Por Kristala Jones Prather, Sangeetha Sagar, Jason Murphy, Michel Chartrain

Integrantes

Solhzetniczi Fritz Alejandro Parra

Sebastin Rocha

ADN Plasmidial en Vacunas y Terapia Gnica

El DNA plasmidial es usado como vector en terapia gnica o

en vacunas especficamente. Esta caracterstica de vector hace que el uso de DNA plasmidial sea una aplicacin atractiva en la inmunizacin respecto a otras vacunas. Ensayos en vacunas contra el cncer, la hepatitis B y C o la tuberculosis ya se estn haciendo y son ms de 600 las vacunas basadas en DNA plasmidial.

 En principio las vacunas de DNA son potencialmente

mejores que las vacunas basadas en protenas y son seguras cuando hay falta de integracin gentica.

Vacunas Basadas en Protenas

Respuestas humorales

v/s
Vacunas Plasmidiales

Respuestas humorales
Respuestas celulares

el ADN plasmidial llega a las clulas presentadoras de antgeno (APC) presentes en el msculo, donde se transcribe el transgn. La protena extraa se sintetiza en el citoplasma, se procesa adicionalmente a travs del complejo mayor de histocompatibilidad y finalmente, muestra en la APC MHC-I presentes en la superficie celular.

El APC despus migra a los ganglios linfticos de drenaje donde se produce una respuesta inmune celular mediante la activacin de la maduracin y la proliferacin de los linfocitos T. El antgeno extrao tambin puede ser liberado en el medio extracelular. Una vez en el medio extracelular, el antgeno solubilizado inicia una cascada de la respuesta inmune humoral clsica.

Figura 1. La respuesta inmune a la vacunacin de ADN plamidial.

 A pequea escala,

los plsmidos son fciles de producir y purificar. embargo, las produccin de plsmidos es muy baja y se debe llevar a escalas ms grandes, especficamente a escala industrial para responder a las demandas emergentes.

Sin

Figura 2. Etapas del proceso para el desarrollo de una vacuna de ADN plsmido.

La Eleccin de Una Replicacin Para la Vacuna de ADN o Constructos de Terapia Gnica

La produccin de DNA plasmidial est basado en la

seleccin de una replicacin. Los constructos de terapia gnica, en su mayora, son formados en bacterias de Escherichia coli. Existen 3 razones para hacer la seleccin: i. Se usan derivados de ColE1 como vectores para la expresin de protenas recombinantes. ii. Se han modificado los derivados de ColE1 para replicar muchas copias. iii. Los procesos de produccin y ampliacin son estudiados usando E. coli como husped para obtener protenas recombinantes.

Tabla 1. Replicaciones comnmente utilizadas en E. coli

Diseando Una Vacuna de ADN o Constructos de Terapia Gnica

El diseo de una vacuna consiste en que el plsmido debe

contener determinados elementos para i) El mantenimiento y la propagacin bacteriana y ii) la expresin del transgn en el husped humano : - Para la propagacin bacteriana y el mantenimiento, est el origen de replicacin y funciones codificadas por plsmidos requeridos para la replicacin. - Para la expresin se tiene a un promotor eucariota, una seal de terminacin de la transcripcin / poliadenilacin, y el transgn de inters.

Elementos para la expresin del transgn en el husped humano

Elementos para la mantencin y propagacin bacteriana

Figura 3. Mapa de una tpica construccin de vacuna de ADN

Produccin de plsmidos
La produccin de plsmidos, a gran escala, requiere la

optimizacin conjunta del nmero de copias de estos (rendimiento especfico) y la concentracin de biomasa
Mejorar el rendimiento especfico mejora tambin el

procesamiento downstream
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Produccin de plsmidos
Es muy probable que parte sustancial del

conocimiento adquirido para producir protenas recombinantes en E. coli ser traducible a la produccin de plsmidos, por parte de este microorganismo.
Sin embargo, las condiciones que buscan la

optimizacin de la expresin proteica pueden diferir de las que son necesarias para alcanzar un alto rendimiento de plsmido.
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Produccin de plsmidos

Sntesis elevada de protenas recombinantes

-

Alto rendimiento de plsmidos

+

Carga metablica

Esto requerir muchos cambios de paradigma en los

mtodos de cultivo conocidos

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Formulacin del medio de cultivo El medio de cultivo puede influir de manera dramtica
el desempeo de los microorganismos (m.o.)
Composici n del medio de cultivo

Cantidad de biomasa

Fisiologa de las bacterias

Rendimiento volumtrico del plsmido

Rendimiento especfico

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Formulacin del medio de cultivo

