bond qui apparait
(R
2
DAS/LOS
a/), ce nombre est de lordre de 10
4
pour notre systme, nous
ngligerons donc ce terme par la suite et considrerons que le rgime de zipping
est uniquement contrl par le mouillage. Finalement, nous obtenons lquation
direntielle suivante:
(1 X(t)
2
)
1/2
= K(
X(t))
2/3
, (3.9)
o K = 3l
2/3
/6
1/3
. Aprs intgration numrique de cette quation (gure 3.16),
nous trouvons un temps caractristique de passage de lordre de 3 ms, assez loi-
gn des temps de passage 300 ms rapports pour des expriences de transfert
spontan [23] mais plus grand que si nous avions considr la friction visqueuse de
Stokes.
Lorsque nous adimensionnalisons les donnes [23] dcrivant le passage de lin-
terface par des gouttelettes en transfert spontan, nous pouvons ajuster la solution
numrique en changeant lchelle des dun facteur 120 (gure 3.16). Cest comme
si nous avions une tension de surface eective de 0,1 mN/m au lieu de la valeur
de 12 mN/m dtermine par lexprience de la goutte pendante. Cependant, nous
navons pas tenu compte, par exemple, que lcoulement sur la surface de la gout-
telette durant sa traverse de la LOS peut compresser les lipides plus que lors
de lquilibre atteint en goutte pendante, rsultant en une tension de surface plus
basse mais surement pas susamment pour atteindre 0,1 mN/m.
De toute faon, lobservation en vue de dessus du passage spontan est dicile
car nous navons pas de rfrence prcise pour le temps initial du dbut du zip-
3.4. PASSAGE DE LINTERFACE 43
Fig. 3.16: A gauche, comparaison de lvolution de cos en fonction de lorsque
lon prend pour la force de dissipation visqueuse la foce de Stokes (courbe bleu)
ou la dissipation de la ligne triple dans un coin (courbe rouge). Au dbut, le
zipping commence doucement puis acclre jusqu lquateur puis diminue
jusqu la n. A droite, comparaison entre les donnes de Yamada et al. [23] pour
des vsicules de dirents diamtres, adimensionnalises et un ajustement de la
solution numrique. Les points exprimentaux suivent bien lallure gnrale de la
courbe lexception des donnes pour une goutte de rayon R=13,8 m (carrs
turquoise) et pour une goutte de rayon R=7,4 m (cercles bleu).
ping . Pour comprendre la cintique de passage, il serait ncessaire deectuer des
sries de mesures en transposant notre dispositif sous microscope pour lmer le
passage en camra rapide, le suivit dune gouttelette tant possible condition de
synchroniser la frquence dacquisition de la camra sur la vitesse de rotation de la
chambre. Une autre possibilit consiste pour des expriences de transfert spontan,
coucher le microscope lhorizontale pour avoir une vue de ct de la chambre.
Ces montages permettraient alors de suivre le passage complet des gouttelettes au
travers de linterface.
3.4.2 Dtachement
A la n de lassemblage des deux feuillets, il faut que la vsicule se dtache de
linterface. Trs probablement, cela consiste en la rupture dun tube de lipides de
taille molculaire. Nous ne connaissons pas les mcanismes qui pilotent cette tape.
Nanmoins, certaines observations nous donnent des indices. Le dtachement de
linterface est aid par la centrifugation; en eet dans le cas du transfert spontan,
44 CHAPITRE 3. CDICE
sous laction de la gravit, les vsicules restent suspendues linterface pendant
de longues heures tandis que dans notre cas une partie des vsicules passent avec
succs linterface et nous les rcuprons dans la DAS. La dirence de densit
entre EAS et DAS semble galement tre une cl du succs: le rendement, cest-
-dire le pourcentage de gouttelettes qui deviennent eectivement des vsicules,
augmente linairement avec la dirence de densit EAS/DAS dans la gamme
teste 4.10
3
0, 65 g/cm
3
jusqu atteindre 60% (gure 3.17). Pour quantier le
rendement, nous avons produit des vsicules pendant une minute tout en lmant la
production des gouttelettes la pointe du capillaire pour dterminer prcisment la
frquence de production. La DAS contenant les vsicules est alors dpose dans une
chambre dobservation sous microscope et nous comptons le nombre de vsicules
produites.
Fig. 3.17: Rendement (pourcentage de gouttelettes qui deviennent eectivement
des vsicules) en fonction de la dirence de densit entre EAS/DAS. Le ren-
dement augmente linairement avec de 1% pour un correspondant des
solutions de sucrose/glucose de 62 mM jusqu 61% pour des solutions de su-
crose/glucose de concentration 1 M. La frquence de production joue un rle im-
portant sur le rendement nal: pour le mme = 0, 033 g/cm
3
, lecacit est
de 34% 450 Hz et chute 23% (carr bleu) lorsque la frquence de production
augmente 775 Hz
3.5. CARACTRISTIQUES DES VSICULES PRODUITES PAR CDICE 45
3.5 Caractristiques des vsicules produites par
cDICE
3.5.1 Distribution de taille des vsicules
Les distributions de taille sont dtermines par analyse dimage. La densit
de probabilit est reprsente en fonction du diamtre des gouttelettes et des
vsicules (gures 3.18 et 3.19). La comparaison des deux distributions permet de
sassurer que les deux sont centres sur la mme valeur moyenne, cest--dire que
les vsicules obtenues sont bien issues de la couverture des gouttelettes par une
bicouche. En revanche la distribution des vsicules prsente un lger paulement
pour les plus grands diamtres (gure 3.18a). Cet paulement peut sexpliquer par
la fusion de gouttelettes durant leur traverse de la LOS ou sur linterface, et ce
malgr le contrle de la frquence de production.
La taille des vsicules peut tre facilement slectionne en variant la taille du
capillaire tout en gardant une faible polydispersit /d) < 11% dans la gamme
10-40 m, et d) tant lcart type et le diamtre moyen (gure 3.18b).
Il est possible de descendre vers de plus petites tailles. Nanmoins, comme
voqu prcdemment, nous sommes limits au niveau de la taille du capillaire des
valeurs denviron 4 m de diamtre. Il faut donc augmenter le nombre capillaire en
changeant la viscosit de la phase continue et la vitesse de rotation pour atteindre la
gamme des valeurs hautes de C
a
de la gure 3.4. Par exemple, avec un capillaire
de 4 m, en utilisant de lhexadecane ( = 3, 3mPa.s) comme phase continue et en
tournant 40 tours par seconde, C
a
= 0, 2 et lon produit ainsi des vsicules de 4
m de diamtre (gure 3.19a). Gouttelettes et vsicules possdent la mme valeur
moyenne, mais la polydispersit augmente /d) = 17 %. Llargissement sur les
tailles suprieures provient probablement de la fusion des gouttelettes en solution,
llargissement vers les tailles plus petites est quant lui plus surprenant.
