Mara Espino Hernndez, Lic., MSc.

Escuela Latinoamericana de Medicina

E-mail: mespino@elacm.sld.cu

Determinacin de la susceptibilidad in vitro

Importante funcin del Laboratorio de Microbiologa Clnica

Monitorear niveles de resistencia Instauracin de polticas teraputicas

Era postAntibiotica?

Muy pocos frmacos dirigidos al tratamiento de bacterias multirresistentes

Pseudomonas aeruginosa
Enterobacterias productoras de BLEE

Estafilococos meticilino resistentes

 El desarrollo de nuevas drogas puede durar varios aos. Se necesita preservar la utilidad de los antimicrobianos disponibles a travs de un uso ptimo y acertado. Las combinaciones de antimicrobianos son comnmente utilizadas en la prctica clnica

No obstante, el riesgo de provocar un efecto contrario al deseado, incrementar la toxicidad y los costos del tratamiento, no es poco frecuente.

Actividad Combinada de Antimicrobianos

Objetivo: Lograr un efecto teraputico ms rpido e incrementado Tcnica del Tablero Tcnica de Curva de Muerte Mtodos de Difusin E-test

 GENERAL
Contribuir al conocimiento de la etiologa y susceptibilidad de los agentes causales de la sepsis neonatal y a la aplicacin adecuada del tratamiento antimicrobiano.

ESPECFICOS
Caracterizar el comportamiento y la etiologa de la sepsis neonatal durante el periodo de estudio. Describir el comportamiento antimicrobianos utilizados. de la resistencia bacteriana a los

Identificar los patrones de resistencia de las cepas aisladas a los -lactmicos y aminoglucsidos.

 Evaluar los resultados del sinergismo in vitro e in vivo, entre las

combinaciones de -lactmicos y aminoglucsidos aplicadas como tratamiento a los pacientes, tomando en cuenta el patrn de susceptibilidad de las cepas.

Evaluar la eficacia del tablero de damas como procedimiento para orientar el tratamiento antimicrobiano combinado.

Tipo de estudio
Investigacin analtica prospectiva y estudio retrospectivo longitudinal de
tendencias.

Marco de la investigacin
Hospital Docente Ginecobsttrico Amrica Arias, Enero 1993 - diciembre 2000.

Universo
534 pacientes con sepsis y 1 457 cepas aisladas de hemocultivo.

Muestra
163 pacientes (seleccin por expertos) y 533 aislamientos bacterianos.

Algoritmo clnico-microbiolgico para evaluar la eficacia del tratamiento antimicrobiano combinado

PACIENTE CON RECIEN NACIDO SIGNOS CLNICOS DE SEPSIS SEPTICO

APLICAR TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO SEGN PROGRAMA DE POLTICA

Aislamiento e identificacin

HEMOCULTIVO 1ra. Resiembra 16-20 horas incubacin

Prueba de susceptibilidad y Sinergismo

REEVALUACIN DE LA TERAPUTICA 48-72 horas

SUSCEPTIBILIDAD Y SINERGISMO ANTIMICROBIANO

(NCCLS, 1993; CLSI, 2006)
35oC 24 h. CMI (g/mL)

0,125-128
0,5 McFarland, Dil.1:31 0,5 McFarland, Dil.1:31 35oC, 24 h. Sinergismo 0,06-64 g/mL Clculo de CFI. Microdilucin en CMH-CA,

Antimicrobianos: Amikacina Ampicilina Azlocilina Cefazolina Cefotaxima Ceftriaxona Gentamicina Kanamicina Oxacilina Penicilina G Vancomicina

Multirresistencia (CDC, 2006): - Estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a vancomicina - Enterobacterias resistentes a todos los -lactmicos o todos los aminoglucsidos. - BNF resistentes a penicilinas de amplio espectro.

