Wrocaw, 27.03.

2012 Hanna Kwias 168587 Agata Witkowicz 176256

Laboratorium Biochemia

wiczenie A: Kinetyka enzymatyczna I

1. Cel wiczenia Wyznaczenie podstawowych parametrw kinetycznych dla wybranego enzymu kwanej fosfatazy. Okrelenie czy stosuje si do kinetyki opisanej rwnaniem Michaelisa-Menten oraz obliczenie staej Michaelisa KM ,szybkoci maksymalnej VMAX i staej szybkoci reakcji k2. 2. Przebieg wiczenia I. Pomiar szybkoci reakcji w funkcji stenia substratu. a) Do 21 probwek podpisanych zgodnie z Tabel 1 dodano poniej wymienione roztwory 0.25 M bufor octanowy o pH = 5.0, 5.0 mM p-nitrofenylofosforan substrat w ilociach zadanych w Tabeli 1. b) Roztwory inkubowano przez 5 min. w ani wodnej o temperaturze 37oC. c) Do nieprimowanych probwek dodano roztwr fosfatazy. d) Prby 1-11 inkubowano przez 25 min. w 37oC. e) Po upywie 25 minut inkubacji do wszystkich prbek dodano po 2 ml 0.5 M roztworu NaOH, ktry przerywa reakcj katalizowan przez enzym. f) Zmierzono absorbancj roztworw przy dugoci fali 410 nm wzgldem prby 11 (odnonika), a wyniki pomiarw zamieszczono w Tabeli 1. II. Krzywa standardowa. a) Otrzymany roztwr p-nitrofenolu rozcieczono 50-krotnie w kolbie miarowej o pojemnoci 10 ml. Kolb miarow wypeniono czciowo buforem octanowym, dodano do niej 200 l p-nitrofenolu i roztwr uzupeniono buforem octanowym do kreski. Dokadnie wymieszano roztwr przez kilkukrotne odwracanie kolby. b) Rozcieczony roztwr p-nitrofenolu przelano do maej probwki chemicznej c) Do 8 suchych probwek podpisanych zgodnie z Tabel 2 dodano nastpujce roztwory: 0.25 M bufor octanowy o pH = 5.0, 0.1 mM p-nitrofenol (w buforze octanowym) standard (produkt),

 0.5 M NaOH w ilociach zadanych w Tabeli 2. 3. Wyniki i obliczenia Tabela 1. Vbuforu Nr prbki [ml] 1 1,75 1 1,85 2 1,70 2 1,80 3 1,65 3 1,75 4 1,60 4 1,70 5 1,50 5 1,60 6 1,35 6 1,45 7 1,20 7 1,30 8 1,05 8 1,15 9 0,80 9 0,90 10 0,50 10 0,60 11 1,80

Vsubstratu [ml] 0,05 0,05 0,10 0,10 0,15 0,15 0,20 0,20 0,30 0,30 0,45 0,45 0,60 0,60 0,75 0,75 1,00 1,00 1,30 1,30 0,00

Venzymu [ml] 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10

VNaOH [ml] 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

A410 0,103 0,002 0,178 0,004 0,288 0,005 0,327 0,006 0,429 0,014 0,510 0,018 0,545 0,025 0,618 0,030 0,670 0,043 0,682 0,052
odnonik

A410/kor/ 0,101 0,174 0,283 0,321 0,415 0,492 0,520 0,588 0,627 0,630 -

Tabela 2 Nr prbki 1 2 3 4 5 6 7 8 Vbuforu [ml] 1,70 1,50 1,30 1,10 0,90 0,70 0,50 1,90 Vp-nitrofenolu [ml] 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0,00 n p-nitrofenolu [mol] 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,00 VNaOH [ml] 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 A410 0,085 0,172 0,254 0,352 0,440 0,523 0,606 odnonik

) Stenie p-nitrofenolu po rozcieczeniu V p = 200 l C p = 5mM V pk = 10ml n p = C p V p = 5 10 3 0,2 10 3 = 10 6 mol C =

k p

np V pk

10 6 = = 10 4 mol / dm 3 3 10 10

) Liczno p-nitrofenolu w prbkach 1-8

k

n=V Cp V1 = 0,20 ml n1 = 0,2010-3 10-4 =0,02mol

0,45 0,4 0,35

y=0,0141x

a bsorba A660 ncj

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 5 10 15 20 25 30

m s g k [] a a lu ozy g
Rys.1 Wykres zalenoci absorbancji A410 w funkcji licznoci p-nitrofenolu [mol] dla prbek 1-8
3

