Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej Inzynieria Eznymowa __________________________________________________________________________________________

Temat: Koimmobilizacja enzymw degradujcych skrobi w alginianie sodu

Odczynniki

Bufor octanowy 0.05 M pH 5.0 3,5 % roztwr alginianu sodu w buforze octanowym 0.05 M pH 5.0 Roztwr zawierajcy alfa amylaz, pullanaz i glukoamylaz 0.2 M roztwr CaCl2 w buforze octanowym 0.006 CaCl2 w buforze octanowym 0.05 M pH 5.0 2 % (v/w) roztwr skrobi w buforze octanowym 0.05 M pH 5.0

Materiay i sprzt

Pompa perystaltyczna Wytrzsarka laboratoryjna Strzykawki We teflonowe o rednicy 0,5 mm lub igy Zlewki

Wykonanie

1.

Do probwki przenie 5 ml roztworu alginianu sodu i doda 0,5 ml preparatu enzymatycznego zawierajcego alfa amylaz

2. 3.

Probwk zamkn i pozostawi na wytrzsarce 60 rpm przez 15 minut. Cao przenie do strzykawki zakoczonej wykiem lub ig 0,5 mm zawieszonej 20 cm nad zlewk z 0.2 M CaCl2

4. 5. 6. 7.

Formowa kulki delikatnie nastrzykujc roztwr do zlewki z 0.2 M CaCl2 Po oprnieniu strzykawki kulki immobilizowanej alfa amylazy pozostawi na 30 minut w 0.2 M CaCl2 Nastpnie kulki przepuka 3 krotnie 0.006 CaCl2 w w buforze octanowym 0.05 M pH 5.0 Nastpnie kulki przenie do roztworu wody destylowanej w temp 4oC. W ten sposb mona je przechowywa przez 1 miesic.

Badanie sprawnoci immobilizowanych enzymw.

Wariant 1.

1. 2.

Kulki przenie do odpowiedniej wielkoci kolumny szklanej Kolumn zamkn i podczy do pompy perystaltycznej.(Przed zamkniciem zala kolumn buforem zwracajc uwag na usuniecie powietrza)

3.

Ustawi przepyw na 0,5 ml na minut

Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej Inzynieria Eznymowa __________________________________________________________________________________________ 4. Przepuka 20 ml buforu octanowego 5. 6. Nastpnie na kolumn wprowadzi zamiast buforu, roztwr substratu i kolekcjonowa frakcj 1ml Po zebraniu 10 frakcji zmierzy aktywno wedug metodyki na oznaczanie stenia cukrw metod redukcyjn. 1. Naley wykona rwnie prb kontroln mierzc aktywno preparatu amylazy przygotowujc mieszanin reakcyjn skadajc si z 1:1, roztwr skrobi : preparat enzymatyczny. Oznaczenie naley wykona w probwce eppendorf. Do 0,25 ml roztworu skrobi doda 0,25 ml preparatu enzymatycznego Zamiesza i odczeka 10 minut Zamiesza i pobra 0,05 ml w trzech powtrzeniach do wczeniej przygotowanych probwek z 10% NaOH Oznaczy stenie cukrw redukujcych wedug metodyki

Wariant 2.

2. 3. 4. 5.

Do zlewki 50 100 ml przenie 25 - 50 ml 2 % roztwr skrobi w buforze octanowym o pH 5.0 Nastpnie doda immobilizowany w alginianie enzym Cao przenie na wytrzsark 100 rpm lub miesza rcznie co 5 minut Pobiera w odstpach 2-5 minutowch przez 60 minut, 0,05 ml mieszaniny i oznacza wedug metodyki stenie cukrw metod redukcyjn.

6.

Naley wykona rwnie prb kontroln mierzc aktywno preparatu amylazy przygotowujc mieszanin reakcyjn skadajc si z 25-50 ml roztworu skrobi i 0,5ml preparatu enzymatycznego. Oznaczenie naley wykona w odpowiedniej zlewce identycznie jak w przypadku matrycy z immobilizowanym enzymem.