T.O. - Ingenieria Genetica

Noem Garca Fernndez Trabajo Obligatorio BIOTECNOLOGA E INGENIERA GENTICA Mes y Ao Enero 2012
UNIVERSIDAD CATLICA SANTA TERESA DE JESS DE VILA
PROPUESTA DE TRABAJO OBLIGATORIO

. Constraints to virus infection in Nicotiana benthamiana plants transformed with a potyvirus amplicon. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20604920
NDICE RESUMEN DEL ARTCULO 1. IDENTIFICACION DEL PROBLEMA
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El creciente inters en el uso de plantas como biofbricas para la produccin de protenas extraas de importancia farmacutica e industrial ha llevado al desarrollo de sistemas de expresin nuevos para obtener altos rendimientos de los productos deseados [ 1 ]. Algunas estrategias se han centrado en el desarrollo de vectores virales de plantas, teniendo en cuenta su capacidad de replicacin como una caracterstica positiva para alcanzar los rendimientos esperados [ 2 - 4 ]. A pesar de que su rapidez a veces puede hacer que la expresin transitoria sea un mtodo conveniente para obtener el producto de inters, uno de los objetivos de la agricultura molecular es el desarrollo de sistemas estables para evitar la inoculacin de los procesos manuales que pueden dificultar y aumentar en gran escala los costos de produccin. Con este propsito, los genomas de plantas han sido transformadas con copias de larga duracin cDNA del genoma de los vectores virales, dando lugar a lo que se ha llamado sistemas de expresin "amplicn" [ 5 - 11]. Por lo tanto, los amplificados, que son derivados de virus transgnicos, fueron diseados para combinar la estabilidad gentica de las plantas transgnicas con la elevada tasa de replicacin del virus de las plantas, escapando de la necesidad de un proceso de inoculacin. Sin embargo, el rendimiento de los amplificados en las lneas transgnicas obtenidas por transformacin de los diferentes genomas virales, como un todo, ha sido muy variable, independientemente de que el virus de los que se basan. Esto ha impulsado un mayor inters en la comprensin de los mecanismos subyacentes que causan estas diferencias de comportamiento, y en el desarrollo de estrategias para controlar la expresin de amplificacin. Resultados Plantas de Nicotiana benthamiana fueron transformadas con una amplificacin que consiste en un ADNc de longitud completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) del genoma modificado para incluir un gen reportero GFP. La expresin de amplificacin mostr una gran variabilidad entre las diferentes lneas transgnicas, e incluso entre diferentes plantas de la misma lnea. Las plantas de la lnea de 10,6 inicialmente se desarrollaron sin signos de expresin de amplificacin, pero en diferentes momentos algunos de ellos comenz a mostrar focos de infeccin espordica en las hojas de la madurez. La infeccin sistmica progreso, pero al final, se recuperaron las plantas infectadas y volvi a un estado inactivo-amplificacin. La falta de deteccin de virus especficos de siRNAs en 10,6 plantas antes de la induccin de amplificacin y despus de la recuperacin sugiere que una fuerte amplificacin de silenciamiento de ARN especfico no se ha establecido en estas plantas. Sin embargo, la co-expresin de los supresores de silenciamiento viral adicional causado cierta activacin de amplificacin, lo que sugiere que un bajo nivel de silenciamiento de ARN podra estar contribuyendo a
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mantener la represin de amplificacin en el 10,6 plantas. Los mecanismos de resistencia que impiden amplicn derivados de infeccin por el virus tambin se activa frente a PPV exgenos introducidos por inoculacin mecnica o injerto, pero no afectar a otros virus. Amplicn derivados de PPV fue capaz de extenderse a los vstagos de tipo silvestre injertada en el 10,6 patrones que no muestra signos de expresin de amplificacin, lo que sugiere que la resistencia tiene poco efecto en el movimiento del virus. La mayora de virus son capaces de inducir en las plantas a las que infectan una respuesta de silenciamiento gnico, que sirve en la planta husped como mecanismo natural de defensa frente al virus. A la vez, muchos virus con capaces de contraatacar produciendo protenas que interfieren con el mecanismo de silenciamiento gnico. El balance entre la induccin de la defensa antiviral de la planta, basada en silenciamiento gnico, y la supresin de esta defensa por parte de los virus, es probablemente uno de los factores que determinan el curso de una infeccin viral. Conclusiones Los resultados sugieren que la amplificacin de derivados de la infeccin por virus es limitado en esta lnea transgnica en particular por una combinacin de factores, incluyendo la supuesta eficiencia de baja de la conversin de la transcripcin del transgn a replicar el ARN viral, y tambin por la activacin de silenciamiento de ARN y otros defensivos las respuestas de la planta, que no son totalmente neutralizados por los supresores virales. 2. IDENTIFICACION DE LA SOLUCION PLANTEADA MEDIANTE INGENIERA GENTICA El silenciamiento de ARN es usado por las plantas como un mecanismo de defensa contra las infecciones de virus [ 12 ], y tambin contribuye a limitar la replicacin de los amplicones virales [ 5 , 13 - 16 ]. Sin embargo, el silenciamiento de ARN puede no ser el nico factor que limita la expresin de amplificacin en muchas ocasiones, por ejemplo, se ha informado de que una versin mutante del virus del mosaico del pepino (CMV) que carecen de su 2b supresor de silenciamiento fue capaz de aliviar la represin de un enrollamiento de la hoja de papa virus (PLRV) amplificacin [ 17 ].Por lo tanto, los amplificados se pueden utilizar no slo para fines de cra molecular, pero tambin pueden servir como sistemas modelo para el anlisis de la expresin transgnica y los procesos de infeccin por el virus, as como los mecanismos de defensa antiviral. Plum pox virus (PPV) es un miembro del gnero Potyvirus [ 18 ]. Potyvirus tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad mensajero ~ 10 kb de longitud. Este ARN genmico se traduce en una poliprotena grande y un producto del marco de lectura truncada, que son procesadas proteolticamente por tres proteasas codificadas por el virus [ 19 , 20 ]. De larga duracin clones de cDNA que son capaces de iniciar las infecciones PPV se han construido y utilizado para la caracterizacin gentica de este virus y el diseo eficiente de vectores de expresin de plantas [ 21 ]. Coexpresin de la HCPro silenciar supresor potyviral se ha demostrado para mejorar fuertemente la actividad de un virus de papa X amplificacin [ 16 ], sin embargo, no se sabe si su propia expresin HCPro podra asegurar altos niveles de expresin de un
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amplicn potyviral. En este trabajo se han transformado Nicotiana benthamiana plantas con una copia de ADNc de longitud completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) . N. benthamiana , un husped experimental de PPV, fue elegido debido a sus peculiaridades que la convierten en una especie de modelo en los estudios virolgicos en las plantas [ 22 ]. Hemos observado una gran variabilidad en los patrones de expresin de las lneas transgnicas resultantes, y se ha caracterizado en detalle la expresin de amplificacin de una de estas lneas. Las plantas de N. benthamiana fueron transformadas con la secuencia completa de ADNc del PPV potyvirus para llevar la secuencia de codificacin de la protena verde fluorescente (GFP) como gen reportero (PPV-NK-GFP, fig. Fig. 11 ).
3. HERRAMIENTAS BIOTECNOLGICAS EMPLEADAS Para la produccin de lneas de amplificacin de PPV-NK-GFP., se ha transformado la N. benthamiana con la secuencia completa de ADNc de una expresin de GFP-PPV recombinantes, dando lugar a diferentes lneas de amplificacin de PPV, que muestra la variabilidad gran expresin (Fig. (Fig. 1).1 ). En informes anteriores se demostr que una amplificacin de represin pueden ser activadas por la coexpresin de un supresor de silenciamiento fuerte [ 16 ]. Los resultados muestran que la expresin de amplificacin puede ser reprimida an cuando la amplificacin lleva un supresor de silenciamiento fuertes como P1-HCPro. Una vez detectada la solucin biotecnolgica al problema, se debe trabajar en las tcnicas empleadas, stas se describen principalmente en el apartado de materiales y mtodos del artculo, (ms adelante se aporta un ejemplo de ndice a seguir). 3.1. MATERIAL BIOLGICO 3.1.1. HUSPEDES HERBCEOS EXPERIMENTALES: Para la comprobacin de la infectividad de los vectores basados en PPV donde se desarrollan infecciones a nivel sistmico, y para la transformacin gentica de planta con secuencias derivadas del genoma viral se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana. Las semillas de plantas no transgnicas se germinaron sobre vermiculita estril. Las semillas de plantas transgnicas se germinaron in vitro, en un medio de agar solidificado con Kanamicina (100mg/ml) para realizar la seleccin mediante resistencia a antibitico.
Transformacin de Nicotiana benthamiana y cultivo de plantas . N. benthamiana discos de hojas se transformaron con esta construccin con A. tumefaciens de la inoculacin, bsicamente de acuerdo con Horsh et al. [ 37 ] y las plantas fueron regeneradas en un medio que contena kanamicina (100 mg / ml).
