YWNO. Nauka. Technologia.

Jako, 2009, 3 (64), 5 18

JOLANTA KRZYCZKOWSKA, EWA BIAECKA-FLORJACZYK, IZABELA STOLARZEWICZ

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

Streszczenie Rozwj przemysu spoywczego, nowych rde i sposobw pozyskiwania surowca, a take wzrost wiadomoci spoeczestwa powoduje, e oczekiwania konsumentw wobec ywnoci ulegaj cigym zmianom. W ostatnich latach obserwuje si rosnce zainteresowanie naturalnymi dodatkami do ywnoci, otrzymywanymi przy zastosowaniu metod biotechnologicznych. W poniszym artykule dokonano przegldu substancji zapachowych produkowanych na drodze biotechnologicznej, przy udziale mikroorganizmw drody, bakterii, grzybw bd izolowanych z nich enzymw. Sowa kluczowe: aromat, mikroorganizmy, synteza enzymatyczna, substancje zapachowe

Wstp W ostatnich latach obserwuje si cigy wzrost zapotrzebowania na substancje zapachowe. Dziki ich zastosowaniu zwiksza si atrakcyjno sensoryczn produktw, przez co staj si bardziej akceptowane przez konsumenta [13]. Syntetyczne substancje aromatyzujce dominuj nad przyprawami pod wzgldem moliwoci standaryzacji, atwoci dozowania, jak rwnie istotn przy produkcji sterylnoci. Ponadto zastosowanie syntetycznych aromatw spoywczych pozwala na stabilizacj waciwoci sensorycznych produktw, ktre ze wzgldu na niekorzystne warunki klimatyczne, dugotrwae przechowywanie czy obrbk fizyczn utraciy w pewnym stopniu swj naturalny aromat i smak. Wzrost wraliwoci spoeczestwa na problemy ekologiczne przyczynia si do wyboru przyjaznych dla rodowiska metod produkcji zwizkw zapachowych, co stanowi impuls do rozwoju rynku aromatw pochodzenia biotechnologicznego. W dyrektywie Rady WE [27] okrelono, e za naturalne substancje aromatyzujce uwaa si nie tylko zwizki wydzielone ze rde naturalnych poprzez zastosowanie procesu
Mgr in. J. Krzyczkowska, dr hab. E. Biaecka-Florjaczyk prof. SGGW, dr in. I. Stolarzewicz, Katedra Chemii, Wydz. Nauk o ywnoci, Szkoa Gwna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, ul. Nowoursynowska 159 C, 02-776 Warszawa

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

fizycznego (np. ekstrakcji), lecz take otrzymane z surowcw naturalnych w wyniku przemiany przeprowadzonej przy uyciu enzymw lub mikroorganizmw. Moliwoci wykorzystania ekstrakcji zwizkw z naturalnych rde s ograniczone, gdy istotne sensorycznie skadniki rolin wystpuj czsto w niewielkiej iloci, std te ich izolacja i otrzymanie w odpowiednio duej iloci s z reguy kosztowne. Przykadem jest keton malinowy, ktry wystpuje w malinach w ladowych ilociach poniej 4 mg na 1 kg owocw [24]. Problemem jest take niestandardowo materiau rolinnego, na co wpyw maj niekontrolowane czynniki, takie jak: warunki rodowiskowe czy choroby rolin. W zwizku z tym cena zwizkw pochodzenia naturalnego jest wielokrotnie wysza ni identycznych substancji otrzymanych w wyniku syntezy chemicznej, chocia z chemicznego punktu widzenia nie ma midzy nimi rnicy. Zdolno mikroorganizmw do wytwarzania zwizkw zapachowych znana jest od dawna; przykadem tego jest ywno fermentowana, w ktrej za typowy zapach odpowiedzialna jest caa gama substancji produkowanych przez drobnoustroje [16, 19, 29]. Tote jedn z metod otrzymywania substancji zapachowych jest ich synteza de novo z wykorzystaniem mikroorganizmw [13, 24]. Alternatywn metod ich bioprodukcji s biotransformacje, czyli synteza z (o ile jest to moliwe) surowcw naturalnych w reakcjach katalizowanych przez enzymy. W poniszym przegldzie przedstawiono obie te metody w odniesieniu do kolejnych grup substancji zapachowych, sklasyfikowanych pod wzgldem ich budowy chemicznej. Estry W wikszoci produktw spoywczych o intensywnym aromacie stwierdzono obecno zwizkw z grupy estrw. Najliczniejsz grup stanowi estry krtkoacuchowych kwasw karboksylowych (C2-C8). Octany: etylu, izoamylu, 2-fenyloetylu czy izobutylu (rys. 1) stanowi gwny aromat piwa [29]. Dziki intensywnemu zapachowi (octan izoamylu aromat bananowy, octan etylu brzoskwiniowy, malinowy, ananasowy, octan izobutylu winiowy, malinowy, truskawkowy) odgrywaj one rwnie istotn rol w przemyle spoywczym roczna produkcja estrw izoamylu wynosia ju w 1989 roku ok. 74 tys. kg [10].
O O
octan izoamylu isoamyl acetate

O O
octan etylu ethyl acetate

O O
octan 2-fenyloetylu 2-phenylethyl acetate

Rys. 1. Fig. 1.

