You are on page 1of 11

TOLERANCIA DE LAS LEVADURAS AL ETANOL

Mauricio Tomasso, 2004

BLANCOS DE ACCIN

1) MEMBRANA PLASMTICA
Sistemas de transporte

2) CRECIMIENTO
Vas anablicas Procesos replicativos

3) GLICLISIS - FERMENTACIN
2

COMPOSICIN LIPDICA DE LA MEMBRANA DE LAS LEVADURAS Fosfolpidos Otorgan flexibilidad a la membrana Principales: fosfatidilcolina (35-50%); fosfatidiletanolamina (25-32%); fosfatidilserina (4%); fosfatidilinositol (20%) Se componen de cidos grasos saturados e insaturados de 16 y 18 carbonos Esteroles Aumentan la rigidez de la membrana y disminuyen su permeabilidad El principal esterol de membrana es el ergosterol el cual vara en un rango amplio dentro de los esteroles totales de membrana (80% en Kluyveromyces lactis y 40% en Saccharomyces bayanus) La sntesis de cidos grasos insaturados y esteroles est estrechamente relacionada con las condiciones de aireacin.
3

Predominante en la membrana mitocondrial interna

EFECTO DEL ETANOL SOBRE LA MEMBRANA PLASMTICA


La clula modifica la composicin en cidos grasos de la membrana para minimizar los efectos de la disminucin de la fluidez que produce el etanol (Guerzoni y col., 1988) La adaptacin de las levaduras al etanol tambin obedece a una modificacin de la composicin lipdica de las membranas bsicamente debida a un enriquecimiento de las mismas en esteroles y cidos grasos de cadena larga. (Charpentie, 1991)

Adaptaciones evolutivas al crecimiento en presencia de altas concentraciones de etanol:

Aumento del contenido de cidos grasos insaturados respecto a los saturados Aumento en la longitud de cadenas carbonadas de los cidos grasos
5

ndice medio de saturacin de cidos grasos (MFASI) MFASI = [c. grasos saturados]/[c. grasos insaturados] MFASI < 1 para cepas tolerantes al etanol MFASI > 1 para cepas sensibles al etanol (Chen, 1981) Niveles elevados de cidos grasos insaturados se observan tambin en bacterias tolerantes al etanol (Zymomonas mobilis) El alargamiento de las cadenas de cidos grasos tambin se observa en bacterias al igual que en levaduras. Lactobacillus homohiochii y L. heterohiochii son los microorganismos ms tolerantes al etanol. Capaces de crecer a [etanol]>18% v/v. Presentan en su membrana cadenas inusualmente largas de c. grasos monoinsaturados (C20-C24) (Tanigawa, Umezu, 1979)

Las clulas de levaduras, al ser ms ricas en esteroles, mantienen por ms tiempo su actividad fermentaria, y al fin de la fermentacin se degrada una mayor cantidad de azcares. En relacin con los esteroles: En cultivo anaerbico existe una correlacin positiva entre contenido en esteroles y etanol producido En cultivo aerbico existe una correlacin negativa entre el contenido en esteroles y etanol producido En cepas alcoholgenas en anaerobiosis, los esteroles favorecen una buena actividad y poder fermentativo (Guidici y col., 1983)
7

EFECTO DEL ETANOL Y OTROS ALCANOLES SOBRE EL TRANSPORTE DE NUTRIENTES


Efecto sobre el transporte de azcares
El etanol, isopropanol, propanol y butanol inhiben el transporte de D-xilosa en S. cerevisiae y en K. fragilis. La inhibicin sigue una cintica de tipo no competitivo (Vmax es alterada pero no Km). Los efectos de los alcanoles sobre los sistemas de transporte de glucosa y maltosa de S. cerevisiae aumentan con su solubilidad en lpidos, lo que seala las regiones hidrofbicas de la membrana como las dianas de su accin.
0 v X = Vmax e k ( X X m )

S KM +S

vx: velocidad inicial de transporte en presencia de alcanol k: constante exponencial de inhibicin Xm: concentracin mnima inhibidora del alcanol
8

Efecto sobre el transporte de amonio


El etanol, isopropanol, propanol y butanol producen un efecto ms poderoso sobre el transporte de amonio en S. cerevisiae que sobre el transporte de azcares. La inhibicin es no competitiva.