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Las plntulas enraizadas se transfirieron al suelo y despus de la aclimatacin en cmara de crecimiento a 22 C y 70 % de humedad con un ciclo de 14 h/10 h luz/oscuridad. Las plantas transgnicas fueron transladadas a un invernadero. despus a una mezcla 3:1 de tierra: vermiculita cuando alcanzaron un tamao de 1 cm y posteriormente se mantuvieron en invernadero o en fitotron, en este ltimo caso con la humedad relativa del 70 %y un fotoperiodo de 16 h de luz + 8 h de oscuridad, a una temperatura de 22 C de 30C..........comprobar. En general, las semillas de las plantas transgnicas fueron germinadas in vitro en un medio de agar solidificado con kanamicina (100 mg/ml) a 23c con un ciclo de 16h de luz/8h. de oscuridad Las plntulas en la hoja 2 se transfirieron al suelo y se cultivaron en cmara de crecimiento a 22 C y 60 % de humedad, con un fotoperiodo se 14 h/10 luz/oscuridad. Las plantas transgnicas de 10.6.1 fueron infiltradas con Agrobacterium tumefaciens cepa C58C1 llevar pBIN61:P19, p35SP1B, p35S-NTAP-P1B,P35S-P1/HC-pro o el vector vaco pBin19. Se aplicaron alrededor de 250 l de acetosiringona inducida por Agrocbacterium cultura con una jeringa en la parte inferior de tres hojas cuando las plantas estaban en la etapa de ocho hojas. Como control de la actividad de los supresores de silenciamiento, las mezclas de cultivos de cepas de Agrobacterium con p35S: GFP y el plsmido que codifica el supresor del silenciamiento, se coinfiltraron en el tipo natural N. bentahmiana. 3.1.2. MICROORGANISMOS EXPERIMENTALES: En este trabajo se han transformado plantas de N. benthamiana con una copia de ADNc de longitud completa del potyvirus PPV., un husped experimental de Plum pox virus (PPV), fue elegido debido a sus peculiaridades que la convierten en una especie de modelo en los estudios virolgicos en las plantas. Aislados originales de PPV y clones cDNA Se han empleado vectores virales basados en un clon cDNA infeccioso denominado pIC-PPV desarrollado en el laboratorio (Lpez-Moya and Garca 2000), y que deriva de un aislado original PPV-R3 cuya secuencia completa del genoma viral de PPV entre un promotor derivado del 35Sde CaMV (con la secuencia potenciadora duplicada) y el terminador NOS. La utilizacin de ese promotor facilita la inoculacin directa de plantas con dicho cDNA para generar transcritos in vivo. As mismo, tiene insertado un intrn que interrumpe la ORF en la regin P3 para mejorar el crecimiento de este clon en las bacterias. Bacterias Para los distintos clonajes se he utilizado la cepa DH5 de E. Coli, tanto para la propagacin como para la propagacin como para la purificacin de plsmidos. Para los experimentos de expresin transitoria as como para la obtencin de plantas trasnsgnicas, se ha utilizado la cepa C58C1 de A. tumefaciens. 3.1.3. MANTENIMIENTO Y MANIPULACIN DEL MATERIAL BIOLGICO

MICROORGANISMOS: Bacterias:
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Escherichia coli Mantenimiento: se cultiv a 37 C en medio LB (bacto-triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l, para los medios slidos se aada agar 18 g/l) Transformacin: las clulas DH5 competentes se transformaron con plsmidos mediante choque trmico o electropropagacin, utilizando procedimientos habituales (Sambrook y col, 1989). En ambos casos los clones deseados se identificaron por anlisis de restriccin de su DNA plasmdico. Agrobacterium tumefaciens Transformacin: los plsmidos que portaban el T-DNA que se pretende transferir e la planta se purificaron a partir de clulas E.coli en las que se haban multiplicado, y se introdujeron por choque trmico en clulas se A. tumefaciens que portaban el plsmido auxiliar que suministra las funciones VIR (cepa c58c1). En ambos casos los clones deseados se identificaron por anlisis de restriccin de su DNA plasmdico. Para conservar las cepas originales y los transformantes de E. Coli y A. tumefaciens durante periodos cortos de tiempo se mantuvieron a 4 C en placas de medio slido. La conservacin por largos periodos de tiempo se realiz resuspendiendo las clulas en una solucin de glicerol al 20 % y mantenindolas a 70 C. Virus: Se conservan en extractos de plantas infectadas, fresco o congelado en N2 lquido y mantenido posteriormente a -70C. Material vegetal: Inoculacin de plantas Inoculacin manual de plantas Para las inoculaciones con extracto de planta infectada, se homogenizaron hojas generalmente en morteros mantenidos en hielo, con tampn fosfato sdico 5mM pH 7,5 (1 gr/2ml). Los restos de tejido se eliminaron centrifugando brevemente las muestras en una microcentrfuga de mesa. Se inocularon tres hojas de cada planta (N. benthamiana ) previamente tratadas con Carborundo, con 15-30 l de extracto. Las lesiones locales de C. phoetidum ....La usamos? Pagina 60 Para la inoculacin directa con DNA plasmdico (obtenido como se describe en el apartado II.2.4.1.1. se aplicaron entre 10-20 l de DNA a una concentracin de 0,1 mg/ml sobre tres hojas de planta. + Inoculacin biolstica
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Para inoculacin directa con DNA plasmdico de plantas usando el aparato HeliosGene Gun (Bio Rad) se ha seguido el protocolo descrito por el fabricante, tras precipitacin del DNA sobre partculas de oro que eran posteriormente proyectadas contra el tejido folir (Lpez Moya y Garca, 2000). Inoculacin mediante agrofiltracin Para la inoculacin de clones cDNA introducidos en la cepa C58C1 de A. tumefaciens, se cultivaron estas bacterias a 28 C, hasta alcanzar una densidad ptica de 600 nm de 0,6, en medio LB, con acetosisyingona 150 M, 10 mN MgSO4, y se introdujeron aproximadamente 1 ml del cultivo en los espacios intercelulares de 2-3 hojas del husped presionando con una jeringa de 1 ml sobre el envs de la hoja. Inoculacin de virus: Dos o tres hojas fueron espolvoreadas con Carborunum y se inocularon con el dedo , frotando con 15 I de ADN o de pICPPV (42), (O,7 mg/ml) o de extractos de hojas infectadas de tipo salvaje de N benthamiana plantas de suelo con 5 mM tampn fosfato (ph 7,4) (1 g en 2 ml). Platas de injerto Las plantas de aproximadamente 10 hojas de la etapa de desarrollo fueron injertados por el mtodo tradicional de hendidura. Para el tipo I de injertos, portainjertos 10.6.1 se prepararon mediante la eliminacin de la sesin por encima de dos hojas basales sanos y en hacer un corte vertical, de 1,5 a 2 cm de largo, en el centro del tallo. Se injertaron vstagos de unos 4 cms de longitud, despus de la eliminacin de todas las hojas excepto los dos ms pequeos y el recorte de su base a una V de cua. Tipo II de injertos 10.6.1 vstagos en patrones de tipo salvaje se prepararon de la misma manera, pero se dejaron tres hojas en lo patrones para facilitar la inoculacin con el tipo salvaje de PPV. Las uniones de stock con el vstago se aseguraron con Parafilm y las plantas injertadas se cubrieron con una bolsa de plstico durante una semana para evitar deshidrtacin. Las imgenes de GFP Las hojas de las plantas fueron seleccionadas para la expresin de las buenas prcticas agrarias con un flii MZ (Leica microsystems) estereoscpico de fluorescencia, utilizando filtros de excitacin y de barrera de 480/40 nmy 510 nm, respectivamente. Las imgenes se obtuvieron con una cmara Olympus DP70 digital DP controlador y el software del administrador de DP. Mantenimiento y manipulacin de plantas en cultivo in vitro MATERIAL VEGETAL /ANIMAL INOCULACIN DE PLANTAS: MANUAL, BIOLSTICA, AGROINFILTRACION
MANTENIMIENTO Y MANIPULACIN DE PLANTAS EN CULTIVO IN VITRO. TRANSFORMACIN DE PLANTAS. DESARROLLO DE PLANTAS A PARTIR DE DISC
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REGENERACIN DE PLANTAS A PARTIR DE TEJIDO: OBTENCIN DE CLONES.
Los restos de tejido se eliminaron centrifugando brevemente las muestras en una microcentrfuga de mesa. Se inocularon tres hojas de cada planta (N. benthamiana ) previamente tratadas con Carborundo, con 15-30 l de extracto.
Para las inoculaciones con extracto de planta infectada, se homogenizaron hojas generalmente en morteros mantenidos en hielo, con tampn fosfato sdico 5mM pH 7,5 (1 gr/2ml). Los restos de tejido se eliminaron centrifugando brevemente las muestras en una microcentrfuga de mesa. Se inocularon tres hojas de cada planta (N. benthamiana ) previamente tratadas con Carborundo, con 15-30 l de extracto.
3.2. PREPARACIN DE ACIDOS NUCLEICOS La extracion de RNA y anlisis de northern blot Tejido de las hojas era un terreno en nitrgeno lquido con mortero y se almacen a -80 C. Los cidos nuclicos se extrajeron como se ha descrito previamente (43). Para el anlisis de transferencia de Northern de siRNAs, se resolvieron aproximadamente 2 g de ARN total con un gel de policrilamida al 15 % de desnaturalizacin (con 7 M urea) y se transfiere a una bolsa de nylon Hybond-N + membrana por transferencia capilar (44).Tincin con bromuro de etidio de la tincin con azul de metileno y el gel de la membrana se utiliza para verificar la igualdad de carga y transferencia. Despus de UV entrecruzamiento y prehibridacin en UltraHyb buffer (applied Biosystems/Ambion), blots se hibrid en la misma solucin con un 32 P-etiquetados sonda de ARN antisentido correspondiente a la P1 de PPV o NIB secuencia de codificacin, previamente hidrolizados con tampn carbonato a una duracin media de aproximadamente 50 nt. Las seales de hibridacin se detectaron con un sistema molecular Imager FX.
