Mtodos de cultura

Desde a dcada de 50, os mtodos clssicos de cultura utilizados no laboratrio so manuais. Utilizam meios de cultura slidos e incubao em estufas bacteriolgicas convencionais. A leitura das colnias de micobactrias feita a olho nu e, em vista disso, o tempo de deteco de positividade da cultura varia de 14 a 28 dias at 8 semanas. As formas disseminadas e rapidamente progressivas de tuberculose e de outras micobacterioses, encontradas com frequncia em pacientes com Aids, exigiram um diagnstico mais rpido. A partir de 1980, os mtodos de cultura tiveram avanos tecnolgicos com o desenvolvimento dos sistemas comerciais. Esses sistemas utilizam um mtodo de processamento e semeadura de amostras muito similar aos mtodos clssicos, de maneira que no diminui o trabalho prvio. Assim o que acelera a leitura, pois a incubao monitorada por sistema informatizado que acusa quando h crescimento celular e, portanto, o tempo de deteco da positividade menor que o exigido para os clssicos. A cultura em meio lquido utilizando sistemas automatizados no radiomtricos e com monitorao contnua so os recomendados para laboratrios que recebem um grande volume de amostras clnicas, como hospitais e Laboratrios de Referncia.

A opo do laboratrio pela utilizao de um sistema comercial automatizado de cultura deve levar em considerao vrios aspectos como:

Oramento regular e contnuo para cobrir as prioridades da cultura. Eficincia com que se comercializam os insumos necessrios. Treinamento dos tcnicos no equipamento. Rapidez com que se processam as amostras aps a coleta. Assistncia tcnica. Custo/complexidade/risco biolgico.

Etapas da cultura
O exame de cultura abrange 5 etapas:
(1) pr-tratamento das amostras clnicas: prepara as amostras, de acordo com suas caractersticas, para as demais etapas metodolgicas; (2) fluidificao-descontaminao: utiliza agentes qumicos para homogeneizar a amostra clnica e eliminar outros microrganismos da mesma; (3) semeadura em meio de cultura: proporciona o contato das micobactrias existentes na amostra com as substncias nutritivas; (4) incubao: fornece a temperatura correta e constante, necessria para a multiplicao das micobactrias; (5) leitura dos tubos semeados e registro dos resultados: verifica a presena de colnias ou de turvao e/ou de contaminao, como sinal de presena de micobactrias e registra a ocorrncia.

Pr-tratamento das amostras

Essa etapa inclui o preparo das amostras clnicas quanto necessidade de centrifugao e/ou macerao, de acordo com as suas caractersticas. As amostras consideradas contaminadas so aquelas provenientes de stios no estreis, tais como escarro, urina, secrees, lavado brnquico, lavado gstrico e fragmento de tecido cutneo. As amostras consideradas no contaminadas so aquelas provenientes de stios estreis, tais como LCR, lquidos (pleural, sinovial, peritonial, pericrdico), fragmentos de rgos, sangue e medula ssea. Para estas, no necessrio descontaminar. No entanto, para garantir que a cultura no seja perdida por contaminao, caso as amostras no tenham sido acondicionadas em condies estreis, recomendvel, aps os procedimentos de pr-tratamento, semear metade da amostra diretamente nos meios de cultura e descontaminar a outra metade conforme o mtodo escolhido.

Procedimentos de pr-tratamento de amostras clnicas para cultura de micobactrias

Agentes fluidificantes descontaminantes

Os agentes qumicos (cidos, bases) liberam as micobactrias do muco e da fibrina (fluidificando o escarro) ou dos tecidos em que esto includos, homogeneizando a amostra clnica e eliminando outros microrganismos da mesma (Quadro 2). A eliminao destes proporciona o crescimento das micobactrias sem a competio pelos nutrientes contidos nos meios de cultura. Portanto, essa etapa realizada apenas nas amostras contaminadas por microbiota associada ou ambiental. A escolha do agente fluidificante descontaminante e do meio de cultura est relacionada com o tipo de amostra clnica a ser processada. Para as amostras de escarro, a concentrao do Hidrxido de sdio pode estar em concentraes de at 4%, e para as outras amostras pulmonares e extrapulmonares a concentrao no deve ser superior a 2%.

