PRINCIPIOS BSICOS EN INMUHEMATOLOGA

ELIZABETH RODRIGUEZ H Docente Banco de Sangre UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA 2012

INMUNOHEMATOLOGA

Corresponde al captulo de la Hematologa que estudia y se ocupa de los procesos inmunes relacionados con las clulas sanguneas Estos procesos estn producidos por anticuerpos (Acs) que reaccionan con antgenos (Ags) presentes en la membrana de las clulas sanguneas Los anticuerpos son inmunoglobulinas: Las de tipo IgG e IgM son las ms habituales Los antgenos son estructuras de la membrana (protenas, glcidos, lpidos o combinaciones de ellos) con capacidad inmunognica: capaces de desencadenar una respuesta inmune.

INMUNOHEMATOLOGA

Los Ags y los Acs son los grandes protagonistas de IH y de los estudios inmunohematolgicos realizados para el diagnstico de los procesos inmunes de la sangre basados en la evidencia de la reaccin Ag-Ac

INMUNOHEMATOLOGA- ANTGENOS

La parte del Ag que reacciona con el Ac es el determinante antignico o eptopo Cada Ag esta constitudo por un nmero variable de eptopos

INMUNOHEMATOLGA -ANTGENOS
UBICACIN EN LAS CLULAS SANGUNEAS

Hemates: Antgenos eritrocitarios Plaquetas: Antgenos plaquetarios Granulocitos: Antgenos granulocitarios AGRUPACIN Y CLASIFICACION ANTIGENOS ERITROCITARIOS (ISBT)

Grupos Sanguneos: serie (001-023) Total 23 Antgenos de Alta Incidencia : serie 900 . Total Aprox 12 Antgenos de Baja incidencia: serie 700. Total Aprox 36 Colecciones: serie 200. Total Aprox 5

HEMOAGLUTINACION- ANTICUERPOS

Los anticuerpos son protenas plasmticas que se producen en respuesta a un antgeno Al realizar un protenograma se observa aparecen varias bandas, con 2 grandes fracciones correspondientes a la albmina y a la globulinas ( 1,a2,B1,B2 y ) Los anticuerpos se sitan en la regin , y por su relacin con la inmunidad se denominan Inmunoglobulinas (Ig)

IMPORTANCIA CLNICA DE LOS ANTICUERPOS

Los anticuerpos ms en transfusin e IH son los de clase IgG ,e IgM y excepcionalmente IgA. Los anticuerpos IgG son incompletos porque no son capaces de aglutinar espontneamente a los hemates. Los anticuerpos de clase IgM son completos o aglutinantes porque son capaces de aglutinar espontneamente a los hemates

CLASIFICACIN DE LOS ANTICUERPOS SEGN SU ORIGEN

NATURALES: Aparecen sin estimulacin detectable, la mayora son IgM o mezclas de IgG + IgM: Regulares: aparecen siempre que se carece del antgeno correspondiente (ABO). Irregulares: No siempre aparecen cuando se carece del antgeno (P, Le, E .). INMUNES: Se detectan despus de un estmulo antignico ( transfusin, embarazo) son casi siempre de tipo IgG . Tambin son Acs irregulares

CLASIFICACIN DE LOS ANTICUERPOS SEGN EL ANTGENO CONTRA EL QUE VAN DIRIGIDOS

ALOANTICUERPO: Dirigido contra un antgeno extrao de la misma especie, no presente en la persona que lo produce. - Los anticuerpos dirigidos contra los ags eritrocitarios Ej: anti Rh (D) en un individuo Rh (D) negativo. AUTOANTICUERPO: dirigidos contra un Ag propio - Responsables de los procesos autoinmunes

REGLA BSICA EN EL DIAGNSTICO INMUNOHEMATOLGICO

La deteccin de un aloanticuerpo en el suero de un paciente exige, siempre que sea factible, la confirmacin la ausencia del correspondiente Ag.

