Enzimas de restriccin.

Son

endonucleasas.

Pueden cortar ADN ya sea nuclear o de organelos. Mas usado es el del cloroplasto, ya que tiene pocos rearreglos, es pequeo y tiene poca mutaciones puntuales.

Tcnica.

Aislar AND (tcnica CTAB)

Purificar ADN
(Ultracentrifugacin en gradientes de Cloruro Celsio y Bromuro de Etidio)

Corta
(enzimas de restriccin)

membrana se hibridiza a ADN (nuclear o cloroplasto) Marcado radiactivamente

Replica de una cadena monocartenaria a una membrana de nylon o nitrocelulosa.

Separacin de fragmentos
(electroforesis en gel)

Se autorradiografa

Se leen los fragmentos.

Mtodo de CTAB.

Se utiliza para la extraccin de ADN.

El protocolo del mtodo (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980.

El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad.

Se utiliza El Bromuro de hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de cetiltrimetilamonio es una sal de amonio cuaternario, con actividad detergente. Se le conoce tambin por las siglas CTAB..

Principios del mtodo del CTAB:

..lisis .. extraccin ..purificacin

Lisis.
Las

clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol.

Lisis de la membrana celular:

Rotura de la membrana celular y nuclear , Para lo cual la muestra

homogeneizada se trata primero con el tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB.

La figura ilustra cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente captura los lpidos y las protenas al entrar en contacto la membrana celular y el tampn de extraccin con CTAB.

Con una concentracin salina (NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daa el ADN).

Extraccin

En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa.

En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo.

Precipitacin
En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente.

Para lo cual la solucin acuosa

Se trata primero con una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl >0,8 M).

En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan.

Purificacin por ultra centrifugacin en gradientes de cloruro de celsio y bromuro de etidio.

ADN puro.

Se corta con enzimas de restriccin.

electroforesis

Los fragmentos se mapean, lo que tambin permite identificar y localizar los rearreglos en la secuencia y las variaciones de longitud.

Se autorradiografia.

autorradiografia

Aplicaciones
ADN

ribosomal: se ha utilizado para comparar la divergencia entre especies cultivadas y sus posibles progenitores. ADN cloroplasto: para detectar ancestros de plantas cultivadas , para detectar especies evolutivas entre especies de una seccin.

Secuencias
Las

secuencias analizan todas las unidades basicas de informacin de un organismo. Para ser filogeneticamente informativa la secuencia debe ser ortologa.

ortloga.(secuencias divergentes de un mismo gen)

Cuatro etapas:
Identificar la secuencia que tenga la variacion necesaria.
Aislar y purificar un numero elevado de la secuencia(amplificacin,

clonacin o transcripcin).

Alinear la secuencia. Secuenciar.

 Tcnicas.

Qumica Enzimtica Automtica

En los artculos que dio la miss vienen ms a detalle

La qumica:
Consiste

en dividir el ADN en cuatro muestras y tratarlas con agentes qumicos que rompen el ADN especficamente en cada base, bajo condiciones en las que solo unos pocos nucletidos del fragmentos se afectan .los fragmentos se marcan con radioactividad y se autodiagrafian.

DIMETIL SULFATO (GUANINAS)

ACIDO FORMICO (ADENINA GUANINA)

HIDRAZINA (TIMINA Y CITOSINA)

NaCl (citosina)

electroforesis

autoradiografi an

 ENZIMATICA.

Automatica:
Utiliza la reaccion de sanger pero con fluorecencia en vez de radioactividad se detecta por medio de un laser. La secuencia se pasa directamente a la computadora o al papel sin necesidad de ller los geles.

APLICACIONES.

GENES DE CLOROPLASTO: rbcL se ha utilizado para determinar los linajes de subfamilias, para determinar las relaciones entre familias cercanas.