La production de vsicules de grande taille (>40 m) demande de diminuer la
vitesse de rotation 10 trs/s pour que la condition
F
>
s
soit respecte. Avec
un capillaire de 6 m et un C
a
= 0, 04, des vsicules de 68 m sont produites;
la polydispersit est plus importante, /d) = 25, 8 % (gure 3.19b).
3.5.2 Encapsulation
La solution aqueuse que lon souhaite encapsuler lintrieur des vsicules
cDICE peut contenir divers objets aussi varis que des collodes, des globules
rouges, des protines, des tampons de force ionique comparable aux conditions
physiologiques (>150 mM), de lADN marqu (25 bases), une solution de sucrose
concentre 1M ou bien du dextran 2MW 8% w/w de viscosit 40 mPa.s. Un
46 CHAPITRE 3. CDICE
Fig. 3.18: a. Superposition de la distribution de taille des gouttelettes produites
(losanges bleu), avec celle des vsicules obtenues (cercles rouges); (d) est la densit
de probabilit en fonction du diamtre. Les deux distributions sont centres sur la
mme valeur moyenne d) = 18 m. Au niveau de lpaulement de la distribution
des vsicules, les ches indiquent les valeurs de diamtres correspondant la
fusion de 2, 3 et 4 gouttelettes. b.Distributions de taille pour des vsicules de
d) = 8 m et = 1 m (losanges vert); d) = 18m et = 2 m (cercles rouge);
d) = 37 m et = 3 m (carrs bleu). Les vsicules ont t produites avec un
capillaire de 5 m C
a
= 0, 06 (losanges vert) et C
a
= 0, 035 avec des capillaires
de 6 et 13 m pour les tailles 18 et 37 m respectivement.
aperu est donn sur la gure 3.20.
Pour parvenir encapsuler ecacement une solution, il faut veiller deux
principaux points: lajustement de la pression osmotique entre EAS et DAS et la
dirence de densit entre ces deux solutions.
An de prvenir les risques de formation de bouchons lors de lencapsulation de
collodes micromtriques, lintrieur des capillaire doit tre trait. La colle optique
NOA61 (Norland) est une bonne candidate, la polymrisation dune ne couche
de colle sur une longueur denviron 300 m la pointe du capillaire permet de
limiter ladhsion des collodes sur les parois internes. Les interactions entre les
particules collodales et la membrane de lipide peuvent galement tre minimises
en utilisant des LOS contenant 5% mol/mol de lipides PEG.
Pour lencapsulation des globules rouges, nous avons ajust la densit de la
solution de suspension avec celle des globules pour viter leur centrifugation dans
les gouttelettes lors de la traverse de la LOS. La distribution de la concentration
3.5. CARACTRISATION DES VSICULES 47
Fig. 3.19: Superposition des distributions de taille des gouttelettes et des vsicules
obtenues. a. Gouttelettes et vsicules sont centres sur la mme valeur moyenne
d) = 3, 8 m et produites C
a
= 0, 2. Pour les vsicules = 0, 6 m. b. Distribu-
tion de tailles des vsicules centre sur d) = 68 m avec = 17 m, production
C
a
= 0, 04.
,
dhmoglobine intracellulaire rsulte en une distribution de densit des globules de
1,085 g/cm
3
pour les plus jeunes jusqu plus de 1,112 g/cm
3
. Nous avons alors
prpar une solution de dextran 1,09 g/cm
3
et ajust la pression osmotique
300 mosm avec du glucose, aprs centrifugation de globules sur cette solution,
nous avons prlev quelques microlitres sur le dessus que nous avons utilis pour
lencapsulation.
Direntes collaborations nous ont amenes encapsuler diverses protines:
lactine (groupe dAndreas Bausch, Munich) et lezrine (Nada Khalifat), compo-
sants du cytosquelette; FtsZ (groupe de Petra Schwille, Dresde), protine impli-
que dans le mcanisme de division cellulaire des bactries. Pour lencapsulation
de lactine, nous avons dilu les monomres dactine 15 M dans le tampon de
polymrisation juste avant de lintroduire dans le capillaire et de commencer lin-
jection. Eectue rapidement, cette tape demande 30 s auxquelles il faut ajouter
5-10 minutes de production de vsicules, du mme ordre de grandeur que le temps
ncessaire pour que la polymrisation dbute. Comme le tampon de polymrisation
est ionique, nous utilisons une solution de glucose ajuste osmotiquement comme
DAS, condition ncessaire pour que le passage linterface se droule correctement.
Pour encapsuler lhmoglobine, protine responsable du transport de loxygne
dans lorganisme, dont la densit est importante, nous ajustons la densit de la DAS
48 CHAPITRE 3. CDICE
a. b.
c.
d.
e.
Fig. 3.20: Exemples dencapsulation. a. collodes de 1 m 4% v/v; b. globule
rouge; c. protine FtsZ 0,5 M qui se lie au POPS de la membrane constitue de
90% Egg-PC+10% POPS; d. et e. faisceaux dactine + fascine. Lchelle reprsente
10 m.
avec du percoll de manire obtenir un de lordre de 2.10
2
2.10
3
g/cm
3
,
nous utilisons galement des capillaires trait la colle pour limiter ladhsion sur
les parois.
Lencapsulation de uides visqueux demande dappliquer une surpression plus
importante du fait de la rsistance hydrodynamique qui augmente avec la viscosit;
pour une solution de dextran 2Mw concentr 8% w/w dont la viscosit avoisine
les 40 mPas, nous appliquons une pression de 800 mbar lorsque lon injecte dans
un capillaire de 10 m de diamtre.
3.5.3 Proprits de la membrane
Observe au microscope avec un objectif x100 immersion et grande ouverture
numrique (N.A.= 1,3), permettant ainsi datteindre une rsolution denviron 0,25
m, la membrane ne prsente pas de dfaut (gure 3.21). Lorsque nous suspendons
3.5. CARACTRISATION DES VSICULES 49
les vsicules dans une solution lgrement hypertonique, les vsicules se dgonglent
et leur membrane uctue indiquant que la membrane est bien permable leau.
Cependant, par manque de temps, nous navons pas caractris les uctuations
permettant de dterminer le module de courbure de la membrane pour le comparer
avec les donnes existantes sur des vsicules lectroformes [? ] . La question de
la prsence de solvant rsiduel dans la bicouche est pertinente, en particulier pour
ltude des proprits physico-chimiques de la membrane comme par exemple la
formation de domaines. La prsence dhuile dans la bicouche peut modier les
proprits de diusion des lipides dans la membrane ou encore les transitions de
phase dans les mlanges. Caractriser prcisment de faibles quantits dhuile reste
dlicat, cependant nous avons ralis plusieurs contrles qui tendent montrer que
si prsence dhuile il y a, cest uniquement ltat de traces.
Fig. 3.21: a. Image en champ clair dune vsicule avec un objectif x100 (N.A. 1,3)
et un condenseur (N.A. 1,1). b. Partie de membrane marque au PKH (sigma) et
image en piuorescence (x100, N.A. 1,3).
