Projektowanie i realizacja preparatyki (odbiaczanie, demineralizacja, barwienie, usuwanie szpiku i tkanki tuszczowej)

Histotechnologia
Histotechnologia jest jednym z dwch krokw, ktre s niezbdne do pracy klinicznej bada koci i chrzstki. Laboratorium badawcze tkanki koci ma unikalne cechy, takie jak bardziej wymagajca fiksacja, stanowica proces odwapnienia, infiltracji mediw i osadzania, potrzeba wytrzymaych mikrotomw, okrgego diamentu lub piy do cicia tkanek i szlifierki do przerzedzania i szlifowania.Istnienie metalowych implantw lub innych powoduje dalsz zoono tego procesu. Dodatkowo do procedury ocen mikroskopijnych elementw komrkowuch i cech strukturalnych, histomorphometria jest wyjtkowym aspektem koci i histologii chrzstki. Laboratorium prowadzce eksperymenty koci i chrzstki powinno mie zarwno podstawowy i specjalistyczny sprzt. Histotechnologa i histomorfometria wymagaj cierpliwoci i wykwalifikowanych rk, jak rwnie podstawowej wiedzy anatomiczna na poziomie organw, tkanek, komrek, a nawet czsteczek. Okres prbny i cige ksztacenie s niezbdne dla utrzymania odpowiedniej znajomoci tkanek biologicznych, podstawowych i szczegowych technik histologicznych, zaznajomieniem si z kwestiami bezpieczestwa laboratoryjnego oraz niezbdna jest praktyka laboratoryjna.

Procedury barwienia / podstawowe i specjalne metody barwienia

Dostpnych jest wiele metod barwienia. Hematoksylin i eozyn (H&E) barwienie jest podstawow i najczstsz procedur dla wikszoci tkanek. Moe by ono uywane do odwapniania oraz undecalcified specimens. Zarwno barwnik Goldners trichrome oraz von Kossa pozwalaj rozrni osteoid od zmineralizowanej macierzy kostnej, pomimo e von Kossa dostarcza mao informacji. Inne czsto stosowane barwniki to: toluidyn niebieski, bkit metylenowy. Natomiast Safranina O, Alcian niebieski oraz acid-Schiff s najczciej uywane do oceny chrzstki statowej. Goldners lub Massons trichrome s przydatne do barwienia chrzstki koci zatopionej w parafinie.

H&E czy pojedycze barwienie

Hematoksylina Cole- jedyna metoda barwienia ktra zostaa uyta w autorskim laboratorium do barwienia czci naziemnych koci oraz koci zawierajcej implanty. Obszary koci s barwione na niebieskofioletowo. Przestrzenie w szpiku kostnym nie s barwione. Podobne wyniki mona uzyska stosujc toluidyn niebieski, jeden kolor barwnika ktry jest atwy w uyciu. Jeli zastosujemy eosine w tym samym punkcie z hematoksylin to przestrzenie w szpiku kostnym zostan zabarwione na czerwono. W rezultacie mamy zmniejszony kontrast midzy koci, tkank mikk oraz przestrzeni w szpiku. Nie jest to problem jeli dokonujemy rcznej oceny, ale moe stworzy duy bd jeli obszary koci s zdigitalizowane automatycznie za pomoc programu komputerowego.

Barwienie Goldners Masson Trichrome

Barwnik ten moe by z powodzeniem stosowany w kociach osadzonych w metakrylanie metylu, metakrylanie glikolu oraz Spurrs resin.

Barwienie Istotne(Vital) ?
Istotne znakowanie fluorescencyjne moe by stosowane w celu okrelenia ywotnoci chondrocytw w chrzstce. Skanowanie laserem pod mikroskopem stosuje si do okrelenia ywotnoci komrek i dystrybucji komrek w obrbie chrzstki tkanki. Sposb okrelenia rozkadu ywych komrek w oparciu o zasad, e komrki rni si w zalenoci od zdolnoci wyczenia okrelonych barwnikw. Uszkodzone bony komrkowe, martwe lub obumierajce s penetrowane przez propidium jodku lub etydyny homodimer,i ich jdra bd fluoryzowa na czerwono. ywe komrki z nienaruszon bon i aktywn cytoplasm bd fluoryzowa na zielono.

Demineralizacja (odwapnianie)
Demineralizacja koci jest to usuwanie jonw wapnia z koci przez proces histotechnologiczny, tym samym czynic ko elastyczna i atwa dla patologicznego ledztwa. Proces powolnego odwapniania tkanki kostnej potrafi nie dawa adnych dolegliwoci. Czsto pierwszym objawem zaawansowania procesu jest zamanie towarzyszce banalnemu upadkowi. Jest to niezbdny proces w celu uzyskania mikkiej czci koci za pomoc mikrotomu. Jony wapnia znalezione w koci s odpowiedzialne za jego sztywn postaw, osoby cierpice na choroby takie jak osteomalacja i krzywica, maj niezwykle mae iloci jonw wapnia w kociach. Demineralizacja jest czasochonna, kawaki koci musz pozosta w odwapniaczu przez kilka dni lub nawet tygodni, w zalenoci od wielkoci koci.

Proces odwapniania
Cienkie wycinki tkanki kostnej naley zaraz po wyjciu z ustroju utrwali w mieszaninie formaliny i edta (etylodwuaminoczterooctanu zwanego popularnie wersenianem sodowym). Przygotowuje si w tym celu 10/o wodny roztwr wersenianu sodowego i miesza si go z formalin w stosunku 1 : 1. W roztworze tym trzymamy tkank kostn a do chwili jej odwapnienia (sprawdza twardo koci cienk ig). Po odwapnieniu przenie tkank kostn ze rodowiska odwapniajcego bezporednio do alkoholu (5070%) bez uprzedniego pukania w wodzie. Wersenian sodowy (edta) nie zmienia stenia jonw wodorowych w rodowisku. Odwapnia on w ten sposb, e wytwarza jony ca2+ nie powodujc ich oddzielenia od tkanki w tak gwatowny sposb, jak to robi wszystkie kwasy. Pozwala to na dobre zachowanie struktur organicznych tkanki kostnej oraz nie upoledza jej barwliwoci. W edta mona te przechowywa kawaki koci do due i przez dugi czas (do 14 dni) bez obawy uszkodzenia.