3.2.1. OBTENCIN DE DNA. PREPARACIN DE DNA DE PLSMIDOS
El plsmido P35S-PPV-NK-GFP-NOST se construy mediante la insercin en pBin19 [35 ] digerido con SmaI y XbaI, el fragmento PvuII-XbaI de pIC-PPV-NK-GFP [ 36 ] que contiene la secuencia de longitud completa de cDNA de PPV.
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PREPARACIN DE DNA GENMICO DE PLANTAS/ANIMALES/MICROORGANISMOS 3.2.2. MANIPULACION DE CIDOS NUCLEICOS TRATAMIENTOS ENZIMTICOS TCNICAS ELECTROFORTICAS. ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA . MARCAJE E HIBRIDACIONES DE CIDOS NUCLEICOS. MARCAJE RADIACTIVO DE OLIGONUCLETIDOS. HIBRIDACIN DE OLIGONUCLETIDOS. ESCRUTINIO DE PLSMIDOS RECOMBINANTES. AMPLIFICACIN DE DNA MEDIANTE PCR. AMPLIFICACIN DE RNA VIRAL MEDIANTE INMUNOCAPTURA Y RT-PCR (IC-PCR) Las hojas se homogenizaron en 5 mM de tampn fosfato de sodio, Ph 7,4 (2 ml por gramo) y se incubaron 2 horas a 37 C y durante la noche a 4C en tubos previamente recubiertos con IgG anti-PPV CP. Despus de dos etapas de lavado con 16 mM de tampn fosfato de sodio, 0,1 M NaCl, 0,5 g/l de Tween 20, ph 7,2, RT-PCR se realiz en tubos de revestimiento con el Titn de RT-PCR System (Roche). Oligodesoxinucleotidos 5-TTGGGTTCTTGAACAAGC-3 Y 5-TGGCACTGTAAAAGTTCC-3 se utilizaron para amplificar fragmentos de cDNA de 1255 nt nt p 511, de PPV-NK-GFP o de tipo salvaje de pago, respectivamente. 3.3.3. MANIPULACION DE PROTENAS: ANLISIS Y DETECCIN. DETECCIN DE PROTENAS El tejido de la hoja se homogeniz con mortero en nitrgeno lquido y se almacenan a -80 C. Los extractos proteicos fueron preparados por el deshielo del polvo en tampn de extraccin,(150mMT Tris HCl, pH 7,5, 6 M urea, 2 % SDS, y el 5 % mercaptoetanol) (1 ml por gramo de tejido). Los extractos fueron hervidos y los restos celulares se eliminaron por centrifugacin. Las muestras fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 12 % de sds y electro blotted a una membrana de nitrocelulosa. Protenas especficas fueron detectados utilizando anti PPV CP o CNV contra o viriones tvmv sueros policlonales como reactivo de primaria, y conjugando con perxidasa de cabra anti-conejo IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) como reactivo secundario, o con un mezcla de dos anti GPF anticuerpos monoclonales (Roche) como reactivo de primaria, y conjugando con peroxidasa de oveja anti- ratn IgG ( Sigma-Aldrich) como reactivo secundario. Las protenas se visualizaron
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immunostaine con un kit de Lite Ablot (Euroclone).Ponceau tincin con rojo se utiliza para comprobar el contenido global de protena en las muestras. ELISA (ENZYME LINKED-IMMUNOSORBENT ASSAY). ENSAYO DE ACTIVIDAD DE UNA PROTEINA DETERMINADA ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA DE PROTENAS DE PLANTAS/ANIMALES/MICROORGANISMOS Y ANLISIS DE WESTERN (INMUNOELECTROTRANSFERENCIA) 3.4. ANTIBITICOS EMPLEADOS Kanamicina (100mg/ml) para realizar la seleccin mediante resistencia a antibitico. 3.5. CONSTRUCCION DE PLSMIDOS 3.6. CONSTRUCCIN DE CLONES 4.-BIBLIOGRAFA
22. Goodin MM, Zaitlin D, Naidu RA, SA Lommel. Nicotiana benthamiana: Su historia
y su futuro como modelo de las interacciones planta-patgeno. Mol plantamicrobio Interact. 2008; 21:1015-1026. doi:. 10.1094/MPMI-21-81015 [ PubMed ] [ Cruz Ref. ]
Objetivos del trabajo 1. Consolidacin de los conocimientos adquiridos durante la asignatura. 2. Desarrollo de capacidad de anlisis y sntesis del alumno. 3. Desarrollo prctico de las aplicaciones biotecnolgicas y la ingeniera gentica. 4. Dominio de los conceptos bsicos relacionados con la asignatura. Criterios de evaluacin La evaluacin, es una componente fundamental de la formacin. Este trabajo obligatorio formar parte de tu calificacin final. En esta tabla, se resumen los aspectos a valorar y el porcentaje que representa cada unos de los mismos.
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Total Contenidos generales Estructuracin, exposicin, orden, limpieza y presentacin Claridad en los conceptos Temas de especialidad Planteamiento y coherencia del problema Planteamiento y coherencia de la solucin biotecnolgica Definicin detallada de las herramientas biotecnolgicas empleadas en el artculo Definicin detallada de la bibliografa Coherencia de la bibliografa con el artculo Otras aportaciones Conclusiones TOTAL 2,00 2,00 7,00 1,00 1,00 3,00 1,00 1,00 1,00 1,00 10,00
Ob.
Fecha lmite de recepcin de trabajos Estn disponibles en el apartado Fechas de Examen de la plataforma informtica. Ficha de Correccin del Trabajo (Espacio reservado para anotaciones del profesor)
Profesor: Alumno (Cdigo / Nombre): Fecha de Entrega: Observaciones sobre el trabajo: Fecha de Calificacin:
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Fecha y Firma: Formato de presentacin 1. La extensin del trabajo no deber superar las 50 pginas
Se presentar en formato informtico toda la informacin del trabajo. Las normas de presentacin sern las siguientes: Procesador: Microsoft WORD. Tamao de letra: 12 ptos. Tipo de letra: sern aconsejables letras como Arial o Times New Roman. Espaciado entre lneas: 1,5 Mrgenes:
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Lateral izquierdo: 3 cm. Lateral derecho: 2 cm. Margen superior: 3,5 cm. Margen inferior: 2,5 cm.
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2. En caso de que el trabajo requiera archivos externos (dibujos Autocad, Catia, Excel, Power Point, programacin, etc) stos debern entregarse junto al trabajo. Es posible que algunos trabajos solo consten de estos ficheros, por lo cual no tendr validez lo indicado en el punto 3. 3. Si el trabajo consta de varios archivos deber enviarse en un solo fichero comprimido. 4. Si el tamao del archivo a enviar excede de 5Mb, en lugar de enviarse por correo electrnico deber entregarse en CD. 5. Resear referencias bibliogrficas cuando se incluyan frases o textos de otros autores, de lo contrario podr interpretarse como plaggio. 6. La fecha de entrega ser la misma para todos los trabajos de todas las asignaturas y se comunicar al principio de cursar dicha asignatura. Segn las regulaciones acadmicas de la Universidad
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Desarrollo de trabajo Espacio reservado para el desarrollo del trabajo por parte del alumno.
Restricciones a la infeccin por el virus en Nicotiana benthamiana plantas transformadas con una amplificacin de potyvirus
Mara Calvo, un Dujovny Gabriela, una Cristina Lucini, 1, 2 Jess Ortuo, unJosefa M Alamillo, 1, 3 Carmen Simn, Mateo, un Juan Jos Lpez-Moya, 1,4 y Juan Antonio Garca 1
Centro Nacional de Biotecnologa-CSIC, Campus de la Universidad Autnoma de Madrid, 28049 Madrid, Espaa 2 Facultad de Ciencias y Artes, Universidad Catlica de vila, vila, Espaa 3 Departamento de Fisiologa Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Crdoba, Crdoba, Espaa 4 Centro de Investigacin en Genmica Agrcola CRAG, CSIC-IRTA-UAB, Barcelona, Espaa Autor correspondiente. Mara Calvo: mcalvo@cnb.csic.es ; Gabriela Dujovny: gdujovny@hotmail.com , Cristina Lucini: cristina.lucini @ ucavila.es , Jess Ortuo: j_ortuno_sanchez@hotmail.com , Josefa M Alamillo: bv1munaj@uco.es ; Carmen Simn-Mateo: csimon@cnb.csic.es , Juan Jos Lpez-Moya: jlmgmy@cid.csic.es , Juan Antonio Garca:jagarcia@cnb.csic.es Recibi 16 de abril 2010; Aceptado 06 de julio 2010. Este es un artculo de acceso abierto distribuido bajo los trminos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), que permite el uso irrestricto, la distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.