-Por ej: Un receptor de sangre portador de un anticuerpo anti- Kell debe ser de fenotipo Kell (-) Pruebas: 1 se investigar la presencia del anticuerpo en el suero: Suero problema +hemates conocidos Kell(+) y Kell(-) 2 se comprobar la ausencia del Ag Kell en el receptor: Anticuerpos conocido (anti Kell) + hemates del receptor

TCNICAS SEROLGICAS AGLUTINACIN

Corresponde al agrupado de hemates que se forma cuando las molculas de acs se unen a los determinantes antignicos Ag(s) de mltiples clulas adyacentes, Algunas molculas son capaces de unirse a los Ag(s) y de interaccionar con otras molculas induciendo a la aglutinacin final Ig (M) Otras molculas solo se unen a su antgeno pero no son capaces de hacerlo con sus vecinas por consiguiente no producen la aglutinacin Ig(G).

TECNICAS SEROLGICAS: AGLUTINACIN

La aglutinacin es un proceso qumico reversible que se produce en dos fases: Fase de sensibilizacin : unin del Ac con el Ag. Fase de Aglutinacin: Formacin de puentes entre las clulas sensibilizadas hasta construir la red que conducen a la aglutinacin. Son muchos los factores que inciden en estas dos fases y que podemos manipular, para aumentar, o disminuir la aglutinacin

FACTORES QUE AFECTAN LA SENSIBILIZACIN

Temperatura pH. Tiempo de incubacin. Tipo de Anticuerpo: clase de Ig Proporcin Ag-Ac Constante afinidad del Anticuerpo

FACTORES QUE AFECTAN LA SENSIBILIZACIN

1-Temperatura:
-Los anticuerpos Ig G reaccionan en forma ptima a 37C (calientes). -Los anticuerpos Ig M Reaccionan en forma ptima a 4C o a TA.(fros)

-Ig M: aglutinante en solucin salina. -Ig G: no aglutina , habr que potenciar la aglutinacin.

4- Tipo de Anticuerpo:

2-pH:
-El pH ptimo de la reaccin est entre 6,9 y 7.2

5- Proporcin de Antgenos y Anticuerpos.

3-Tiempo de Incubacin:
- El estado de equilibrio de la reaccin sin potenciadores esta entre 15-60 minutos
-

Tiene que haber una proporcin entre el nmero de molculas de Acs y el de determinantes antignicos.

6- Constante de Afinidad del Anticuerpo

A mayor afinidad del anticuerpo mayor velocidad de asociacin y ms lenta la disociacin

FACTORES QUE AFECTAN A LA FASE DE AGLUTINACIN

1- Intensidad Inica del Medio (Potencial Z)

- El Potencial Z es la diferencia del potencial entre el hemates cargado negativamente y la nube de cargas positivas del medio - Es el responsable de la fuerza de repulsin de los hemates 2- El tipo de Ac. - Los IgM siempre aglutinan - Los IgG ocasionalmente (Segn localizacin del eptopo del Ag)

POTENCIADORES DE LA REACCION Ag-AC

SOLUCIONES DE BAJA FUERZA INICA (LISS) - Aceleran la fase de sensibilizacin al disminuir la carga negativa. - Suelen requerir de una sustancia no inica para eviatar la hemlisis (Glicina). ALBMINA - Reduce la repulsin entre las clulas (Potencial Z), favoreciendo la aglutinacin - Hace posible que anticuercos IgG sean capaces de unir hemates adyacentes ENZIMAS -Bromelina, tripsina, papana, ficina, pronasa y neuromidasa - Reducen la carga negativa, hacen aglutinantes Ac de tipo IgG - Mejoran el acceso a los determinantes antignicos MOLECULAS CARGADAS POSITIVAMENTE - Son Polmeros que aportan un exceso de carga positiva: Polybrene, Sulfato de protamuina,,poli-L-lisina,que pueden producir una aglutinacin espontanea. - Pueden producir falsos positivos PEG -Es un polmero soluble que potencia la reaccin Ag.Ac, eliminando el agua que hay alrededor de los hemates. - til para la deteccin de Ac de tipo IgG

TEST DE ANTIGLOBULINA HUMANA TEST DE COOMBS

En 1945 Coombs y Mourant y Race disearon una tcnica Para poner en evidencia los Ac que no eran capaces de aglutinar directamente a los hemates (IgG). 1- La base esta en utilizar un suero anti-Inmunoglobulina o anti Complemento (suero antiglobulina) que acta como un puente de enlace entre los Ac fijados. 2- Originalmente se empleo para demostrar anticuerpos Rh(D) incompletos o no aglutinantes (IgG) en el suero. 3- Posteriormente ,para detectar la sensibilizacin in vivo por anticuerpos o factores de complemento (autoanticuerpos) en pacientes que padecen de anemias hemolticas inmunes

Cmo se obtiene la Antiglobulina?