Quadro 2 : Agentes fluidificantes-descontaminantes usados no tratamento de amostras clnicas para cultura de micobactrias

Meios de cultura
As micobactrias so exigentes para sua multiplicao em meios de cultura e requerem meios especficos. Os meios de cultura podem ser de consistncia slida base de ovos ou de agar e de consistncia lquida. Os meios lquidos so mais enriquecidos que os slidos e por isso so indicados para amostras paucibacilares, como sangue, LCR e macerados de tecidos. Tambm so utilizados para subcultivos e armazenamento de cepas em freezer. Os sistemas comerciais de cultura utilizam meios lquidos especiais, desenvolvidos a partir do Middlebrook 7H9.

MEIOS SLIDOS
LOWENSTEIN-JENSEN

Composio: ovos coagulados, verde malaquita, sais, glicerol, farinha de batata Inoculao: 0,5 a 1,0 ml do material clnico Incubao: 37C em estufa com 5% a 10% de CO2, na ausncia de luz, com exceo de amostras de pele em que o meio deve ser incubado a 30C, por at 8 semanas. Nas 2 primeiras semanas manter os tubos na posio horizontal com as tampas um pouco desrosqueadas, depois colocar na vertical e apertar as tampas. Leituras: ler duas vezes durante as duas primeiras semanas (fazer a segunda leitura da primeira semana sempre com 7 dias exatos, j que um parmetro importante para a identificao posterior) e depois uma vez por semana at completar 8 semanas. Observar o pigmento da colnia. Se o meio estiver contaminado com outros microrganismos, desprezar o meio e preparar outra cultura se o material estiver ainda estocado. Descontaminar novamente o material antes de inocular no meio.

MIDDLEBROOK 7H10, 7H11

Composio: sais, vitaminas, cofatores, cido olico, albumina, catalase, glicerol, glicose
(7H10), acrescido de hidrolizado de casena (7H11)

Inoculao: semear 0,5 a 1,0mL do sedimento tratado na placa. Utilizar uma ala descartvel para espalhar bem todo o material sobre a superfcie da placa. No utilizar a tcnica normal de semeadura em placas, semear em todas as direes.

Incubao: a 37C em estufa com 5% a 10% de CO2 no escuro por at 8 semanas. Leituras: ler duas vezes durante as duas primeiras semanas (fazer a segunda leitura da primeira semana sempre com 7 dias exatos, j que um parmetro importante para a identificao posterior) e depois uma vez por semana at completar 8 semanas.

Os meios slidos so importantes para observar amostras que possuem mais de um tipo de micobactria

MEIOS LQUIDOS
MIDDLEBROOK 7H9

Composio: sais, vitaminas, cofatores, albumina, catalase, glicerol Inoculao: inocular a amostra de bipsia ou fragmento de pele diretamente no meio Incubao: incubar a 37C em estufa contendo 5 a 10% de CO2. Se forem inoculados fragmentos de pele no meio incubar um tubo a 37C e outro a 30C. Leitura: examinar os tubos duas vezes durante as duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 8 semanas.

