HPLC-DAD-ESIMS ANALYSIS OF PHENOLIC COMPOUNDS IN BAYBERRIES (MYRICA RUBRA SIEB. ET ZUCC.

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Zhongxiang Fang, Min Zhang *, Linxiang Wang

Introduccin

Bayberry (ssMyrica rubra sieb. Et zucc.) es el nombre de un rbol que crece en la selva o bajo condiciones de cultivo en el sur de china. Sus frutos se usan para combatir los problemas gastrointestinales como la diarrea. Los compuestos fenlicos son el mayor constituyente de estos frutos y juegan un papel importante en las propiedades nutricionales, organolpticas y comerciales de los frutos y sus productos derivados.

Antecedentes

Los compuestos fenlicos estn implicados en la degradacin de color en el jugo de blueberry (arndano), y la formacin de turbidez y sedimentos en los jugos de frutas y bebidas alcohlicas. La mayor antocianina en los frutos de bayberry fue identificada como la cianidina 3-glucosido, la cual representa alrededor de 95% del contenido total de pigmentos en el fruto.

Los principales flavonoides en los frutos de bayberry son identificados como miricetina, quercentina, y kaempferol, y ellos existen en forma de glucsido en los frutos.

HPLC-DAD-ESIMS
HPLC: cromatografa liquida de alta resolucin. DAD: (diode array detector): Detector de matriz de fotodiodos. ESIMS: (electrospray ionization mass spectrometry): espectrometra de masas de ionizacin por electrospriado.

HPLC-DAD: proporciona informacin extensa en la estructura de polifenoles.

HPLC-ESIMS: proporciona informacin acerca del peso molecular del polifenol y la estructura molecular a partir de sus datos de desfragmentacin.

Objetivos

1.- La determinacin de fenlicos excepto antocianinas en frutos de bayberry de 3 diferentes variedades (Xiangshan, biqi y dongkui) usando un mtodo de HPLC-DAD-ESIMS, dado que las antocianinas ya han sido analizadas por otros autores.

2.- Aprender el mecanismo de la degradacin de color y la formacin de turbidez durante el procesamiento y almacenamiento del jugo de bayberry, en el cual se supone que los compuestos fenlicos estn involucrados.

Materiales y mtodos

Qumicos y solventes:
Estndares puros de acido glico, acido protocatquico, catequina, cido elgico, y quercetina 3-glucsido, estos se disolvieron con metanol hasta una concentracin de 1.2 a 120 mg/L. Acetonitrilo y metanol (grado HPLC), acetato de etilo, acido actico, acido frmico y acido hidroclorhidrico (grado analtico).

Material vegetal:
5 Kg de frutos de cultivos Biqi, Dongkui y Xiangshan (despalilladas y lavadas).

Anlisis de polifenoles totales:

5 gr de fruto cortado en 2 rebanadas Moler en un mortero con 50 ml de acido actico al 4% en acetonitrilo Pasar la molienda a un matraz y aforar a 100 ml con la misma sol. utilizada Agitar a 200 rpm por 1 h a 30 C Centrifugar a 4000 rpm por 10 min y usar el sobrenadante para el anlisis

Preparacin de la muestra

El total de polifenoles fue estimado colorimtricamente usando el mtodo modificado de Folin-Ciocalteau, el cual se basa en la construccin de una curva estndar estabilizada con 100, 200, 300, 400 y 500 mg /L de acido glico y los resultados fueron expresados como equivalentes a acido glico en miligramos por kilogramos de peso fresco (mg GAE/kg FW). (Los resultados eran promedios de anlisis triplicados) Extraccin de compuestos fenlicos (no antocianinicos): Las muestras fueron pesadas (5g) en los tubos de centrifugados para extraccin. Los homogeneizados fueron extrados 3 veces usando 10 ml de acetato de etilo con mezcla intermitente y centrifugado. Las fases orgnicas se separaron, se reunieron y se evaporaron a sequedad con un rotavapor a presin reducida. El residuo seco fue resuspendido en 5 ml de metanol para el anlisis usando HPLC-DADESIMS. Todas las muestras fueron filtradas a travs de un filtro de acetato de celulosa de 0.45m.

Analisis usando HPLC-DAD-ESIMS: Este anlisis arroja dos tipos de grficos, uno de espectro de absorcin en el UV-vis (se hiso la medicin despus del HPLC) y otro de espectro de masas. En el primero las mediciones se hicieron desde el rango de los 200 hasta los 600 nm y los cidos fenlicos fueron detectados en el rango de los 280 nm y los flavonoides a los 360 nm.

Identificacin y cuantificacin de polifenoles: Los cidos fenolicos y los glucsidos de flavonoides fueron identificados por su espectro UV-Vis, espectro ESIMS, y donde fuera posible, por comparaciones cromatograficas con estndares. Las concentraciones fueron expresadas como mg/kg FW. La repetitividad del anlisis fue de 5%.

Resultados y discusin

Identificacin de los picos cromatogrficos

cidos fenlicos

Flavonoides

Contenido de los compuestos fenlicos totales e individuales

Los glucsidos de miricetinas, glucsidos de quercetinas y los glucsidos de kaempferol estuvieron presentes en todos los cultivos.

Conclusin

Por primera vez, una tcnica de HPLC acoplada a un detector de matriz de fotodiodos y a espectrometra de masas de ionizacin por electrospriado (HPLC-DAD-ESIMS) fue utilizada con xito en la determinacin de compuestos fenlicos a partir de cultivos de bayberry Xiangshan, Biqi y Dongkui. Bsicamente se identificaron 3 compuestos fenlicos:

Acido glico (siendo el mayor compuesto fenlico de las tres especies ensayadas) Acido protocatquico Quercetina 3-glucsido

Estos resultados son relevantes no solo de un punto de vista nuricional, sino que tambin pude ser usado en el control de la estabilidad del color y la formacin de turbidez durante el proceso de elaboracin y el almacenamieno del jugo de bayberry.