MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Claudia Cristina Ortiz Lpez

ortizc@uis.edu.co


TEMA 3: BIOPROCESOS
Principales etapas de un proceso
biotecnolgico industrial:
Seleccin/
optimizacin del
agente biolgico


Propagacin
de los
cultivos
Fermentacin:
produccin del
compuesto de
inters

Esterilizacin
Preparacin
de medios
Separacin o
recuperacin

Purificacin

Terminado

Tratamiento
de efluentes
3
Seleccin/ optimizacin del agente
biolgico
Factores a tener en cuenta:
Capacidad productora tan alta como sea posible
Capacidad de utilizar materias primas de bajo costo
(de produccin local)
Estabilidad del agente biolgico: para obtener
procesos reproducibles
Que no sea patgeno

Estos factores pueden incorporarse a un agente
biolgico mediante el uso de ingeniera gentica

4
Produccin del compuesto de inters
Se lleva a cabo en bioreactores o fermentadores

Son recipientes que proveen las condiciones
ambientales propicias (Temp., pH, aireacin, etc. )
para que los agentes biolgicos puedan crecer y
producir las mximas cantidades del compuesto
deseado.
5
A- Inyeccin de aire
B- Difusor
C- Eje transmisor
D- Motor
E- Agitadores
F- Controladores
G- Salida gases
H- Entrada
I- Deflectores
J- Rompe-espuma
K- Camisa
L- Salida
Fermentador tipo tanque agitado
6
7
8
1)Propagacin de cultivos: comienza en un tubo
de ensayo o un tubo congelado o liofilizado
donde se conserva la cepa de inters, o de una
colonia del microorganismo previamente
seleccionado. Se propaga en el laboratorio
progresivamente aumentando el volumen del
medio de cultivo.


2) Fermentacin: Se prepara el medio de
nutrientes y se esteriliza.



Se siembra un tanque de inculos cuyo volumen
depende de la escala industrial.

V
inculos
~50-1000 L y

Vf
ermentador industrial
~10-1000 m
3

3. Separacin y purificacin:

operaciones mecnicas de ruptura de clulas.

separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin.

separaciones primarias por extraccin, absorcin,
adsorcin, ultrafiltracin.

purificacin por extraccin lquido-lquido, extraccin en
dos fases acuosas o cromatografa de afinidad.

aislamiento y acondicionamiento del producto.



4) Tratamiento de efluentes: no tiene relacin
directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volmenes involucrados y
para preservar el medio.
1. Preparacin y propagacin de inculos
I. Preservacin del inculo
II. Multiplicacin del inculo
III. Cultivo de prefermentacin
IV. Fermentacin de produccin
El tamao del inculo generalmente es del orden
del 1-10% del volumen total del medio
Preservacin del inculo

El objetivo de la preservacin es mantener las
cepas durante tanto tiempo como sea posible
sin divisin celular. Se verifica pureza y
capacidad de formar producto.
Multiplicacin del inculo
El cultivo preservado se reactiva inicialmente
mediante crecimiento en un cultivo lquido en
agitacin o en medio slido si se requiere la
formacin de esporas.

Cultivo de pre-fermentacin

En general se requieren las siguientes concentraciones
de inculo:
Actinomicetos...............5 - 10 %
Otras Bacterias.............0,1 - 3,0 %
Hongos..........................5 - 10 %
Preparacin y propagacin de inculos
IV. Fermentacin de produccin
preservacin reactivacin
Medio lquido
enriquecido
Medio
de experimentacin
CINTICA DE PROCESOS BIOQUMICOS
PROCESO
MATERIA PRIMA PRODUCTO
Acondicionamiento Transformacin Recuperacin
Celulares
(microorganismos, clulas
vegetales y animales)
Bioqumicas
(enzimas)
Libres Inmovilizadas Libres Inmovilizadas
Los bioprocesos tienen una funcin PRODUCTIVA que cumple un rol y tiene
asociado el factor COSTO que debe ser el menor posible
CINTICA DE PROCESOS BIOQUMICOS
VELOCIDAD DE CAMBIO: CINTICA DE CAMBIO, que
obedece al mecanismo propio del sistema.

Es propia del sistema y depende de muchos factores
que se deben conocer para tener control del proceso.

El seguimiento del crecimiento del microorganismo o
de la produccin de sus metabolitos en trminos
cinticos, se puede expresar mediante
La cintica permite modelar el fenmeno en
trminos de la velocidad e identificar los
parmetros y cmo son afectados



MODELOS MATEMTICOS

CINTICA DE PROCESOS BIOQUMICOS
Aspectos cinticos
Balances de masa
Diseo
(dimensionamiento de equipos)
Rendimiento
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Depende de:

Microorganismo
Caractersticas genticas
Condiciones ambientales
Crecimiento: aumento ordenado de todos los
componentes qumicos de un sistema biolgico
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

BACTERIAS: FISIN BINARIA
LEVADURA: GEMACIN

HONGO (MOHO)
Crecimiento
apical
Determinacin de la concentracin msica
de clulas:

Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en
suspensin)


Mtodos indirectos: se basan en un efecto que
inducen, como puede ser la velocidad de consumo
de un sustrato o de formacin de un producto.

