2.4.

Avantajele utilizrii fluidelor supercritice Utilizarea drept solveni n diferite procese industriale i biotehnologice se datoreaz urmtoarelor avantaje care pot fi grupate n patru categorii (tabel 2.4): avantaje privind mediul nconjurtor; avantaje privind sntatea i sigurana utilizrii; avantaje privind condiiile de desfurare a proceselor; avantaje legate de caracteristicile fizico-chimice. Beneficiile asupra mediului nconjurtor sunt recunoscute la utilizarea dioxidului de carbon supercritic i a apei supercritice. Cu toate c SC-CO2, alturi de alte fluide supercritice, sunt gaze de ser, utilizarea sa este benefic datorit posibilitii nlocuirii solvenilor lichizi organici. Utilizarea SC-CO2 nu contribuie la creterea emisiilor de CO2, existnd posibilitatea reciclrii emisiilor de CO2. Beneficiile legate de sntate i siguran se datoreaz faptului c fluidele supercritice (n special, SC-CO2 i SC-H2O) sunt necancerigene, netoxice, nemutagene, neinflamabile i stabile termodinamic.
Tabelul 2.4. Avantajele utilizrii fluidelor supercritice (dup Jessop, 1999) Categoria Mediul nconjurtor Avantaje nu contribuie la formarea smogului nu distrug stratul de ozon nu prezint ecotoxicitate nu formeaz deeuri lichide necancerigen netoxic neinflamabil nu formeaz reziduuri Condiiile de desfurare a procesului permite separarea uoar a produselor de reacie viteze de difuzie mari vscozitate sczut densitate i putere de solvatare optim pre sczut miscibilitate ridicat cu gazele constant dielectric variabil compresibilitate ridicat densitate mare vitez de difuzie mare Exemple de SCFs majoritatea fluidelor supercritice majoritatea fluidelor supercritice CO2, H2O CO2 i alte fluide SC volatile majoritatea fluidelor supercritice (cu excepia hexanului C6H6) majoritatea fluidelor supercritice (cu excepia HCl, HBr, NH3) CO2, N2O, H2O, CHF3 CO2 i alte fluide supercritice volatile CO2 i alte fluide supercritice volatile toate fluidele supercritice toate fluidele supercritice toate fluidele supercritice CO2, H2O, NH3 toate fluidele supercritice fluidele supercritice polare toate fluidele supercritice toate fluidele supercritice toate fluidele supercritice

Sntate i sigurana utilizrii

Caracteristi cile fizicochimice

Procesele chimice desfurate n condiii supercritice au loc la un consum energetic redus, acest aspect constituind un avantaj din punct de vedere economic. Avantajele referitoare la desfurarea procesului deriv de la proprietile fizice ale fluidelor supercritice: difuzivitate termic mare, vscozitate dinamic sczut, valori medii ale densitii. Cel mai important avantaj al utilizrii fluidelor supercritice n sinteza chimic se refer la proprietatea lor de separare, aspect deosebit de important pentru extracia cu ajutorul fluidelor supercritice. Datorit volatilitii lor, ele pot fi ndeprtate din produsele de reacie fr un consum energetic suplimentar. Acest aspect este important pentru industria alimentar i farmaceutic. Utilizarea fluidelor supercritice permite desfurarea unor procese eficiente i curate.

Deoarece fluidele supercritice sunt miscibile cu alte gaze, reaciile desfurate n fluidele supercritice au loc cu vitez mare de reacie. Alte avantaje ale utilizrii dioxidului de carbon supercritic sunt: - determin creterea vitezei transferului de substan a substratului la enzim; - prezint proprieti fizice uor ajustabile n domenii relativ mari, prin modificri uoare ale valorilor presiunii i temperaturii; - preul de cost este mult mai mic, comparativ cu al solvenilor convenionali; - permite o separare uoar a fazelor ulei i ap n bioreactor cu funcionare continu la scar industrial. Astfel, permite integrarea i recircularea solventului (Habulin i colab., 2002); - permite utilizarea bioreactoarelor cu volume mici i productiviti ridicate n procese desfurate la scar industrial.

