Universidad Politcnica de Tlaxcala

Calidad del producto Biotecnolgico

Profesor: Amado Israel Grandes Blanco
TEMA: MTODO BRADFORD Integrantes:
Elizabeth Maldonado Lima Valeria Gracia Osorio GRUPO: 3ro B
Ing. En Biotecnologa 9/agosto/2012

 Son

macromolculas formadas por residuos de aminocidos. Pueden tener distintas funciones:

Defensa Trasporte Reserva Enzimas Movimiento Estructurales Regulacin

Es importante contar con una tcnica que permita determinar la cantidad presente en una muestra biolgica (orina, sangre, plasma, extracto vegetales, semillas, clulas, tejidos, etc.).

Purificacin de protenas. Actividad Enzimtica. Diagnostico de enfermedades

Mtodos de Absorcin: Propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV. Mtodos Derivados Fluorimtricos: Formacin de derivados qumicos. Mtodos Colorimtricos La capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

 Fue diseado por Bradford en 1976. Tcnica sensible, simple (1-15 g), rpida (la reaccin finaliza a los 5 min. y es estable hasta una 1 hr.), barata y pocas sustancias interfieren en su determinacin.

Consiste en la medicin de la extincin provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante.

Colorante Coomassie brilliant blue G-250 (tambin Serva Blue)

En solucin cida

Azul Forman un complejo protenacolorante

rojo Se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.

Este compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos.

Colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a 595 nm.

La determinacin del contenido proteico de una muestra requiere la comparacin del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de protenas.

Realizar una curva de calibracin Se requiere contar con un solucin testigo de protena de concentracin conocida (generalmente se utiliza albmina srica bovina o inmunoglobulina G).

Se preparan por lo menos 4 tubos testigos con distintas cantidades de protenas.

Luego se agrega la misma cantidad del reactivo de Bradford a cada tubo

Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm)

0.7

y = 5.2361x + 0.0102 2 R = 0.998

0.6

y = Abs 595
0.5

m = pendiente x= la concentracin de protenas b = ordenada al origen

0.4
Abs (595 nm)

0.3

0.2

0.1

0 0 -0.1 Albmina (mg)

Abs promedio )Lineal (Abs promedio

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

Se preparan diluciones con la solucin de NaCl 0.15 M: 1:10,1:20,1:50 Se toman 200 ul de cada una de las diluciones y se les agrega 2 ml de reactivo de coomassie. Se mide la absorbancia 595 nm , y los datos se interpolan en la ecuacin de la recta y=mx +b

En aplicaciones muy especificas el mtodo de Bradford es muy til para la determinacin de protenas tal es el caso, que Bradford (1976) menciona que valores fuera de un rango establecido no son confiables para la cuantificacin de protena en tejidos y fluidos. De esto nos pudimos dar cuenta en artculos como Adaptacin de mtodos en microplacas para identificar mecanismos de resistencia en Tetranychus urticae Koch en donde podemos darnos cuanta que al analizar profundamente el caso y estudiarlo se concluyen que las oxidasas, y las y esterasas estudiadas aportaron mayor presencia dentro de la poblacin de campo, por lo que estas enzimas son las responsables de la resistencia a acaricidas de la poblacin de T. urticae Koch en estudio.

Ya que se realizan comparaciones en la absorbancia para saber el factor que est determinando las condiciones para que los rangos tengan variacin significante o no. La diferencia de lecturas (T10T0) se us para el anlisis de los resultados. Pero para que se pueda llevar a cabo todo esto es importante establecer patrones, en este caso tomar en cuenta a otras protenas como base para comparacin en las futuras lecturas de absorbancia una de las protenas ms utilizada puede ser la albmina srica bovina (ASB)
REFERENCIA: Agrociencia vol.44 no.6 Mxico Ago./sept. 2010 versin impresa ISSN 1405-3195. Biotecnologa. Adaptacin de mtodos en microplacas para identificar mecanismos de resistencia en Tetranychus urticae Koch Ernesto Cerna, Yisa Ochoa, Mohammad Badii, Jernimo Landeros. http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S140531952010000600002&script=sci_arttext