Tablero de Damas (Checkerboard)

ndice de Concentracin Fraccionaria Inhibitoria (CFI) (Berenbaum, 1978)
CFI = CMI A1/A2 + CMI A1 solo CMI A2 solo CMI A2/A1

Antibitico 1 (A1) (g/mL)

Antibitico 2 (A2) (g/mL)

Criterios de interpretacin (Berenbaum, 1978; Eliopoulos, 1989) - Sinergismo (S): CFI 0,5 - Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 < CFI < 1 - Indiferencia o adicin (I): 1 CFI < 2 - Antagonismo (A): CFI 2

Figura 1. Agentes causales de sepsis neonatal. Hospital Amrica Arias, 1993-2000. Total: 533 aislamientos.
P. mirabilis C. freundii EBH (c) (Grupo B, presuntivo) Klebsiella spp. Enterococcus spp. E. coli Enterobacter spp. BNF (b) S. aureus ECN (a) 0 10 20 30 40 %
Leyenda: (a): Estafilococo coagulasa negativa; (b): Bacilos gramnegativos no fermentadores; (c): Estreptococo -hemoltico

0,6 0,8 1,3 1,7 2,6 4,3 9 13,5 20,5 45,8 50

- (Shimabuku et al., 2004; Schrag y Schuchat, 2005; Alonso et al., 2005; Hrtel et al., 2008)

Resistencia bacteriana. Hospital Amrica Arias, 1993-2000

Tendencia: Incrementos significativos: -lactmicos (p 0,001) y
amikacina (p 0,05)

Patrones de resistencia principales (grampositivos):

-lactmicos:
SARM (33,9%) ECNRM (64,8%)

Aminoglucsidos:
K-G: (51,4 y 48,7%) K-G-AK: (27,0 y 25,3%)

- Enterococcus faecium (VanA) vancomicina-teicoplanina resistente (CMI128 g/mL) - Cuatro aislamientos ECNRM-vancomicina resistente (CMI128 g/mL)

Patrones de resistencia principales (gramnegativos):

Enterobacterias:
-lactmicos:
AM-AZ (32,2%)
AM-AZ-KZ-CTX-CRO (33,3%)

Aminoglucsidos :
K-G: (20,7%) K-G-AK: (28,7%)

BNF: -lactmicos:
AM-KZ-CTX-CRO (31,9%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (40,3%)

Aminoglucsidos :
K-G: (23,6%) K-G-AK: (29,2%)

Hospital Docente Ginecobsttrico Amrica Arias.Enero 1993-diciembre 2000.

Combinaciones ensayadas y pacientes evaluados: 163 Penicilina G/kanamicina Penicilina G/gentamicina Penicilina G/amikacina Azlocilina/amikacina Cefazolina/amikacina Cefotaxima/amikacina Ceftriaxona/amikacina Meticilina/gentamicina Meticilina/amikacina Meticilina/kanamicina

Resultados in vitro de la interaccin entre los frmacos probados

Sinrgicas: 56 Parcialmente sinrgicas: 25 Indiferentes: 71 Antagnicas: 10

Resultados del sinergismo in vitro.

Tabla 1. Valores de Concentracin fraccionaria inhibitoria y Concentracin mnima inhibitoria en las combinaciones ensayadas Disminucin de CMI (g/mL) Interaccin ndice CFI 0,276 0,664 1,097 2
(Media geomtrica)

-lactmico 1/8 1/2 0 0

Aminoglucsido 1/32 1/4 1/128 0

Sinrgico Sinrgico parcial Indiferente Antagnico

Tabla 2. Relacin entre el sinergismo in vitro y la eficacia clnica del tratamiento Eficacia clnica del tratamiento (b) Interaccin in vitro (a) Sinrgico

Eficaz
51

No eficaz
5

Total
56

Sinrgico parcial Indiferente

Antagnico Total

18 52
0 121

7 20
10 42

25 72
10 163

p (a-b)0,001 (3 gl); 2 = 37,32

Tabla 3. Relacin entre el sinergismo in vitro y la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinacin ensayada

Patrn de susceptibilidad de la cepa a los frmacos combinados (b) Interaccin in vitro (a) Sensible a uno de los dos Sinrgico Sinrgico parcial Indiferente Antagnico Total
p (a-b)=0,014 (3 gl); 2 = 10,59

Resistente a los dos 25 14 37 10 86

Total 56 25 72 10 163

31 11 35 0 77

Patrones de 34 cepas bacterianas multirresistentes con las que se obtuvo sinergismo in vitro

6%

3%

P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G
15%

P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G-AK P-OX-KZ-CTX-CRO-K P-OX-KZ-CTX-CRO

46%

15%

AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AK AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G
15%

Leyenda: P= penicilina; OX= oxacilina; KZ= cefazolina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; K= kanamicina; G= gentamicina; AK= amikacina; AM= ampicilina; AZ= azlocilina.