Aplicaii ale fluidelor supercritice n biotehnologii

3.1. Istoricul utilizrii fluidelor supercritice ca mediu pentru reacii biochimice n 1680, cercettorul englez Denys Papin iniiaz cercetrile descoperirii punctului critic, proiectnd un recipient cu funcionare la presiune nalt destinat fierberii apei. n Frana, baronul Cagniard de LaTour presupune c acest control al fierberii apei trebuie s aib o limit, astfel c n 1822 dovedete existena punctului critic (Jessop, 1999). Faraday a considerat punctul critic ca punctul de delichefiere i starea supercritic ca cea mai frumoas stare pe care Cagniard de LaTour a fcut-o cunoscut. ns Andrews introduce termenul de punct supercritic mult mai trziu (Jessop, 1999). n 1907, E. Buchner prezint rezultate experimentale referitoare la solubilitatea naftalinei n SC-CO2. El constat c la presiuni mici, solubili-tatea este zero. ns cu creterea presiunii peste valoarea critic a CO2, respectiv 73 bar, solubilitatea crete brusc. Primele reacii desfurate n ap supercritic au fost efectuate de GabrielAuguste Daubre, iar n 1857, studiaz reacii n SC-H2O la 400C. n 1879, Hannaz i Hogarths observ c oxidul de zinc n stare solid reacioneaz cu SC-CCl4 (cloroform n stare supercritic) la 300C fr s se dizolve. Villard, n 1898, observ c atunci cnd ncearc s dizolve iodul n SC- C2H4 la 17C i 300 bar, iodul odat dizolvat reacioneaz cu etilena. O gam variat de reacii desfurate la presiuni nalte sunt descrise de Vladimir Ipatiev n perioada 1904 1914. Sunt abordate urmtoarele reacii: dehidrogenarea 2propanolului, deshidratarea 2butanolului, izomerizarea ciclohexanului la metilciclopentan, hidrogenarea benzenului. Cercettorul revoluioneaz cataliza eterogen, introducnd nu numai utilizarea presiunilor nalte, dar i ali catalizatori, precum Ni2O3/Al2O3. Cercetrile utilizrii fluidelor supercritice continu, astfel c pentru prima dat la mijlocul secolului XX se prezint rezultatele folosirii SC-CO2 pentru reacia de polimerizare. Sargent, n 1949, sugereaz c bioxidul de carbon poate fi ncorporat n polietilen pentru obinerea unui compus mai ceros, acest lucru fiind posibil prin utilizarea SC-C2H4 i SC-CO2 la 72...88C i 100 bar n prezena benzoilperoxidului. Astfel, SC-CO2 este utilizat drept solvent inocent pentru polimerizarea radicalilor liberi. n 1966, Stevens patenteaz procedeul copolimerizrii CO2 i a oxidului de etilen pentru obinerea policarbonailor n condiii supercritice (Jessop, 1999). ncepnd cu anii 80, s-au utilizat enzimele drept catalizatori activi n reacii enzimatice desfurate n medii neconvenionale, iar primele rezultate au fost publicate dup civa ani.