Estry zapachowe. Aroma-active esters.

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

Biotechnologiczna produkcja estrw dotyczy przede wszystkim reakcji bezporedniej estryfikacji lub transestryfikacji, katalizowanych przez lipazy, najczciej w rozpuszczalnikach organicznych. Pozyskiwane z rnych rde lipazy mog uczestniczy w reakcji w postaci wolnej bd immobilizowanej. Dziki swej selektywnoci, w zalenoci od pochodzenia, preferuj syntezy okrelonego typu estrw konkretnych kwasw i alkoholi, decydujc o profilu zapachowym produktu [3, 19, 25]. Poza tym reakcje prowadzone w rozpuszczalnikach organicznych, w ktrych lipazy rwnie zachowuj sw aktywno, umoliwiaj lepsz rozpuszczalno hydrofobowych substratw, eliminuj uboczne reakcje, do ktrych przyczyniaa si obecno wody, uatwiaj odzyskanie enzymu i nieprzereagowanego produktu, jak rwnie eliminuj zakaenia mikrobiologiczne [3, 20]. Romero i wsp. [20] badali syntez octanu izoamylu w heksanie, katalizowan przez immobilizowan lipaz Candida antarctica. Przebadano cztery rne donory acylu: kwas octowy, octan amonu, octan etylu i bezwodnik octowy. Spord tych reagentw najlepsze rezultaty w produkcji octanu izoamylu obserwowano przy zastosowaniu bezwodnika octowego. Najwysz wydajno estru osigano przy steniu 0,8 mol/dm3 bezwodnika octowego, trzykrotnym nadmiarze alkoholu, steniu enzymu 13,8 g/mol bezwodnika i temp. 40 C. Przy zastosowaniu tych warunkw octan izoamylu produkowany by w iloci 9,5 g/g enzymu/h. Biotechnologiczna produkcja tego estru prowadzona bya take z kwasu octowego i alkoholu izoamylowego przy udziale immobilizowanych lipaz z Candida cylindracea czy Rhizomucor miehei. Najwyszy stopie przereagowania (80 %) i wysokie stenie estru (380 g/dm3) osigano przy zachowaniu warunkw: 1 mol kwasu na 2 mole alkoholu, 5 % wagowych enzymu w stosunku do substratu i w temp. 30 C. Hamowanie aktywnoci enzymu nastpowao dopiero przy zastosowaniu stenia kwasu octowego powyej 3,6 mol/dm3 [10]. Kolejnym estrem kwasu octowego, otrzymywanym na drodze biotechnologicznej i majcym due znaczenie w przemyle aromatw spoywczych jest octan benzylu (aromat gruszki, truskawki, jaminu). Zwizek ten generowano w reakcji transestryfikacji octanu winylu z alkoholem benzylowym przy zastosowaniu handlowej lipazy Lipozyme RM IM. Stosujc do reakcji 1 mol alkoholu benzylowego na 8 moli octanu winylu, temp. inkubacji 45 C uzyskiwano 100-procentowe przereagowanie substratw ju w cigu 10 min [18]. Drog biotechnologiczn wytworzono take octan butylu ester o zapachu ananasowym. Do reakcji syntezy tego estru wykorzystano butanol i kwas octowy. Katalizatorem reakcji bya immobilizowana lipaza z Rhizopus oryzae. Najwiksze przereagowanie uzyskano przy uyciu rwnomolowych iloci substratw, w temp. 37 C i 45-procentowym dodatku wody [22]. Synteza estrw zapachowych przy udziale lipaz bya prowadzona take przez Larios i wsp. [15]. Frakcj B lipazy z Candida antarctica (CAL-B) wykorzystano do biokatalitycznej produkcji estrw krtkoacuchowych kwasw karboksylowych. Przeprowadzono reakcj estryfikacji n-butanolu i geraniolu z rnymi kwasami kar-