Efecto sobre la permeasa general de aminocidos (GAP)


El etanol, isopropanol, propanol y butanol a concentraciones superiores a la mnima inhibidora, inhiben el transporte de glicina y otros aminocidos. La concentracin mnima inhibidora disminuye con la solubilidad en lpidos de los alcanoles. La inhibicin es no competitiva.

Soluto Glucosa Lisina Arginina

Disminucin del ingreso con Transporte 0.5M de EtOH (~3% vol.) 26% 45% 47% Facilitado Activo Activo

Se puede considerar ms de un mecanismo para explicar la accin inhibidora de los alcanoles sobre el transporte de aminocidos: despolarizacin de la membrana colapso parcial del gradiente de protones cambios de conformacin en la permeasa y/o la bomba de protones, tanto por accin directa sobre las protenas transportadoras como por la alteracin del ambiente lipdico de stas, o por ambos motivos a la vez

10

Transporte de AA acoplado al movimiento de protones (cotransporte) en ausencia (A) y en presencia (B) de etanol. (Bisson, 1991)
11

Glucosa Alcanol Etanol k Xm

Maltosa k Xm

Amonio k Xm

Glicina k 1.69 2.25 3.20 Xm 0.71 0.37 0.13

0.62 0.33 0.65 0.54 1.48 0.87 ~0 ~0 ~0 1.19 0.29 2.45 0.33 1.65 0.28 3.88 0.17

Isopropanol 0.77 Propanol Butanol 0.93 2.79

9.55 0.10 8.50 0.05 13.49 0.05

Concentracin mnima inhibidora (mol/L) y constante exponencial de estimulacin/inhibicin (L/mol) de distintos alcanoles en S. cerevisiae.

Se observa que a mayor solubilidad en lpidos de los alcanoles, menor es la concentracin necesaria para inhibir el transporte de los distintos sustratos.

12

Variacin del coeficiente exponencial en la ecuacin de velocidad


3,00 2,50

e -k(X-Xm)

2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0,20 0,33 0,87

Glucosa Amonio

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

Etanol (M)

13

BLANCOS DE ACCIN

1) MEMBRANA PLASMTICA
Sistemas de transporte

2) CRECIMIENTO
Vas anablicas Procesos replicativos

3) GLICLISIS - FERMENTACIN
14

Crecimiento
La presencia de etanol en el momento de la inoculacin alarga la fase de latencia y reduce la multiplicacin celular, una temperatura elevada aumenta esta accin inhibitoria. Nmero de levaduras (106.mL-1) Nitrgeno asimilado (mg.L-1) 252 233 194 81 Retardo en el inicio de la fermentacin (das) Adicin de alcohol (% vol.) Grado alcohlico alcanzado (% vol.) Grado alcohlico formado (% vol.)

Azcar restante (g.L-1)

+0 +2 +6 + 10

1 2 4 12

80 67 62 30

14.0 15.6 18.2 16.0

14.0 13.6 12.2 6.0

2 6 15 125

Incidencia en la marcha de la fermentacin de una adicin de etanol en el mosto (fermentacin en aerobiosis moderada; t=25C) (Ribreau-Gayon y
otros, 1975a)
15

BLANCOS DE ACCIN

1) MEMBRANA PLASMTICA
Sistemas de transporte

2) CRECIMIENTO
Vas anablicas Procesos replicativos

3) GLICLISIS - FERMENTACIN
16

Glicerol (mmol.L-1) 57 65 72 80

El etanol producido durante la fermentacin posee un efecto ms inhibidor (20-25 veces mayor) que el aadido al medio (Novak y col., 1981) 132g/L