Numerosas experiencias apuntan a que el rendimiento

especifico de plsmido vara inversamente con la tasa de crecimiento celular en los cultivos por lote (batch)
Esto se ve reflejado en lo siguiente

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Formulacin del medio de cultivo

De la tabla se puede extraer que:
Los medios complejos estndar, como caldo Luria

Bertani (LB), poseen menor rendimiento especifico de plsmido que medios semi-definidos.
Emplear formulaciones enriquecidas, como Terrific

Broth (TB), sostiene altos rendimientos volumtricos de

plsmido sin comprometer el rendimiento especfico.
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Formulacin del medio de cultivo

Por lo estudiado por OKennedy et al, se sabe que la

razn ptima de Carbono/Nitrgeno (C:N) para la produccin plasmidial es de alrededor 2,78:1

Esta razn podra influenciar la fisiologia de los m.o.

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Formulacin del medio de cultivo

Por otra parte, Wang et al demostraron que utilizar

medios semi-definidos mejora la estabilidad segregacional de los plsmidos, por sobre el uso de medios de cultivo complejos
Lo anterior sera consecuencia de que un medio

definido ofrece una menor ventaja de crecimiento a las

clulas libres de plsmido
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Formulacin del medio de cultivo

Por las investigaciones realizadas se puede afirmar que

utilizar medios semi-definidos permite

Alcanzar un mejor rendimiento especfico Lograr mayor estabilidad segregacional del plsmido

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Mtodos de cultivo
Tanto la tecnologa de cultivo batch como la de lotes

alimentados (fed-batch) han sido empleadas para la produccin de plsmidos por E. coli El cultivo batch, fuera se ser muy simple, es severamente limitado con respecto a conseguir biomasa elevada y rendimiento volumtrico de plsmido

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Mtodos de cultivo
Se ha demostrado que los cultivos con medios

enriquecidos, por lote, crean un ambiente limitado de oxgeno

Esto gatilla la produccin de subproductos txicos por

parte E. coli, mayormente cido actico

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Mtodos de cultivo
Debido a sus caractersticas, el mtodo de cultivo fed-

batch es una solucin razonable y ampliamente explorada Esta tecnologa permite combinar las ventajas de un cultivo por lote y un cultivo continuo Manteniendo las condiciones ptimas para favorecer la llamada: amplificacin plasmidial

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Figura 5
Grfica representativa del crecimiento celular y la acumulacin de plsmido en un proceso fed-batch tpico. Las unidades utilizadas para la biomasa son comnmente la densidad ptica medida a 600 [nm] o el peso de clula seca expresado en [g/L]. La produccin de DNA plasmidial es usualmente expresado como volumen o especficamente [g/mg de pso de clula seca]

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Mtodos de cultivo
Finalmente,
Las condiciones del cultivo y la composicin del medio

permiten controlar el rendimiento especifico del plsmido, la estabilidad y la cantidad de biomasa producida Es importante seguir trabajando en el diseo del medio de cultivo y definirlo qumicamente

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Figura 6
Factores principales que controlan la productividad plasmidial en biorreactores

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Problemas de grandes escalas

Cosecha de clulas
TFF ( filtracin de flujo tangencial)
Centrifugacin
limpieza de equipos ensuciamiento de la membrana

Lisis pH Lizocimas Calor Mecnico

Diseo de vacunas Estrategias de calefaccin y diseo de equipos

Resto celular / Separacin de restos de alimentos

Centrifugacin DE filtracin
Limpieza de equipos Eliminacin de la filtracin, floculacin de los coadyuvantes

TFF ( filtracin de flujo tangencial)

Precipitacin de afinidad
Cuestin de estrategia y floculacin de adicin PEG Alcohol Detergentes cationicos Poliaminas

Absorcin (una o varios pasos)

Cromatografa

Diseo de columnas

Intercambio de Buffer

Precipitacin del etanol Diseo de bomba y rea de membrana TFF

Producto final

Conclusin
A medida que avanza la produccin en el campo de las vacunas de ADN y/o terapias gnicas basadas en plsmidos, y emergen como productos comerciales,

por ao deben ser construidas fbricas capaces de producir kilogramos de ADN plasmidial. Los avances en la fermentacin, purificacin y formulacin de ADN plsmidico estn siendo impulsados por esta nueva necesidad de grandes cantidades y el marco regulador actual. Para usos comerciales, las consideraciones de las restricciones propiedad intelectual se deben hacer al seleccionar vectores especficos, lneas de clulas husped, y tecnologas de produccin. Las tecnologas de fermentacin y el proceso de ADN plsmidico farmacutica escala aqu reseados son un buen comienzo hacia la meta de la vacuna de ADN produccin a gran escala rentable.