PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE QUIMICA DEPARTAMENTO DE QUIMICA FISICA

INFORME N2

QIM-117 LABORATORIO DE BIOQUMICA T-P

AISLAMIENTO Y PROPIEDADES QUMICAS DE LA HEMOGLOBINA

NOMBRE: Manuel Matus Q..

OBJETIVOS
-Conocer el comportamiento de las clulas de la sangre previamente lavadas cuando se encuentran en disoluciones con distintas concentraciones de cloruro de Sodio. -Analizar, conocer y aislar las distintas especies de la Hemoglobina presentes en la sangre. -A partir de una disolucin de oxihemoglobina obtener disoluciones de desoxihemoglobina, nitrosilhemoglobina y metahemoglobina para estudiar su afinidad con la hemoglobina y su comportamiento a travs de un anlisis espectromtrico. -Obtener un grfico espectrofotomtrico que permita analizar la cintica de formacin de la metahemoglobina. -Observar la velocidad de elusin de la metahemoglobina a travs de una filtracin a travs de una columna de exclusin molecular (Sephadex) y los cambios que durante este proceso ocurren.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Una vez lavado el volumen inicial de sangre, se separan de este volumen 2 mL para realizar el efecto de concentracin salina, y el resto de las clulas se hemolizan por la adicin de agua y tolueno, con el fin de extraer la oxihemoglobina. Test del efecto de concentracin salina:

Tubo N VNaCl % 20 V H2O

1 0 10

2 0.3 9.7

3 0.4 9.6

4 0.5 9.5

5 1 9

6 3 7

7 5 5

8 8 2

9 10 0

A cada tubo se le agregan 2 gotas de clulas lavadas. Observaciones de los tubos de ensayo: Tubo N 1: La solucin es de color roja intensa y en el fondo se observa ms concentrada. Tubo N 2: Al igual que el tubo 1 se observa solucin de color roja y en el fondo un poco s concentrada. Tubo N 3: En este tubo se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente. Tubo N 4: Se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente, pero con un poco de turbidez. Tubo N 5: Se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente, aunque al igual que el anterior con cierta turbidez. Tubo N 6: Se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente. Tubo N 7: En este tubo la solucin ya no es transparente ni parcialmente transparente, es absolutamente roja con presencia de un poco ms de precipitado. Tubo N 8: Este tubo presenta las mismas caractersticas que el tubo anterior. Tubo N 9: La solucin es roja y se observa una especie de aconchado precipitado rojo.

Espectros de absorcin de las diferentes especies de hemoglobina:

Todas las Absorbancias fueron ledas en el rango 450 650nm cada 5nm. La solucin de oxihemoglobina utilizada fue diluida hasta que se obtuvo una absorbancia de 0.519. 1- Espectro de absorcin de oxihemoglobina Presenta 2 picos: - 542 nm (absorbancia de 1.042) - 576 nm (un poco ms alto que el primer pico de absorcin, y una absorbancia de 1.113)

2- Espectro de absorcin de desoxihemoglobina Presenta 1 pico: - 555 nm ( seal muy ancha y de absorbancia de 0.967)

3- Espectro de absorcin de nitrosilhemoglobina Presenta 2 picos: - 517 nm (absorbancia de 0.600) - 633 nm (absorbancia de 0.281) 4- Espectro de absorcin de metahemoglobina Presenta 2 picos: - 502 nm (absorbancia de 0.678) - 631 nm (absorbancia de 0.286)

Cintica de formacin de la metahemoglobina

A una solucin de Oxihemoglobina de 3 ml y que presentaba una Absorbancia de 0.397, se le agreg 3 ml de fosfato potsico y 0.2 ml de una solucin de nitrito de sodio 0.025 M (tiempo cero) con el fin de transformar esta protena en Metahemoglobina. Para observar la cintica de este cambio, se midi la Absorbancia cada 5 segundos a 560 nm, los resultados fueron los siguientes:
Absorbancia 0.397 0.36 0.342 0.307 0.291 0.281 0.273 0.266 0.259 0.254 0.247 0.244 0.238 0.235 0.234 0.232 0.231 0.229 0.228 Tiempo 0 5 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

Se observa que la absorbancia va disminuyendo hasta que llega al punto donde se hace constante. Esto se representa con el siguiente grfico:

Grfico Absorbancia v/s Tiempo

0 5 15 20 0.45 25 0.4 30 0.35 35 0.3 40 0.25 45 0.2 50 55 0.15 60 0.1 65 0.05 70 0 75 0 80 85

Absorbancia v/s Tiempo

Absorbancia

Serie1

50 Tiempo (s)

100

Filtracin a travs de una columna de exclusin molecular:

Por una columna de Sephadex, se hizo pasar una muestra de metahemoglobina. Al bajar por la columna, inicialmente se observaron tres colores; caf (el original de la muestra de metahemoglobina), rojo y amarillo. Luego de unos segundos, desde la parte superior a la inferior, se observ el color amarillo, luego el caf, rojo, y por ltimo un rojo mucho ms intenso. Luego, el color amarillo qued en la parte superior de la columna, mientras que el caf segua avanzando hasta alcanzar la zona del ditionito de sodio, donde apareci un tercer color: rojo oscuro (debido a que la metahemoglobina se redujo a hemoglobina de color rojo). Al ir creciendo esta banda, el color caf fue desapareciendo, mientras que la amarilla desapareca ms lentamente en la parte superior. Al salir la muestra por la manguera de la columna, sta ya no era del mismo color rojo observado, sino que se convirti en rojo escarlata (color propio de la oxihemoglobina). El color amarillo fue el ltimo en emerger de la columna. La lnea de transicin entre la hemoglobina y la oxihemoglobina se mueve ms rpido que el ferricianuro porque stas molculas son ms grandes que los poros del gel , por lo tanto, pasan por fuera, en la fase lquida. En cambio, el ferricianuro es ms pequeo y por ste motivo penetra en la red o partculas de gel quedando atrapado, y por sta razn no desciende con tanta facilidad como la hemoglobina y oxihemoglobina.

