CITOGNETICA Y MUTAGNESIS

LPEZ GARCA LAURA ALINE GALO ABAD

MENDEZ MATIAS

Antecedentes

La tcnica fue desarrollada en 1969 por Gall y Pardue e independientemente por Jonh y colaboradores en el mismo ao.

Hibridando rRNA con rDNA extracromosomal en ovocitos de Xenopus laevis, detectando una localizacin diferencial en la clula, de los hbridos en diferentes estados.

Marcadores radioactivos y autorradiografas

Tritio, = 12.8 aos, mnima fraccin de tomos degradados, periodos de exposicin de 4 a 8 semanas. Los electrones, se desplazaban en un radio de 1m

Desnaturalizacin e incremento del rendimiento con el uso de RNA sintetizado in vitro.

Secuencias fcilmente purificadas y aisladas por mtodos bioqumicos.

Harper en 1981 detect en cromosomas metafsicos el gen de la insulina por autorradiografa. En 1985 Coghlan sintetiz oligonucletidos marcados radioactivamente para deteccin.

Tcnica no radiactiva, al igual que el uso de marcadores enzimticos. Presenta marcaje de tipo directo e indirecto. Consiste en la desnaturalizacin de un fragmento clonado de DNA etiquetado con una marca fluorescente y su hibridacin con ADN desnaturalizado en cromosomas metafsicos o interfsicos.

Mayor velocidad, resolucin y confiabilidad. Permite una pre-hibridacin, para bloquear la extensa fraccin de secuencias repetitivas del genoma. Reduce el nivel de ruido. Altamente especficos, ya que puede ser combinado con PCR para amplificar las secuencias de pegado y aumentar la deteccin de la seal.

Marcaje directo

Una molcula reportera se enlaza directamente al cido nuclico.

Esto puede ser visualizado en el microscpio inmediatamente despus de la reaccin de hibridacin. Subsista a las condiciones de lavado. Lo ms importante, es que la molcula reportera no interfiera con la hibridacin.

El marcaje con un fluorocromo en pruebas de RNA desarrollada por Bauman en 1980 y 1984, sigue este criterio.

Marcaje indirecto

Requiere una marca que contenga la molcula reportera, introducida qumica o enzimticamente, que pueda ser detectada por afinidad citoqumica.

La molcula reportera debe estar accesible a los anticuerpos que la detecten.

Se han descrito un sin nmero de modificaciones a haptenos (Langer et al., 1981) y uno de los sistemas ms populares es el sistema DIG (digoxigenina).

Marcaje con digoxigenina (DIG)

Esteroide aislado de las plantas Digitalis purpurea y Digitalis lanata. nica fuente natural de digoxigenina.

Se enlaza en la posicin C5 de la uridina mediante un brazo que contiene 11 tomos de carbono. Pueden ser detectadas con una alta especificidad por anticuerpos anti-digoxigenina (Anti-DIG) que son conjugados a fosfatasa alcalina, peroxidasa, fluorescena, rodamina u oro coloidal.

Resultados reproductivos anormales

Cada ao en EU:

2 millones de embarazos se pierden antes de la 20 semana de gestacin.

7% de recin nacidos presentan bajo peso al nacimiento.

5% de bebes nacen con algn defecto de nacimiento.

Cerca del 50% de abortos espontneos y una sustancial fraccin de defectos morfolgicos y de desarrollo al nacimiento, son asociados con las anormalidades cromosmicas de novo. 3

 Trisomas autosmicas, predominantemente maternas Aneuploidas cromosmicas sexuales, tienen una sustancial contribucin paterna.

Factores de riesgo

Quimioterapia Fisiologa anormal reproductiva Factores de predisposicin gentica

Exposiciones ambientales/ocupacionales
Estilo de vida

La tcnica de mltiple M-FISH o hibridacin in situ con fluorescencia de todos los cromosomas se utiliza en el mundo desde hace 5 aos y ha causado revuelo por la introduccin de colores en la citogentica tradicionalmente gris. 1956,Tjio y Levan, preparacin metafasica de cromosomas humanos, cultivo de fibroblastos de pulmn de un mortinato. M-FISH se diferencian en el anlisis que utilizan para las marcaciones combinatoriales y la exposicin secuencial a travs de filtros especficos para los diversos fluorocromos (tinciones fluorescentes), se revela como una estrategia complementaria, til y bonita (cientfica y literalmente), coadyuvante al diagnstico citogentico de anomalas complejas, de tanta trascendencia en muchas oportunidades (Castillo, 2002).

Se necesitan slo cinco fluorocromos (con capacidad combinatorial de 31) para distinguir los 24 cromosomas Por hibridacin de juegos de sondas de ADN cromosoma-especficas, cada uno es marcado diferencialmente y se le atribuye luego un color falso que lo identifica.

Los procesos automatizados de anlisis corrigen la imagen geomtrica, calculan el delineamiento de cada cromosoma con una tincin general de ADN con DAPI (4 -6-diamidino-2-phenilindole), calculan y sustraen el trasfondo de cada fluorocromo considerando un valor umbral. Visualizan el material que hibrida con cada sonda cromosmica haciendo posible la asignacin individual, crean una imagen compuesta de valores grises que codifica a cada cromosoma y presentan los resultados finales con la asignacin de un pseudocolor a cada uno de estos valores grises, permitiendo asimismo un pronto resultado (Castillo, 2002).