Utilizarea fluidelor supercritice drept medii de desfurare a reaciilor enzimatice se datoreaz tensiunii superficiale i vscozitii reduse, difuzivitii mari, proprieti care conduc la intensificarea transferului de substan. Pentru majoritatea reaciilor enzimatice sunt necesare temperaturi apropiate de 50...60C pentru meninerea stabilitii biocatali-zatorului. Alegerea tipului de fluid supercritic este limitat de proprietile i avantajele acestora. 3.2. Consideraii privind utilizarea enzimelor n bioreactoare cu funcionare la presiuni nalte Utilizarea fluidelor supercritice ca solveni nepolari pentru reaciile enzimatice a fost iniiat n anii 80. Cele mai studiate enzime sunt lipazele, folosite n reacii de transesterificare sau esterificare a acizilor grai, dar i n reacii de hidroliz i epoxidare. n ultimii ani, au fost studiate reacii de polimerizare catalizate de lipaze. Enzimele prezint stabilitate mai mare n fluide supercritice dect n soluii apoase. Deoarece nu sunt solubile n fluide supercritice, cataliza enzimatic este ntotdeauna eterogen. Stabilitatea i activitatea enzimelor n fluide supercritice depinde de urmtorii factori: tipul de enzim i sursa microbian; tipul fluidului supercritic; coninutul de ap liber n amestecul enzim/suport/mediu; presiunea i temperatura la care are loc reacia enzimatic; modalitatea de realizare a etapelor de presurizare/depresurizare. Pentru procesele industriale, este primordial meninerea activitii enzimatice o perioad ct mai ndelungat. O importan deosebit asupra stabilitii preparatului enzimatic modificri n jurul centrului activ afectnd activitatea enzimei. o are i structura enzimei, mici

La presiuni cuprinse ntre 7787 bar i temperatura de 31C, lipaza produs de Candida cylindracea absoarbe un numr mare de molecule de CO2. Astfel, au loc modificri n structura enzimei, situsul activ devenind accesibil pentru moleculele substratului. Se pare c dioxidul de carbon cu proprieti apropiate de cele critice (near-critical CO2) activeaz lipaza produs de Candida cylindracea (Ikushima i colab., 1996). Lozano i colab. (1996) precizeaz efectul presiunii asupra stabilitii -chimotripsinei n dioxid de carbon supercritic (SC-CO2). Creterea presiunii de la 80 bar la 150 bar determin creterea timpului de njumtire a -chimotripsinei imobilizate. Celulaza expus cinci zile la 35C n SC-CO2 pierde 10 % din activitate (Zheng i Tsao, 1996). n schimb, nu s-a constatat o scdere semnificativ a activitii lipazei imobilizate izolat din Mucor miehei, enzima fiind meninut 64 ore n SC-CO2. Habulin i colab. (1995) au meninut lipaza imobilizat izolat din Rhizomucor miehei ntr-un bioreactor continuu n SC-CO2 pentru o lun, constatnd doar o uoar reducere a productivitii reaciei de esterificare, de la 70 % la aproximativ 65 %. n schimb, lipaza produs de Mucor miehei termostatat n SCCO2 la presiunea de 36 bar i temperatura de 40C, timp de 4 zile pierde 10 % din activitate (Yu i colab., 1992). n cazul unei proteinaze separat din latex de Carica papaya s-a constatat o cretere a activitii odat cu creterea temperaturii att la presiune atmosferic, ct i la meninerea n SC-CO2 la 300 bar. n SC-CO2 temperatura optim de aciune a enzimei a fost 40C, mai mic dect cea nregistrat la presiune atmosferic (50C). Modificarea comportamentului stabilitii termice a preparatului enzimatic n SC-CO2 se datoreaz activrii/dezactivrii termice i distribuiei apei din sistem. Preparatul enzimatic brut conine 1,53 % ap, n timp ce proteinaza dup 24 ore n SC-CO2 la temperatura de 60C conine doar 0,99 % ap. Activitatea rezidual a proteinazei meninut n SC-CO2 la 300 bar a fost mai mic dect activitatea preparatului comercial. S-a constatat inactivarea complet a proteinazei n propan la temperaturi cuprinse ntre 60C i 70C. n schimb, n SC-CO2 activitatea rezidual la temperatura de 40C este mai mare (1,39 %) dect la presiune atmosferic la 50C (1,12 %) (Knez i colab., 2003).