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

boksylowymi: octowym, masowym, izowalerianowym, fenylooctowym i tyglinowym ((E)-2-metylobut-2-enowym). Najwysz wydajno syntezy (powyej 80 %) zaobserwowano w reakcji n-butanolu z kwasem masowym i izowalerianowym, przy czym czas reakcji do osignicia tej samej wydajnoci, przy zastosowaniu kwasu izowalerianowego by znacznie duszy. Zbadano take enancjoselektywno CAL-B, w heksanie, w reakcji butanolu z bd podstawionymi kwasami karboksylowymi: kwasem mlekowym, 2-metylomasowym, 3-hydroksymasowym i 2-hydroksyheksanowym. Badania dowodz, e CAL-B moe by uyta jako dobry katalizator w reakcjach estryfikacji krtkoacuchowych estrw zapachowych (tyglinianu n-butylu, tyglinianu geranylu oraz 2-hydroksypropionianu butylu, 2-metylomalanu butylu i 2-hydroksyheksanianu n-butylu) prowadzonych w rodowisku rozpuszczalnikw organicznych, ale enancjoselektywno tego enzymu w stosunku do krtkoacuchowych kwasw karboksylowych jest znikoma [15]. W biotechnologicznej produkcji estrw zapachowych wykorzystywane s rwnie esterazy. Np. do otrzymywania estrw etylowych rednioacuchowych kwasw tuszczowych zastosowano esterazy drodowe i grzybowe [4]. W syntezie kapronianu etylu i kaprylanu etylu estrw o cierpkim, jabkowym zapachu [29] istotnym w wiecie aromatw, wykorzystano esteraz z Bacillus licheniformis [3]. Aktywno esteraz ma rwnie istotne znaczenie w przeksztacaniu rednioacuchowych kwasw uwalnianych podczas anaerobowej fermentacji, prowadzonej przy produkcji napojw fermentowanych [4]. Kolejn grup zwizkw zapachowych otrzymywanych w procesach biotechnologicznych s cykliczne estry laktony. Charakteryzuj si one przyjemnym, intensywnym zapachem i s do rozpowszechnione w naturze. Mog by izolowane z owocw, warzyw, orzechw, produktw mlecznych i misa. Zapach laktonw jest uzaleniony od wielkoci piercienia, dugoci bocznego acucha wglowego, obecnoci nienasyconych wiza i konfiguracji centrw chiralnych. Moliwo produkcji laktonw na drodze biotechnologicznej odkryto ju w 1960 r., gdy zbadano przeksztacenia kwasu rycynolowego do C16, C14 i C12 hydroksykwasw przy udziale bakterii i komrek zwierzcych [28]. Wysoko cenionym skadnikiem aromatw owocowych jest -dekalakton. Rynkowa sprzeda -dekalaktonu siga kilkuset ton rocznie. -dekalakton charakteryzuje si do intensywnym, olejowo-brzoskwiniowym aromatem wyczuwalnym ju przy steniu 5 mg/dm3 [23]. Chemiczna synteza tego zwizku prowadzi do powstania racemicznej mieszaniny, enancjomeru R (wystpujcego w brzoskwiniach i w wikszoci innych owocw) oraz enancjomeru S (charakterystycznego dla mango). Std te ceniona jest bioprodukcja -dekalaktonu pozwalajca na zachowanie czystoci optycznej [13]. Obecnie na skal przemysow -dekalakton jest otrzymywany z kwasu rycynolowego gwnego kwasu tuszczowego w oleju rycynowym (ok. 90 %) bd jego estrw metylowych, przy udziale drody (rys. 2)

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

[23, 28]. Wysok wydajno produktu obserwuje si przy uyciu do reakcji drody Yarrowia lipolytica. Wynika to z dobrego adaptowania si tych mikroorganizmw w rodowisku hydrofobowych substratw, dziki licznym lipazom, cytochromowi P450, oksydazom acetylo-CoA i zdolnoci produkcji biosurfaktantw [28].
CH3(CH2)5
OH
kwas rycynolowy ricinoleic acid

(CH2)7COOH

CH3(CH2)5
OH

COOH CH3(CH2)5 O O

kwas 4-hydroksydekanowy 4-hydroxy decanoic acid

dekalakton decalactone

Rys. 2. Fig. 2.

Biosynteza -dekalaktonu z kwasu rycynolowego (kwasu (R)12hydroksyoktadek-9-enowego) przez drode Yarrowia lipolytica. Biosynthesis of ricinoleic acid ((R)-12-hydroxyoctadec-9-enoic acid) to -decalactone by Yarrowia lipolytica.

Dalsze korzystne zmiany mona uzyska przy zastosowaniu inynierii genetycznej. Mutacja szczepu Yarrowia lipolytica pozwala na uzyskanie nawet 11 g -dekalaktonu na dm3 w cigu 55 h [23]. Drode Yarrowia lipolytica s zdolne take do produkcji duych iloci innych laktonw [28] np. 3-hydroksy--dekalaktonu, ktry jest prekursorem dec-2-en-4-olidu czy dec-3-en-4-olidu (tab. 1) [9]. Ten ostatni zwizek ma bardziej intensywny zapach brzoskwiniowy ni -dekalakton, nie jest jednak wykorzystywany przez przemys aromatw spoywczych ze wzgldu na trudnoci oddzielenia go od izomerycznego dec-2-en-4-olidu, ktry charakteryzuje si zapachem grzybowym [28]. Garcia i wsp. [9] przeprowadzili badania, w ktrych okrelili wpyw rnych czynnikw rodowiskowych na produkcj 3-hydroksy--dekalaktonu. Uzyskane przez nich wyniki stanowi wany krok w otrzymywaniu dec-2-en-4-olidu oraz dec-3-en-4-olidu. Przebadano wpyw stenia substratu, pH, napowietrzania i rozpuszczalnoci tlenu. Zaobserwowano kluczow rol tlenu w produkcji 3-hydroksy-dekalaktonu. Najwysz wydajno reakcji (0,5 mola) osigano przy 5- i 30procentowej rozpuszczalnoci tlenu oraz pH 4,5. Podjto take prby otrzymania -dekalaktonu przy uyciu innych mikroorganizmw np.: Monilia fructicola, Sporobolomyces odours, Rhodotorula glutinis, Sporidiobolus spp., Aspergillus niger, Pichia etchellsii, Cladosporium suaveolens, ale uzysk produktu przy zastosowaniu tych drobnoustrojw nie przekracza 1 g/dm3. Wykorzystujc zdolno drody piekarskich Saccharomyces cerevisiae do enancjoselektywnej redukcji grupy karbonylowej, mona z kwasu 3-metylo-4-oksooktanowego otrzyma izomery cis i trans laktonw, wystpujcych jako skadniki zapachowe whisky i koniaku (whisky i cognac lactones) (rys. 3) [24].

