CARATERIZACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

C. Mejia (0910307), J. E. Ortiz (0636308)

Jheortiz@yahoo.es; claudita8809@hotmail.com UNIVERSIDAD DEL VALLE; DEPARTAMENTO DE QUMICA; LABORATORIO DE BIOQUIMICA 2011

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Abstract: Some reactions were studied to identify amino acids and proteins which may involve a free amino group, the peptide bond in protein or amino acid residues concerned, as the test solution biuret gives pink or purple (depending on the protein); reaction with ninhydrin which generates a blue-purple (or yellow) and the behavior of proteins interacting with osmolytes or when subjected to heat. Finally it was determined quantitatively protein for a sample of egg white by the reaction of biuret setting a regular calibration curve, finding a content of 19.9%. Key words: Amino acids, protena, peptide bond, free amines, hydrogen bonding, salt bridge, ninhydrin, osmolytes, biuret, xantoproteica reaction, quantification.

1. INTRODUCCIN Las protenas son compuestos orgnicos constituidos por aminocidos unidos por enlaces peptdico que interviene en diversas funciones vitales esenciales como el metabolismo, la contraccin muscular o la respuesta inmunolgica. Tiene un peso molecular elevado y son especficas de cada especie y de cada uno de sus rganos. Puesto que cada protena puede tener cientos de aminocidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedad prcticamente infinita de molculas de protena. Los 20 aminocidos aminados que suelen encontrarse en las protenas poseen todos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxlico (COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El ms simple de todos, la glicina, tiene como cadena lateral un H; la alanina, un grupo CH3. El grupo amino permite al aminocido actuar como base y combinarse con cidos; el grupo cido, le permite combinarse con las bases. Los aminocidos y las protenas sirven de amortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Los aminocidos se unen entre s para formar protenas mediante un enlace peptdico entre el grupo amino de una molcula y el grupo carboxilo de la otra. Por la estructura polimrica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes originndose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa de las protenas. Por presentarse variaciones en la composicin de los aminocidos de las diferentes protenas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reaccin, ntimamente relacionado con la naturaleza de la protena analizada.

2. MTODO EXPERIMENTAL Para el estudio cualitativo se utiliz como muestras problemas 1mL de soluciones de albmina de clara de huevo, glicina, prolina y aspartame las cuales individualmente fueron tratadas con: - 15 gotas de ninhidrina (0,05g/25mL), agitacin suave y luego con una gota NaOH al 50% y se calent. - Varias gotas de acido ntrico concentrado, agitacin suave y luego con gotas de NaOH al 50%. - Varias gotas de sulfato de amonio (7g/10mL), agitacin suave y luego con gotas de urea 6M. Igualmente se estudi para 1mL de la solucin de clara de huevo su comportamiento ante el calor sometindola a 100C en un bao de mara. Por ltimo, se realiz una curva de calibracin utilizando la reaccin de biuret para patrones de albmina de suero bovino en concentraciones de 0.04 a 0.6mg/mL y se cuantific una solucin problema de clara de huevo, para esto se trat cada patrn y la muestra con 5mL de solucin A (NaOH y tartrato sdico-potasio) y 5mL de solucin B (CuSO4.5H2O), se afor a 25mL y se lee en un espectrofotmetro UV-vis. a 555nm. En adicin al anlisis cualitativo se trataron 2mL de solucin de glicina y aspartame respectivamente con 2mL de solucin A y B respectivamente para observar su comportamiento.

3. DATOS, CLCULOS Y RESULTADOS Las siguientes tablas muestran los resultados obtenidos experimentalmente en el estudio de los aminocidos y protenas. Tabla 1. Anlisis cualitativo.
Reaccin Muestra Observaciones

Albmina

Prolina

Ninhidrina

Aspartame

Glicina

interaccin de protenas con osmolitos

Albmina

En presencia de Ninhidrina no se observ ningn cambio, al adicionar unas gotas de solucin de NaOH al 50% se torn amarilla, al cabo de un tiempo prpura y posteriormente al calentarla se torn oscura. La solucin inicial presentaba una coloracin amarilla, al adicionar la solucin de ninhidrina y de NaOH se torn amarilla oscura que al cabo de un tiempo paso a azul, posteriormente al calentarla se torn amarilla. En presencia de Ninhidrina no se observ ningn cambio, al adicionar unas gotas de solucin de NaOH al 50% se torn amarilla, al cabo de un tiempo prpura y posteriormente al calentarla se torn oscura. En presencia de Ninhidrina no se observ ningn cambio, al adicionar unas gotas de solucin de NaOH al 50% se torn amarilla, al cabo de un tiempo azul y posteriormente al calentarla se torn oscura. Con el HNO3, la solucin se torna turbia y amarilla. Con la adicin de NaOH al 50% se dio la formacin de un precipitado, en donde el precipitado se torn amarillo oscuro y la solucin amarillo claro, la reaccin fue muy exotrmica.