Tabla 4. Patrones de resistencia de 10 cepas con las que se obtuvo antagonismo in vitro
No 1 2 Patrn AM-K-G AM-AZ-K Agente Causal Enterobacter E. coli Total 1 1

3
4 5 6 7 8

AM-AZ- K-G
AM-AZ-KZ-K AM-AZ-KZ-K-G-AK AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AK

BNF
E. coli Enterobacter Enterobacter ECN BNF

1
1 1 1 2 2

Leyenda: AM= ampicilina; K= kanamicina; G= gentamicina; AZ= azlocilina; KZ= cefazolina; AK= amikacina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; P= penicilina; OX= oxacilina

Tabla 5. Relacin entre la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinacin probada y la eficacia clnica del tratamiento Eficacia clnica del tratamiento (b) Eficaz 62 59 121 No eficaz 15 27 42 Total 77 86 163

Susceptibilidad de la cepa a los frmacos combinados (a)

Sensible a uno de los dos Resistente a los dos Total

P (a-b)=0,119 (1 gl); 2 = 2,42

Tabla 6. Eficacia del Tablero de Damas como procedimiento diagnstico.

Verdaderos positivos (VP)= 37; Falsos positivos= 70; Verdaderos negativos (VN)= 51; Falsos negativos (FN)= 5
Parmetro Sensibilidad Especificidad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo Razn de verosimilitud positiva Razn de verosimilitud negativa Valor (%) 88,10 42,15 34,58 91,07 1,52 0,28 IC (95%) 86,85 89,35 41,68 42,62 34,06 35,10 90,13 92,01 1,52 0,28

Mtodo: Tablero de Damas

Sensibilidad: 88,10%

Valor Predictivo Negativo: 91,07%

Paciente con sepsis grave por microorganismo multirresistente

PRUEBA DE SCREENING VALIOSA

 El panorama epidemiolgico de la sepsis neonatal se mantuvo estable durante el periodo analizado con una mayor incidencia de estafilococos en la sepsis precoz y la tarda. La resistencia global a los antimicrobianos fue elevada, y se increment significativamente para cefalosporinas, gentamicina, amikacina y para oxacilina en cocos grampositivos. Se encontr una amplia variedad de patrones de resistencia para -lactmicos en bacterias gramnegativas y fueron frecuentes los patrones kanamicina-gentamicina y kanamicina-gentamicina-amikacina en todas las cepas. Las combinaciones de frmacos sinrgicas in vitro mostraron una elevada probabilidad de eficacia para el tratamiento, con independencia del patrn de susceptibilidad de la cepa y de si sta fue o no resistente a los dos antibiticos combinados.

 La probabilidad de obtener eficacia clnica con la fusin de antimicrobianos con sinergismo parcial in vitro, fue la misma que se obtuvo con las combinaciones cuyo resultado fue indiferente y todos los resultados antagnicos in vitro se correspondieron con falla clnica del tratamiento in vivo, corroborando as, que el criterio asumido en este estudio fue adecuado. El mtodo del tablero de damas fue un buen procedimiento diagnstico para predecir los tratamientos ineficaces y para advertir la probabilidad de una teraputica eficaz cuando la prueba fue sinrgica.

Tablero de Damas y Microdilucin. Especificaciones Tcnicas y Algoritmo de Trabajo para su aplicacin en la prctica Clnico-Microbiolgica
(Metodologa para evaluar combinaciones de frmacos in vitro y su eficacia en el paciente) Autor: Prof. Mara Espino Hernndez

Asesores: Prof. Jorge L. Zuazo Silva

Dra. Isabel Martnez Mota Escuela Latinoamericana de Medicina, 2008

Partes componentes: TABLA DE CONTENIDO RESUMEN INTRODUCCIN ANTECEDENTES y OBJETIVOS SECCIONES (1 a la 5) BIBLIOGRAFA ANEXOS (Tablas, esquemas y Figuras)

SECCIONES
1 2 3
Seleccin y preparacin de los antimicrobianos

Mtodos
Procedimientos para el control de la calidad

Comentarios a los procedimientos de microdilucin y el tablero de damas

Algoritmo de trabajo microbiolgico