Manejo cuantitativo de los microorganismos


Peso seco
Biomasa
Mediciones directas Turbidimetra

Recuento en celda
Nmero
Recuento en placa (viables)

Consumo de nutriente

Mediciones indirectas Acumulacin de producto

Compuesto celular
Mtodos para la cuantificacin del crecimiento de
poblaciones microbianas
Mtodo Fundamento Observaciones

Recuento de celda Conteo directo de clulas Requiere clulas individuales y medio limpio
Recuento de placa Conteo de nmero de colonias Supone clulas individuales. Viables
Nefelometra Dispersin de luz Requiere cultivo homogneo y traslcido
NMP Estadstico Requiere clulas individuales y medio limpio
Peso seco Medicin directa No admite componentes insolubles en el medio,
dispendioso
Turbidimetra

Transmisin de luz Requiere clulas individuales y medio limpio
Volumen empacado Centrifugacin del cultivo No admite presencia de slidos
Fsicos y qumicos Variado, indirecto Cambios de viscosidad, pH, anlisis de un componente
celular
Balance de masa Conservacin de masa Requiere varios anlisis
Instrumentales Variado Requiere variados anlisis. Utilizados solos o en conjunto
con balance de masa en desarrollo
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Cintica de crecimiento de un cultivo por lote batch
Etapas:

1) latencia o
induccin

2) crecimiento
exponencial

3) dedesaceleracin

4) estacionario

5) muerte o
declinacin
Celular

6) Crecimiento
crptico
1
2
3
4 5
6
tiempo
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase Lag, de latencia o de induccin.
Es la expresin de un perodo de adaptacin para iniciar el crecimiento.
Su presencia y su extensin depende de:
Estado fisiolgico
Fase de crecimiento
Tamao
Tipo de microorganismos
Inculo
Composicin del medio en el que se inocula
Condiciones fisicoqumicas del medio

Fase Lag aparente: con inculos pequeos
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase Lag, de latencia o de induccin
Cintica
(dX/dt) = 0
X = Concentracin de clulas
X = X
0
t = Tiempo
X
0
= Biomasa inicial

Incidencia Industrial
Costo del tiempo de fermentacin
Tamao del fermentador
Riesgo de contaminacin

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase de crecimiento exponencial (aceleracin)
Clulas en plena reproduccin a una velocidad que es la mxima

(dX/dt) = X MODELO DE CRECIMIENTO CELULAR
La es constante durante la fase de crecimiento exponencial y
corresponde con la pendiente en un grfico semilogartmico (figura)

= 1 dx = d ln x
x dt dt
= velocidad Especfica de crecimiento
X= concentracin de biomasa
t: tiempo
Integrando:
ln x = t
xo

X= Xo e
(t)
X= Xo e
(t)
Relacin con el tiempo de duplicacin:

To = 0 T=Td

X = Xo X= 2Xo



Ln ( 2Xo / Xo ) = . Td


Despejando Td:
O
O O
O O O O
OOOO OOOO
32 64 128 256 512 1024
ln
2Xo
Xo

ln2

Td
=
=
To= 0
T=td
X= Xo
X= 2Xo
Td= 0.693

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
*El tiempo de duplicacin
es el perodo que requieren las clulas de una poblacin
microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas
clulas por cada una de las que existan anteriormente.
Td aproximados (h):

Bacterias: 0.3 2.5
Levaduras: 1 - 4
Hongos: 1.5 - 7
Protozoos: 6 h.
Microalgas: 18-35
Cl. Mamferas: 20-40
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase exponencial
El cultivo est en estado autocataltico
Es un perodo relativamente corto
Se cumple que:
X = X
0
* 2
n
Cintica de crecimiento
Se caracteriza por ser una fase de crecimiento constante
(dX/dt) = X

X = Biomasa microbiana
= Constante especifica del crecimiento microbiano en hr-1.
t = Tiempo en hrs

Cintica de crecimiento
Crecimiento diuxico
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase Estacionaria (de declinacin o retardo)
Representa el fin del perodo exponencial. Se
detiene el crecimiento
La concentracin celular no cambia

Esta dado por:
Agotamiento de un sustrato
Acumulacin de un inhibidor
Otras causas ajenas al crecimiento
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Fase de crecimiento crptico
En algunos cultivos es posible
apreciar una zona de crecimiento
lento despus de la fase de muerte. El
contenido citoplasmtico liberado
por las clulas lisadas proporciona los
nutrientes requeridos para el
crecimiento
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
*Constante especfica de la velocidad
de crecimiento microbiano.
La constante especfica de la velocidad de crecimiento
microbiano () se utiliza para caracterizar el
comportamiento de una poblacin microbiana.