BACTEC 12B
Antes de serem inoculados com amostras clnicas ou cepas bacterianas os frascos devem ser colocados no equipamento Bactec 460TB para que sejam inoculados com uma quantidade determinada de C02. Composio (Middlebrook 7H12): caldo 7H9, albumina bovina, hidrolizado de casena, catalase, substrato marcado com 14C(1Ci/ml). Inoculao: inocular 0,5 ml do sedimento tratado pelo mtodo de NALC, com uma seringa tipo insulina. Adicionar 0,1 ml de uma soluo de antibiticos (PANTA, Becton Dickinson) nas amostras que podem apresentam alguma contaminao bacteriana. Incubao: 37C; amostras de tecidos ou fragmentos de pele devem ser incubados tambm a 30C (preparar 2frascos). No necessrio incubar no escuro. Leituras: ler 2 vezes nas duas primeiras semanas de incubao e uma vez nas semanas seguintes at completar 6 semanas. Frascos com ndices de crescimento (GI) maior que 10 devem ser separadas e testadas diariamente. Frascos que apresentarem GI superiores a 10 devem ser considerados como suspeitos de serem positivos, quando o GI chegar a 50 preparar uma lmina e corar pelo mtodo de ZiehlNeelsen. Algumas vezes pode ser difcil visualizar as micobactrias com um GI to baixo; aguardar para fazer outra lmina quando o frasco apresentar um GI maior. Algumas vezes o meio 12B no adere bem lmina e solta do esfregao, adicionar uma gota de albumina na lmina antes de colocar a gota do 12B para fixar o esfregao. Se o frasco apresenta alm de bacilos lcool-cido outras bactrias, descontaminar a amostra diretamente do 12B removendo todo o contedo e processando pelo mtodo de 4% de NaOH. Inocular o sedimento tratado novamente em um novo 12B.

BACTEC 13A Composio (Middlebrook 7H13): caldo 7H9, albumina bovina,hidrolizado de casena, catalase, substrato marcado com 14C(1Ci/ml), Tween 80, polianetolsulfonato de sdio (SPS). Inoculao: colocar at 5 ml de sangue diretamente no frasco. Adicionar no laboratrio 0,5 ml da soluo de enriquecimento que vem junto com os frascos Bactec 13A. Incubao: 37C por at 6 semanas. Leituras: ler os frascos duas vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 6 semanas. Os frascos 13A no necessitam ser passados no Bactec 460 para colocar C02, pois estes j vem preparados com a quantidade certa de C02.

MGIT
Composio: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente embebido em silicone sensvel ao oxignio. Inoculao: 0,5 ml do material tratado, adicionar 0,5 ml de OADC (acompanha o kit) e PANTA (soluo de antibiticos, Becton Dickinson). Incubao: 37C. Leituras: realizar a primeira leitura aps 48 horas de incubao. Ler duas vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 8 semanas. A leitura feita com uma luz ultravioleta e a fluorescncia emitida comparada com um controle positivo e negativo. Amostras de sangue no devem ser colocadas neste meio. Existe disponvel um equipamento automatizado (MGIT 960) que realiza as leituras automaticamente.

ESP MYCO Composio: caldo Middlebrook 7H9 e esponjas de celulose. Inoculao: 0,5 ml da amostra clnica. So adicionados OADC e uma mistura de antibiticos (MycoPVNA). Incubao: Os frascos so incubados no aparelho ESP Difco por um perodo de 6 semanas. Leituras: O equipamento automatizado vai realizar as leituras continuamente e medir o consumo e produo de gases. Este sistema permite o processamento de qualquer amostra clnica inclusive sangue.

MB/BACT Composio: Middlebrook 7H9, casena pancretica digerida, catalase, albumina bovina. Inoculao: 0,5 ml do material clnico tratado. Uma mistura de antibiticos adicionada. Incubao: 37C no equipamento automatizado MB BacT/Alert por 6 semanas. Leituras: os frascos so lidos automaticamente e constantemente pelo equipamento. BACTEC MYCO LYTIC Composio: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente sensvel ao oxignio. Inoculao: 5 ml da amostra. Incubao: 37C no equipamento Bactec 9420 durante 42 dias Leituras: o equipamento realiza as leituras e o monitoramento contnuo dos frascos. Estes frascos so apenas para processamento de amostras de sangue. Para amostras respiratrias o equipamento usado o Bactec 9000MB e o frasco o Myco/F.

BIBLIOGRAFIA
Anvisa, 2004. Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica. Disponvel em : <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_6_2004.pdf> Portal Sade, 2008. MINISTRIO DA SADE; Secretaria de Vigilncia em Sade; Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Manual Nacional de VIGILNCIA LABORATORIAL da TUBERCULOSE e outras MICOBACTRIAS. Disponvel em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_laboratorio_tb.pdf