Recombinant DNA and Biotechnology Kreuzer, Massey

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

El mtodo estndar para separar fragmentos de ADN

es la electroforesis en geles de agarosa.

La agarosa es un polisacrido como el agar o la pectina

que se disuelve en agua hirviendo y se va solidificando mientras se enfra.

En la electroforesis, el ADN se aplica a un bloque de

agarosa gelificado al cual se le va a aplicar corriente elctrica.

 Gracias a que el ADN est cargado negativamente,

migra a travs del gel hacia el electrodo positivo.

Bajo condiciones normales, los grupos fosfato en el

esqueleto del ADN estn cargados negativamente.

Por regla general, los opuestos se atraen, de esta

manera el ADN se ve atrado por cualquier cosa que est cargada positivamente.
Y este principio se utiliza en la electroforesis.

 La tasa de migracin del ADN depende del tamao del

fragmento.
Mientras es ms pequeo, migra ms rpido a travs

del gel.
La tasa de migracin de fragmentos lineales es

inversamente proporcional al log 10 de sus pesos moleculares.

Esta tasa de migracin, tambin se ve afectada por la

forma de la molcula de ADN.

 Las molculas circulares (plsmidos) migran de

diferente manera que los fragmentos lineales del mismo peso molecular.
Otro parmetro importante en la electroforesis, es la

concentracin de la agarosa en el gel.

Mientras la concentracin es mayor, ms se retarda el

movimiento de todos los fragmentos de ADN.

Es por esto, que es mejor usar concentraciones

relativamente altas de agarosa para separar y ver fragmentos pequeos.

 Algunos ejemplos de concentraciones de agarosa y los

tamaos de ADN que pueden separar eficientemente se presentan a continuacin:

% Agarosa 0.3 0.6 Tasa de separacin de fragmentos lineales (kb) 60 - 5 20 1

0.9 1.5 2.0

7 0.5 4 0.2 3 0.1

 Los geles de agarosa se preparan y se corren en una

buffer.
La buffer es necesaria porque durante la electroforesis

se generan iones que convierten el nodo en alcalino y al ctodo en cido.

Si el gel es accidentalmente preparado y corrido en

agua, las bandas de ADN se van a ver mal.

Una buffer es la mezcla, ya sea de un cido dbil con su

sal o una base dbil con su sal.

 La buffer de electroforesis ms comn est hecha de la

base dbil Tris y su sal hecha aadiendo cido brico.

Tambin se aade un quelador de metales como el

EDTA (cido etilendiaminotetraactico).

La buffer resultante se llama TBE por Tris-Borato-

EDTA.
Otras buffer utilizadas son TAE (Tris-Acetato-EDTA) y

TPE (Tris-Fosfato-EDTA).

 El voltaje que se aplica al gel afecta la rapidez con la

que el ADN migra.

Mientras es ms alto el voltaje, es ms rpida la

migracin por el gel.

Sin embargo, los geles que corren a altos voltajes no

separan los fragmentos de ADN tan eficientemente como los corridos a bajos voltajes.
Para una buena separacin, los geles deben correrse a

no ms de 10V/cm de largo del gel.

PREPARACIN DE UN GEL

TEIDO DEL GEL

Para hacer los fragmentos de ADN visibles luego de la

electroforesis, stos se deben teir.

Uno de los tintes usados es el bromuro de etidio. Esta sustancia se intercala en el ADN y sirve como un

marcador de cidos nucleicos.

INTERCALADO DEL BROMURO DE ETIDIO

 Una vez que el bromuro de etidio se une al ADN, ste

fluorece bajo luz ultravioleta (UV).

Bajo esta luz emite una luz rojo-anaranjada, que se

intensifica unas 20 veces despus de haberse unido a una cadena de ADN.

Es un tinte sensible pero tiene varios efectos negativos

para la salud humana.

Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta

sustancia tiene un poderoso efecto mutagnico y, posiblemente puede ser cancergeno o teratgeno.

 Otra sustancia que se utiliza para teir los geles es el

SYBR Green.
Es un agente intercalante utilizado en la tincin de

ADN para el anlisis por electroforesis de productos de PCR.

Esta molcula se introduce en la estructura secundaria

de la doble hlice del ADN y se acopla energticamente a los cidos nucleicos que lo forman.
El SYBR Green representa una alternativa como tinte al

bromuro de etidio.

ELECTOFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

El otro material usado en la electroforesis de ADN es la

poliacrilamida.
La poliacrilamida forma una malla ms compacta que

la agarosa.
Por esta razn, los geles de poliacrilamida pueden

separar molculas ms pequeas.

 La poliacrilamida tiene un poder ms alto de

resolucin, es decir, el gel de poliacrilamida puede separar dos molculas cuyo peso molecular es muy parecido.
Se la utiliza para anlisis forenses, en los cuales es

crtico determinar si es que dos fragmentos de ADN son exactamente del mismo tamao.
Tambin se la utiliza para electroforesis de protenas.

 La poliacrilamida es un polmero de la acrilamida. Para hacer un gel de poliacrilamida, se disuelve la

acrilamida en buffer junto con el agente entrecruzador (cross-linking) bisacrilamida.

Se

aaden catalizadores para comenzar la polimerizacin (in persulfato como persulfato de amonio).

La mezcla lquida es rpidamente vertida en un

espacio delgado entre dos vidrios o platos plsticos.

 Los geles de poliacrilamida que se usan para separar

ADN usualmente se hacen y corren en TBE, al igual que los geles de agarosa.
El qumico urea, puede ser aadido al gel para

mantener al ADN en cadena simple.

Esto puede ser til en varias aplicaciones como por

ejemplo la secuenciacin de ADN.

ELECTROFORESIS DE PROTENAS
Las protenas normalmente son separadas en geles de

poliacrilamida porque son molculas mucho ms pequeas que los fragmentos de ADN comnmente separados en agarosa.
Las protenas presentan una carga elctrica neta si se

encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo elctrico.

 La velocidad de migracin es proporcional a la relacin

entre las cargas de la protena y su masa.

Cuanto mayor carga por unidad de masa ms rpida

ser la migracin.
La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo

conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.

ELECTROFORESIS DE PROTENAS