DISCUSIN
Test del efecto de concentracin salina: El test salino tiene como finalidad demostrar la influencia de distintas concentraciones de NaCl en los glbulos rojos de la sangre. A una concentracin aproximada de 1.2% NaCl, el volumen de las clulas es el mismo que el que ocupan en el plasma. Esta concentracin se dice que es isotnica con respecto a los eritrocitos. Una solucin que contenga una concentracin menor que la existente en el plasma, se llama hipotnica. Los hemates en este ambiente, se hinchan, aumentando su tamao, pero llega un momento al cual estallan, liberando la Hemoglobina contenida en ellos. Si por el contrario, el entorno que rodea a la clula tiene una concentracin mayor que la isotnica, es decir, es una solucin hipertnica, las clulas se retraen para igualar las presiones osmticas, lo cual conlleva a un cambio brusco en las propiedades de la membrana de stas y la hemoglobina sale hacia el exterior. Espectros de Absorcin de las diferentes especies de Hemoglobina: Grficos absorbancias vs longitud de onda: -Oxihemoglobina: El grfico Absorbancia vs obtenido para la oxihemoglobina nos muestra 2 absorbancias mximas a 542nm y 576nm. Los valores de absorbancias mximas descritas son: 540nm y 574nm. -Desoxihemoglobina: El grfico Absorbancia vs obtenido para la desoxihemoglobina nos muestra una absorbancia mxima a 555nm. El valor de absorbancia mxima descrita es: 555nm. -Nitrosilhemoglobina:
El grfico Absorbancia vs obtenido para la nitrosilhemoglobina nos muestra 2 absorbancias mximas (no muy perceptibles) a 517nm y 633nm. Los valores de absorbancias mximas descritas son: 545nm y 565nm.

-Metahemoglobina: El grfico Absorbancia vs obtenido para la metahemoglobina nos muestra 2 absorbancias mximas a 502 nm y 631nm. Los valores descritos de absorbancias mximas son: 500nm y 630nm. Nota: Los valores descritos de absorbancia fueron tomadas de la bibliografa. Las absorbancias pueden haberse visto afectadas por factores como la temperatura, la manipulacin de las celdas, etc, aunque nuestros espectros son bastantes similares a los tericos, excepto los valores de la nitrosilhemoglobina, esto pudo haber ocurrido por no haber homogenizado de manera correcta la preparacin de este. Cintica de Formacin de Metahemoglobina: La formacin de la Metahemoglobina ocurre lentamente en un principio, luego este cambio se hace ms rpido para luego estabilizarse, indicando que toda la oxihemoglobina se transform en metahemoglobina. El grfico que se obtuvo, confirma esa tendencia, por lo tanto, los resultados fueron los esperados, aunque en el grfico del paper la coordenada del tiempo est en minutos.

Filtracin a travs de una columna de exclusin molecular:

La lnea de transicin entre hemoglobina y oxihemoglobina se mueve ms rpido que el ferricianuro, porque ste ltimo tiene una estructura ms pequea y como la columna es de exclusin, el ferricianuro se demora ms en recorrer el relleno, debido a que penetra en la partcula de gel de Sephadex por su tamao y forma, en cambio, molculas grandes como metahemoglobina o hemoglobina, eluyen ms rpido porque al no poder penetrar en el gel, pasan por fuera arrastrados en la fase lquida. En el experimento, se observ muy bien este principio, el ltimo elemento en salir fue el Ferricianuro, mientras que se vea la velocidad mayor con la que la metahemoglobina bajaba.

CONCLUSIN
Gracias a esta experiencia del laboratorio pudimos aislar la hemoglobina y, adems aislar las distintas especies que pueden formarse a partir de esta. El test de concentracin salina, en el cual se pudo observar como van reaccionando las clulas a cierto tipo de concentraciones de NaCl. Tambin, se pudo obtener espectros bastantes similares a los estndares de las distintas especies de hemoglobina. Mediante la cintica de formacin de la metahemoglobina se pudo observar lo rpido e instantneo que ocurre el cambio de la absorbancia lo que indic la formacin de este compuesto Y por ltimo; se observ con claridad la relacin existente entre el tamao de las molculas con la velocidad de elusin en un filtro de exclusin molecular. Al analizar las transformaciones realizadas de la disolucin de oxihemoglobina a nitrosilhemoglobina y metahemoglobina nos damos cuenta de los riesgos que se corre al haber en el medio ambiente excesos de nitrato y nitrito; ya que stos compuestos interactan rpidamente con la hemoglobina ocupando el lugar en el que se transporta el oxgeno. Debido a esto, es muy importante tener en cuenta que existen sustratos como el CO, los nitratos y los nitritos, que interactan con la hemoglobina, que, al estar presentes en cantidades elevadas en nuestro organismo tienen una mayor afinidad con la hemoglobina que el oxgeno, algo letal para nuestro organismo.

BIBLIOGRAFA
S. F. Ruso y R. B Sorstokke, Hemoglobina. Isolation and Chemical properties. J. Chem. Ed. 50, 347-350 (1973)