) Masa fosfatazy w mieszaninie reakcyjnej m E m E = x = A660 / 0,0141 P mG ,7 = 0,025 / 0,0141 = 1,77 g

M ) Masa glukozy zawarta w 6 ml mieszaniny reakcyjnej mG M G

VM

VM P

M mG - masa glukozy w mieszaninie reakcyjnej, VM - objto mieszaniny reakcyjnej 6ml, P mG - masa glukozy w prbce badanej, VMP - objto mieszaniny reakcyjnej przeniesiona do prbki badanej 0.1ml. M mG ,12 = (1,77 * 6)/0.1 = 106,4

M ) Liczno glukozy w mieszaninach reakcyjnych nG MG = 180g/mol masa molowa glukozy M M nG = mG / MG

n12 = 106,4/(180 *106)= 0,591 mol

8

) Aktywno inwertazy Aktinwertazy w badanych prbkach

Akt inwertazy =

n substratu t reakcji V E

M nG = liczno glukozy w mieszaninie reakcyjnej treakcji = czas reakcji hydrolizy 10 min VE = objto enzymu dodana do mieszaniny reakcyjnej 0.5 ml

Akt1 = 0.591/ (10 * 0.5) = 0.118 U/ml 9) Tabela 3. P mG [g] Treakcji [C] A660/kor/ 4 0,025 1,77 20 0,089 6,31 40 0,217 15,39 60 0,248 17,59 100 0,002 0,14
10

M mG [g] 106,4 378,7 923,4 1055,3 8,5

M nG [mol] 0,591 2,104 5,130 5,863 0,047

Aktinwertazy [U/ml] 0,118 0,421 1,026 1,173 0,009

)
1,4 1,2

Aktinwertazy [U/m l]

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120

t [C]
Rys.2 Wykres zalenoci aktywnoci inwertazy Aktinwertazy w funkcji temperatury, w jakiej prowadzona bya reakcja enzymatyczna t [C]

4. Wnioski Szybko reakcji enzymatycznej zwiksza si wraz ze wzrostem temperatury, jednak po przekroczeniu optimum temperaturowego, czyli temperatury, w ktrej szybko reakcji enzymatycznej osiga maksimum, aktywno enzymu spada. Zjawisko to tumaczy

denaturacja enzymu, zmianie ulega jego struktura przestrzenna, co w wikszoci przypadkw jest procesem nieodwracalnym. Zaprezentowane wyniki obrazuj dosy klarownie wpyw temperatury na aktywno enzymu uytego w dowiadczeniu. Punkty na wykresie uoyy si w ksztacie dzwonu, wierzchoek tego wykresu to optimum temperaturowe, po jego przekroczeniu aktywno enzymu spada. Aktywno inwertazy odczytana z wykresu osiga maksimum przy temperaturze 55C, po jej przekroczeniu nastpuje denaturacja cieplna enzymu, zatem aktywno spada. Na podstawie National Centre for Biotechnology Education dla inwertazy pochodzcej z wycigu drodowego optimum temperaturowe to 60C. Najmniejsza aktywno inwertazy osignita jest przy temperaturze 100C, jest to spowodowane tym, i po przekroczeniu optimum nastpuje spadek aktywnoci, spowodowany denaturacj enzymu, wedug danych literaturowych inaktywacja inwertazy zaczyna si w 65C, a totalnie inaktywowana jest po 5 minutach w 90C. W dowiadczeniu enzym inkubowano przez 20 minut w 100C, zatem po tym czasie uleg kompletnej inaktywacji, dlatego te aktywno jest bliska zeru. Przedzia optimum temperaturowego dla badanego enzymu mona oceni jako szeroki. Wyznaczona krzywa standardowa umoliwia oznaczenie iloci glukozy powstaej w reakcji enzymatycznej. Celem wiczenia byo zapoznanie si z jedn z metod oznaczania stenia cukrw redukujcych co zostao zrealizowane. Zapoznano si z metod Nelsona. Dowiadczenie pozwolio na zbadanie wpywu temperatury na aktywno enzymw, okrelenie najbardziej optymalnej temperatury dla inwertazy.