Habulin i colab. (2000) au folosit lipaza pancreatic ca biocatalizator pentru reacia de esterificare a acidului butiric cu alcool izoamilic cu scopul caracterizrii proprietilor catalitice ale enzimei. Reacia enzimatic s-a desfurat n urmtoarele variante: n soluie apoas la presiune atmosferic i temperatura de 40C i n SC-CO2 i propan, la temperatura de 40C i presiunea 300 bar. Stabilitatea termic a lipazei pancreatice a fost analizat prin meninerea enzimei n SC-CO2, respectiv propan la 300 bar i 40C pentru 24 ore, enzima fiind apoi utilizat pentru reacia de esterificare n prezena apei la 30C i presiune atmosferic. S-a demonstrat c stabilitatea lipazei pancreatice se menine att n SC-CO2, ct i n propan. Activitatea ei rmne constant chiar i dup meninerea timp de 24 ore la presiunea 300 bar i temperatura de 40C. Lipaza produs de Rhizomucor miehei (preparatul comercial Lipozyme IM) prezint o stabilitate termic bun n SC-CO2 prin meninere timp de 24 ore la presiunea de 100 bar i temperatura de 35C. Stabilitatea acestor lipaze este analizat prin incubarea lor n SC-CO2 i propan supercritic la 300 bar i 40C timp de 24 ore, iar dup o uoar depresurizare utilizate n reacii de esterificare la presiune atmosferic. Enzima prezint acelai efect i atunci cnd este tratat n butan i amestec npropan:nbutan. ns o dezactivare termic a enzimei a fost observat numai dup o expunere timp de 46 ore n azot supercritic (Krmelj i colab., 1999). 3.3. Bioreactoare cu lipaze imobilizate cu funcionare la presiuni nalte n ultimele decenii, s-a descoperit potenialul extraordinar al enzimelor drept biocatalizatori pentru procesele chimice n medii neapoase. Utilizarea lor ofer multe avantaje: - creterea solubilitii substratelor slab solubile n ap; - evitarea unor reacii nedorite; - favorizarea recuperrii produilor de reacie. Reaciile enzimatice n medii neconvenionale prezint interes deosebit datorit avantajelor pe care le au. Avantajele utilizrii fluidelor supercritice ca mediu pentru studiul stabilitii enzimelor sunt: prezint stabilitate ridicat pentru enzime; permit dizolvarea compuilor hidrofobi i stabilirea echilibrului reaciei; prezint valori sczute ale difuzivitii i vscozitii, astfel c transferul de substan dintre substrat i centrul activ al enzimei este redus, determinnd o cretere a vitezelor de reacie; densitatea i constanta dielectric a fluidelor supercritice depind de presiune i temperatur, astfel nct activitatea i specificitatea enzimelor poate fi monitorizat prin modificri ale presiunii i temperaturii; depresurizrile n cascad (treptate) permit o separare optim a produilor de reacie (Gamse i colab., 2003; Marthy i colab., 1994); fluidele supercritice pot fi utilizate ca solveni n bioreactoare cu funcionare continu combinate cu o coloan de extracie; dioxidul de carbon supercritic (SC-CO2) prezint o valoare sczut a temperaturii critice, este netoxic, disponibil, ieftin, astfel nct multe enzime sunt stabile i active n acest mediu.

Bioreactoarele cu lipaze imobilizate cu funcionare la presiuni nalte cuprind: bioreactoare cu funcionare discontinu, bioreactoare cu funcionare continu, bioreactoare cu membrane biocatalitice. 3.3.1. Bioreactor cu agitare i funcionare discontinu Bioreactorul cu agitare i funcionare discontinu la presiuni nalte (High Pressure Batch Stirred Tank Reactor HPBSTR (figura 3.1) s-a folosit pentru sinteza enzimatic a esterului izoamil-acetat (esterul specific aromei de banan) cu ajutorul lipazei izolate din tulpini de Candida antarctica, lipaza imobilizat pe rini acrilice macroporoase cu un coninut de ap de 12 %.