Le premier test consiste encapsuler une solution de uorescine puis dajouter
a posteriori de lalpha-hmolysine dans la solution dans laquelle sont suspendues les
vsicules. Cette protine est connue pour former des nanopores dans les membranes
[? ]. En pratique, 1 l dalpha-hemolysine 1 mg/ml dans 10 mM Hepes et 150
mM KCl est dilu dans 100 l de glucose (ajust osmotiquement avec lEAS).
Ces 100 l sont ensuite ajouts dans la chambre dobservation contenant 200 l de
suspension de vsicules. Des photos en uorescence sont prises avant et aprs ajout
de lalpha-hmolysine: au dpart lintensit lintrieur des vsicules atteint 2000
ua (unit arbitraire) et celle de la solution de suspension 225 ua; trois heures plus
tard, les pores forms par lalpha-hmolysine ont permis un change entre EAS et
solution extrieure et lintensit dans les vsicules est tombe 325-330 ua tandis
que dans le mme temps lintensit de la solution extrieure a augment autour de
50 CHAPITRE 3. CDICE
310-315 ua. Cette protine transmembranaire est donc bien fonctionnelle.
a.
b.
Fig. 3.22: Vsicules contenant de la uorescine, avant (a.) et 3h aprs (b.) ajout
dalpha-hmolysine. Les prols dintensit correspondant sont reprsents droite
de chaque photo. Avant ajout dalpha-hmolysine, le fond prsente une intensit
de 225 ua (unit arbitraire) tandis que lintensit lintrieur de la vsicule atteint
environ 2000 ua. 3 heures aprs ajout de lalpha-hmolysine , des nanopores se sont
constitus dans les membranes autorisant un change entre EAS/DAS: lintensit
du fond a maintenant augment 310-315 tandis que lintensit dans la vsicule a
chut 325-330. Lintensit de la photo b. a t rechelonne pour lachage.
Le deuxime test, plus direct, consiste mesurer lpaisseur de la bicouche en
microscopie force atomique (AFM). Ces mesures ont t ralises en collabora-
tion avec Pierre Emmanuel Milhiet et Cdric Godefroy (CBS, UMR 5048 CNRS,
UMR554 INSERM). Un choc osmotique hypotonique est appliqu pour faire cla-
ter les vsicules et en prsence dions Ca
2+
(3 mM CaCl
2
) les membranes sont
plaques sur le substrat de mica. Le tout est rinc avec le tampon dimagerie (Tris
10 mM, KCl 150 mM, MgCl
2
5 mM pH 7,4). Un premier point positif est lhomo-
gnit de la membrane (voir gure 3.23 A), indiquant quil ny a pas de dfaut
sur la membrane ou de goutte dhuile emprisonne dans la bicouche. De plus les
hauteurs mesures sur 40 sections donnent une valeur moyenne de 4, 280, 62 nm,
similaire aux hauteurs (4-5 nm) mesures par AFM pour une bicouche supporte
de DOPC prpare par fusion de SUV (small unilamellar vesicles) [? ] et proche de
la valeur mesure par rayons X de 3,69 nm [? ]. La dirence avec la mesure rayons
X provient de la prsence dune ne couche molculaire deau entre la surface de
3.5. CARACTRISATION DES VSICULES 51
mica et les ttes polaires des lipides [? ].
Fig. 3.23: Caractrisation par AFM dune bicouche degg-PC sur du mica prove-
nant de lclatement dune vsicule CDICE. A. Membrane image en mode peak
force tapping (mode oscillant), lchelle de couleur qui code pour la hauteur st-
tend sur 30 nm et la barre dchelle reprsente 10 m. La ligne horizontale au milieu
correspond une perte dinterraction pointe chantillon. B. Image quadrature
qui rend compte de la dirence dinteraction entre la pointe et lchantillon se-
lon que lon se trouve sur le mica ou la membrane. C. Distribution des hauteurs
mesures sur 40 sections avec une valeur moyenne de 4,28 0,62 nm
52 CHAPITRE 3. CDICE
3.6 Conclusion
La mthode que nous avons dvelopp prsente de nombreux avantages. Simple
mettre en uvre, elle permet la production de vsicules de taille contrle avec
une distribution de taille pique: /d) < 11% dans la gamme 4-40 m de diamtre
et plus large sur une gamme tendue de 4-70 m. La formation individuelle de
chaque feuillet puis leur assemblage nal lors du passage des gouttelettes au travers
de linterface huile/eau, est un processus ecace autorisant lencapsulation de
substances varies, en veillant ce que losmolarit des solutions interne et externe
soit quilibre et lEAS lgrement plus dense que la DAS.
La production de gouttelettes monodisperses par goutte goutte et le contrle
de la frquence de production des gouttelettes permet doptimiser la couverture
continue des interfaces huile/eau, rsultant en un rendement important: environ
150 vsicules par seconde produites avec un seul capillaire et de faon continue (>20
min). Ceci nest possible qu la seule condition que la cintique dadsorption des
lipides aux interfaces soit susament rapide. La mise au point du protocole de dis-
persion des lipides dans lhuile minrale a demand de nombreux ajustements mais
il est maintenant reproductible et applicable de nombreux lipides et mlanges de
lipides.
De par ltendue des tailles accessibles 4-70 m qui couvre les tailles des cellules
biologiques, de lecacit dencapsulation, de la diversit des lipides que nous
avons utilis et la possibilit de travailler en conditions salines physiologiques, nous
pensons que cette nouvelle technique est une mthode de choix pour la conception
de systmes biomimtiques.
De faon plus gnrale, cette mthode ainsi que le concept plus gnral de
production de capsules dpaisseur contrle a fait lobjet dun dpot de brevet.
Deuxime partie
Une approche microuidique de
la drpanocytose: tude de la
vaso-occlusion
53
Introduction une maladie
gntique du sang: la
drpanocytose
Lanmie falciforme ou drpanocytose est une maladie gntique de la micro-
circulation sanguine qui touche environ cinquante millions de personnes de part le
monde, principalement sur le continent Africain, en Inde et au Moyen Orient. Son
caractre hrditaire est dmontr par James Neel en 1949 [52] et la mme anne
Linus Pauling [53] en dcouvre lorigine molculaire: une stucture anormale de la
protine dhmoglobine la rendant moins soluble. Cest la premire fois que le lien
est fait entre une maladie gntique et un dysfonctionnement au niveau molcu-
laire. Lhmoglobine, contenue dans les globules rouges, est la protine responsable
du transport de loxygne dans lorganisme. La forme responsable de cette mala-
die est appele hmoglobine S (HbS). Elle est le rsultat dune mutation gntique
impliquant la substitution dun seul acide amin qui la rend moins soluble. En
absence doxygne, le changement conformationnel de la protine rend possible
lagrgation des monomres dHbS. Ce phnomne est compltement rversible et
ds que la concentration doxygne est susante les bres dHbS dpolymrisent.
La pathophysiologie de la drpanocytose est complique par son caractre multi-
chelle et reste inexplique: au niveau molculaire, lHbS polymrise en quelques
millisecondes pour former des bres qui peuvent atteindre plusieurs microns;
lchelle du globule rouge, les dformations apparaissent en quelques secondes; en-
n plus grande chelle, la vaso-occlusion est responsable des crises anmiques
rptitives [1].