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Abstracto
Fondo Genoma de las plantas han sido transformadas con copias de larga duracin cDNA de genomas virales, dando lugar a lo que se ha llamado "amplificacin" de sistemas, tratando de combinar la estabilidad gentica de las plantas transgnicas con la elevada tasa de replicacin del virus de las plantas. Sin embargo, el rendimiento amplicones 'ha sido muy variable, independientemente de que el virus de los que se basan. Esto
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ha impulsado un mayor inters en la comprensin de los mecanismos subyacentes que causan estas diferencias de comportamiento, y en el desarrollo de estrategias para controlar la expresin de amplificacin. Resultados Nicotiana benthamiana plantas fueron transformadas con una amplificacin que consiste en un ADNc de longitud completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) del genoma modificado para incluir un gen reportero GFP. Expresin de amplificacin mostraron una gran variabilidad entre las diferentes lneas transgnicas, e incluso entre diferentes plantas de la misma lnea. Las plantas de la lnea de 10,6 inicialmente desarrollado sin signos de expresin de amplificacin, pero en diferentes momentos algunos de ellos comenz a mostrar focos de infeccin espordica en las hojas de la madurez. La infeccin sistmica progresado, pero en los ltimos tiempos las plantas infectadas se recuper y volvi a un estado inactivo-amplificacin. La falta de deteccin de virus especficos de siRNAs en 10,6 plantas antes de la induccin de amplificacin y despus de la recuperacin sugiere que una fuerte amplificacin de silenciamiento de ARN especfico no se ha establecido en estas plantas. Sin embargo, la co-expresin de los supresores de silenciamiento viral adicional causado cierta activacin de amplificacin, lo que sugiere que un bajo nivel de silenciamiento de ARN podra estar contribuyendo a mantener la represin de amplificacin en el 10,6 plantas. Los mecanismos de resistencia que impiden amplicn derivados de infeccin por el virus tambin se activa frente a PPV exgenos introducidos por inoculacin mecnica o el injerto, pero no afectar a otros virus. Amplicn derivados de PPV fue capaz de extenderse a los vstagos de tipo silvestre injertada en el 10,6 patrones que no muestra signos de expresin de amplificacin, lo que sugiere que la resistencia tiene poco efecto en el movimiento del virus. Conclusiones Nuestros resultados sugieren que la amplificacin de derivados de la infeccin por virus es limitado en esta lnea transgnica en particular por una combinacin de factores, incluyendo la supuesta eficiencia de baja de la conversin de la transcripcin del transgn a replicar el ARN viral, y tambin por la activacin de silenciamiento de ARN y otros defensivos las respuestas de la planta, que no son totalmente neutralizados por los supresores virales.
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Fondo El creciente inters en el uso de plantas como biofbricas para la produccin de protenas extraas de importancia farmacutica e industrial ha llevado al desarrollo de sistemas de expresin nuevos para obtener altos rendimientos de los productos deseados [ 1 ]. Algunas estrategias se han centrado en el desarrollo de vectores virales de plantas, teniendo en cuenta su capacidad de replicacin como una caracterstica positiva para alcanzar los rendimientos esperados [ 2 - 4 ]. A pesar de que su rapidez a veces puede hacer que la expresin transitoria de un mtodo conveniente para obtener el producto de inters, uno de los objetivos de la agricultura molecular es el desarrollo de sistemas estables para evitar la inoculacin de los procesos manuales que pueden dificultar en gran escala los costos de produccin y aumentar la . Con este propsito, los genomas de plantas han sido transformadas con copias de larga duracin cDNA del genoma de los vectores virales, dando lugar a lo que se ha llamado "amplicn" sistemas de expresin [ 5 - 11]. Por lo tanto, los amplificados, que son derivados de virus transgnicos, fueron diseados para combinar la estabilidad gentica de las plantas transgnicas con la elevada tasa de replicacin del virus de las plantas, escapando de la necesidad de un proceso de inoculacin. Sin embargo, el rendimiento de los amplificados en las lneas transgnicas obtenidas por transformacin de los diferentes genomas virales, como un todo, ha sido muy variable, independientemente de que el virus de los que se basan. Esto ha impulsado un mayor inters en la comprensin de los mecanismos subyacentes que causan estas diferencias de comportamiento, y en el desarrollo de estrategias para controlar la expresin de amplificacin. Silenciamiento de ARN es usado por las plantas como un mecanismo de defensa contra las infecciones de virus [ 12 ], y tambin contribuye a limitar la replicacin de los amplicones virales [ 5 , 13 - 16 ]. Sin embargo, el silenciamiento de ARN puede no ser el nico factor que limita la expresin de amplificacin en muchas ocasiones, por ejemplo, se ha informado de que una versin mutante del virus del mosaico del pepino (CMV) que carecen de su 2b supresor de silenciamiento fue capaz de aliviar la represin de un enrollamiento de la hoja de papa virus (PLRV) amplificacin [ 17 ].Por lo tanto, los amplificados se pueden utilizar no slo para fines de cra molecular, pero tambin pueden servir como sistemas modelo para el anlisis de la expresin transgnica y los procesos de infeccin por el virus, as como los mecanismos de defensa antiviral. Plum pox virus (PPV) es un miembro del gnero Potyvirus [ 18 ]. Potyvirus tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad mensajero ~ 10 kb de longitud. Este ARN genmico se traduce en una poliprotena grande y un producto del marco de lectura truncada, que son procesadas proteolticamente por tres proteasas codificadas por el virus [ 19 , 20 ]. De larga duracin clones de cDNA que son capaces de iniciar las infecciones PPV se han construido y utilizado para la caracterizacin gentica de este virus y el diseo eficiente de vectores de expresin de plantas [ 21 ].
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Coexpresin de la HCPro silenciar supresor potyviral se ha demostrado para mejorar fuertemente la actividad de un virus de papa X amplificacin [ 16 ], sin embargo, no se sabe si su propia expresin HCPro podra asegurar altos niveles de expresin de un amplicn potyviral. En este trabajo se han transformado Nicotiana benthamiana plantas con una copia de ADNc de longitud completa del potyvirus PPV. N. benthamiana , un husped experimental de PPV, fue elegido debido a sus peculiaridades que la convierten en una especie de modelo en los estudios virolgicos en las plantas [ 22 ]. Hemos observado una gran variabilidad en los patrones de expresin de las lneas transgnicas resultantes, y se ha caracterizado en detalle la expresin de amplificacin de una de estas lneas.
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Resultados La produccin de PPV-NK-GFP lneas de amplificacin N. benthamiana plantas fueron transformadas con la secuencia completa de ADNc del PPV potyvirus llevar la secuencia de codificacin de la protena verde fluorescente (GFP) como gen reportero (PPV-NK-GFP, fig. Fig. 11 ). Figura 1 PPV-NK-GFP plantas de amplificacin . A: representacin esquemtica de p35S-PPV-NK-GFPNOST. Cajas grises representan las secuencias que codifican las protenas de la indicada PPV. La caja verde representa el gen reportero GFP clonado entre el NIB y la CP secuencias de codificacin. Negro (ms ...)
Desarrollo de la planta, la acumulacin viral y la expresin de GFP fueron muy variables entre los transformantes primarios. En particular, dos plantas eran estriles, y otro (10,2) dio muy pocas semillas, la mayora de los cuales no eran viables. Semillas de transformantes frtiles fueron germinadas in vitro y las plntulas resultantes se analizaron para la expresin de GFP. Curiosamente, GFP se detect en las nicas dos plantas de la lnea de 10.2 que se podran obtener, y en todas las plantas de la lnea de 10,1, pero en el resto de las lneas de otras frtiles, la acumulacin de GFP se observ slo en algunas de las plntulas. Sin embargo, aunque en teora todas las clulas de las plantas transformadas contienen el transgn viral, incluso en las plntulas de la lnea 10.1 de la expresin de GFP observada no fue uniforme en los cotiledones y las hojas (Fig. (Fig.1b).1B ). Los datos de la segregacin de resistencia a kanamicina de las lneas transgnicas diferentes eran compatibles con uno o dos loci de insercin, pero no hemos encontrado correlacin entre el nmero loci y los patrones de expresin GFP (datos no mostrados). Las plntulas de algunas de las lneas fueron transferidas al suelo y se cultivaron en una cmara de crecimiento. Patrones de expresin de GFP fueron muy variables, no slo entre las lneas, sino tambin entre las plantas en la misma lnea (datos no mostrados). Expresin de la amplificacin de PPV-NK-GFP en el 10,1 y 10,6 lneas 10.1 de la lnea transgnica que mostr la expresin de amplificacin ms eficiente.Las plantas de esta lnea acumularon altos niveles de virus, ya que brotan, aunque, incluso en este caso, la expresin de GFP no fue igual en los cotiledones de cada planta, y la alta variabilidad tambin se observ a partir de plntulas de semilla (Fig. (Fig. 1B).1B ). Sin embargo, a medida que crecan, todas las plantas muestran sntomas 10,1 fuerte infeccin que causaban alteraciones graves del desarrollo, y persisti durante la vida de la planta completa (Fig. (Fig.2a).2A ). Este patrn de infeccin es similar a la de una infeccin causada por PPV normales-NK-GFP en el medio silvestre de tipo N.benthamiana plantas. Figura 2 Los patrones de expresin de la amplificacin de PPV-NK-GFP en plantas transgnicas 10.1.7 (A) y 10.6.1 plantas (B) .Posiciones de la hoja (de la parte inferior de la planta) se indican.Fotos fueron tomadas bajo la luz ultravioleta a los 42 DPT (10.1.7 y 10.6.1 de las hojas 8-10) y 50 dioptras (hojas (ms ...)