TEST DE ANTIGLOBULINA PRUEBA DIRECTA-PAD

TEST DE ANTIGLOBULINA TEST INDIRECTO -PAI

Indicaciones: -Deteccin e Identificacin de Acs -Pruebas de Compatibilidad-Pretransfusional -Tipificacin de Ags eritrocitarios que no son visualizados por aglutinacin directa

Sensibilizacin : reaccin Ag-Ac

EL suero de antiglobulina se une al fragmento Fc de los Acs IgG

El suero antiglobulina acta como puente entre los Acs IgG favoreciendo la aglutinacin

Aglutinacin final

Mtodos para observar la aglutinacin

LA TCNICA EN TUBO: Es la tcnica estndar.

- Ventajas: Se pueden aadir aditivos .Permite la manipulacin. La hemlisis es visible - Desventajas; La aglutinacin es inestable .Requiere experiencia en la manipulacin y lectura cuidadosa

MICROPLACA

Mtodo .Porta-objetos

Mtodos para observar la aglutinacin

Aglutinacin en columna /Tarjeta. la columna contiene gel, microesferas. Utiliza aditivos de tipo Liss, para potenciar la reaccin Ag-Ac y reduce el tiempo de incubacin La reaccin es semipermanente, puede evaluarse horas, das despus.

VENTAJAS: Entrenamiento mnimo y poca manipulacin, Se requiere pocos reactivos DESVENTAJAS : Se requiere equipamento Muy sensible

LECTURA EN MICROCOLUMNA GEL

4 + 3 + 2 + 1 +

DP

SISTEMA ABO FUNDAMENTOS BIOQUIIMICOS, MOLECULARES Y GENETICOS DE LOS ANTIGENOS

Experimento de Landsteiner
+

=
Resultado 1 Aglutinacin Resultado 2

Persona 1 Persona 2

+
22 personas (incluyendo la suya y de sus colaboradores) Separ el suero y los glbulos rojos de la sangre total.

Mezcl cada suero con los diferentes glbulos rojos y tabulaba los resultados.

SISTEMA ABO (001 ISBT) El sistema ABO es el ms importante de los sistemas de grupos sanguneos, es un sistema tisular de histocompatibilidad. Sus antgenos estn presentes en todas las clulas del organismo, lquidos biolgicos como el plasma sanguneo, la saliva y el lquido pericrdico, en la forma de glicoprotenas solubles.

GENERALIDADES

Los Ag H son las molculas precursoras a partir de las cuales se sintetizan los Ag A y B. Los Ag ABO se encuentran en molculas de carbohidratos relacionadas. Los antgenos resultan de la accin de glucosiltrasferasas especficas que agregan glcidos en forma secuencial en puntos de cadenas cortas de carbohidratos (oligosacridos).

GENERALIDADES
Los productos primarios son enzimas llamadasGlicosiltransferasas, Las glicosiltransferasas ABO transportan los azcares ABO y los insertan en las cadenas glucdicas de glicoprotenas y glicolpidos que ya contengan el antgeno H como substrato para las enzimas. los antgenos ABO son productos secundarios de los alelos ABO. Los antgenos ABO son representados por puntos de polimorfismo en cadenas complejas de glcidos ubicados en glicoprotenas membranarias y solubles ,principalmente, en glicolpidos membranarios

GENERALIDADES

El gen ABO se extiende por 18 kb (quilobases) de DNA genmico en el cromosoma 9 (9q34), presentando en su estructura 7 exones. Cambios de bases de nucletidos en los exones 6 y 7 crean una diversidad de alelos ABO, que a su vez, producen glicosiltransferasas con diferentes especificidades y capacidades variables de transporte del azcar especfico.

los fenotipos comunes ABO (A1, A2, B, A1B, A2B y O) producidos por los alelos comunes correspondientes (A1, A2, B y O) los fenotipos denominados raros (A3, Aend, Ax, Am, Ay, Ael, B3, Bx, Bm, Bel, B(A) y cis-AB) producidos por los alelos raros correspondientes (A3, Aend, Ax, Am, Ay, Ael, B3, Bx, Bm, Bel, B(A) y cis-AB).