Este es una prueba en la cual se utilizan sondas de hibridacin de cidos nucleicos las cuales son especificas para identificar ciertos segmentos de DNA. Estas sondas estn marcados con colorantes fluorescentes. Esta tcnica de hibridacin in situ fluorescente se denomina a si debido a que el DNA de los cromosomas en metafase fijados en los porta objetos es desnaturalizado all mismo, para exponer las dos cadenas de DNA, lo que permite que una sonda marcada se hibride con el DNA cromosmico. Se utilizan distintas sondas para marcar varias regiones de los cromosomas o distintos cromosomas con distintas sondas. (Nussbaum, 2008).

La sonda hibridada emite fluorescencia cuando los cromosomas so visualizados con una luz cuya longitud de onda estimula el colorante fluorescente. Una de las sondas mas utilizadas son los fragmentos de DNA procedentes de una localizacin especifica de un cromosoma. Estas sondas dan paso a el marcaje del sitio en cada cromosoma homologo correspondiente a la localizacin normal de la secuencia que constituye la sonda (Nussbaum, 2008).

Este es una prueba para al observacin e investigacin de los mecanismos de segregacin meiotica de los cromosomas. Con esta tcnica se pueden observar anormalidades cromosmicas tanto estructurales como numricas, dentro de las anormalidades que se pueden detectar con las diferentes tipos de FISH mutile se encuentran: 1.- Deleciones y duplicaciones parciales cromosmicas. 2.- Aneuploidias y diploidias. 3.- Rupturas cromosmicas. 4.- Translocaciones reciprocas. 5.- Rearreglos cromosomicos.

Es un mtodo especifico de FISH que es utilizado en espermatozoides para pruebas para las regiones centromericas y telomericas del cromosoma 1p adems para una prueba centromerica para el cromosoma 8

Con esta prueba es posible detectar espermas que llevan duplicacin terminal y deleciones en el cromosoma 1p, aneuploidias involucrada s en el cromosoma 1 y 8, y espermas diploides.

Inicialmente la verificacin se basaba sobre deteccin de segregacin meiotica producida por una translocacin reciproca, demostrando una fuerte correlacin entre las frecuencias de espermas que llevan anormalidades cromosmicas estructurales identificadas por FISH vs las frecuencias de metafases anormales.

Este nuevo mtodo de FISH es tambin substancial para la evaluacin de frecuencias basales de espermas anormales en el semen de donadores sanos quienes han sido previamente evaluados por la prueba Hamster-egg.

Esta tcnica fue modificada estratgicamente para la deteccin espermas que llevan duplicaciones terminales y delecines en cromosoma 1 usando el cromosoma 16 como una referencia cromosmica.

Muestras de donadores sanos previamente analizados con la prueba Hamster-egg. Preparacin de las laminillas. Tomar una alcuota d e 7 L colocando los en una laminilla (frotis) dejando secar al aire. Las laminillas fueron preparadas en incubacin durante 30 min en 10 mM de DTT, en una solucin de Tris. HCl 0.1 M, seguido de 30 min en 4mM diodosalicilato de litio en una solucin de Tris- HCl 0.1M, a temperatura del cuarto. Secado al aire.

Hibridacin fluorescente in situ. Mezclado y desnaturalizado de las sondas en formaldehido 55%, 2XCC (NaCl 0.3 M, Citrato de Na 0.003 M, pH 7). 10% de sulfato de dextran a 78C durante 6 min y colocados despus en hielo. Deshidratacin en 70%, 85% y 100% de etanol. La pos-hibridacin fue realizada mediante lavados a 45C con formaldehido al 60%, 2XCC y 10 en buffer PN ( NaH2PO4 0.1M, NaHPO4, pH 8, 0.1% de Nonidet P-40). Antes de la deteccin de fluorescencia fueron pre-imcubadas las laminillas durante 10 min en buffer PMN para minimizar el blackground.

Bibliografa.
Nussbaum R. 2008. Genetica en medicina. Elsevier Masson, Septima edicion. Barcelona. Espaa. Castillo S et. Al. Application of the cytogenetic techniques multiple Fish and multiple Band. Report of five cases. Rev. md. Chile v.130 n.5 Santiago mayo 2002. Laboratorio Clnica Alemana, Seccin Citogentica, Clnica Alemana, Santiago, Chile. GALL, J.G., Pardue, M.L.1969. Formation ande detection of RNA-DNA hybrid molecule in cytological preparations. Proc. Natl. Acad Sci. USA 63, 378-383. Graham T. 2007. Male mediated developmental toxicity. The royal society of chemestry. Cambridge. UK.

JONH, H., M, M. Birnstiel, K. Jones. 1969. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 223, 582-587. KADKOL, S.S., W. R. Gage, G.R. Pasternack. 1999. Molecular Diagnosis Vol. 4 No. 3169-182