Substratul format din anhidrid acetic (cu rol de donor al gruprilor acil) i alcoolul izoamilic sunt introdui n bioreactor mpreun cu preparatul enzimatic, apoi SC-CO2 este pompat n bioreactor pn la presiunea dorit. Gruprile acil reprezint radicali monovaleni ai unor acizi organici. n timpul desfurrii reaciei enzimatice s-au prelevat probe, dup fiecare prelevare presiunea fiind restabilit prin introducere de SC-CO2. Cercetrile au evideniat c aceast cantitate suplimentar de dioxid de carbon nu afecteaz semnificativ compoziia amestecului de reacie (Romero i colab., 2005). Reacia enzimatic s-a desfurat la 40C i 15 MPa (150 bar) obinndu-se un randament de bioconversie maxim (92 % dup 90 minute) cu 6,25 g/mol lipaz imobilizat. Atunci cnd s-a utilizat preparatul enzimatic Novozym 435, valorile bioconversiei au fost de opt ori mai mari, comparativ cu utilizarea preparatului Lipozyme RM-IM (care conine lipaza produs de Rhizomucor miehei imobilizat pe rini macroporoase). Bioreactorul cu agitare i funcionare discontinu la presiuni nalte prezentat n figura 3.1. (din cadrul Laboratorului pentru Procese de Separare, din cadrul Facultii de Chimie i Inginerie Chimic, Universitatea din Maribor, Slovenia) poate fi utilizat pentru studiul stabilitii lipazei produs de Candida antarctica (Gtin i colab., 2006).
TI

6
PI

5 4 T=const.

Figura 3.1. Bioreactor cu fluide supercritice prevzut cu agitare i funcionare discontinu 1 bioreactor; 2 dispozitiv magnetic de agitare; 3 butelie SC-CO2; 4 pompa de nalt presiune; 5 camer termostat; 6 indicator de temperatur; 7 indicator de presiune; 8 separator.

HPBSTR funcioneaz la presiuni cuprinse ntre 50250 bar i temperaturi cuprinse ntre 25...150C. Din punct de vedere funcional, bioreactorul este de tip discontinuu cu agitare, cu un volum total 150 mL i volumul util de 7080 mL) (figura 3.2).
Figura 3.2. Corpul bioreactorului HPBSTR 1 corpul bioreactorului; 2 capacul bioreactorului.

2 Corpul bioreactorului (1) este din oel inoxidabil prevzut cu sistem de agitare magnetic i imersat n baie de ulei pentru meninerea temperaturii optime. La partea superioar, bioreactorul are un capac din oel inoxidabil (2) pe care se afl fixat manometrul, capacul fiind prevzut cu deschideri etanate, ce pot fi folosite pentru:

- sonda de temperatur; - deschidere pentru alimentarea cu dioxid de carbon supercritic (SC-CO2); - deschidere pentru evacuarea SC-CO2; - deschidere de rezerv. Funcionarea bioreactorului HPBSTR. Etape preliminare n prima etap se regleaz temperatura din baia de ulei cu aproximativ 5C sub temperatura de lucru i se verific periodic temperatura cu ajutorul termometrului digital. De asemenea, se verific nivelul uleiului din baia de ulei i se asigur un nivel optim, astfel nct corpul bioreactorului s fie imersat aproape complet n ulei. O detaliere a corpului bioreactorului este prezentat n figura 3.2. n practic, trebuie s se asigure omogenitatea dispersiei enzimei n ntreg volumul bioreactorului pentru a nu exista riscul antrenrii acesteia de ctre fluidul supercritic. Acest lucru se realizeaz prin introducerea preparatului enzimatic dozat n interiorul unui tub de form i dimensiuni specifice, confecionat din hrtie de filtru, etanat la capete. Proba introdus n corpul bioreactorului trebuie plasat astfel nct partea inferioar a termocuplului i a manometrului (care comunic cu interiorul corpului bioreactorului) s nu ating sau s distrug tubul din hrtie de filtru. Se verific integritatea garniturii capacului de etanare. Garnitura trebuie s realizeze o etanare perfect, deoarece o eventual neetaneitate conduce la pierderea SC-CO2, deci la scderea presiunii de lucru. Se recomand nlocuirea garniturii capacului de etanare dup fiecare trei utilizri succesive. Dup verificarea strii garniturii se realizeaz nchiderea capacului bioreactorului i apoi plasarea ntregului aparat n baia de ulei. Se realizeaz conectarea termometrului electronic cu ajutorul cruia se stabilete temperatura din interiorul bioreactorului. Se nchide complet ventilul de pe circuitul de alimentare cu SC-CO2. Funcionarea propriu-zis. La atingerea temperaturii dorite, se conecteaz bioreactorul la butelia cu SC-CO2 folosind un tub de legtur. Se realizeaz o deschidere a ventilului superior al autoclavei de alimentare cu SC-SCO2 n funcie de presiunea dorit. Se recomand o deschidere mai mare a ventilului astfel nct manomentrul autoclavei s indice cu aproximativ 30 bar mai mult dect presiunea dorit. Se nchide ventilul superior i se deschide cel inferior i ventilul de alimentare cu SC-CO2, dar treptat, astfel nct presiunea indicat de manometru s nu depeasc 0,5 bar/minut. Atunci cnd parametrii optimi, presiunea i temperatura, sunt stabilii, se nchide ventilul de alimentare cu dioxid de carbon i se pornete cronometrul. Parametrii, presiune i temperatur, se monitorizeaz continuu. Oprirea bioreactorului. La sfritul perioadei de termostatare a enzimei n dioxid de carbon supercritic (SCCO2) se realizeaz urmtoarele etape: se ataeaz tubul pentru evacuarea SC-CO2 n atmosfer; se deschide treptat ventilul de evacuare a SC-CO2 astfel nct presiunea s scad cu 0,5 bar/minut; atunci cnd manometrul indic 0,00 bar se deschide capacul bioreacto-rului i se recupereaz tubul de hrtie care conine enzima tratat; corpul bioreactorului se spal cu detergent lichid i ap, urmat de cltire cu un amestec de aceton cistein. 3.3.2. Bioreactor tubular cu funcionare continu la presiuni nalte