GENES QUE CONTROLAN LA APARICIN Y UBICACIN DE LOS AGS A Y B.

Hh
Ligado al cromosoma 19

ABO
Se localizan en el locus ABO del cromosoma 9

Se
Ligado al cromosoma 19

Gen H produce una glucosiltrasnferasa que acta a nivel celular para formar los Ags sobre los que se construyen los Ags. A y B.

Genes A y B codifican las glucosiltrasnferasas que producen los Ags A y B.

Gen O no codifica ninguna enzima funcional.

Gen Se es el responsable directo de la expresin del Ag. H e indirecto de los Ags. A y B en las glucoprotenas de las secreciones epiteliales.

ANTGENOS

Sustancia precursora L-FUCOSA

Antigeno H

Antigeno A

Antigeno B

D-GALACTOSA N-ACETILGALACTOSAMINA

N-ACETILGLUCOSAMINA

GEN H

L-FUCOSIL-TRANSFERASA GA L

GalNAc

GA L

GlcNAc

FUC N-Acetilgalactosaminil transferasa

ANTGENO A

SISTEMA ABO. UCMC 2010

GEN H

L-FUCOSIL-TRANSFERASA GA L

Gal

GA L

GlcNAc

FUC D-Galactosil transferasa

ANTGENO B

DIFERENCIAS DE ACTIVIDAD A,B,H SEGN LA EDAD

En eritrocitos de lactantes predominan los oligosacridos lineales con un solo extremo para la fijacin de los glcidos H y mas tarde los A y/o B En adultos abundan oligosacridos ramificados proporcionando cadenas oligosacridas adicionales para la conversin a Ag H y luego a A y B
Glcido inmunodominante A
Glcido inmunodominante B Cadenas de oligosacaridos en cadenas ramificadas y lineales respectivamente

ANTIGENOS Y ANTICUERPOS SISTEMA ABO

Grupo Subgrup Antgenos en Anticuerpos en el o los G,rojos suero
O H* Anti-A Anti- A1 Anti -B Anti -A,B Anti-B Anti-A Anti-A1 Ninguno

A B AB

A1 A2 A1B A2B

A+A1 A B A+A1+B A+B

* Las clulas O tienen gran cantidad de Ag H , y las A1B la menor concentracin, inseparable su reaccin, del 1-8% de los individuos A2 poseen Anti-A1 y del 22-35% de los individuos A2B Anti- HI ocasionalmente lo poseen individuos A1 y A1B

CARACTERSTICAS DE LOS ANTICUERPOS

SISTEMA ABO. UCMC 2010

SINTESIS DE ANTICUERPOS
La sntesis de anticuerpos aumenta conforme avanza la edad, y en las etapas tardas de la vida, declina. Las personas de edad avanzada poseen concentraciones de anti - A y anti - B ms bajas que los adultos jvenes

MOMENTO DE APARICIN
los anticuerpos Anti-A y Anti-B se detectan en el suero despus de los primeros meses de vida. En ocasiones algunos lactantes los producen desde el momento del nacimiento, pero la mayor parte de los presentes en sangre de cordn es de origen materno.

CARACTERSTICAS
Los sueros de algunas personas hemolizan los eritrocitos ABO incompatibles a temperaturas inferiores a 37oC. Cuando el sobrenadante del suero es rosado o rojo o el sedimento celular es escaso o nulo, cabe pensar en hemlisis por anticuerpos ABO. La hemlisis debe interpretarse como resultado positivo.

CARACTERSTICAS
ACS ABO
Las dos clases de inmunoglobulinas aglutinan los glbulos rojos en forma preferencial a temperatura ambiente (20-24oC) o menos y activan el complemento a 37oC Su capacidad ltica se manifiesta cuando las pruebas incluyen una fase de incubacin a 37oC.