Efecto de calor

Glicina Biuret Aspartame

Al adicionar (NH4)2SO4 la solucin se torn turbia, posteriormente al adicionar urea la solucin se torn incolora, volvi a su estado inicial. Pasado el tiempo se observo la coagulacion de la muestra pero no fue muy notorio. Al adiconar la solucion A no presento cambio, posteriormente al adcionar la solucion B torno azul clara. Al adicionar la solucion A se torno amarilla, posteriormente al adiconar la solucion B se torno azul clara.

Tabla 2. Datos para la cuantificacin de protena en la clara de huevo. Concentracin (mg/mL) Absorbancia 0,04 0,006 0,12 0,029 0,20 0,040 0,40 0,090 0,60 0,143 Muestra 0,031

Grafica 1. Curva regular de calibracin ensayo biuret.

y = mx + b y = 0,2414x 0,004 r = 0,998 Partiendo de la absorbancia de determinamos la concentracin de esta. la muestra

0,031 = 0,2414[Albmina] 0,004 [Albmina] = 0,145mg/mL

Por ultimo, con la glicina se obtuvo la misma situacin mencionada solo que el color final fue azul. En general, la reaccin con ninhidrina fue:

4. ANLISIS DE RESULTADOS En el anlisis cualitativo se evalu la interaccin de soluciones de albmina de clara de huevo, prolina, aspartame y glicina con diferentes reactivos encontrndose: - Reaccin con ninhidrina: al tratar la albmina con las gotas de ninhidrina no se observ ningn cambio, esto debido a que muy posiblemente el pH es tal que los N-terminales de la protena y los posibles grupos aminos que estn en los residuos + estn como NH3 con lo que no reaccionara con el reactivo; con la adicin de NaOH al medio se observ un cambio desde tonalidad amarilla hasta un color prpura posiblemente a que se neutraliza esta acidez quedando los NH2 libres lo cual permite la reaccin para formar el complejo colorido esperado. Luego se pudo observar que la coloracin se intensific al calentarse, posiblemente debido a que con el calor y el pH alto por la adicin de la base propicia una hidrlisis bsica que aumenta la concentracin de aminos por los aminocidos liberados. Luego se utiliz una solucin de prolina la cual present una coloracin amarilla que se intensific al adicionar el NaOH; analizando la situacin, inicialmente la reaccin parece generarse con el pH inicial y con la adicin de la base la reaccin se mejora como lo explicado anteriormente. La diferencia es que la prolina es una amina secundaria que conlleva a la formacin de un ion iminio el cual es el posible causante de la coloracin amarilla y que como es fcilmente hidrolizable conllev a algn producto similar al obtenido con las aminas primarias que gener el color azul. Luego al calentar se genero el color amarillo nuevamente que pudo deberse a que el calor gener otros productos no conocidos en el medio. Al utilizar el aspartame igualmente no se observ cambios con la adicin de la ninhidrina debido a lo ya explicado y con la adicin de NaOH se obtienen los grupos aminos responsables de la reaccin, con el calentamiento igualmente es probable que se de una hidrlisis bsica liberando los dos aminocidos que lo componen produciendo una coloracin ms oscura.

Figura 1. Reaccin prueba de la ninhidrina.

- Efecto del calor: Al someter la muestra de albmina a temperaturas elevadas (100C) se observ una leve coagulacin, se esperaba que la protena fuera desnaturalizada. Analizando lo observado y conociendo que esta albmina es rica en cistena y metionina permite concluir que la estructura nativa esta reforzada posiblemente por puentes disulfuro provenientes de las cistena impidiendo la precipitacin ya que el enlace S-S es covalente (fuerte). Al fritar un huevo se alcanza una temperatura mucho mayor por el aceite con lo que se debe vencer esta fuerza y coagula. - Interaccin con osmolitos: Inicialmente se adicion acido ntrico concentrado observndose una solucin turbia y amarilla, esto se puede explicar por el medio acido que genera la desnaturalizacin de la protena por interferir con los puentes salinos que se forman en la protena + por los residuos con carga como -COO y NH3 que le estaban dando rigidez a la estructura formando as el cido xantoproteico de coloracin

amarilla. Con la adicin de NaOH se observ formalmente la aparicin de un precipitado color amarillo oscuro con produccin de calor, la explicacin es que el NaOH neutraliza el medio cido (reaccin exotrmica) y propicia la nitracin de los anillos aromticos de residuos de aminocidos presentes en la protena como triptfano y tirosina que son anillos activados por la presencia del grupo OH y N=, y en menor medida el anillo de la fenilalanina (no activado).
O H N CH CH2 C H N CH CH2 O C

Figura 3.Complejo formado entre el cobre del reactivo de biuret y los enlaces peptdicos de una protena.