Une premire approche consiste tudier la cintique de polymrisation de
solutions puries dHbS. Lexistence dun temps de latence entre le moment o
lhmoglobine est compltement dsoxygne et la formation des bres a ainsi t
mis en vidence [54], ce temps dpend grandement de la concentration initiale
dHbS. Les mesures sur la cintique ont aussi permis de proposer deux types de
mcanismes pour la formation des polymres [55]; une nuclation initiale homogne
suivie par une nuclation htrogne sur le polymre dj existant. Ce modle de
55
56
double nuclation permet dexpliquer les dpendances extrmes la concentration
dHbS du taux de nuclation [56], et du taux de formation de domaines [57] .
Dautres tudes ont aussi t menes sur la cintique de polymrisation pour des
saturations partielles en oxygne [58] ou encore sur la cintique de dpolymrisation
[59]. Toujours sur des solutions dHbS, la nuclation, la croissance de bres et
de domaines ont t observs par microscopie contraste interfrentiel [60, 61],
observations conrmant le modle de double nuclation. Enn Wang et al. [62] ont
mesur le module de courbure et la longueur de persistence de bre individuelle.
Lextrme variabilit et le fait que lon ne puisse pas prvoir les crises parmi
des patients ayant le mme gnotype HbSS sont la preuve que le processus encore
indtermin conduisant la vaso-occlusion est complexe. Stephen H. Embury [63]
et Robert P. Hebbel [64] font chacun une analyse critique du dogme de la poly-
mrisation et dformation des globules rouges comme uniques facteurs importants
menant la vaso-occlusion. Pour aller plus avant dans la comprhension de la pa-
thophysiologie et des mcanismes impliqus dans la vaso-occlusion de nombreuses
tudes ont t menes sur des globules rouges in vitro mais aussi in vivo. Lh-
trognit de la concentration en HbS dans les globules rouges est responsable
dune riche morphologie [65] et de comportements rhologiques dirents [66]. La
capacit dun globule rouge se dformer est un facteur important lors du passage
dans les capillaires sanguins les plus petits, la polymrisation intracellulaire et la
rptition des cycles de dformation altrent la dformabilit des direntes popu-
lations de globules; les plus denses, souvent irrversibles (gardent leur dformation
mme en condition normale doxygnation) sont ceux qui deviennent le moins d-
formables tandis que les rticulocytes les moins denses sont les plus dformables et
moins rigides [67]. Il a t montr que la dtrioration des proprits mcaniques
concide avec la dshydratation des globules et laugmentation de la viscosit due
laugmentation de la concentration intracellulaire dhmoglobine [6870]. Dshy-
dratation et dformation sont intrinsquement lies car la dsoxygnation et la
dformation qui laccompagne induisent une augmentation de la permabilit de
la membrane pour les cations (K
+
, Na
+
et Ca
2+
) [71] et dune perte deau [72].
Les expriences de micropipettes [67, 73, 74] ont permis de mesurer les propri-
ts mcaniques sur des cellules drpanocytaires individuelles dmontrant ainsi que
mme en condition normale doxygnation ces globules possdent une dformabi-
lit moindre et une rigidit plus importante que les globules normaux. Les globules
anmis ont aussi la particularit dtre plus adhrents sur les cellules endothliales
[75], Barabino et al. ont aussi tudi les proprits dadhsion grce une chambre
ux recrant mieux les conditions physiologiques dcoulement [76]; de plus, cette
plus grande adhsion a aussi t observe in vivo [77].
Plus rcemment, la dmocratisation des techniques de lithographie a permis
la construction de puces microuidiques pour dsoxygner rapidement des cellules
57
[78] ou bien pour ltude en gomtrie conne du ux dune solution de globules
anmis [79].
58
Chapitre 4
Pathophysiologie, Hmoglobine S
et tudes sur des cellules
4.1 Pathophysiologie
Les crises anmiques, caractrises par dintenses douleurs pouvant durer plu-
sieurs jours et localises principalement dans les extrmits des membres, la poi-
trine ou labdomen [80], sont pourtant la consquence dune unique mutation sur
un seul acide amin de la molcule dhmoglobine.
Langle dapproche pour comprendre ces aspects pathophysiologiques jusque
dans le milieu des annes 90 consistait considrer le problme de la vaso-occlusion,
responsable des crises douloureuses, comme tant le rsultat dune obstruction
strique de la microcirculation due la dicult de passage dans les capillaires
sanguins les plus ns (quelques microns) des globules rouges fortement dforms
en absence doxygne, par la polymrisation de lhmoglobine S in cellulo. Cette
approche a dbouch sur toutes les tudes ralises sur des solutions dhmoglobine
S purie. Cependant, cette seule explication soure de plusieurs contradictions.
Tout dabord parce que la vaso-occlusion arrive frquemment dans les artres cr-
brales ( 20% des cas chez les enfants [81]), loin de limage des capillaires obstrus
par quelques globules falciformes. La vaso-occlusion a lieu galement au niveau de
la circulation pulmonaire, donc par des globules ne contenant pas de polymre
et par consquent prsentant pour la plupart leur forme discocyte normale. Le
syndrome thoracique aigu concerne les deux tiers des personnes aectes par la
drpanocytose, il est responsable de 20% des cas de dcs [82].
Le dogme de la polymrisaton au niveau molculaire comme seule responsable
des symptmes observs lchelle de lorganisme, a commenc tre remis en
cause partir des annes 90 mais surtout dans les annes 2000 [63, 64]. La grande
disparit dun malade lautre dans loccurence des crises anmiques et le caractre
59
60 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
non prvisible de celles-ci, a men la rexion sur la recherche des autres facteurs
pouvant tre impliqus, et guid les tudes raliss lchelle de la cellule et sur les
observations de la circulation dans des modles in-vivo. La vision moderne qui
se dgage au regard de ces rcentes tudes, implique ncessairement un processus
multi-chelles (molculaire, cellulaire, et circulation) et multi-tapes qui seront
discuts dans la dernire partie de ce chapitre.
4.2 Structure molculaire
4.2.1 La molcule dhmoglobine
La molcule dhmoglobine dont la principale fonction est le transport de loxy-
gne des poumons jusque dans les tissus profonds, tient une place particulire dans
lhistoire de la chimie des protines; de par son abondance et sa facilit lisoler de
nombreux scientiques se sont penchs sur son tude. On doit la premire obser-
vation de la cristallisation dune protine Friedrich Hnefeld qui en 1840 laissa
svaporer lentement une goutte de sang entre deux lamelles [83]. Lhmoglobine
fut la premire protine caractrise par ultracentrifugation [84], qui permit de
dmontrer que la molcule contient quatre atomes de fer et que cest un matriau
homogne, rsultats fondamentaux une poque o la nature des protines tait
encore inconnue. Cest aussi la premire fois dans le cas de lanmie falciforme que
la nature molculaire dune maladie a t prouve, Linus Pauling faisant le lien en
1949 [85] entre mutation gntique et le changement dun seul acide amin dans
la structure de lhmoglobine. Les premires structures tridimentionnelles de pro-
tines dtermines par rayons-X furent celles de la myoglobine (monomre) puis
peu de temps aprs de lhmoglobine par Perutz en 1959 [86].