Bioreactorul tubular cu funcionare continu la presiuni nalte (High-pressure tubular continuous flow reactor HPTCR (figura 3.3.) are o lungime de 75 cm i diametrul capilarului 5 mm, fiind echipat cu dou separatoare termostatate.
TI PI TI PI PI

6 2 4 2 3
TI

5 CO2
TI

Figura 3.3. Bioreactor tubular cu funcionare continu la presiune nalt (dup Romero i colab., 2005) 1 butelie SC-CO2; 2 alimentare substrat; 3 amestecare substrat; 4 bioreactor tubular; 5 separatoare; 6 debitmetru pentru SC-CO2; 7 prelevare probe produ-i de reactie; PI indicator de presiune (pressure indicator); TI indicator de tempe-ratur (temperature indicator).

Lipaza imobilizat este introdus n bioreactor, apoi ncepe alimentarea cu SC-CO2, iar cnd se atinge presiunea optim de lucru, substratul este introdus prin intermediul a dou pompe speciale. Acest tip de bioreactor poate fi folosit la studiul stabilitii enzimatice a lipazei. n acest scop s-a utilizat lipaz imobilizat (6,5 g), alcool izoamilic (6,3 mL/h) i anhidrid acetic (7,8 mL/h). Debitul de SC-CO2 a fost de 100 L/h, n timp ce presiunea 15 MPa. Din punct de vedere industrial, este important stabilitatea enzimei i meninerea activitii sale pentru o perioad ct mai lung de timp. Habulin i colab. (1996, 2001) au constatat c utiliznd Novozym 435 n acest tip de bioreactor, productivitatea izoamilacetatului s-a meninut 100 % timp de 30 zile, ulterior scznd uor. De asemenea, utiliznd lipaza izolat din Rhizomucor miehei se constat o descretere cu 4% a randamentului de bioconversie dup 30 zile de utilizare continu a enzimei n bioreactorul tubular. 3.3.3.1. Bioreactoare cu membrane biocatalitice tubulare Bioreactoarele cu membrane biocatalitice tubulare (Tubular Membrane Bioreactor TMB) sunt prevzute cu membrane biocatalitice care conin enzima imobilizat a crei imobilizare pe membran necesit parcurgerea urmtoarelor etape: - obinerea membranelor prin filtrarea tangenial a unui amestec gelatin-polietilenimin; - activarea gruprilor amino libere de ctre glutaraldehid; - ataarea enzimei. Membrana biocatalitic, obinut cu lipaza imobilizat respectnd etapele precizate mai sus, poate fi depozitat n soluii tampon fosfat la pH = 7,8 i temperatura de 4C sau poate fi utilizat direct n bioreactor