SISTEMA ABO. UCMC 2010

REACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTI-A Y ANTI-B

Inmunoglobulinas Anti- A Inmunoglobulinas Anti- B Inmunoglobulinas Anti- A y Anti-B Predominante en individuos del grupo B Predominante en individuos del grupo A

Son IgM

- IgG

Inmunoglobulinas Anti-A, B

Predominante en individuos del grupo O

Son IgG

PRINCIPALES GRUPOS Y SUBGRUPOS ABO

DETERMINACIN FENOTIPO ABO

El fenotipo ABO de un individuo se determina comnmente por las reacciones de aglutinacin de sus glbulos rojos con los antisueros Anti-A, Anti-B y Anti-AB. Al probar muestras de sangre de adultos, se puede obtener la confirmacin del grupo sanguneo ABO por la reaccin del suero del individuo con las suspensiones de glbulos rojos testigo A y B (contraprueba).

MTODOS TIPIFICACIN ABO

PORTAOBJETOS MICROPLACAS TUBOS GEL

MICROCOLUMNA
ADSORCIN-ELUCIN.** * TCNICAS ESPECIALES**

PRUEBAS PARA LA TIPIFICACION ABO

DIRECTAS O ERITROCITARIAS Utilizan Acs anti-A y anti-B para determinar la presencia o ausencia de Ag.

El antusuero anti-A,B es opcional .

Siempre se debe incluir el control control salino para validar la prueba SEROLOGICAS

Emplean GR A1 y B como reactivos para detectar anti-A y anti-B en el suero. Los GR A2 y O son opcionales

* Es indispensable la realizacin y correlacin de las dos pruebas para la Interpretacin del grupo sanguneo ABO.

DETERMINACION FENOTIPO ABO

FENOTIP O
GENOTIP O (S) POSIBLES

PRUEBA DIRECTA
anti-A antiB AntiA,B
CONTR SALIN O

PRUEBA INVERSA
GRA 1 GRA2 GRB GR O

O A B

O/O
A/A A/O B/B B/O

0 4+ 0

0 0 4+

0 4+ 4+

0 0 0

4+ 0 4+

4+ 0 4+

4+ 4+ 0

0 0 0

AB
Oh

A/B
h/h 0

4+

4+
0

4+
0

0
0

0
4+

0
4+

0
4+

0
4+

SUBGRUPOS DEL SISTEMA ABO

Fenotipos que difieren en la concentracin de Ag en los GR y la saliva de los secretores.
Los Subgrupos del A son ms comunes que los del B y AB.

Producto de glucotransferasas menos efectivas.

Los dos principales subgrupos del A: A1 y A2

SISTEMA ABO. UCMC

La Clasificacin de los Subgrupos A dbiles

A A1 A,B H

Aglutinacin de los GR Con anti-A y Lectina anti-A1.

Aglutinacin de los GR Con anti-A, B.

Aglutinacin de los GR Con lLectina anti-H.

Presencia o ausencia de Anti-A1 en el suero.

La presencia de sustancias A y H en la saliva de los Secretores.

SUBGRUPOS DEL SISTEMA ABO

Fenotipos que difieren en la concentracin de Ag en los GR y la saliva de los secretores.
Los Subgrupos del A son ms comunes que los del B y AB.

Producto de glucotransferasas menos efectivas.

Los dos principales subgrupos del A: A1 y A2

C .

Prueba que utiliza lectina obtenida

de las semillas de Dolichos biflorus.

anti-A1 ,o extrada de la Habichuela

Reacciona como anti-A1. Aglutina el 80% de los eritrocitos A y AB, el 20 % restante de los A y AB no son aglutinados

A2 A2B

Menor nmero de puntos antignicos A eritrocitarios. Incremento del antgeno H.

El suero del 1-8% de los individuos A2 y el 22-35% de los A2B posee anticuerpos antiA1, se presentan como alo anticuerpos.

Los anti-A1 reaccionan a temperaturas inferiores a 37 C.. Los que son activos a 37C, revisten de importancia clnica.

SISTEMA ABO. UCMC 2010

IMPORTANCIA EN MEDICINA TRANSFUSIONAL

Aint

A3

Ax

Am

Ael

Rx menos con Los anti-A1. Mas con los Anti-H que los A2.

No en presencia De anti-A de Personas del grupo B. Si con anti-A, B De las del grupo O.

No aglutinacin Con anti-A o Anti-B de Ningn origen.