Concentracin de biomasa (g/L)

106g/L

Durante la primera fase, cuando la multiplicacin celular es rpida, el contenido en etanol intracelular es muy elevado, disminuyendo a medida que avanza la fermentacin (la concentracin de azcar inicial es 50g/L) 17

No existe una relacin cintica entre el etanol producido y la tasa de crecimiento, ya que cuando la concentracin de etanol disminuye, no disminuye la tasa de crecimiento. La hexoquinasa sufre inhibicin no competitiva por retroaccin en presencia de etanol. A concentraciones crticas de etanol, la formacin de un complejo inactivo hexoquinasa-etanol, puede detener la reaccin glucosa glucosa-6-P (Reed, Nagodawithana, 1988).

La tolerancia al etanol es dependiente de la habilidad de la clula para exportar el etanol del interior al medio externo, un proceso que depende de la composicin de la membrana y de su fluidez (Reed, Nagodawithana, 1988).

18

Enzima
Hexoquinasa Fosfofructoquinasa Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa

Vmax (M-1min-1) Sin etanol 15% etanol Sin etanol 15% etanol KM (M) 7,6.10 -5 1,3.10 -4 5,7.10 -5 7,6.10 -5 1,3.10 -4 5,7.10 -5 1176 73 92,8 532 61 59,4

19

SINERGISMO ENTRE EL ETANOL Y OTROS ALCANOLES Y LA TEMPERATURA


Cepas de S. cerevisiae y Kluyveromyces fragilis, creciendo en medio lquido y a concentraciones crecientes de etanol:
Tmx. (temperatura disminuye. Tmin . (temperatura aumenta. mxima mnima de de crecimiento) crecimiento)
13 a 27C

En S. cerevisiae se observa una meseta de temperatura de 13 a 27C, entre las cuales la tolerancia al etanol es mxima, siendo la concentracin mxima tolerada del 11%. Las fermentaciones a temperaturas altas ( vino ej: tinto) y las fermentaciones a temperaturas bajas (ej: cerveza y champagne) son ms sensibles al etanol, con respecto al crecimiento de la levadura, que las fermentaciones a temperaturas intermedias.

Tmin

Tmax

20

La mayor parte de las especies del gnero Saccharomyces tienen su ptimo de temperatura hacia los 20C. Cuanto ms elevada es la temperatura, ms entorpece el etanol el crecimiento y desarrollo poblacional de las levaduras y al final el poder fermentativo conseguido es menor. Los alcanoles estimulan la muerte trmica actuando de forma no especfica sobre los lpidos de las membranas, esto es, dependiendo solamente de la solubilidad en lpidos del alcanol y, si acaso, de su tamao molecular, pero no de su estructura qumica. La toxicidad al etanol aumenta cuando aumenta la temperatura y aquellas levaduras que son ms tolerantes al etanol tambin lo son a la temperatura.

21

Otras consideraciones
La clula responde al etanol produciendo una membrana rica en cidos grasos insaturados y ergosterol, aumentando el contenido de los primeros en aproximadamente dos veces mientras que de los ltimos en hasta 18 veces (Ciesarova, Sajibidor et al., 1996) El etanol afecta la traslocacin de especies inicas como Ca2+ y Mg2+, lo cual juega un rol muy importante en la toxicidad. El etanol tambin afecta la funcin y estabilidad de enzimas citoplasmticas. El etanol impacta sobre la funcin de los transportadores afectando el reconocimiento al sustrato, su unin o los cambios conformacionales que se requieren para su traslocacin dentro de la clula. La diferencia de tolerancia al etanol entre cepas, ha sido asociada a niveles celulares de acetaldehdo, aquellas cepas con menores niveles de acetaldehdo citoplasmtico seran las ms tolerantes al etanol.
22

You might also like