Bioreactorul dotat cu membrana biocatalitic este alimentat cu CO2 lichid cu ajutorul unei pompe de nalt presiune. Fluidul supercritic este continuu recirculat prin bioreactor, monitorizndu-se debitul de fluid cu ajutorul debitmetrului (5). Substratul este pompat cu ajutorul unei pompe de nalt presiune de tip HPLC la 5 mL/min. n timpul reaciei enzimatice, sunt prelevate probe, sistemul fiind represurizat prin pompare de CO2 proaspt. ntreg sistemul este plasat ntr-o camer termostat pentru controlul temperaturii. Stabilitatea lipazei imobilizate (lipaza produs de o tulpin de Candida antarctica) pe membrana activ a fost studiat timp de 6 ore, apoi depozitat 18 ore la temperatura camerei (Lozano i colab., 2004). S-a constatat o comportare excelent, fr nicio pierdere a activitii enzimatice. Acest lucru se datoreaz naturii hidrofile a stratului polimeric al membranei active care constituie mediu potrivit pentru stabilitatea lipazei n timpul reaciilor enzimatice continue. Membranele active obinute prin legarea covalent a lipazei de membrane acoperite cu polimeri hidrofili (PEI - gelatin) conduc la o activitate mult mai mare n dioxid de carbon supercritic (SC-CO2) dect n solveni organici. Pomier i colab. (2005) propun un nou bioreactor cu membran tubular avnd dimensiunile porilor de ordinul nanometrilor i fiind destinat interesterificrii triacilglicerolilor (figura 3.6).
Retentat Permeat
Preparat enzimatic imobilizat pe membran

Analiz GC-MS Analiz GC-MS

CO2 1

4 Ulei + metil oleat 4 7 5

Figura 3.6. Bioreactor cu preparat enzimatic imobilizat pe membran cu funcionare la presiune nalt (dup Pomier i colab., 2005) 1 tanc de alimentare; 2 bioreactor cu membran enzimatic; 3 vscozimetru dotat i cu termometru; 4 dispozitiv de prelevare a probelor; 5 debitmetru; 6 pomp; 7 racord de alimentare cu SC-CO2 ; 8 racord de alimentare cu substrat.

Bioreactorul lucreaz la presiuni nalte cu SC-CO2, solvent neconvenional care reprezint un mediu bun pentru lipaza imobilizat, reacia enzimatic desfurndu-se n condiii blnde de temperatur i presiune, 31C i respectiv, 74 bar. SC-CO2 este folosit cu succes ca mediu de reacie pentru procesarea uleiurilor vegetale, de exemplu pentru hidroliza uleiului de floarea-soarelui, de soia, interesterificarea uleiului de palmier cu acid stearic, metanoliza i extracia uleiului de ricin etc. Bioreactorul este folosit pentru uleiuri cu vscoziti mari (ulei de ricin, ulei de palmier), SC-CO2 facilitnd filtrarea tangenial a amestecului vscos, reacia fiind catalizat de lipaza imobilizat.