Cuantificacin De Los anti-A1

Tcnica de Absorcin y Elucion

SISTEMA ABO. UCMC

SUBGRUPOS B
Los estudios de diferenciacin son similares a los empleados en el grupo A. . B . B3 : contiene sustancia B la saliva Bx : aglutinacin dbil, saliva sustancia B que inhibe actividad anti-B Bm

Molecular basis associated with variant B transferases3 (ABO*B101 taken as the reference allele sequence) Phenotype Nucleotide change Amino acid change

B3 1054CT Arg352Trp Bx 871GA Asp291Asn Bel 641TG Met214Arg Bel 669GT Glu223Asp Bw 873CG Asp291Glu Bw 721CT Arg241Trp Bw 548AG Asp183Gly Bw 539GA Arg180His Bw 1036AG Lys346Glu Bw 1055GA Arg352Gln Bw 863TG Met288Arg Silent mutations are not noted. For more alleles and details, see http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/ index.htm.

# sitios Antignicos x106 por G rojo

A sites 0.83 A1 adults 0.811.17 A1 adults 0.85 newborn 0.250.37 A2 adults 0.240.29 A2 adults 0.24 newborn 0.14 A1B adults 0.460.85 newborn 0.22 A2B adults 0.14 B sites B adults 0.75 newborn 0.20.32 A1B adults 0.43 H sites O adults 1.7 newborn 0.325 A, B, AB newborn 0.07

COMPATIBILIDAD TRANSFUSIONAL

ORDEN DE SELECCIN DE GRUPO TRANSFUSIN DE G. ROJOS

GRUPO ABO RECEPTOR COMPONENTE DE GRUPO ABO
1 Eleccin 2 E leccin 3 Eleccin 4 Eleccin

AB A B O

AB A B O

A O O

ORDEN DE SELECCIN DE GRUPO TRANSFUSIN DE PLASMA

GRUPO ABO RECEPTOR COMPONENTE DE GRUPO ABO
1 Eleccin 2 E leccin 3 Eleccin 4 Eleccin

AB A B O

AB A B O

(A) AB AB A

(B) (B) (A) B

(O) (0) (0) AB

(Los grupos sanguneos en parntesis representan elecciones con plasma incompatible en el orden de menos incompatible)

COMPATIBILIDAD ABO EN TRANS FUSIN DE PLAQUETAS

La superficie de las plaquetas exhibe antgenos ABO: Recuperacin de Plaquetas A en un receptor O es meno, dado que aunque no reviste un significado clnico importante, la transfusin de plasma ABO incompatible presente en los componentes plaquetarios tambin podra reducir el recuento plaquetario postransfusional La hemlisis no es frecuente pero a menudo la PAD resulta positiva , implicando ms costos de investigacin serolgica Estudios retrospectivos muestran que la sobrevida de los transplantes hermatopoyticos, fue reducida en pacientes que recibieron transfusiones de plasma incompatibles

COMPATIBILIDAD ABO EN TRANS FUSIN DE PLAQUETAS

ES PRUDENTE EMPLEAR PLAQUETAS ABO COMPATIBLES, EN PACIENTES QUE REQUIEREN DE MLTIPLES TRANSFUSIONES, SIN EMBARGO LAS TRANSFUSIONES DE URGENCIA NO DEBEN POSTERGADAS POR NO TENER UNIDADES ABO COMPATIBLE EN LACTANTES SE ACONSEJA EVITAR LA TRANSFUSIN DE PLASMA INCOMPATIBLE CON SUS GLBUOS ROJOS SI NO SE DISPONE UNIDADES ABO COMPATIBLES SE PUEDE UTILIZAR MTODO DE REDUCCIN DE PLASMA

COMPATIBILIDAD Rh EN PLAQUETAS

LOS ANTGENOS D NO SON DETECTABLES EN PLAQUETAS LA SOBREVIDADES DE PLAQUETAS D POSITIVAS EN RECEPTORES D NEGATIVAS ES NORMAL LAS PLAQUETAS CONTIENEN PEQUEAS CANTIDADES DE G ROJOS Y LOS INDIVIDUOS Rh NEGATIVOS PODRAN ALOINMUNIZARCE LA TRANSFUSIONES DE UNIDADES DE PLAQUETAS Rh POSITIVAS DEBEN EVITARSE EN MUJERES D NEGATIVAS EN EDAD DE CONCEBIR Y CABE LA POSIBILDAD DE LA ADMINISTRACIN DE IG Rh