HNO3
O2 N OH OH
O H N CH CH2 C

NO2

Segmento Tirosina
O H N CH CH2 C

NaOH
NO2 O

O2N OH

NO2

O 2N

Na+

Figura 2. Nitracin de un residuo aromtico (tirosina).

Por ultimo, se trato con sulfato de amonio observndose turbidez en la solucin lo cual se debe a que este reactivo neutraliza y deshidrata la protena generando la precipitacin la cual no fue muy apreciable y con la adicin de la solucin de urea se esperara que hubiera precipitado la protena completamente (osmolitos que interfiere en los puentes de H desnaturalizndola) pero la solucin final fue clara. Se podra pensar que al adicionar gota a gota la urea, esta va neutralizando nuevamente el bisulfato producido anteriormente lo que permite que se hidrate de nuevo la protena y se estabilizara su estructura nativa; seguramente si se hubiera continuado la adicin de urea la protena hubiera precipitado como se esperaba. - Biuret para la glicina y aspartame: La reaccion se basa en la formacion de un complejo de 2+ coordinacion entre los iones Cu y los pares de electrones no compartidos del nitrogeno que forma parte de los enlaces peptidicos.

Experimentalmente al adicionar a una muestra de glicina unas gotas de la solucin A (NaOH y tartrato sdico-potasio) y de solucin B (CuSO4.5H2O) se torn azul al igual que en el caso del aspartame. Analizando los resultados, para el asparteme es como se eperaba positivo debido a que es un dipeptido. Para la glicina que es un aminoacido libre se esperaba que fuese negativo (no hay enlaces peptidicos); pero lo que en realidad se obtuvo fue un falso positivo debidoa que en la estructura el grupo CH2NH2 de la glicina posee electrones libres los cuales pueden ser donados y aceptados por el ion cobre (II) coordinando varias glicinas generando una coloracin similar a lo que se espera observar si se tiene un enlace peptidico. Finalmente, se determin el contenido de protena en la clara de huevo utilizado en la experimentacin por medio de la coloracin creciente que se genera a realizar el ensayo de biuret para patrones con concentraciones crecientes conocidas de protena (mtodo colorimetrico), se realiza la curva de calibracin por mnimos cuadrados y se obtuvo un valor de 19.9% (p/p). Este valor es bastante bajo que el estimado en la guia de la practica (65%), posiblemente a que en la actualidad las modificaciones que se realizan para producciones ms altas en las avicolas estn desmejorando la calidad de dicho contenido. Se considera que el anlisis realizado es confiable ya que la correlacin obtenida en la curva de calibracin fue aceptable en el mtodo desarrollado (r = 0,998). 5. RESPUESTA A PREGUNTAS I. El aspartame (aspartilfenilalanina metil ester) es un dipptido sinttico, un edulcorante casi 200 veces ms dulce que el azcar (sacarosa) y presenta muchas menos caloras que la sacarosa (16kilocalorias de azcar por cada 1kilocaloria de aspartame). Su estructura es:

IV. Reaccin de Bradford Consiste en la unin de un colorante, el Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las protenas. La solucin del colorante libre es de color rojizo (mxima absorcin a 465nm) y cambia a azul (mxima absorcin a 595nm). La unin es un proceso rpido y el complejo colorante-protena se mantiene estable hasta una hora despus de producido. Electroforesis Aplicacin de un campo elctrico a una solucin de la protena o aminocido con carga neta (+ o -), con lo que migrar a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamao y su forma. Cromatografa de intercambio inico La cromatografa de intercambio inico consiste en intercambiar iones de la fase estacionaria, la cual es un polmero con iones lbiles (cationes o aniones) de estructura porosa, insolubles, pero capaz de aumentar su volumen al ser humedecidos. V. La clara contiene ms de 13 polipptidos con caractersticas de glicoprotenas que integran una estructura bien organizada, gelatinosa y espesa y que representan 10.9% de esta fraccin del huevo; adems de su alto valor nutritivo, muchos de estos polmeros presentan actividades biolgicas cuya finalidad es proteger el embrin (cuando el huevo est fecundado), ya que actan como enzimas, inhibidores, anticuerpos, etc., evitando que los microorganismos se desarrollen. La albmina de suero sanguneo o ser albmina se encarga de transportar sustancias de naturaleza qumica muy diversa, como cidos grasos, aminocidos, esteroides, metales (como el calcio), y numerosos frmacos, facilitando la transferencia de muchas de ellas desde la circulacin sangunea a rganos como el hgado, el rin, el intestino y el cerebro. VI. Se hidroliza la muestra en condiciones fuertes (a 110C durante 22 horas en cido clorhdrico (HC1) 6N), neutralizadas y su pH ajustado a 2,2 con buffer citrato 0,02 N. Los hidrolizados se derivatizan si es necesario y se cuantifican por cromatografa lquida HPLC determinando as el contenido de cada aminocido en la protena identificndose cada uno de acuerdo a su tiempo de retencin frente a una biblioteca. VII. Comparando frente a la electroforesis, esta ltima es mucho ms sensible que la reaccin de biuret ya que es ms selectiva por permitir diferenciar entre protenas porque las separa una por una y por que el anlisis realizado puede