10

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

Tabela 1 Laktony produkowane przez drode Yarrowia lipolytica. Lactones produced by the Yarrowia lipolytica yeast.

Struktura zwizku Compound Structure

O O

Nazwa zwiazku Name of compound -dodekalakton -dodecalactone -dekalakton -decalactone -nonalakton -nonalactone -dekalakton -dekalaktone
O

Nuty zapachowe Scent notes brzoskwiniowy / peach, masowy / butter, tuszczowy / fatty brzoskwiniowy / peach, tuszczowy / fatty, owocowy / fruity kokosowy / coconut, tuszczowy / fatty, owocowy / fruity, anykowy / aniseed brzoskwiniowy / peach, oleisty / oily, kremowy /creamy owocowy / fruity, oleisty / oily, tuszczowy / fatty grzybowy / mushroom

O O

O O

O
O O

dec-3-en-4-olid dec-3-en-4-olide dec-2-en-4-olid dec-2-en-4-olide

O O R stereoizomer cis stereoisomer cis

Rys. 3. Fig. 3.

O O R stereoizomer trans stereoisomer trans

R=C4H9 whisky lacton R=C5H11 cognac lacton

Izomery cis i trans laktonw wystpujcych jako skadniki zapachowe koniaku i whisky. Isomers of cis and trans lactones occuring as odour components of cognac and whisky.

Alkohole, aldehydy i kwasy karboksylowe Nie tylko estry s cennymi zwizkami w wiecie aromatw spoywczych. Spord alkoholi istotne znaczenie ma 2-fenyloetanol. Dotychczas produkcja tego zwizku zdominowana bya przez metody chemiczne. Obecnie poszukiwane s biotechnolo-

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

11

giczne drogi syntezy 2-fenyloetanolu, ktry jest produkowany przez wiele bakterii, a take przez niektre drode. Najwaniejsz naturaln drog otrzymywania 2-fenyloetanolu jest degradacja naturalnej L-fenyloalaniny przy udziale enzymw drodowych. Reakcja polega na deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego, a nastpnie dekarboksylacji kwasu do aldehydu fenylooctowego, ktry poprzez dziaanie dehydrogenazy jest przeksztacany w 2-fenyloetanol (rys. 4) [23].
COOH NH2 COOH

transaminaza Transaminase

L-fenyloalanina

2-ketoglutaran L-glutaminian 2-Ketoglutarate L-Glutamate

L-Phenylalanine

kwas fenylopirogronowy Phenylpyruvate

dekarboksylaza Decarboxylase

OH

CO2

O H

dehydrogenaza Dehydrogenase
NAD NADH

2-fenyloetanol 2-Phenylethanol
Rys. 4. Fig. 4.

aldehyd fenylooctowy Phenylacetaldehyde

Przeksztacanie aminokwasu L-fenyloalaniny do 2-fenyloetanolu przy udziale drody Yarrowia lipolytica. Transformation of amino acid - L-phenylalanine into 2-phenylethanol by yeast Yarrowia lipolytica yeast.

Istotnymi, lotnymi zwizkami, dajcymi charakterystyczne sensoryczne wraenie zielonej smakowitoci s te C6 aldehydy i odpowiadajce im alkohole. Przykadem moe by cis-3-heksen-1-ol (liciowy alkohol) majcy intensywny zapach wieo citej trawy i stanowicy wany skadnik naturalnej nuty zapachowej [1, 23, 24]. Tradycyjna metoda pozyskiwania zielonej nuty zapachowej poprzez destylacj olejkw rolinnych jest obecnie zastpowana przez biokataliz. Naturalnymi prekursorami w biokatalitycznej produkcji zielonej nuty s kwas linolowy i linolenowy. Dziaanie lipooksygenazy, otrzymywanej z mki sojowej, powoduje ich przeksztacenie do 13-wodoronadtlenku kwasu oktadeka-9-cis-11-trans-dienowego (C13-HPOD) bd odpowiednio 13-wodoronadtlenku-kwasu oktadeka 9-cis-11-trans-15-cis-trienowego