En contraste con la lnea 10.1, ninguna de las plntulas de la lnea de 10,6 GFP expresado inicialmente. Sin embargo, cuando estas plantas se transfirieron a suelo, una serie de plantas comenzaron a expresar GFP despus de algunos das en la cultura. Expresin de amplificacin exitosa y la infeccin viral posterior que pareca ser un evento estocstico en la lnea de 10,6, y este fenotipo se mantuvo en diferentes progenies F2 de esta lnea. La descendencia de las plantas 10.6.1 (F2) fue utilizado para los experimentos siguientes. A pesar de la induccin de amplificacin se llev a cabo en diferentes plantas en diferentes das despus del trasplante (DPT), la expresin de las buenas prcticas agrarias siempre se inicia en la expansin de las hojas
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sometidas a la madurez (Fig.(Fig.2C2C muestra los resultados de 5 experimentos independientes). En la primera amplificacin que expresan las hojas, la fluorescencia verde fue detectado en focos aislados, que no progres ampliamente. GFP expresin se expande a cubrir la base de las hojas slo en la parte superior de los primeros que expresan GFP de la hoja, mientras que las buenas prcticas agrarias se ha detectado a lo largo de la lmina completa de las hojas ms jvenes (Fig. . (Fig.2b).2B ). Sin embargo, aproximadamente 10 das despus de la aparicin de las primeras manchas de color verde fluorescente, islas verdes oscuros tpicos de la recuperacin de virus [ 23 ] se han observado en las hojas de reciente desarrollo. La induccin del fenotipo de recuperacin confirmado por la aparicin posterior de las hojas que no mostraron sntomas de la infeccin o la expresin de GFP. Debido a los patrones de expresin anormal observado en la lnea 10.6, nos hemos centrado ms estudios en esta lnea especfica. La acumulacin de virus especficos de siRNAs en el PPV-NK-GFP 10,6 amplificacin de lnea Silenciamiento de ARN se ha demostrado que median la resistencia a virus y constitutiva inducida por el virus derivados de los transgenes virales [ 24 - 26 ], y para reprimir la expresin de los amplicones virales [ 5 ]. A fin de evaluar la posible contribucin de silenciamiento de ARN a la represin de la expresin inicial de amplificacin, y la induccin de la eventual recuperacin de virus en el 10,6 plantas, se analiz la acumulacin de siRNAs especficos del transgn viral, la principal sea de identidad de procesos de silenciamiento de ARN . Semillas de plantas 10.6.1 fueron germinadas in vitro y las plntulas resultantes fueron trasplantadas y cultivadas en el suelo. En este experimento, 13 de las 64 plantas desarrollaron una infeccin derivada de amplificacin. Pequeos RNAs fueron extrados de tres tipos de hojas de las plantas infectadas: las hojas por debajo de la primera hoja que expresan GFP (R1), las hojas sometidas a PPV-NK-GFP infeccin (G), y recuperado por completo las hojas jvenes (R3). Muestras equivalentes, R1, R2 (de la misma edad que deja G) y R3, se obtuvieron de plantas 10.6.1 no muestra sntomas de la infeccin, y que se han mantenido en idnticas condiciones de crecimiento (Fig. (Fig.3a).3A ). Los pequeos RNA de muestras fueron sometidas a anlisis de Northern con sondas derivadas ya sea de la P1 o la secuencia de codificacin de NIB PPV (Fig. (Fig.3b).3B ). PPV-siRNAs especficos slo se detectaron en las muestras de las buenas prcticas agrarias-que expresa las hojas (G). SiRNAs viral se detect ni en las hojas desarrolladas antes de la induccin de amplificacin (R1) ni en las hojas superiores se recuper (R3) de los infectados 10.6.1 plantas. SiRNAs virales tampoco se detectaron en ninguna de las muestras recogidas de las plantas de control no infectados. Figura 3 siRNA acumulacin en las plantas de amplificacin 10.6.1 . A:representacin esquemtica de los dos tipos de plantas 10.6.1. Los patrones de color verde y el rojo indica la expresin y la falta de expresin de la GFP, respectivamente. B : se extrajo el ARN de las muestras de hoja se indica en (ms ...)
Efecto de los supresores de silenciamiento de ARN en la expresin de los 10,6 PPV-NK-GFP amplicn La ausencia de siRNAs detectable en el tejido de las plantas 10.6.1 que no se expresa la amplificacin PPV sugiere que silenciamiento de ARN no se activa en estas plantas. Para confirmar que el silenciamiento de ARN no estaba jugando un papel en la represin de la amplificacin, 10.6.1 plantas que no mostraron signos de PPV-NK-GFP infeccin se infiltraron con cultivos de Agrobacterium tumefaciensexpresar diferentes supresores de silenciamiento viral. Expresin de los supresores de silenciamiento P1B (intacto o con una etiqueta TAP N-terminal) de la vena del pepino amarillo virus (CVYV) dio lugar en algunas hojas de fluorescencia de GFP difundido en todo el tejido infiltrado, con algunas manchas verdes dispersos ms intenso (Fig. (Fig.4a).4a ). Slo manchas verde fluorescente fueron detectados en otras hojas agroinfiltradas con este supresor de silenciamiento (Fig. (Fig.4b)4b ) y en un bajo porcentaje de hojas agroinfiltradas con el P19 supresores de silenciamiento de tomate Bush truco virus (TBSV) (Fig. (Fig.4d)4d ) o P1-HCPro del virus del grabado del tabaco (TEV) (Fig. (Fig.4f).4f ). Sin embargo, la fluorescencia de GFP no se detect en la mayora de las hojas que manifieste su TBSV p19 o TEV P1-HCPro (Fig. (Fig.4c4c y and4e).4e ). TBSV P19 tiende a causar fluorescencia amarilla, probablemente indicativa de la induccin de la necrosis (Fig. (Fig.4d).4d ). La aparicin de la fluorescencia de GFP correlaciona con la deteccin de buenas prcticas agrarias y los CP de PPV en el anlisis occidental (datos no mostrados). Fluorescencia de la GFP no se detect en el tejido infiltrado con Agrobacterium culturas llevar un control del vector vaco (Fig. 4g-h ), lo que indica que la induccin de amplificacin es el resultado de la expresin del supresor de silenciamiento. Figura 4 Efecto de silenciamiento de los supresores de plantas 10.6.1 .Tres hojas (posiciones 3-5 desde la parte inferior) de 10.6.1 plantas fueron infiltrados con Agrobacterium cepas que expresan diferentes
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ARN silenciador supresores o con un control de Agrobacterium que contiene un vaco (ms ...)
La expresin sistmica de la amplificacin no parece ser mayor en las plantas agroinfiltradas con los supresores de silenciamiento con respecto a las plantas agroinfiltradas con el vector vaco o agroinfiltradas no, lo que sugiere que la supresin de locales de silenciamiento de ARN no es suficiente para el alivio PPV de los mecanismos de defensa que evitar su propagacin en el 10,6 plantas de amplificacin. La susceptibilidad de los 10,6 PPV-NK-GFP plantas amplicn a la infeccin viral exgeno Desde los 10,6 plantas parecen tener mecanismos de defensa que limitan la expresin de la amplificacin del transgen, se pregunta si estas actividades antivirales fueron capaces de interferir con las infecciones exgenas y si estas infecciones podran afectar a la expresin endgena de la amplificacin de PPV. Para responder a estas preguntas, 10.6.1 plantas que no mostraron signos de PPV-NK-GFP infeccin de tipo salvaje y N. benthamiana plantas fueron inoculadas de forma manual, ya sea con el tipo salvaje PPV, un potyvirus en segundo lugar, la vena del tabaco virus moteado (TVMV), o un virus heterlogo, el CMV cucumovirus, burlarse de inoculados. Todas las plantas inoculadas con TVMV desarrollado una infeccin sistmica (tabla (Tabla 1).1 ). 10.6.1 La plantas transgnicas no mostraron una mayor resistencia a CMV sea, aunque algunos de tipo salvaje y las plantas 10.6.1 no estaban infectados, probablemente como consecuencia de una baja infectividad del inculo utilizado por CMV (tabla (Tabla 1).1 ) . La falta de resistencia de las plantas 10.6.1 contra estos virus fue confirmado por el anlisis occidental (Fig. (Fig. 5).5 ). En contraste, mientras que todas las plantas de tipo salvaje eran susceptibles a la infeccin por PPV tipo salvaje, slo 5 de cada 8 10.6.1 plantas inoculadas con el virus muestra sntomas de la enfermedad (tabla (Tabla 1).1 ). La resistencia parcial de 10,6 plantas de PPV fue apoyada por el anlisis occidental que muestra la acumulacin de mucho menor de PPV CP en las hojas inoculadas y en las hojas inmediatamente por encima de la 10.6.1 plantas infectadas con respecto a la de los de tipo salvaje (Fig. . (Fig. 5).5 ). Curiosamente, esta resistencia parece que hay que superar con el progreso de la infeccin, ya que los niveles de acumulacin de PPV fueron similares en la cuarta hoja por encima de los inoculados de 10.6.1 y plantas silvestres infectadas (Fig. (Fig. 55 ). Tabla 1 Infectividad del virus en diferentes 10.6.1 PPV-NK-GFP plantas de amplificacin.