La molcule dhmoglobine est un htrottramre compos de deux sous-units
alpha et deux sous-units beta (voir gure 4.2) qui sont apparentes la myoglobine
(protine monomrique responsable du transport de loxygne dans les muscles),
chacune de ces sous-units est lie de faon non covalente un hme (gure 4.1).
Molcule planaire, lhme contient en son centre un atome de fer II qui est respon-
sable de la couleur rouge du sang et sur lequel se lie une molcule de dioxygne
(gure 4.1).
Les chaines de polypeptides sont arranges de telle sorte que les interactions
les plus importantes ont lieu entre sous-units direntes: lassociation
1
1
(et
son quivalence par symmtrie
2
2
) implique 35 rsidus tandis que lassocia-
tion
1
2
(et
2
1
) met en jeux 19 rsidus. En plus de ces interactions de
nature hydrophobe, il existe de nombreuses liaisons hydrogne et paires dions. Les
interactions entre sous-units similaires (
1
2
et
1
2
) sont quant elles peu
nombreuses, ceci sexplique par le fait que ces sous-units se font face de part et
4.2. STRUCTURE MOLCULAIRE 61
Fig. 4.1: Formule de la molcule dhme, le dioxygne se xe sur latome de fer
au centre (wikipedia)
dautre dun canal de 20 de diamtre sur 50 de long (voir gure 4.2).
Fig. 4.2: A gauche, reprsentation de la structure de la molcule dhmoglobine
forme des quatre sous units
1
,
2
,
1
et
2
renfermant chacune un hme (plan
rouge). Le canal form au centre du ttramre est rempli de solvent. A droite, le
changement de conformation entre la forme oxygne et dsoxygne consiste en
une rotation de 15
du dimre
1
1
par rapport
au dimre
2
2
rsultant en un dplacement de 6 de certains atomes linterface
2
(gure 4.2). Habituellement, la forme dsoxygne est not T (pour "tense")
62 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
et la forme oxygne R (pour "relaxed").
La liaison de lhmoglobine avec les molcules de dioxygne est un processus
coopratif ou allostrique, lanit de liaison est aecte par la saturation en oxy-
gne de la molcule: la xation de la premire molcule entrainant un changement
de conformation de lhmoglobine qui augmente lanit de liaison de la seconde
et ainsi de suite. Le caractre coopratif est caractris par une courbe danit en
fonction de la pression partielle en oxygne en forme de sigmode (gure 4.3). La
capacit de lhmoglobine xer loxygne dcroit avec la prsence de monoxide
de carbone qui se lie prfrentiellement la place de loxygne.
arterial pressure
veneous pressure
Fig. 4.3: Pourcentage de sites saturs en O
2
dune solution dhmoglobine en
fonction de la pression partielle dO
2
, les lignes noires verticales reprsentent res-
pectivement la pression partielle dans les veines et dans les artres. (adapt de
Voet et al. [89])
De nombreuses variantes anormales de lhmoglobine existent, plus de 860 mu-
tants ont t rpertoris ce jour et 5 % de la population mondiale est porteur
dune variante hrditaire. Lhmoglobine S (HbS) responsable de lanmie falci-
forme est le rsultat dune mutation impliquant la substitution dun seul acide
amin: la sixime position des chaines , le glutamate charg ngativement est
remplac par une valine neutre et hydrophobe. Localise sur la surface de la mol-
4.2. STRUCTURE MOLCULAIRE 63
cule, cette substitution na pas deet majeur sur la conformation de la protine.
Cependant, moins soluble que lhmoglobine normale (HbA), lHbS dans sa forme
dsoxygne peut sagrger pour former un polymre.
4.2.2 Structure du polymre
La premire mise en vidence que lHbS forme des structures ordonnes est
mettre au crdit de Sherman [90] qui observa en 1940 la birfringence de solutions
de globules dsoxygns. Les nombreuses tudes de microscopie lectronique [91
93] ont permis de dterminer la structure molculaire des bres dHbS, celles ci
consistent en 7 double brins arrangs en un rseau hexagonal compact torsad; le
diamtre dune bre est de 21 nm (voir gures 4.5 et 4.4).
Fig. 4.4: Modle de la section dune bre dHbS, les sphres reprsentent les dif-
frents rsidus. Les rsidus impliqus dans des contacts inter double brin, intra
double brin en latral et intra double brin en axial, sont respectivement colors en
rouge, vert et bleu. (Voet et al. [89])
Les dirents contacts intermolculaires dans un double brin sont reprsents
sur la gure 4.6; seule la valine substitue de la sous unit
2
intervient dans un
contact intermolculaire. Elle se loge alors dans une poche de la sous unit
1
de la molcule adjacente dont la valine en 6
me
position ne participe pas dans
un contact. Cette poche est absente lorsque lhmoglobine S est oxygne. Le
fait que lhmoglobine A dsoxygne ne polymrise pas indique que le contact
impliquant la valine est essentiel pour la formation de bres. Limportance des
autres contacts intermolculaires a t dmontr en ralisant des expriences de
copolymrisation avec dautres mutants [94, 95] qui ont permis de dresser la carte
des principaux rsidus impliqus.
64 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.5: La photo de gauche est un clich de microscopie lectronique dune bre
dHbS xe en solution, le diamtre moyen dune bre est de 21 nm. A droite,
modle dune bre dHbS reconstitu partir des images de microscopie, chaque
sphre reprsente un molcule dhmoglobine.(Dykes et al. [91])
4.2. STRUCTURE MOLCULAIRE 65
Fig. 4.6: Shma reprsentant les contacts intermolculaires dans un double brin,
les rsidus en lettre blanche participent aux contacts les plus important. La valine
la sixime position de la chaine
2
est la seule tre implique dans un contact
intermolculaire, la valine de la chaine
1
est libre. (Voet et al. [89])
66 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
4.3 Etudes en solution
4.3.1 Solubilit de lhmoglobine S
Ds le dbut des annes 70 de nombreuses tudes sont menes sur des solu-
tions puries dHbS pour comprendre la cintique de polymrisation. Le systme
tudi, constitu dune solution de monomres et dune phase polymre est appel
gel et le processus conduisant la formation de polymre, glation ou polymrisa-
tion. Une description thermodynamique simple dun gel revient considrer que la
phase polymre se comporte comme un cristal en quilibre avec une solution dh-
moglobine monomrique (voir gure 4.7). La concentration dHbS dans la phase
solution est alors la solubilit.