12

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

(C13-HPOT). Nastpnie liaza wodoronadtlenkowa (enzym cytochromu P450) przeksztaca C13-HPOT i C13-HPOD do aldehydw C6, z ktrych dziki dziaaniu dehydrogenazy alkoholowej z drody piekarskich, w obecnoci NADH/NAD, powstaj odpowiednie alkohole: cis-3-heksen-1-ol, trans-2-heksen-1-ol czy heksan-1-ol [1, 23]. W grupie lotnych zwizkw tworzcych zielon nut powszechnie wykorzystywanym w przemyle spoywczym jest take octan cis-3-heksen-1-ylu. Chiang i wsp. [8] otrzymali ten zwizek na drodze biotechnologicznej z wykorzystaniem immobilizowanej lipazy z Rhizomucor miehei, ktra katalizowaa reakcj transestryfikacji cis-3heksen-1-olu z triacetin w n-heksanie.
Tabela 2 Produkcja kwasw karboksylowych przez bakterie kwasu octowego. Production of carboxylic acids by acetic acid bacteria. Kwas karboksylowy Carboxylic acid kwas propionowy propionic acid Zapach/smak Odour/taste ostry / pungent, kwany /sour, przypominajcy skwaniae mleko / reminiscent of sour milk, serowy / cheese, masowy / butter); malina /rasberry, truskawka / strawberry, koniak / cognac, maso / butter mocny / powerful, przenikliwy / penetrating, przypominajcy zjeczae maso / reminiscent of rancid butter; maso / butter, ser / cheese, orzechy / nut, owoce / fruit mocny / powerful, przenikliwy / penetrating, w rozcieczeniu przyjemny / almost pleasant when diluted, owocowy / fruity; ser / cheese, owoce / fruit ostry / pungent, dranicy / acrid, przypominajcy ser Roquefort / reminiscent of Roquefort cheese, w rozcieczeniu przyjemny / pleasant when diluted, owocowy / fruity; ser / cheese, maso / butter, czekolada / chocolate przenikliwy / diffusive, kwasowydranicy / acid-acrid, w rozcieczeniu serowy / in dilution cheesy, nieprzyjemny / unpleasant, przy duym rozcieczeniu (poniej 20mg/dm3) zioowy / herbaceous if highly diluted (<20mg/ dm3), suchy / dry), orzech / nut, kawa / coffee Biokatalizator Biocatalyst Gluconobacter oxydans Acetobacter pasteurianus Propionibacterium

COOH
kwas masowy butyric acid

Gluconobacter oxydans Acetobacter pasteurianus

COOH kwas izomasowy isobutyric acid

Gluconobacter oxydans

COOH kwas 2-metylo masowy 2-methylbutyric acid

Gluconobacter oxydans Acetobacter pasteurianus

COOH

kwas izowalerianowy isovaleric acid

COOH

Gluconobacter oxydans Acetobacter pasteurianus

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

13

Niektre kwasy karboksylowe dziki swemu intensywnemu zapachowi i charakterystycznemu smakowi odgrywaj istotn rol w przemyle spoywczym. Biotechnologiczne pozyskiwanie tych kwasw polega na utlenianiu alkoholi, zachodzcym przy udziale bakterii kwasu octowego: Acetobacter pasteurianus, Gluconobacter oxydans, Propionibacterium (tab. 2) [23]. Due zainteresowanie budzi rwnie mikrobiologiczna metoda produkcji istotnego w wiecie aromatw benzaldehydu. Naturalny benzaldehyd, ktry stanowi kluczowy skadnik zapachw owocowych, m.in. wini, pozyskiwany jest z amygdaliny cyjanogennego glikozydu wystpujcego w pestkach owocw (moreli, wini, liw, brzoskwi) oraz gorzkich migdaach. Jednake ekstrakcja prowadzi do powstania niepodanych produktw ubocznych, np. cyjanowodoru [17]. Dlatego te biokonwersja stanowi alternatyw dla produkcji naturalnego benzaldehydu. W biotechnologicznej produkcji benzaldehydu prekursorem jest L-fenyloalanina [17, 21]. Degradacja tego zwizku przy udziale grzybw Ischnoderma benzoinum, Bjerkandera adusta bd Polyporus tuberaster pozwala na uzyskanie benzaldehydu w iloci 71 - 587 mg/l, w zalenoci od uytego szczepu [17]. Wanilina (C8H8O3, 4-hydroksy-3-metkosy-benzaldehyd) jest wanym aldehydem w przemyle spoywczym i kosmetycznym, gdy stanowi jeden ze skadnikw aromatycznych wanilii. Wanilina wystpuje w ziarnie tropikalnej roliny Vanilia planifolia w iloci ok. 2 % jej masy, std te wyodrbnienie tego zwizku poprzez ekstrakcj nie przekracza 1 % wiatowej produkcji. Biotechnologiczny proces produkcji waniliny polega na biokonwersji izoeugenolu lub eugenolu przez szczepy bakterii Corynebacterium bd Pseudomonas (rys. 5, reakcja [a]) [13, 23, 30].
CH2CH=CH2 [a] OCH3 OH eugenol OH wanilina vanilin CHO [b] OCH3 OH kwas ferulowy ferulic acid CH=CHCOOH

OCH3

[c]

OH

CH3O O HO glukoza

izorapontygenina isorhapontin

Rys. 5. Fig. 5.

