INTRODUCCIN A LA BIOTECNOLOGA Miguel Zarzar Maza Ingeniero Civil Bioqumico

Solubilizacin de un sulfuro u xido insoluble

mediante la accin de microorganismos. Tecnologa simple y con bajos requerimientos de costos de capital. Otros trminos:
Lixiviacin bacteriana Lixiviacin microbiana Biooxidacin Biohidrometalurgia Biominera

A.C (poca de los Romanos): Accin bacteriana natural en Minas de Cobre

1950-1980: Utilizacin de biolixiviacin en botaderos (relaves, ripios) y minerales de baja ley (< 0,5% Cu)

1947-1953: Demostracin de la participacin de microorganismos en el proceso de disolucin del metal (Aislamiento de especies de Thiobacillus)

1980-1981: Puesta en marcha de la mina Lo Aguirre de Minera Pudahuel con una planta piloto de Biolixiviacin; y patentamiento del proceso de lixiviacin TL de Pudahuel

Fenmenos de Transporte

Fenmeno Biolgico

Fenmeno genmico

BIOPROCESOS

BIOLOGA MOLECULAR

 Conocimiento de los microorganismos lixiviantes y su

comportamiento.
Estudio de las condiciones de operacin que favorecen

la accin microbiana.

MATERIA PRIMA

PROCESO:
Pretratamiento Transformacin Recuperacin

PRODUCTO

BIOPROCESO: Agentes de transformacin son clulas

 Littrofos

Auttrofos (hetertrofos?)
Acidfilos

Grupo Primario: ferrooxidantes (auttrofos CO2)

Grupo Secundario: sulfooxidantes (auttrofos) Grupo Terciario: acidofilos heterotrofos (C orgnico)
Ferrooxidantes Ferroreductores Sulfooxidantes

Microorganismo

Fe oxidantes
Leptospirillum ferroxidans L. ferriphilum L. thermoferroxidans Ferrimicrobium acidiphilum Ferroplasma acidiphilum S oxidantes Acidithiobacillus thioxidans At. caldus Metallosphaera spp. Sulfulobus spp. Fe y S oxidantes At. Ferroxidans Acidianus spp. Sulfulobus metallicus Mesfilo Termfilo extremo Termfilo extremo Mesfilo Termfilo moderado Termfilo extremo Termfilo extremo Mesfilo Mesfilo/termotolerante Termfilo moderado Mesfilo Mesfilo

Microorganismo Fe reductores Acidiphilum spp. Fe oxidantes/reductores Acidimicrobium ferrooxidans Fe oxidantes/reductores y S oxidantes Sulfobacillus spp. Mesfilos y termfilos moderados Termfilo moderado Mesfilo

 Procesos basados en irrigacin:

Lixiviacin en botaderos Lixiviacin en pilas Minera in situ

Procesos en estanques agitados

Pila de mineral

Extraccin por solvente (SX)

Electroobtencin (EW) COBRE

H2SO4 Nutrientes

mineral concentrate

water & nutrients

liquid pH adjustment & disposal

make-up tank

primary aeration tanks

secondary aeration tanks

settling tank solids to cyanidation & gold recovery

Operaciones comerciales en estanques de biolixiviacin: (a) reactor Sao Bento BIOX, Brazil; (b) Planta Tamboraque BIOX, Peru; (c) Planta Laizhou Mintek-BacTech, China; (d) Planta Sansu BIOX, Ghana (from Rawlings et al., Trends in Biotechnology 21 (2003)

FeS 2 3,5O2 Fe 2SO 2 H

El oxgeno no es un buen oxidante de pirita en

2 4

comparacin al in frrico:
2 FeS2 14 Fe3 8 H 2O 15Fe2 2 SO4 16 H

Regeneracin del in frrico:

14 Fe 2 3,5O2 14 H 14 Fe 3 7 H 2O

Fe2+

FeS2

Microbio

Fe3+

 Sulfuros metlicos insolubles en cido (FeS2, MoS2

and WS2)
Slo se disuelven va oxidacin del in frrico

Sulfuros metlicos hidrolizables por cido (ZnS, NiS,

CuS and Cu2S, et al.)

Son susceptibles al ataque de protones

Tambin son susceptibles a la oxidacin por in frrico

SOM Fe2+ + S2O32SO42-

FeS2

FeOM

Fe3+

After Schippers and Sand, Appl. Environ. Microbiol. 1999

Zn2+ + Sn2-

S8

ZnS

SOM

H+

SO42-

After Schippers and Sand, Appl. Environ. Microbiol. 1999

 Se consideraba que ocurra mediante un mecanismo

directo o indirecto (Silverman, M.P., 1967, J. Bacteriology)

En el mecanismo directo, los microbios catalizaran la

disolucin del sulfuro por una reaccin enzimtica e implicara su unin al mineral.
El mecanismo indirecto ocurrira va in frrico

mediante microbios adheridos y plantnicos.