Figura 4. Estructura del aspartame

II. Un osmolito es una sustancia que en general provoca una situacin que es termodinmicamente desfavorable, ya que el potencial qumico tanto de la protena como del aditivo se incrementa; como consecuencia, la estructura nativa de las protenas se estabiliza, porque la desnaturalizacin o disociacin de las mismas, generan una superficie de contacto mucho mayor para el solvente, y por tanto, aumentan el efecto termodinmicamente desfavorable mencionado. El proceso de desplegamiento de una protena puede describirse como un paso de transicin entre los estados plegado y desplegado, ya que cualquier forma intermedia es sumamente inestable y solo existira en cantidades despreciables. Por ejemplo, se usa sulfato de amonio para purificacin el cual por deshidratacin de la superficie de la protena las desnaturaliza obligndolas a precipitar y luego son sometidas a centrifugacin para separarlas de acuerdo a su peso por decantacin. III. Ccromatografa de tamizado molecular: se basa en la difusin diferencial de las molculas en los poros de un gel. Las protenas con masas moleculares altas no pueden entrar en los poros del gel, por lo que son eludas ms rpido a travs del volumen de exclusin de la columna. De esta manera, las molculas eluyen de la columna aproximadamente en orden decreciente de peso molecular. Para determinar el peso molecular de una protena desconocida se recurre al ndice de Kovacks; ste ndice no es ms que la razn existente entre la diferencia entre el volumen de elucin de la protena problema y el volumen de exclusin o intersticial de la columna, y el volumen de poro de la matriz: Kd = Ve - Vz / Vp Kd: ndice de Kovacks. Ve: volumen de elucin de la protena problema. Vz: volumen intersticial. Vp: volumen del poro.

depender exclusivamente del pH de la solucin problema permitiendo la separacin en base al respectivo punto isoelctrico caracterstico, en cambio por biuret requiere de purificacin y separacin de la protena de inters aumentando las posibles interferencias por la presencia de otras molculas que puedan generar falsos positivos.

5 BIBLIOGRAFA
[1] Lehninger, A.L. (1991): Bioqumica. 2da Ed. Editorial omega S:A (Barcelona, Espaa), pp.59187. [2] Mancilla, C.G., Blanco, E.Z., Perez, S.L. Propiedades qumica y fisicoqumica de las protenas. Chapultepec: Universidad del Valle de Mxico. p 1-12. [3] Gonzales, E.C. Aplicacin de osmolitos como estabilizantes trmicos de soluciones de inmunoglobulinas equinas. Cartago: Instituto tecnolgico de Costa Rica. [4] Berezov T.T., Korovkin B.F. (1992): Chemistry of Proteins. 1 Ed. Editorial Mir Publishers Moscow (Mosc, Rusia), pp. 19 64. [5] Cabanes J. (1988): Propiedades qumicas y separacin de los aminocidos. 1 Ed. Editorial Sntesis (Madrid, Espaa), pp. 8792. [6]dbm.exa.unrc.edu.ar/Materias/mat/qbmic ro/.../TP%206.doc. [7]http://www.ehu.es/biomoleculas/proteina s/desnaturalizacion.htm.

6. CONCLUSIONES - En general cada prueba realizada permiti apreciar el comportamiento caracterstico de los aminocidos y protenas. - Mediante las diferentes pruebas cualitativas se pudo inferir que aminocido y grupo funcional presenta la protena en la clara de huevo, por medio de las pruebas de biuret, ninhidrina e interaccin con osmolitos, ya que cada una de ellas arroj resultados positivos como es caracterstico de las protenas. - Con la prueba de la precipitacin de la protena por efecto de los osmolitos se evidenci la presencia de anillos aromticos en la estructura y la sal permite corroborar el efecto de la polaridad en la coagulacin de protenas. - Mediante tratamiento trmico se evidenci que en la protena de la clara de huevo hay presencia de puentes disulfuro que estabiliza su estructura nativa. - Se observ la utilidad del ensayo de biuret para la cuantificacin de protenas en una muestra problema.