Figura 5 Virus y las buenas prcticas agrarias de acumulacin de tipo salvaje y 10.6.1 transgnicos N. benthamiana plantas inoculadas con el virus diferentes . Los extractos de las hojas inoculadas (inoc.), la hoja inmediatamente por encima de los inoculados (+ 1 hoja), y la cuarta hoja encima de la inoculados (ms ...) En este experimento, slo un simulacro de inoculados 10.6.1 planta desarrollaron infeccin de la endgena PPV-NK-GFP amplificacin. El hecho de que ninguno de los 10.6.1 plantas inoculadas con PPV tipo salvaje muestran la fluorescencia de GFP (no se muestra) o GFP acumulacin (Fig. (Fig.5A),5A ), indic que la propagacin sistmica de forma exgena PPV aplicada no es capaz de suprimir la represin de la amplificacin endgeno. No fluorescencia de GFP o la acumulacin de buenas prcticas agrarias en el western blot se observaron en TVMV plantas infectadas, mostrando que TVMV, como la exgena de tipo salvaje de pago, no fue capaz de derepress la amplificacin de PPV de la lnea de 10,6 (Fig. (Fig.5B).5B ). Por el contrario, todas las plantas 10.6.1 infectados con CMV mostr la expresin de GFP en algunas hojas infectadas. GFP aparece como pequeas manchas al parecer, situado en las hojas al azar, aproximadamente siete das despus de estas hojas desarrollaron sntomas CMV (no mostrado), y nunca se muestra el patrn de buenas prcticas agrarias expresin tpica de la infeccin sistmica amplicn derivados de estas plantas (figura (Fig. 2B).2B ).Expresin
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de amplificacin en las plantas infectadas con CMV fue confirmado por las buenas prcticas agrarias y la deteccin de PPV CP por el anlisis occidental (Fig. (Fig.5C5C ). Una caracterstica tpica de la infeccin por PPV deriva de la expresin de amplificacin en el 10,6 plantas es la recuperacin a veces tardas de la infeccin (Fig. (Fig.2b).2B ). Anlisis de Western demostr que las plantas podran 10.6.1 recuperarse de la infeccin producida por una exgena PPV en la misma forma en que se recuper de una infeccin endgena de amplificacin (Fig. (Fig.6A):6A ): CP no se detect en las hojas jvenes que no mostraban sntomas o expresin de las buenas prcticas agrarias ms. En cambio, ni de tipo salvaje N. benthamiana recuperado de la infeccin por PPV (Fig. (Fig.6A),6A ), ni los transgnicos 10.6.1 plantas recuperadas de TVMV o infeccin por CMV (Fig. (Fig.6B6B y and6C).6C ). Adems, la espordica CMV inducida por desrepresin de la amplificacin de PPV-NK-GFP an se llev a cabo en jvenes infectados por CMV sale a veces tarde en la que 10.6.1 plantas infectadas con PPV endgenos o exgenos se han recuperado ya (Fig. (Fig. 0.6 A6A y and6C6C ). Figura 6 La recuperacin de la infeccin por el virus en las plantas transgnicas 10.6.1 . Los extractos de madurez (M) o joven (Y) las hojas de tipo transgnico 10.6.1 o silvestres N. benthamiana plantas inoculadas con PPV (panel A ), TVMV (panel B ) o CMV (panel C ) recogidos en 32 das post inoculacin (ms ...)
Virus movimiento desde y hacia PPV-NK-GFP 10,6 tejido transgnico Para conocer el paso de infeccin a la que se impide la expresin sistmica de la amplificacin de 10,6, hemos hecho injertos recprocos entre 10.6.1 y de tipo salvajeN. benthamiana plantas. Tipo I injertos consisti en un patrn 10.6.1 y un vstago de tipo salvaje (abreviado Rx / SWT, donde x es el nmero de plantas 10.6.1). Tipo de injertos II consisti en un patrn de tipo salvaje y un vstago 10.6.1 derivados de las mismas plantas utilizadas para el tipo de injerto recproco I (abreviado ERP / Sx). Ninguna de las plantas 10.6.1 expres GFP en el momento del injerto. Expresin de amplificacin se observ slo en dos de las ocho plantas injertadas de tipo I (R1/Swt y R11/Swt). Sorprendentemente, en estas plantas injertadas, los sntomas de la enfermedad y la fluorescencia de GFP se detect en los vstagos de tipo salvaje, cuando todava no haba seales de expresin de amplificacin en los portainjertos transgnicos (Fig. (Fig.7A7A y datos no presentados). Una de estas portainjertos (R1/Swt) GFP muestra y sntomas de la enfermedad de reciente aparicin en las hojas laterales sucursal, en los ltimos tiempos. GFP no poda ser detectado por el anlisis occidental en el tejido patrn que no mostraron fluorescencia verde. En el caso de R11/Swt, viral ARN se amplific por IC-PCR y una banda dbil CP se detect en un anlisis occidental del rizoma asintomtico (Fig. (Fig. 8).8 ). infeccin progres en los vstagos de tipo salvaje de la R1/Swt y / R11 swt plantas de una manera similar a las plantas de tipo salvaje intacta, y no se recuper de la infeccin derivada de amplificacin (datos no mostrados). amplicn expresin no se observ en ninguno de los otros tipos I injertado plantas y productos virales no poda ser detectado por el oeste o el anlisis de IC-PCR (Fig. (Fig. 88 y datos no presentados). Figura 7 Movimiento de 10,6 amplicn derivados del virus a travs de uniones de injerto . Injertos recprocos se realizaron con el tipo salvaje N. benthamiana y 10.6.1 plantas transgnicas. Patrn y el injerto hojas de las plantas injertadas que consta de un vstago de tipo salvaje en un patrn 10.6.1 (ms ...)
Figura 8 Virus y las buenas prcticas agrarias en la acumulacin de 10,6 plantas injertadas . Los extractos de hojas de la pa (S) y portainjertos (R) las secciones de las plantas injertadas que consta de un vstago de tipo salvaje en un patrn 10.6.1 o 10.6.1 de un vstago en un patrn de tipo salvaje que fue inoculado (ms ... ) Los patrones de tipo salvaje de ocho plantas de tipo II injertadas fueron inoculados con una infecciosas ADNc de longitud completa de PPV tipo salvaje a los 4 das despus del trasplante (DPG). Cuatro plantas (Rwt/S1, Rwt/S2, Rwt/S4 y Rwt/S10) muestra un tipo salvaje infeccin de PPV en los patrones de tipo salvaje y dos de
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ellos (Rwt/S4 y Rwt/S10) mostraron sntomas leves de PPV en una pocas hojas vstago, que no se extendi en todo el resto de la pa (datos no mostrados). PPV CP, pero no las buenas prcticas agrarias, fue detectado por el anlisis occidental de los portainjertos y los injertos mostrar sntomas (Fig. (Fig. 88 y datos no presentados). Una banda muy dbil CP se detect en el anlisis occidental de la pa asintomticos de la planta Rwt/S2 (no mostrado). A pesar de PPV CP no fue detectado por el anlisis occidental en el vstago de la planta asintomtica Rwt/S1 (Fig. (Fig.8A),8A ), un fragmento de diagnstico de tipo salvaje PPV ARN se amplific por IC-PCR a partir de este vstago, y el mismo fragmento se amplific tambin en las muestras del patrn sintomtico de esta planta y el vstago sintomtico de Rwt/S10 (Fig. (Fig.8B).8B ). Los cuatro tipo de plantas injertadas II que no estaban infectados con la primera inoculacin PPV cDNA se inocul con un extracto crudo de PPV hojas infectadas a 25 dpg, cuando todava no ha dado muestras de expresin de amplificacin. Tres de ellos (Rwt/S6, ERP / S7, y Rwt/S22) se pareca a la Rwt/S1 plantas que muestran la acumulacin de la enfermedad y la CP slo en el rizoma (Fig. (Fig.8A8A y datos no presentados), aunque un fragmento de cDNA de PPV tipo salvaje se amplific a partir de los dos los patrones sintomticos y asintomticos, el vstago de la planta Rwt/S6 (Fig. (Fig.8B).8B ). fluorescencia de GFP o la acumulacin de la protena GFP no fue detectado en ninguna de estas tres plantas (Fig. (Fig.8A8A y datos no presentados). En contraste con el resto de las plantas injertadas de tipo II, la planta Rwt/S11 desarrollado un expresan GFP amplicn derivados de la infeccin en las hojas jvenes de los patrones de tipo salvaje, mostrando slo una pequea mancha GFP en una hoja del vstago transgnicos (Fig. . (Fig.7B).7B ). Grandes cantidades de GFP y CP de PPV fueron detectados por el anlisis occidental en el patrn que expresan GFP sintomtica, pero no en el vstago asintomticos de esta planta (Fig. (Fig.8A).8A ). Un fragmento de cDNA de PPV tipo salvaje se amplific por IC-PCR del rizoma de la planta Rwt/S11, demostrando que la planta est coinfectado por el que expresan GFP amplicn derivados del virus y la exgena PPV tipo salvaje (Fig. (Fig. 0.8 B).8B ). IC-PCR de extractos de los asintomticos Rwt/S11 vstago transgnicos principalmente amplific el fragmento de cDNA del virus de la amplificacin de origen, pero tambin produjo una cantidad muy baja de los fragmentos de PPV tipo salvaje (Fig. (Fig.8B),8B ), lo que sugiere que el virus exgenos tambin podra haber invadido el tejido de la planta transgnica.