Fig. 4.7: Schma reprsentant les deux phases en quilibre dans un gel dhmo-
globine S dsoxygne: solution de monomres-polymre (Eaton et al. [1])
La sdimentation par ultracentrifugation de gel de deoxyHbS (hmoglobine S
dsoxygne) permet de sparer la phase gel de la phase polymre, la solubilit est
dtermine en mesurant la concentration dHbS du surnageant. En 1976 Hofrichter
et al. [96] ont dmontr que la solubilit est indpendante de la concentration
initiale totale dhmoglobine , ce rsultat fondamental est cohrent avec le modle
dquilibre entre cristal et monomres: pour former du polymre, la solution doit
pralablement tre sature puis toute molcule dHbS supplmentaire se retrouve
dans le polymre.
4.3. ETUDES EN SOLUTION 67
Par des expriences de sdimentation lquilibre, Williams [97] a dmontr
que la phase monomrique ne comporte pas dagrgat molculaire: une solution de
deoxyHbS de concentration infrieure la solubilit est centrifuge vitesse plus
faible, les forces de sdimentation et de diusion atteignent un quilibre rsultant
en un prol de concentration apparent stable au cours du temps. La comparaison
de donnes obtenues pour une solution de deoxyHbS et de carbonmonoxyHbS qui
ne forme pas dagrgats (complexe soluble jusqu 0, 5 g/cm
3
) permet de conclure
labsence dagrgats en solution (voir gure 4.8), rsultat en accord avec la des-
cription dun quilibre solution-polymre. Labsence dagrgat en solution a t
vrie une dizaine dannes plus tard par Kam et Hofrichter [98] en diusion de
lumire.
Fig. 4.8: Rsultats dexprience de sdimentation lquilibre pour une solution
dhmoglobine S 20
C et
atteint un minimum de 0, 16 g/cm
3
35
C
(Golderb et al. [100])
1
(sel qui sert xer loxygne pour la conservation des chantillons) un pH
= 7,1. Ces conditions exprimentales relvent plus de lhabitude par rapport aux
premires tudes entreprises. Goldberg et al. [100] ont regard linuence du pH
sur la solubilit de la deoxyHbS, les donnes sont reprsents sur la gure 4.11:
entre les pH 6,0 et 7,0 la solubilit varie peu mais augmente rapidement pour
des pH plus acide ou basique, le minimum de solubilit est atteint pour un pH
de 6,5, valeur proche du pH isolectrique
2
de lordre de 7 pour la deoxyHbS; le
principal eet dun pH plus lev ou moins lev est de dstabiliser le polymre par
une augmentation des interactions lectrostatiques rpulsives entre les molcules.
Chez les humains le pH du sang varie entre 7,35 et 7,45 soit dans la gamme de pH
pour lesquels la solubilit augmente.
1
en solution, le dithionite de sodium ragit avec loxygne et soxyde en ions sulphite et
sulphate selon la raction: S
2
O
2
4
+ O
2
+ 2OH
SO
2
3
+ SO
2
4
+ H
2
O
2
pH pour lequel la molcule est sous forme zwitterionique
4.3. ETUDES EN SOLUTION 71
Fig. 4.12: Solubilit de lHbS en fonction de la saturation en oxygne (points
rouge) et monoxyde de carbone (points bleu) 23, 5
Cet25
C respectivement. La
courbe en rouge est un ajustement des donnes pour loxygne avec la fonction
empirique c
s
= 0, 183 + 0, 0924y
s
+ 0, 0980y
3
s
+ 0, 235y
15
s
. ( partir des donnes de
Sunshine et al. [102] pour loxygne et Hofrichter pour le CO [103])
Eet de la concentration doxygne
La concentration en oxygne est le paramtre le plus critique pour la poly-
mrisation de lHbS. Historiquement, le fait quune solution dHbS compltement
dsoxygne polymrise tandis quune solution pleinement oxygne reste stable
t dcouvert par Harris en 1950 [101]. Pour avoir des donnes de solubilit entre
ces deux extrmits il a fallu attendre une trentaine danne car faire des mesures
prcises sur des chantillons des saturations partielles doxygne est dlicat du
fait de la faible stabilit du systme dans le temps. Les donnes de solubilit
23, 5
C, la fraction de po-
lymre pour plusieurs concentrations initiales dHbS en fonction de la saturation
en oxygne, est reprsente sur la gure 4.13: on remarquera que pour une concen-
tration totale de 0, 45 g/cm
3
, qui correspond la concentration intracellulaire des
globules les plus denses, du polymre est prsent jusqu une saturation en oxygne
de 95%.
Les courbes danit pour loxygne des direntes phases permettent de com-
plter la description. Pour la phase solution, les mesures ont montr que le compor-
tement est le mme que pour de lhmoglobine A (voir gure 4.14), les monomres
dhmoglobine S se lient donc loxygne normalement.
La gure 4.15 compare lanit pour loxygne du polymre, de la phase solu-
tion et du gel total: lanit du polymre est beaucoup plus faible que celle de la
solution, contrairement la solution, il se lie de faon non cooprative loxygne.
Ces donnes mesures confortent le modle deux phases composes dune solu-
tion monomrique dHbS et dune phase polymre de concentration totale dHbs
c
p
= 0, 69 g/cm
3
, les points de lanit du gel total sajustent la courbe danit
calcule partir de la relation de conservation de la masse doxygne:
y
t
= y
p
x
p
+ y
s
(1 x
p
), (4.4)
avec y
t
la saturation du gel et y
p
la saturation du polymre donne par y
p
= K
p
p/(1 + K
p
p)
o p est la pression partielle en oxygne.
4.3. ETUDES EN SOLUTION 73
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
Saturation O2
F
r
a
c
t
i
o
n
p
o
l
y
m
r
i
s
e
Fig. 4.13: Fraction dHbS polymrise en fonction de la saturation en oxygne
de la solution 37
C (solution de monomres)
et de suivre lvolution au cours du temps de la turbidit de la solution par spectro-
mtrie. Lors dune exprience par photolyse, une solution dHbS est sature avec
du monoxide de carbone (complexe stable dans le temps) puis la polymrisation
76 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.17: Suivi de la cintique de polymrisation par mesure de la turbidit lors
dexpriences de saut de temprrature de 0 37
C
pour les carrs, 25
C suivi de 5
minutes 95
C et 95
C permet
une monte en temprature plus douce an de minimiser les contraintes dans le
matriau.
La rsine est alors insole aux UV travers le masque sur lequel sont dessins les
canaux, les parties non masques polymrisent (gure 5.2b). Le dosage de lnergie
est important; une trop longue exposition rsulte en des murs obliques tandis que
dans le cas contraire les canaux nadhrent pas au wafer. Aprs une srie dessais,
210 mJ/cm
2
pour une paisseur de 30 m donnent des rsultats convenables.
Une fois linsolation eectue, le wafer est directement plac sur plaque chauf-
fante pour nir de durcir la rsine: 1 minute 65
C suivi de 5 minutes 95
C pour
30 m.
Ltape de dveloppement permet de dissoudre la rsine non polymrise, le
wafer est plong dans un bain de dveloppeur vendu par MichoChem durant 4-5
minutes (gure 5.2d). Agiter le wafer dans le bain permet daider le dveloppement
des stuctures les plus connes.