Lipaza este imobilizat pe suporturi ceramice (-alumina cu diametrul porilor 1,4 m, lungime 15,5 cm, diametrul interior 7 mm, diametrul exterior 10 mm). Lipaza produs de o tulpin de Candida antarctica este imobilizat pe membrana poroas astfel: enzima este ataat prin legare covalent de stratul polimeric (gelatin-poli-etilenimin), polimer adsorbit anterior pe membrana ceramic prin reticulare cu ajutorul glutaraldehidei ca agent de reticulare. Condiiile de lucru ale bioreactorului sunt temperatura de 55C i presiunea 220 bar (22 MPa). Substratul format din metil oleat i ulei de ricin cu vscozitatea dinamic cuprins ntre 1315 mPas i SC-CO2 sunt introduse n bioreactor. Cnd vscozitatea i densitatea amestecului sunt optime (la echilibru), se realizeaz separarea. Retentatul este recirculat, iar permeatul este continuu ndeprtat din sistem. Cercetrile au evideniat o scdere a activitii enzimatice a lipazei, scdere datorat adaptrii enzimei la condiiile de mediu (Pomier i colab., 2005). Apoi, dup 25 ore, activitatea lipazei se menine constant obinndu-se o conversie de 30%. Astfel, membrana biocatalitic favorizeaz reacia dintre biocatalizator i substrat. Utilizarea membranelor n bioreactoare cu funcionare la presiuni nalte prezint urmtoarele avantaje: membranele polisulfonice sunt stabile n SC-CO2 la temperatura 35C i presiunea 350 bar ; utilizarea SC-CO2 nu determin modificri ale proprietilor de separare a membranei; SC-CO2 nu determin modificri ale microstructurii membranei; creterea/descreterea uoar sau rapid a presiunii nu afecteaz stabilitatea membranei; membranele pot fi folosite cu succes ca uniti de separare n bioreactoare cu funcionare continu. 3.3.4. Bioreactor tip coloan cu enzim imobilizat, cu funcionare la presiune nalt Bioreactorul poate fi utilizat pentru reacia de esterificare a acizilor grai cu ajutorul lipazei imobilizate, lipaza izolat din Rhizomucor miehei (preparatul enzimatic comercial Lipozyme RM-IM). Bioreactorul este prevzut cu un vas auxiliar pentru evacuarea apei formate n timpul reaciei de esterificare (figura 3.10). Este construit din oel inoxidabil, coloana bioreactorului avnd 150 mm lungime i 43 mm diametru interior i prevzut cu manta la exterior. Se pot folosi coloane cu alte caracteristici: 380 mm lungime i 27 mm diametru interior sau 52 mm lungime i 73 mm diametru interior. La baza bioreactorului este o sit perforat peste care se plaseaz enzima imobilizat, iar deasupra nc o sit perforat. Sita perforat are rolul de a mpiedica antrenarea particulelor suport cu enzim imobilizat. Vasul auxiliar (1), prevzut pentru ndeprtarea apei, este alctuit din 31 capilare (270 mm lungime/120 mm diametru interior) i este prevzut cu manta. Substratul din acest vas auxiliar este dirijat ctre bioreactor cu ajutorul pompei (7).

vaccum 3 PI 2 1 8 8 5

3 PI

5 6 3 PI 4

Figura 3.10. Bioreactor tip coloan cu enzim imobilizat 1 vas auxiliar; 2 dispozitiv de agitare; 3 manometre (pressure indicator); 4, 4valv intrare, respectiv ieire din membran; 5 racord evacuare ap; 6 bioreactor cu enzima imobilizat pe membran; 7 pomp; 8 racord alimentare ap

Temperatura optim a bioreactorului este meninut prin circulaia continu a apei calde cu temperatura 45...65C. n prima etap a ciclului de funcionare, acizii grai (1200 g) sunt transportai ntre bioreactor (6) i vasul auxiliar (1) timp de 30 minute. n a doua etap acizii grai sunt eliminai prin antrenare cu azot gazos. Cantitatea de acizi grai rmas (estimat la 240 g) este suplimentat prin adaos a 1150 g, mpreun cu 210 g glicerol, iar amestecul meninut sub agitare (600 min-1) la temperatura 50C. Eliminarea apei din mediul de reacie se realizeaz la 4 mbar (4102 Pa), iar la fiecare 5 minute se pot preleva probe pentru determinarea coninutului de gliceride i a coninutului de ap din faza neapoas. La sfritul reaciei de esterificare produsul de reacie este evacuat, iar sistemul este alimentat cu 1200 g acizi grai, fiind pregtit pentru o nou reacie enzimatic.