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Discusin Hemos transformado N. benthamiana con la secuencia completa de ADNc de una expresin de GFP-PPV recombinantes, dando lugar a diferentes lneas de amplificacin de PPV, que muestra la variabilidad gran expresin (Fig. (Fig. 1).1 ). En informes anteriores se demostr que una amplificacin de represin pueden ser activadas por la coexpresin de un supresor de silenciamiento fuerte [ 16 ]. Nuestros resultados muestran que la expresin de amplificacin pueden ser reprimidos an cuando la amplificacin lleva un supresor de silenciamiento fuertes como P1-HCPro. Aunque todas las clulas de las plantas de amplificacin llevar el ADNc de longitud completa del genoma del virus, incluso en las plantas de 10,1 lneas, que siempre se muestra seales de expresin de amplificacin, amplificacin de origen infeccin por el virus no fue uniforme en toda la planta (Fig. ( Fig.1b).1B ). No es posible discernir si la infeccin en un lugar determinado de la planta es el resultado de la expresin endgena de los transgenes o de propagacin del virus de las regiones previamente infectadas de la planta. En las plantas de la lnea 10.6, amplicn derivados de la infeccin se observ por primera vez en discretas y espordicas focos (Fig. (Fig.2b).2B ).Esto sugiere que el proceso de "transgenes nucleares de transcripcin de mRNA de procesamiento de ARNm de exportacin al citoplasma-ARNm traduccin de ARNm de replicacin" es ineficiente, ya que se ha sugerido anteriormente [ 27 , 28 ], sino tambin que un estado de resistencia de las plantas impide la progresin de la infeccin de las clulas de raro en que la transcripcin del transgn ha sido capaz de iniciar la replicacin del virus. El establecimiento de una infeccin sistmica posterior, con un patrn similar al de las infecciones normales de pago, en la gran mayora de las plantas de la lnea que muestra el 10,6 localizado focos de infeccin (Fig. (Fig.2b),2B ), sugiere que infeccin por el virus en las hojas superiores se deriva del movimiento del virus a partir de las hojas inferiores y que, en estas plantas, la resistencia a la difusin de locales es una restriccin ms fuerte en la progresin de la infeccin que la resistencia al movimiento sistmico. Otra pieza de evidencia de que la resistencia al movimiento sistmico del virus es dbil en el 10,6 plantas fue el inicio de la amplificacin de origen infeccin por el virus en el vstago de tipo salvaje de las plantas injertadas antes de que pudiera ser detectada en el tejido portainjertos transgnicos (Fig. (Fig. 7).7 ). Este hecho tambin sugiere que los virus infecciosos podran acumularse en niveles muy bajos (por debajo del lmite occidental de deteccin de anlisis) en al menos aproximadamente 10,6 plantas que no presentan fluorescencia verde visible, sin embargo, no hemos sido capaces de infectar a las plantas como indicadores de tipo salvaje N. benthamiana , N. clevelandii o foetidum Chenopodiumcon extractos de las hojas que no mostraban fluorescencia verde de 10,6 plantas, incluso cuando las hojas superiores de estas plantas se expresa la amplificacin (datos no mostrados). Todava no s qu factor desencadena la expresin de amplificacin en las plantas de la lnea 10.6. Esto se llev a cabo en tan slo un pequeo nmero de plantas de 10,6, y la capacidad para apoyar la activacin de amplificacin no parece ser un rasgo hereditario ya que todas las plantas de la descendencia de las plantas que 10.6.1 ya sea expresa o no expresa la amplificacin recuperado de las personas inactivas estado, y el
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porcentaje de plantas con induccin de la expresin de amplificacin fue similar en ambos tipos de progenies (datos no mostrados).Taliansky et al. [ 17 ] demostr que un estrs abitico, la expresin de un supresor de silenciamiento, o la infeccin con diferentes virus activa un amplicn de PLRV.Sin embargo, la activacin de la amplificacin de PPV de la lnea de 10,6 aparentemente espontnea, a pesar de que no se puede descartar un efecto desencadenante, por ejemplo, un tipo de estrs desapercibido. La activacin de la amplificacin de TMV descrito por Siddiqui et al. [ 29 ] Tambin fue espontnea, pero mientras que la resistencia limita la expresin de la amplificacin de TMV se rompi en una etapa especfica del desarrollo de la planta (aproximadamente 7 a 8 semanas despus de la germinacin), la expresin de la amplificacin de PPV parece depender menos de la edad de la planta (que se activ entre 2 y 6 semanas despus del trasplante) que en la etapa de desarrollo de las hojas en particular (Fig. (Fig.2C).2C ). No sabemos si fue en estas hojas una mejora del proceso que conduce desde la transcripcin del transgn en el ncleo de iniciar la replicacin del virus en el citoplasma, o un debilitamiento de los mecanismos de resistencia que impide el establecimiento de una infeccin por PPV desde el ARN viral producto de esta cascada. Cul es la naturaleza del mecanismo de resistencia a limitar la expresin de amplificacin en el 10,6 plantas? La resistencia parcial de estas plantas inoculadas exgena PPV tipo salvaje, mientras que son totalmente susceptibles a TVMV y CMV (Figs. (Figs.5B5B y y 6)6 ) indica que la resistencia es especfica para el virus. La falta de deteccin de virus especficos de siRNAs en 10,6 plantas antes de la activacin de amplificacin (Fig. (Fig. 3),3 ), como se ha informado de represin amplicn TMV [ 29 ], sugiere que la fuerte amplificacin especfica de silenciamiento de ARN es postranscripcional no establecidos en estas plantas. Sin embargo, el hecho de que agroinfiltracin con supresores de silenciamiento causado cierta limitada amplificacin PPV (Fig. (Fig. 4)4 ) podra indicar que un bajo perfil silenciamiento de ARN podra estar contribuyendo a mantener la amplificacin PPV inactivos en el 10,6 plantas. La replicacin del virus moderado observado en las reas agroinfiltradas con supresores de silenciamiento no fue capaz de facilitar el establecimiento de una infeccin sistmica. Teniendo en cuenta que el 10,6 plantas no parecen plantear una fuerte restriccin a la circulacin del virus (ver arriba), este hecho implica que estas plantas presentan algn nivel de resistencia no slo contra la transcripcin endgena derivada de la infeccin por el virus inoculado o mecnicamente (Fig. (Fig.5A)5A ), sino tambin a la salida del virus al tejido vascular. De acuerdo con esta sugerencia, slo un bajo porcentaje de 10,6 vstagos fueron infectados de infectados patrones de tipo salvaje en las plantas injertadas (Fig. (Fig. 8).8 ). Por lo tanto, la infeccin espontnea de 10.6 plantas que requieren no slo de una entrada de ms de la transcripcin de ARN de origen infeccioso o un deterioro en la resistencia de las hojas que muestran los primeros focos del virus, sino tambin un debilitamiento de la proteccin antivirus en las hojas superiores que posteriormente fueron sistemticamente infectados. Aunque la infeccin por potyvirus se ha demostrado para suprimir el silenciamiento de ARN [ 30 ], la activacin de amplificacin no se detect en el 10,6 plantas infectadas con PPV tipo salvaje o TVMV (Fig. (Fig.5A5A y and5B).5B ). En contraste, la infeccin por CMV caus la expresin de amplificacin espordicos en algunas hojas de las plantas de 10,6 (Fig. (Fig.5C).5C ). Estos resultados estn de acuerdo con un informe anterior muestra que tanto TVMV y la infeccin por CMV volvi inducida por el virus silenciamiento de N. benthamiana plantas transformadas con un transgn PPV derivados, pero la susceptibilidad a PPV fue restaurada slo en las plantas transgnicas infectadas con CMV, lo que sugiere que la infeccin podra ser TVMV provocar una interpotyvirus proteccin cruzada mecanismo [ 31 ]. Una posible contribucin de la naturaleza PPV tipo de infeccin o TVMV a la supresin del silenciamiento de amplificacin en el 10,6 plantas podra haber sido enmascarado por esta caracterizado proteccin cruzada mecanismo. Por otra parte, el CMV puede suprimir un mecanismo de resistencia a limitar la expresin de amplificacin del 10,6 por diferentes plantas de silenciamiento de ARN. En este sentido, el 2b del CMV se ha demostrado que interfiere no slo con el silenciamiento de ARN, sino tambin con la resistencia saliclico virus mediada por el cido [ 32 ]. Por otro lado, el hecho de que un mutante que carecen de la CMV 2b silenciar supresor fue capaz de facilitar el escape del virus de un silencio de amplificacin PLRV, sugiere que la CMV tambin puede suprimir un mecanismo de resistencia a los virus por una va independiente-2b [ 17 ]. En cualquier caso, el patrn irregular de expresin amplificacin observada en el 10,6 infectados por CMV plantas indica que la infeccin por CMV no es capaz de suprimir todas las barreras defensivas que se levantaron durante la induccin aparentemente espontnea de la amplificacin de PPV-NK-GFP. Una vez que la amplificacin de una planta de 10,6 se activa, la infeccin sistmica progresa en esta planta del mismo modo como en una planta de tipo salvaje (Fig. (Fig.2b).2B). Sin embargo, a veces ms tarde, el 10,6 plantas infectadas, pero no los transgnicos 10.1 o las plantas de tipo salvaje infectado, aparece islas de color verde oscuro, que son tpicos de la recuperacin de silenciamiento de ARN mediada [ 23 , 25 , 33 ]. Entonces, la recuperacin progres y hojas recin en desarrollo libres de virus (Fig. (Fig.6A).6A ). El fenotipo de recuperacin del 10,6 por plantas era especfico de canales de pago, ya que tambin se observ en el 10,6 exgena plantas infectadas con el tipo salvaje PPV, pero no en las plantas infectadas con el 10,6 TVMV o CMV (Fig. (Fig.6B6B y and6C).6C ). Nuestros resultados no revelan si la represin de la expresin de amplificacin en el tejido recuperado es similar a la que el mantenimiento de la amplificacin inactivo antes de su induccin espontnea. La ausencia de grandes cantidades de virus especficos de siRNAs en el tejido recuperado, al igual que en el tejido que no ha sufrido la activacin de amplificacin (Fig. (Fig.3b),3B ), sugiere que el mantenimiento de la represin de amplificacin despus de la
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recuperacin no se basan tambin en un estado de silenciamiento de ARN fuerte. Sin embargo, existe la posibilidad de que el silenciamiento dbil, el ARN transitoria o espacio localizado, podra ser el detonante de la recuperacin de 10,6 plantas. Esto estara de acuerdo con otro informe que muestra que antiviral silenciamiento de ARN se limit a la zona marginal del virus libre de tejido de color verde oscuro en plantas de tabaco infectadas con el virus del mosaico del tomate [ 34 ].