5.4. MICROFLUIDIQUE 99
rsine SU8
wafer de silicium
UV
m
a
s
q
u
e
dveloppeur fixateur
cuisson
cuisson
a.
b.
c.
d.
e.
Fig. 5.2: a. Couche de rsine SU8 dpose par spin coating sur un wafer de silicium.
b. Aprs une premire cuisson pour durcir la rsine, exposition au UV de la rsine
travers le masque sur lequel sont dessins les canaux. c. Aprs un recuit, on voit
apparatre les canaux sur la rsine. d. Passage dans un premier bain de dveloppeur
pour liminer la rsine non expose, puis dans un second bain de xateur. e. Au
nal on obtient les canaux sur le wafer de silicium.
100 CHAPITRE 5. TECHNIQUES EXPRIMENTALES
Pour nir, un rinage lisopropanol permet darrter le dveloppement et de
xer la rsine polymrise et aprs un schage lazote, on vrie la qualit des
canaux sous microscope.
5.4.2 Construction des canaux en rsine photosensible
Lutilisation de la colle NOA81 (Norland) pour la confection des canaux micro-
uidiques se justie par le besoin dobtenir un matriau tanche aux gaz. De plus
elle prsente de bonnes qualits optiques en faisant ainsi la candidate idale pour
notre application. La mise en uvre avec cette colle nest pas aussi directe que
dans le cas traditionnel du polydimethylsiloxane (PDMS); dnomme microuidic
stickers cette lgante technique t dveloppe par Denis Bartolo et al. [130] en
2008.
En premier lieu, ltape de lithographie prcdemment dcrite est eectue, les
canaux devant apparaitre en creux dans la rsine SU8. Du PDMS liquide (sylgard
184) est vers sur les canaux, dgaz puis cuit 70
C
par un ux dair chaud. Les puces en PDMS comprennent quatre entres-sorties
desservant le circuit de gaz et les microcanaux pour lcoulement des globules.
Le canal de gaz est aliment directement partir dun contrleur de pression
(Fluigent) et les globules sont injects via une chambre de pressurisation.
Les globules rouges sont suspendus 25 % dhmatocrite (fraction volumique)
dans une solution de PBS + 5 mM de glucose ajuste 300 mosm. Sauf cas
contraire clairement explicit, les globules rouges utiliss proviennent de la frac-
tion n
. Ailleurs
dans lcoulement o il y a galement des changements de direction mais plus
faible comme lentre ou la sortie des canaux de 30 m, nous nobservons pas
de telles structures. De plus les streamers se dveloppent mi hauteur dans
120 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
Fig. 6.13: Images confocale de streamers sous ux illustrant limportance de langle
sur leur croissance. Lchelle reprsente 200 m (Rusconi et al. [139])
Fig. 6.14: Schma des lignes de courants autour dun plot de PDMS illustrant
lhypothse dun ux secondaire local comme initiateur de ladhsion mi hauteur
de lcoulement.
lcoulement. Lexplication propose [140] est la suivante: bien qutant faible
nombre de Reynolds, il existe une perturbation locale du ux au niveau des coins,
dont lamplitude est proportionelle limportance de langle de changement de
direction du ux. Cette perturbation gnre un ux secondaire avec une compo-
sante verticale dirige du bas vers le milieu de lcoulement et une autre dirige du
haut vers le milieu de lcoulement, initiant ainsi la croissance des streamers
mi-hauteur. La gure 6.14 illustre ce que pourrait donner cette perturbation locale
dans le cas de la croissance des agrgats de globules au niveau des plots de PDMS,
sachant que nous observons eectivement que les agrgats contenant en particulier
des globules blancs, ottent dans lcoulement.
6.5. CONCLUSION 121
hmoglobine S
libre en solution
globules blancs
agrgats cellulaires vaso-occlusion
?
coulement en coin
Fig. 6.15: Rle jou par les dirents paramtres tests.
6.5 Conclusion
Notre tude permet de bien dcoupler linuence des dirents paramtres (oxy-
gne, globules blancs, hmoglobine libre, gomtrie), la gure 6.15 rsume le rle
jou par chacun. Les globules drpanocytaires sont naturellement plus adhsifs que
les globules sains. Lhmoglobine S libre en solution est pour partie responsable de
cette caractristique. De plus les globules blancs sont un facteur dterminant dans
la formation de longues structure dans lcoulement. Ces structures lorsquelles
cassent peuvent ralentir drastiquement la vitesse de lcoulement mme si cela na
jamais conduit lobstruction totale dun canal.
Quelle est la pertinence de la gomtrie de nos canaux ? Lide de dpart tait
de tester si nous pouvions observer lobstruction strique de globules en forme
de faucille enchevtrs dans des canaux de petite taille (30 m) pour vrier le
scnario si souvent dcrit pour avancer une explication la vaso-occlusion. Les
plots de PDMS tant destins uniquement au soutnement de la puce. Ce scnario
a vite t cart et la formation inattendue dagrgats cellulaire au niveau des
plots nous a conduit nous interesser ces structures.
Les expriences ralises nont pas permis de conclure quant aux mcanismes
menant jusqu la vaso-occlusion, nanmoins les rles de certains paramtres ont
t mis en lumire. Il serait interessant par exemple de contruire des coulements
microuidiques comportant un rseau de bifurcations avec des canaux de largeur
dirente se jetant les uns dans les autres et dobserver le comportement des
agrgats cellulaires dans une telle gomtrie.
122 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
Conclusions et perspectives
Le travail eectu durant cette thse a permis de dvelopper tous les outils
ncssaires ltude de la vaso-occlusion dans le cas dune maladie gntique: la
drpanocytose.
La premire partie relative la fabrication de vsicules pour la conception de
globules rouges articiels sest rvle plus riche que prvu. Le travail ralis au
cours de cette thse a consist pour la majeure partie du temps, la mise au point
de cette technique qui, de par ses nombreux avantages, est toute indique pour
la construction de systmes biomimtiques. Simple et rapide mettre en uvre,
elle permet la production haut rendement de vsicules contrles en taille et en
contenu. Les vsicules ainsi formes, possdent une membrane sans dfaut dont
nous avons fait varier la composition parmi une gamme importante de lipides. De
plus, il est possible de travailler des concentration salines physiologiques. Cette
mthode est utilise dans plusieurs laboratoires, pour ltude de la dynamique
du cytosquelette (groupe dAndreas Bausch), pour la reconstruction de divisomes
(groupes de Petra Schwille et German Rivas), pour lencapsulation dADN (Annie
Viallat)...
La deuxime partie constitue une tude prliminaire de la vaso-occlusion lie
la drpanocytose. Lemploi des techniques microuidiques nous a permis de recrer
des coulements mimant les conditions physiologiques, et de dcoupler linuence
des dirents paramtres (taux doxygne, prsence des globules blancs, hmoglo-
bine libre, gomtrie). Nous avons montr que la gomtrie de lcoulement est une
condition ncssaire pour la formation dagrgats cellulaires. Le caractre adhsif
des globules drpanocytaires est en partie d lhmoglobine libre en solution
rsultant de lhmolyse plus importante de ces globules malades. La morphologie
des agrgats est grandement dpendante de la prsence en solution des globules
blancs dans lcoulement, les structures formes pouvant mesurer jusqu plusieurs
centaines de microns de long.