Moliwe drogi bioprodukcji waniliny. Possible pathways for the bioproduction of vanilin.

14

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

Produkcja na skal przemysow bazuje na biokonwersji kwasu ferulowego pozyskiwanego z otrb ryowych (rys. 5, reakcja [b]) [23]. Inn moliw drog jest utlenianie naturalnego stilbenolidu, wystpujcego w przyrodzie w postaci glikozydu izorapontygeniny; utlenianie do waniliny jest katalizowane przez dioksygenaz pochodzc z Pseudomonas sp. (rys. 5, reakcja [c]) [11]. Pochodne terpenowe
O OH CH2OH

l-mentol l-menthol

citronellol citronellol

karwon carvone

pinen pinene

limonen limonene

Rys. 6. Fig. 6.

Struktura terpenw. Structure of terpenes.

W ostatnim okresie wrasta zainteresowanie terpenoidami, jako naturalnymi zwizkami zapachowymi. Terpenoidy wystpuj gwnie w wydzielinach drzew szpilkowych, eukaliptusw, w olejkach eterycznych owocw cytrusowych i wielu innych rolin. Odgrywaj one nie tylko istotn rol biologiczn (ochrona przed rolinoercami, insektami), ale i s rdem okrelonych zapachw (rys. 6) [2, 11]. Std te znaczna cz tej grupy zwizkw organicznych, stosowanych w aromatach i kompozycjach zapachowych mono- i seskwiterpeny oraz ich pochodne tlenowe, pochodzi ze rde naturalnych. Obecnie wzrasta take zainteresowanie biotechnologicznymi metodami otrzymywania tych zwizkw, poniewa wiele z nich wystpuje w postaci konkretnych enancjomerw, zatem biotransformacje s tu preferowane ze wzgldu na stereoselektywno reakcji enzymatycznych (tab. 3) [7]. Wikszo przeksztace mikrobiologicznych dotyczy monoterpenw (rys. 6). Prowadzono badania nad pozyskiwaniem l-karwonu z - lub -pinenu na drodze mikrobiologicznej z uyciem Pseudomonas, a take citronellolu z citronellalu przy udziale drody Candida reukaufii AHU 3032 [11]. Wanym terpenowym alkoholem w przemyle aromatw jest l-mentol. Naturalny l-mentol pozyskiwany jest poprzez krystalizacj z mity pieprzowej. Jedna z biotechnologicznych metod jego otrzymywania polega na dziaaniu esteraz preferujcych hydroliz estrw l-mentylu: wyselekcjonowane szczepy Pencillium, Rhizopus, Bacillus, Trichoderma prowadz asymetryczn hydroliz octowych, propionowych czy kapronowych estrw d,l-mentolu.

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

15
Tabela 3

Waciwoci zapachowe enancjomerw wybranych zwizkw terpenowych. Aromatic properties of enantiomers of some selected terpene compounds. Monoterpeny Monoterpene karwon carvone limonen limonene -pinen -pinene mentol menthol Enancjomer Enantiomer (R)-(-) (S)-(+) (R)-(+) (S)-(-) (1R, 5R)-(+) (1S, 5S)-(-) (1R, 3R,4S)-(-) (1S, 3S, 4R)-(+) Zapach Fragrance mietowy / spearmint kminkowy / caraway pomaraczowy / orange terpentynowy / turpentine sabo mitowy / slightly minty sosnowy / pine tree mietowy / minty fenolowy / phenolic

Immobilizowan lipaz mikrobiologiczn z drody Candida antarctica wykorzystano w transestryfikacji alkoholi terpenowych z estrami winylowymi. Lipaza katalizowaa powstawanie w rodowisku organicznym estrw citronellolu i geraniolu z octanu i propionianu winylu jako czynnikw acylujcych. Zastosowanie 10 % enzymu w stosunku do masy reagentw pozwolio osign w cigu 8 - 16 h wydajno reakcji powstawania octanu citronellylu i octanu geranylu rzdu 98 - 99 % [2]. Jednym z najbardziej licznych monoterpenw jest R-(+)-limonen. Wystpuje powszechnie w skrkach owocw cytrusowych, std te stanowi niedrogi, powszechnie wystpujcy produkt uboczny. Jego chemiczna struktura jest zbliona do wielu monoterpenoidw (pochodnych tlenowych, takich jak: alkohol perillylowy, karweol, karwon, mentol) o przyjemnym zapachu, dlatego moe on stanowi prekursor w produkcji tych zwizkw zapachowych. Bicas i wsp. [5] prowadzili badania nad biotransformacj R-(+)-limonenu do R-(+)--terpineolu. Zwizek ten stanowi wany handlowo produkt, wykorzystywany w mydach, kosmetykach i preparatach zapachowych, gdy cechuje si kwiatowym zapachem. Biotransformacje R-(+)-limonenu do R-(+)-terpineolu (C10H18O) prowadzono z udziaem Fusarium oxysporum 152b. Najlepsz wydajno 2,4 g/l osignito po 72 h od rozpoczcia reakcji, przy zastosowaniu 0,5 % (v/m) stenia limonenu w czystej destylowanej wodzie, uytej jako poywki, w stosunku 0,25 (m/m) inokulum do poywki, w temp. 26 C i szybkoci mieszania 240 obr./min. Przeksztacanie R-(+)-limonenu do R-(+)--terpineolu metod biotechnologiczn prowadzone byo rwnie z udziaem Cladosporium sp. [12], Pseudomonas gladioli [6] czy P. digitatum [26].