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Conclusiones En este estudio, se han construido varias lneas amplicn derivados del PPV potyvirus y caracterizado en detalle uno de ellos, la lnea 10.6. A pesar de la produccin de los fuertes supresores de silenciamiento HCPro, los patrones temporales y espaciales de expresin de la amplificacin de PPV son muy variables entre las diferentes lneas transgnicas y plantas individuales de estas lneas.Restricciones a la amplificacin del virus y locales difusin, en lugar de movimiento sistmico, parecen ser los principales factores que restringen la infeccin por virus de la lnea transgnica 10.6. Resistencia a los virus en esta lnea transgnica es especfica para el virus y afecta no slo a partir de la amplificacin del virus del transgn endgeno, sino tambin en la infeccin de virus exgenos, introducidos por inoculacin mecnica o por injerto. Adems, los dispositivos de amplificacin de antivirales derivados desplegados en el 10,6 plantas tienen un efecto retardado que resulta en un fenotipo de recuperacin tarda. Nuestros resultados sugieren que la expresin de amplificacin pueden ser restringidos por una combinacin de factores, incluyendo probablemente una conversin eficiente de la transcripcin de los transgenes nucleares a citoplasma replicable ARN viral, silenciamiento de ARN y otras respuestas defensivas de la planta que no puede ser totalmente contrarrestado por los supresores virales.
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Mtodos Construccin de p35S-PPV-NK-GFP-NOST, Nicotiana benthamianatransformacin y cultivo de plantas P35S-PPV-NK-GFP-NOST plsmido se construy mediante la insercin en pBin19 [35 ] digerido con SmaI y XbaI, el fragmento PvuII-XbaI de pIC-PPV-NK-GFP [ 36 ] que contiene la secuencia de longitud completa de cDNA de PPV. N. benthamianadiscos de hojas se transformaron con esta construccin con A. tumefaciens de la inoculacin, bsicamente de acuerdo con Horsh et al. [ 37 ] y las plantas fueron regeneradas en un medio que contena kanamicina (100 mg / ml). Plntulas enraizadas fueron trasplantadas al suelo y despus de la aclimatacin en cmara de crecimiento a 22 C y 70% de humedad con un 14 h/10 h luz / oscuridad ciclo, las plantas transgnicas fueron trasladados a un invernadero. En general, las semillas de las plantas transgnicas fueron germinadas in vitro en agar solidificado medio con kanamicina (100 mg / ml) a 23 C con 16 h / 8 h luz / oscuridad ciclo. Plntulas en la etapa de la hoja 2 (aproximadamente 10 das despus de la germinacin) se transfirieron al suelo y se cultivaron en una cmara de crecimiento a 22 C y 60% de humedad, con un 14 h/10 h luz / oscuridad fotoperodo. Expresin de los supresores de silenciamiento por agroinoculation 10.6.1 plantas transgnicas fueron infiltrados con A. tumefaciens cepa C58C1 llevar pBIN61: P19 [ 38 ], p35S-P1B, p35S-NTAP-P1B [ 39 ], p35S-P1/HC-pro [ 40 ] o el vector vaco pBin19. Alrededor de 250 l de acetosiringona inducida porAgrobacterium cultura (OD 600 = 0,6) se aplicaron con una jeringa en la parte inferior de tres hojas cuando las plantas estaban en la etapa de ocho hojas. Como control de la actividad de los supresores de silenciamiento, las mezclas de cultivos deAgrobacterium cepas con p35S: GFP [ 41 ] y el plsmido que codifica el supresor de silenciamiento, se coinfiltrated en el tipo natural N. benthamiana . Virus inoculacin Dos o tres hojas fueron espolvoreadas con carborundum y se inocularon con el dedo, frotando con 15 l de ADN o de pICPPV [ 42 ] (0,7 mg / ml) o de extractos de hojas infectadas de tipo salvaje N. benthamiana plantas de suelo con 5 mM tampn fosfato (pH 7,4) (1 g en 2 ml). Planta de injerto Las plantas de aproximadamente 10 hojas de la etapa de desarrollo fueron injertados por el mtodo tradicional de hendidura. Para el tipo I injertos, portainjertos 10.6.1 se prepararon mediante la eliminacin de la sesin por encima de dos hojas basales sanos y en hacer un corte vertical, de 1,5 a 2 cm de largo, en el centro del tallo.Vstagos de unos 4 cm de longitud fueron injertados despus de la eliminacin de todas las hojas excepto los dos ms pequeos y el recorte de su base a una "V" de cua. Tipo II de injertos 10.6.1 vstagos en patrones de tipo salvaje se prepararon de la misma manera, pero tres hojas fueron dejados en los patrones para facilitar la inoculacin con el tipo salvaje PPV. Las uniones de stock / vstago fueron asegurados con Parafilm y las plantas injertadas se cubrieron con una bolsa de plstico durante una semana para evitar la deshidratacin. GFP imgenes Hojas de las plantas fueron seleccionadas para la expresin de las buenas prcticas agrarias con un flii MZ (Leica Microsystems) estereoscpico de fluorescencia, utilizando filtros de excitacin y de barrera de 480/40
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nm y 510 nm, respectivamente.Las imgenes se obtuvieron con una cmara Olympus DP70 digital DP controlador y el software de administrador de DP. Deteccin de protenas Tejido de la hoja se baja con mortero en nitrgeno lquido y almacenadas a -80 C.Extractos proteicos fueron preparados por el deshielo del polvo en tampn de extraccin (150 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 M urea, 2% SDS, y el 5% -mercaptoetanol) (1 ml por gramo de tejido). Los extractos fueron hervidos y los restos celulares se eliminaron por centrifugacin. Las muestras fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 12% de SDS y electroblotted a una membrana de nitrocelulosa.Protenas especficas fueron detectados utilizando anti PPV CP o CMV contra o viriones TVMV sueros policlonales como reactivo de primaria, y conjugado con peroxidasa de cabra anti-conejo IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) como reactivo secundario, o una mezcla de dos anti-GFP anticuerpos monoclonales (Roche ) como reactivo de primaria, y conjugado con peroxidasa de oveja anti-ratn IgG (Sigma-Aldrich) como reactivo secundario. Las protenas se visualizaron immunostained con un kit de LiteAbLot (Euroclone). Ponceau tincin con rojo se utiliza para comprobar el contenido global de protena de las muestras. La extraccin de RNA y anlisis de Northern blot Tejido de las hojas era un terreno en nitrgeno lquido con mortero y se almacen a -80 C. Los cidos nucleicos se extrajeron como se ha descrito previamente [ 43 ].Para el anlisis de transferencia de Northern de siRNAs, aproximadamente 2 g de ARN total se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 15% de desnaturalizacin (con 7 M urea) y se transfiere a una bolsa de nylon Hybond-N + membrana por transferencia capilar [ 44 ]. Tincin con bromuro de etidio de la tincin con azul de metileno y el gel de la membrana se utiliza para verificar la igualdad de carga y transferencia. Despus de UV entrecruzamiento y prehibridacin en UltraHyb buffer (Applied Biosystems / Ambion), blots se hibrid en la misma solucin con un 32 P-etiquetados sonda de ARN antisentido correspondiente a la P1 de PPV o NIB secuencia de codificacin, previamente hidrolizados con tampn carbonato a un duracin media de aproximadamente 50 nt. Seales de hibridacin se detectaron con un sistema molecular Imager FX. RT-PCR despus de inmunocaptura (IC-PCR) Las hojas se homogeneizaron en 5 mM de tampn fosfato de sodio, pH 7,4 (2 ml por gramo) y se incubaron 2 horas a 37 C y durante la noche a 4 C en tubos previamente recubiertas con IgG anti-PPV CP. Despus de dos etapas de lavado con 16 mM de tampn fosfato de sodio, 0,1 M NaCl, 0,5 g / l de Tween 20, pH 7,2, RTPCR se realiz en los tubos de revestimiento con el Titn de RT-PCR System (Roche). Oligodesoxinucletidos 5'-TTGGGTTCTTGAACAAGC-3 'y 5'-TGGCACTGTAAAAGTTCC-3' se utilizaron para amplificar fragmentos de cDNA de 1255 nt nt o 511, de PPV-NK-GFP o de tipo salvaje de pago, respectivamente. Autores de las contribuciones MC hecho todos los experimentos con la lnea de 10.6 se muestra en este artculo, con la supervisin cientfica de la GD en los primeros pasos de la obra. CL construy el plsmido e hizo la transformacin de la planta y la caracterizacin de los transformantes primarios, con la JMA y supervisin JLM. JO y Di-s hizo los primeros anlisis fenotpico de las plntulas de las diferentes lneas transgnicas.CSM colabor en el anlisis de siRNA. JAG coordin el trabajo, participaron en la discusin de todos los experimentos y escribi el manuscrito. Todos los autores ledo y aprobado el manuscrito final. Agradecimientos Damos las gracias a Elvira Domnguez de apoyo tcnico. Este trabajo fue apoyado por becas BIO2007-67283 del MEC espaol, CPE03-022-C5-3 de INIA, SAL/0185/2006 de la Comunidad de Madrid, y KBBE-204429 de la Unin Europea.GD fue apoyado por la Fundacin Carolina. CL fue beneficiario de una beca de la Comunidad de Madrid. MC fue beneficiario de una beca I3P del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC)Fondo Social Europeo. CSM fue apoyada por un contrato Ramn y Cajal.
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Noem Garca Fernndez Trabajo Obligatorio BIOTECNOLOGA E INGENIERA GENTICA Mes y Ao Enero 2012

UNIVERSIDAD CATLICA SANTA TERESA DE JESS DE VILA

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16. Mallory AC,

22. Goodin MM, Zaitlin D, Naidu RA, SA Lommel. Nicotiana

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