 Ahora se acepta que el in frrico solamente es el

oxidante de los sulfuros metlicos.

Por lo tanto, los trminos mecanismos directo e

indirecto deberan ser reemplazados por mecanismos con contacto y sin contacto.

Clulas Adheridas (Lixiviacin con contacto)

Clulas Remotas (Lixiviacin sin contacto)

Fe2+

Fe3+

FeS2
Fe3+ Fe2+

S2O32-

SO42-, H+

N P Mg Ca K

Crecimiento celular:
Fe2+ S red.

Fe3+ H+ C L U L A Informacin gentica Clulas Producto

Calor

Energa Nutrientes CO2

O2

Condiciones adecuadas de pH y temperatura

 Variables de operacin que afectan el comportamiento

de los microorganismos lixiviantes:

Mineral Condiciones nutricionales Condiciones ambientales

Cambios operacionales de mayor impacto en la

biolixiviacin:
Tipo de mineral Modalidad de operacin Aireacin Monitoreo

 Oxidados (lixiviacin cida) y Sulfurados

(pirometalurgia)
Sulfuros primarios
Calcopirita (CuFeS2) Enargita (Cu3AsS4)

Sulfuros secundarios
Calcosina (Cu2S) Covelina (CuS) Bornita (Cu5FeS4)

 Influye en la velocidad del proceso y en los costos

asociados a molienda Tamaos:

Percolacin: 13 a 200 mm Reactores agitados: 100 m

Aglomerado Mayor permeabilidad Mayor homogeneidad

DEMANDA > <

OFERTA

lCO2+mNH3+p(Fe2++H+)+nO2 CdHeOfNg+pFe3++tH2O

CO2+0.17NH3+71.4(Fe2++H+)+16.7O2 CH2.16O0.46N0.17+71.4Fe3++34.9H2O En la ecuacin: O2/CO2 = 16.7 En el aire: O2/CO2 = 700

YCEL/O2 = 0.06
YCEL/CO2 = 1

 Clulas Cu2+ Fe2+, Fe3+ pH, Eh, acidez

Al3+, SO42 Metales pesados

 Cuantificacin de microorganismos Control de disponibilidad de O2 y CO2 Control de pH Control de temperatura

Aumentar la biomasa por kilo de mineral

Microorganismos ms resistentes a inhibiciones

Mayor desafo a futuro:

Lograr un proceso rentable para la biolixiviacin de CALCOPIRITA

 Bioidentificacin y Control del Proceso

(biomonitoreo) de Microorganismos: Quines, cuntos, que hacen?

Seleccin de Microorganismos eficientes y control de

su crecimiento de acuerdo al diseo del proceso

Optimizacin del crecimiento de los microorganismos

adecuados

Bio-Identificacin
Estado del Arte Cuntos MO? Quienes? Cun activos?

Tcnicas Microbiolgicas: Recuento ptico Tcnicas Moleculares: Basadas en extraccin de DNA Tcnica Respiromtrica: Consumo de O2 Tcnica de viabilidad por fluorescencia

Comunidad Compleja de Microorganismos

Tecnologas de Biomonitoreo
Tecnologas para identificacin y monitoreo de Microorganismos Biomineros

Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Real Time qPCR

Microscopic Microbial Counting Biomining Screen (BMS). Microarray

Viability determination Oxygen Consumption Measurement

MTODOS DE ANLISIS MOLECULAR qPCR

Correlaciona la cantidad de ADN y por tanto de microorganismos, con una seal fluorescente que se puede monitorear en el tiempo (en tiempo real mientras se amplifica el fragmento de DNA)

Aumento de Fluorescencia

Cintica de amplificacin de distintas muestras

Xn = X0(1 + E)n

Ciclo de PCR = ADN caracterstico de A. ferrooxidans = dilucin 1/10 de ADN caracterstico de A. ferrooxidans = dilucin 1/100 de ADN caracterstico de A. ferrooxidans = dilucin 1/1000 de ADN caracterstico de A. ferrooxidans

Se correlaciona con cantidad de microorganismos inicial en la muestra problema

MTODOS DE ANLISIS MOLECULAR

DGGE

Group II

Acidithiobacillus spp. AF339743 Acidithiobacillus spp. AF359940

At. caldus Z29975 At. caldus AF137369 At. caldus AB023405 Acidithiobacillus DSM612 AJ459802 T1

Group I

Group III Acidithiobacillus spp. AF023264 Thermithiobacillus tepidarius spp. AF023264