16 Zwizki heterocykliczne

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

Interesujcymi dla przemysu spoywczego, pod wzgldem zapachu, s te pochodne pirazyny heterocykliczne zwizki zawierajce w piercieniu dwa atomy azotu (rys. 7). Pirazyny s mikroskadnikami aromatw stosowanych w produktach spoywczych (w aromacie orzechowym lub pieczonych ziemniakw). Metoksyalkilopirazyny odkryto w rnorodnych warzywach, m.in. w ostrej papryce, ziemniakach, zielonym groszku. W przypadku papryki, za jej typowy zapach odpowiedzialna jest 2-metoksy3-izobutylopirazyna [11]. Powstawane alkilopirazyn w produktach ywnociowych zwizane jest z reakcjami Maillarda i piroliz zwizkw aminowych. Biotechnologiczna produkcja pirazyn przebiega przy udziale drody. Drode piekarskie uczestnicz w tworzeniu acyloin, katalizujc biotransformacj aldehydw alifatycznych i kwasw 2-ketokarboksylowych. Wytworzone tym sposobem acyloiny reaguj z 1,2-propanodiamin tworzc 5,6-dihydropirazyny. Kurniadi i wsp. [14] syntetyzowali z udziaem drody piekarskich kilka pochodnych pirazynowych: 2-etylo-3,5-dimetylopirazyn o aromacie orzechowym; 2,3-dietylo-5-metylopirazyn charakteryzujc si zapachem pieczeni oraz 2,3-dietylo-5-metylo-5,6-dihydropirazyn o aromacie skrki chleba.

N N
pirazyna pyrazine
Rys. 7. Fig. 7. Struktura pirazyny. Structure of pyrazine.

Podsumowanie Metody biotechnologiczne stanowi doskona alternatyw zarwno dla ekstrakcji z materiaw rolinnych, jak i dla typowej syntezy chemicznej. O ile w pierwszym przypadku czynnikiem przemawiajcym za biotransformacjami jest koszt procesu, o tyle w drugim decydujce s wzgldy ekologiczne, a w przypadku zwizkw chiralnych selektywno enzymw. Cz omwionych procesw wykorzystywana jest ju w przemysowej produkcji, np. otrzymywanie octanu izoamylu, fenyloetanolu (z L-fenyloalaniny), waniliny (z kwasu ferulowego, eugenolu i stilbenw) czy -dekalaktonu z kwasu rycynolowego. Inne syntezy zostay wykonane, jak dotd, w skali laboratoryjnej, jednak olbrzymi potencja tkwicy w biotransformacjach pozwala przypuszcza, e bd one stosowane coraz powszechniej.