Bien que nous nayons jamais observ de vaso-occlusion initie par ces agrgats
cellulaires, il serait intressant de construire des microcanaux reproduisant plus
dlement des portions stratgiques de la microcirculation. Par exemple, conce-
voir des puces comportant un rseau de bifurcations avec des canaux de largeurs
123
124 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
direntes se jetant les uns dans les autres an dobserver le comportement
des agrgats cellulaires dans une telle gomtrie.
Nous avons galement observ que les globules dsoxygns sous coulement
ne se dforment pas en faucille. Nous pourrions utiliser des vsicules encapsulant
des solutions dHbS de concentration bien calibre pour observer la formation de
polymres sous cisaillement.
Appendices
125
Annexe A
Dtermination de la vitesse
dapproche en rgime de Taylor
Aux faibles nombres de Bond, on peut condidrer les interfaces uides (EAS/LOS
et LOS/DAS) comme non dformables et se ramener ainsi au problme de lap-
proche dune sphre dure sur un plan rigide.
A.1 Gomtrie du problme
R
r
hO
h(r,t)
z
R
V(t)
hO
a
Fig. A.1: Schma reprsentant une sphre de rayon R approchant un plan des
petites distances: h
O
R, avec h
O
la distance minimale entre la sphre et le plan.
La dynamique dapproche est gouverne par le dplacement du uide dans
lespace compris entre la sphre et le plan. La pression est maximum lorsque r=0
et dcroit rapidement lorsque r R, nous pouvons donc imaginer que la gomtrie
proche du minimum (r 0) sera la plus importante. Daprs la gure A.1 on peut
crire:
R + h
O
= h(r, t) +
R
2
r
2
, (A.1)
127
128 ANNEXE A. RGIME DE TAYLOR
soit pour r R:
h(r, t) R + h
O
R
_
1
1
2
_
r
R
_
2
+
1
8
_
r
R
_
4
_
h
O
_
1 +
r
2
2Rh
O
1
8
r
4
R
3
h
O
_
.
(A.2)
A partir de lquation A.2, nous pouvons dterminer une longueur caractristique
pour laquelle la gomtrie de lespace entre la sphre et le plan varie de faon
signicative (cest--dire la distance pour laquelle h varie dun facteur 2):
h(r, t)
h
O
= 1 +
r
2
2Rh
O
longueur caractristique l =
_
Rh
O
(A.3)
A.2 Champs des vitesse et de pression
Pour des distances sphre-plan R, en utilisant lapproximation de lubrica-
tion, nous considrons donc le champ de vitesse u = (u
r
, u
z
) avec [u
r
[ [u
z
[. Dans
de telles conditions, lquation de Navier Stokes et la condition dincompressibilit
scrivent respectivement:
p
r
+
2
u
r
z
2
= 0, (A.4)
p
z
= 0, (A.5)
1
r
(ru
r
)
r
+
u
z
z
. (A.6)
Lquation A.5 indique que la pression ne varie pas dans la hauteur sphre-plan,
par consquent p(r,t). En intgrant lquation A.4, nous obtenons le champ des
vitesses:
u
r
(r, z, t) =
1
2
p
r
z
2
+ C
1
(r, t)z + C
2
(r, t). (A.7)
En tenant compte des conditions aux limites u
r
= 0 z = 0 et u
r
= 0 z = h(r, t),
les fonctions C
1
et C
2
peuvent tre explicits et nous obtenons:
u
r
(r, z, t) =
1
2
p
r
z(z h). (A.8)
Nous intgrons prsent la condition dincompressibilit dans linterstice:
A.3. FORCE RSISTIVE EXERCE SUR LA SPHRE 129
_
h(r,t)
0
1
r
(ru
r
)
r
dz + V (t) = 0, (A.9)
avec V (t) = u
z
(r, h, t) =
dh
O
dt
la vitesse de la sphre. En injectant lquation A.7
dans cette expression, nous obtenons:
1
r
r
_
rh
3
p
r
_
= 12V (t), (A.10)
que nous intgrons une premire fois:
h
3
p
r
= 6V r. (A.11)
En utilisant lexpression A.2, nous dterminons compltement le gradient de pres-
sion dans lespace entre la sphre et le plan:
p
r
=
6V r
h
3
0
_
1 +
r
2
2Rh
O
_
3
. (A.12)
Finalement, en intgrant lquation prcdente, nous obtenons le champ de pres-
sion:
p(r, t) = C
3V R
h
2
O
_
1 +
r
2
2h
O
R
_
2
. (A.13)
Pour des distances caractristiques suprieures
Rh
O
, la fonction dans le terme
de droite diminue rapidement. En consquence nous choisirons comme pression de
rfrence constante p
O
, la pression pour r = R, ainsi:
p(r, t) p
O
=
3V R
h
2
O
_
1 +
r
2
2h
O
R
_
2
. (A.14)
A.3 Force rsistive exerce sur la sphre
La principale contribution la force hydrodynamique rsistive qui sapplique
sur la sphre est due la pression dans lespace entre la sphre et le plan et peut
tre calcule de la faon suivante:
130 ANNEXE A. RGIME DE TAYLOR
F
_
gap
(p p
O
)n e
z
dS
3V R
h
2
O
.2
_
R
0
r
_
1 +
r
2
2h
O
R
_
2
dr
6V R
2
h
O
.
(A.15)
A.4 Calcul de la vitesse en rgime de Taylor
La vitesse dune sphre approchant un plan rigide, peut tre explicit en cri-
vant lquilibre entre la force rsistive calcule prcdemment et la force centrifuge
(4/3 R
3
a), et nous obtenons nalement:
V =
2aRh
9
. (A.16)
Cest cette vitesse, caractristique du rgime de Taylor, que nous utilisons pour
dcrire lapproche de gouttelettes dune interface uide dans le cadre des faibles
nombres de Bond.
Annexe B
Protocole dtaill de dispersion
des lipides dans lhuile minrale
B.1 Contrle de lhumidit
La dispersion des lipides dans lhuile minrale est un point critique pour la
production de vsicules, une matrise ne de cette tape permet de plus lobtention
de vsicules sans dfaut et en grande quantit. Une attention particulire doit tre
porte aux conditions dhumidit tout au long du processus de dispersion. Pour cela
nous utilisons une poche gant (atmosbag Sigma Aldrich) dans laquelle lhumidit
relative est maintenue autour de 10% en insuant de lazote.
B.2 Dissolution des lipides dans le chloroforme
mthanol
Dans la poche gants, nous commenons par dissoudre les lipides achets sous
forme de poudre dans un mlange chloroforme/mthanol 9:1 v/v 50 mg/ml pour
de lEgg-PC. Cette solution est conserve 20