Aislamiento de plsmidos

Conocer los fundamentos para la purificacin del DNA plasmdico y su separacin del DNA Realizar el aislamiento de DNA plasmdico

James Watson y Francis Crick en 1953 demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hlice formada por dos cadenas.

La extensin de DNA que tiene cada organismo no es la misma. El DNA a pesar de su extensin tiende a formar una estructura helicoidal compacta.

Doble hlice Estabilizada por puentes de hidrgeno En la clula generalmente superempacada o superenrollada

Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA slo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

Abierto

Relajado

Superenrollado

El superenrollado es ms compacto y por tanto migra ms rpido en el gel

1.

Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripcin o cambia la unin de protenas al DNA.
Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactacin del DNA y la recombinacin sitio especfica

2.

DNA estructura helicoidal

Estructura estabilizada por puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas (A=T; GC)

Superenrollamiento DesnaturalizarRenaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrgeno

Calor, pH, iones

se eliminan sus puentes de hidrgeno.

Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en est conforme alteramos o despegamos la doble hlice EFECTO HIPERCRMICO

Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.

El DNA se puede volver a renaturalizar. Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto. De no ser as se pueden producir agregados fcilmente precipitables.

Paso 1: Lisis celular Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana

Paso 2: Precipitacin de protenas y desnaturalizacin del DNA

Se perturban los puentes de hidrgeno entre cadenas Se aade generalmente NaOH

Paso 3: Renaturalizacin del DNA Se neutraliza el pH de la solucin y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!

Cuando los puentes de hidrgeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmdico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rpidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solucin y la fidelidad de la reasociacin es substancialmente diferente para ambas macromolculas.

Paso 4: Separacin del DNA cromosomal del DNA plasmdico y su purificacin

El DNA cromosomal est agregado y al centrifugar se queda en el botn El DNA renaturalizado se queda en la solucin, el sobrenadante

El experimento

 A. B. C.

D.

Una vez que se tenga el plsmido purificado entonces: Correr una muestra en un gel de agarosa Medir la absorbancia a 260 nm. Estimar la concentracin. Guardar a 20C para usar en la prxima sesin

Continuamos con:

Ensayo de restriccin (2 h incubacin de DNA con enzimas) Corrimiento electrofortico: Gel de agarosa (aprox 45 min)

Induccin de protena recombinante (Alcanzar DO 0.6 en 1.5h; induccin 1.5h) Corrimiento electrofortico: Gel de poliacrilamida (45 min)