At. ferrooxidans AF465607 Tinto 3 Acidithiobacillus spp. AF407402 Acidithiobacillus spp. At. ferrooxidans AJ457808 AF376020 At. ferrooxidans At. ferrooxidans X75268 AJ278719 At. ferrooxidans AF465604

Leptospirillum ferrooxidans X86776

0.10

MTODOS DE ANLISIS MOLECULAR Bio Mine Screen (BMS) diseo bioinformtico

A B C D E F G H I

1 HPYL-D ATSP-5 BRL1-10 RUS ECOL-F FESP-10 LESP-1 SBSP-1 THAC-3

2 Empty ATSP-9 BRL1-5 BRL1-2 ECOL-G FESP-7 LEP2-1 SLSP-7 THAC-2

3 4 ACSP-1 APSP-1 ATSP-2 ATSP-4 BRL1-13 BRL1-8 RUS 90% BR36-3 ECOL-H EUKA-1 FESP-5 FESP-11 LEP3-5 LEP3-4 SLSP-1 SLSP-8 THAC-8 THAC-1

5 ANFE-1 ATTO-1 BRL1-6 BR36-4 FESP-1 HPYL-2 LEP3-3 SLSP-3 THAC-6

6 ATSP-1 FNBC-4 BRL1-4 BR36-1 FESP-3 HPYL-3 LEP3-1 SLSP-10 THAC-4

7 ATSP-7 FNBC-1 BRL1-7 BR36-2 FESP-2 PWFE-1 LEP3-2 SLSP-2 THAC-7

8 ATSP-3 FNBC-3 BRL1-12 BR36-6 FESP-4 PWFE-2 MESP-1 SLSP-5 THAC-5

9 ATSP-8 FNBC-5 BRL1-9 BR36-5 FESP-6 PWFE-3 PSEU-1 SLSP-9 TPSP-1

10 ATSP-10 FNBC-2 BRL1-11 DSLV-D FESP-8 LESP-2 RAND-1 SLSP-4 HPYL-D

11 ATSP-6 FNBC-6 BRL1-14 ECOL-E FESP-9 LESP-3 STEN-1 SLSP-6 Empty

Acidithiobacillus
A. ferrooxidans BRL001 BRL036 Thermoplasma acidophilum Ferroplasma sp. Leptospirillum sp. Sulfolobus sp.

MTODOS DE ANLISIS MOLECULAR BioMine Screening BMS

Basado en la tecnologa de Microarray de DNA. Cada punto representa un organismo y en algunos casos representa una funcionalidad relevante para la biolixiviacin
1 A B C D E F 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Resultado:

A B C D

3 especies distintas

E F

DAPI-stained cells

Cells hybridized with LEP636 probe (Cy3-labeled) specific for L. ferrooxidans

Basado en el consumo de oxgeno registrado en muestras slidas y lquidas indicativo de presencia de organismos aerobios y oxidantes de hierro y/o azufre.
Tecnologa basada en deteccin de luminiscencia que cambia en presencia de oxgeno disuelto o en fase gaseosa Flexible con el n de muestras a analizar (depende del nmero de minisensores ) Muy simple y robusta, permite su uso en operacin

Muestreo

Aislamiento

Cepas puras

Objetivo:
Desarrollo de conocimiento sobre funcin y regulacin de vas metablicas relevantes relacionadas con biolixiviacin. Deteccin de genes u operones (grupo de genes regulados en forma conjunta) posibles blancos de manipulacin.

Propiedad Confidencial de BioSigma S.A.

Electroporator

Transformants (GMO) Bioleaching Culture

d CPlasmid for transformation

Transformacin por Electroporacin

Gene X = Target gene

pBM3 gene X

Cloning X gene and strain Transformation Protein X activity Gene X expression

pBM3 gene X

GMO Genetic Modified Organism with target gene expression stable at pH 4,5 or higher
Propiedad Confidencial de BioSigma S.A.

Substrate (minerals)
S2O32-

Extra cellular Metabolites (EPS)

DNA

Gene

mRNA

Protein

Metabolite

Signal Molecule

Genome
Genome Sequencing

Transcriptome Microarray Analysis

Proteome 2D gels

Metabolome

CE-MS

Key genes and proteins In bioleaching Metabolism

Entendimiento del mecanismo biolgico de la biolixiviacin

Actividad: Slo un 10% conmparado con condic ideales

1) Identificacin de genes claves en la biolixiviacin de calcopirita. 2) Identificacin de metabolitos clave para mejorar las condiciones de operacin y lograr la actividad ptima de los microoraganismos involucrados en la lixiviacin en pilas

Bio-Identificacin

Aislamiento

Mejoramiento Gentico
*
Biolixiviacin de minerales

Produccin de Biomasa

Monitoreo de Microorganismos quienes, cuntos y cun activos?

Amenability tests

Diseo e ingeniera de planta

Pila piloto y prototipo