BIOTECHNOLOGICZNE METODY OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI ZAPACHOWYCH

17

Literatura
[1] [2] [3] [4] Akacha N., Boubaker O., Gargouri M.: Production of hexenol in a two-enzyme system: kinetic study and modeling. Biotechnology Letters, 2005, 27, 1875-1878. Akoh C.C, Yee L.B.: Lipase-catalyzed transesterification of primary terpene alcohols with vinyl esters in organic media. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1998, 4, 149-153. Alvarez-Macarie E., Baratii J.: Short chain flavour ester synthesis by a new esterase from Bacillus licheniformis. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2000, 10, 377-383. Bardi L., Crivelli C., Marzona M.: Esterase activity and release of ethyl esters of medium-chain fatty acids by Saccharomyces cerevisiae during anaerobic growth. Can. J. Microbiol./Rev. can. Microbiol., 1998, 44 (12), 1171-1176. Bicas J., Barros F., Wagner R., Godoy H., Pastore G.: Optimization of R-(+)--terpineol production by the biotransformation of R-(+)-limonene. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2008 35, 1061-1070. Cadwallader K., Braddock R., Parish M., Higgins D. Bioconversion of (+)-limonene by Pseudomonas gladioli. J. Food Sci., 1989, 54, 1241-1245. Carvalho C., Fonseca M.: Biotransformation of terpenes. Biotechnol. Advances, 2006, 24, 134-142. Chiang W. D., Chang S. W., Shieh C. J.: Studies on the optimized lipase-catalyzed biosynthesis of cis-3-heksen-1-yl acetate in n-heksane. Process Biochemistry, 2003, 38, 1193-1199. Garcia E., Aguedo M., Gomes N., Choquet A., Belo I., Teixeira J., Belin J., Wache Y.: Production of 3-hydroxy--decalactone, the precursor of two decenolides with flavouring properties, by the yeast Yarrowia lipolytica. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 57, 22-26 Guvenc A., Kapucu N., Mehmetoglu U.: The production of isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent-free system. Process Biochemistry, 2002, 38, 379-386. King R.D., Cheetham P.S.J.: Food Biotechnology 2. Elservier Applied Science. London 1988. Kraidman G., Mukherjee B., Hill J.: Conversion of D-limonene into an optically active isomer of -terpineol by a Cladosporium species. Bacteriol. Proc., 1969, 69-63. Krings U., Berger R.G.: Biotechnological production of flavours and fragrances. Appl. Microbiol. Biotechnol, 1998, 49, 1-8. Kurniadi T., Rhlid R.B, Fay L.B., Juillerat M.A, Berger R.G.: Chemoenzymatic synthesis of aroma active 5,6-dihydro- and tetrahydropirazines from aliphatic acyloins produced by baker`s yeast. J. Agric. Food Chem., 2003, 51 (10), 3103-3107. Larios A., Garcia H.S., Oliart R.M., Valerio-Alfaro G.: Synthesis of flavor and fragrance esters using Candida antarctica lipase. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65, 373-376. Liu S. Q., Holland R., Crow V. L.: Esters and their biosynthesis in fermented dairy products: a review. Int. Dairy J., 2004, 14, 923-945. Lomascolo A., Stentelaire Ch., Asther M., Lesage-Meessen L.: Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry. Tibtech, 1999, 17, 282-289. Majumder A.B, Singh B., Dutta D., Sadhukhan S., Gupta M.N.: Lipase catalyzed synthesis of benzyl acetate in solvent-free medium using vinyl acetate as acyl donor. Bioorg. Med. Chem. Letters, 2006, 16, 4041-4044. Rojas V., Gil J.V., Pinaga F., Manzanares P.: Studies on acetale ester production by nonSaccharomyces wine yeasts. Int. J. Food Microb., 2001, 70, 283-289. Romero M.D., Calvo L., Alba C., Daneshfar A., Ghaziaskar H.S.: Enzymatic synthesis of isoamyl acetate with immobilized Candida antarctica lipase in n-hexane. Enzyme Microb. Technol., 2005, 37, 42-48. Rozzell J. D.: Commercial scale biocatalysis: myths and realities. Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 2253-2261.

[5] [6] [7] [8] [9]

[10] [11] [12] [13] [14]

[15] [16] [17] [18]

[19] [20]

[21]

18

Jolanta Krzyczkowska, Ewa Biaecka-Florjaczyk, Izabela Stolarzewicz

[22] Salah R B., Ghamghui H., Miled N., Mejdoub H., Gargouri Y.: Production of butyl acetate ester by lipase from novel strain of Rhizopus oryzae. J. Biosci. and Bioeng., 2007, 103 (4), 368-372. [23] Schrader J., Etschmann M.M. W., Sell D., Hilmer J. M., Rabenhorst J.: Applied biocatalysis for the synthesis of natural flavour compoundscurrent industrial processes and future prospects. Biotechnol. Letters, 2004, 26, 463-472. [24] Serra S., Fuganti C., Brenna E.: Biocatalytic preparation of natural flavours and fragrances. Trends in Biotechnology, 2005, 23 (4), 193-198. [25] Talon R., Montel M. C., Berdague J. L.: Production of flavor esters by lipases of Staphylococcus warneri and Staphylococcus xylosus. Enzyme Microb. Technol., 1996, 19, 620-622. [26] Tan Q., Day D., Cadwallader K. Bioconversion of R-(+)-limonene by P. digitatum (NRRL 1202). Process Biochem., 1998, 33, 29-37. [27] The Council of the European Communities. Council Directive 88/388/EEC of 22 June 1988. [28] Wache Y., Aguedo M., Nicaud J. M., Belin J. M.: Catabolism of hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 61, 393-404. [29] Verstrepen K.: Flavor-active esters: adding fruitiness to beer. J. Biosci. Bioeng., 2003, 96 (2), 110118. [30] Xu P., Hua D., Ma C.: Microbial transformation of propenlbenzenes for natural flavour production. Trends in Biotechnology, 2007, 25 (12), 571-576.

BIOTECHNOLOGICAL METHODS FOR PRODUCING ODORIFEROUS SUBSTANCES Summary The development of food industry, new sources of and methods for winning raw materials, as well as the raising awareness among the population cause the consumer expectations of food to continuously change. It has been reported that, in recent years, consumers have become more and more interested in natural food additives produced using biotechnological methods. The present paper contains a review of odoriferous substances, which are biotechnologically produced with the application of such microorganisms as: yeast, bacteria, fungi or enzymes isolated from them. Key words: aroma, micro-organisms, enzymatic synthesis, odoriferous substances