Su valor depende de las condiciones ambientales en
que se encuentra el microorganismo.

Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y
energa tanto en calidad como en cantidad.
Velocidad especfica de crecimiento, h
-1







dX
dt
X
=
Cintica de primer orden
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Crecimiento de tipo exponencial que se puede modelar
max
lnX
t
=
1 dX
=
X dt
dlnX
dt
Velocidades de crecimiento de algunos
microorganismos bajo condiciones ptimas
Efecto de la fuente de carbono sobre el crecimiento
Diseo de medio de cultivo
Inculo
Nutrientes: H20, C,
N, sales
inorgnicas,
vitaminas, otros
O
2
Productos gaseosos
De salida:
CO
2
, CH
4
, etc.
Otros productos:
Biomasa, otros
Estequiometra del crecimiento celular y
produccin
Fuente C + Fuente de N + Fuente de O2 + sales minerales
+ nutrientes especficos
Masa celular + producto + CO
2
+ H
2
O
OBJETIVO: Desarrollo de una fermentacin con mnimo
costo por unidad de producto
Concepto de fermentacin
Proceso de fermentacin:
MICROORGANISMOS
Bacterias, levaduras , hongos
MEDIO DE CULTIVO
CONDICIONES AMBIENTALES
MICROORGANISMO
CO2
PRODUCTO
Intra o extra celular
Crecimiento microbiano: Descripcin
qumica


AC
a
H
b
O
c
+ BO
2
+ DNH
3
MC
a
H
b
O
c
N
d
+ PCO
2
+ QH
2
O
C
donde: A, B, D, P y Q son moles.
C
a
H
b
O
c
fuente carbono-energa.
M son moles de una unidad celular, C
a
H
b
O
c
N
d

Aproximadamente el 92 % en promedio de biomasa
corresponde a los elementos mayores
Datos de composicin celular
Bacterias
C
0.53
; N
0.12
; O
0.19
;

H
0.07


Levaduras

C
0.47
; N
0.075
; O
0.31
; H
0.065
Requerimientos nutricionales
FUENTE DE ENERGA:
-C: AUTOTROFO, HETEROTROFOS
-FOTOTROFICO
-QUIMIOTROFICO

FUENTE DE ELEMENTOS MAYORES: C, H, O, N
FUENTE DE ELEMENTOS MENORES: P, K, S, Mg, Ca, Na
FUENTE DE ELEMENTOS TRAZA:
Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn,
Nutrientes esenciales: factores de crecimiento
Clasificacin Fuente de carbono Fuente de energa
Auttrofos CO
2
-------
Hetertrofos Compuestos
orgnicos
--------
Quimitrofos --------- Compuestos qumicos
Quimiolittrofos _______ Compuestos qumicos
inorgnicos
Quimiorgantrofos _______ Compuestos qumicos
orgnicos
Quimioauttrofos CO
2
Compuestos qumicos
Fottrofos _______ Luz
Fotoauttrofos CO
2
Luz
Fotohetertrofos Compuestos
orgnicos
Luz
Quimiohetertrofos Compuestos
orgnicos
Compuestos qumicos


Tipos de medio de cultivo
MEDIOS COMPLEJOS: Para un determinado elemento
est presente ms de una fuente. Composicin variable.
Ej.
Extracto de levadura, extracto de carne, melaza,
subproductos o desechos.
MEDIOS DEFINIDOS: Una fuente definida para cada
elemento. Compuestos puros, Composicin conocida y
reproducible, una fuente por cada elemento.
MEDIO MNIMO: fuente de C y E + sales inorgnicas
MEDIO MNIMO ENRIQUECIDO: con algn factor de
crecimiento (esencial o inductor).

Tipos de medio de cultivo
MEDIOS COMPLEJOS INDUSTRIALES

Componente Origen
Melaza Industria azucarera
Licor de maceracin
de maz
Subproducto del procesamiento de maz
Licor de sulfito Desecho de la industria de pulpa y papel
Permeado de suero Subproducto del procesamiento del suero de leche
Vinazas Subproducto de la produccin de etanol por
fermentacin
Harinas de soya y
pescado
Industrializacin de soya y pescado
Hidrolizado y
extracto de levadura
Industria productora de levadura forrajera y de
panificacin
Criterios utilizados en la formulacin del medio(I)
CARACTERSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Contener los elementos para la sntesis celular y para la
formacin de producto
Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o
formacin del producto.
Econmicamente rentable.
Mxima produccin.
Adaptacin constante al proceso de fermentacin.


Criterios utilizados en la formulacin del medio.(II)

Recuperacin del producto.
Eliminacin de la represin catablica.
Materiales de fcil disposicin en cantidad suficiente.
Bajos costes de transporte.
Impedir que las impurezas dificulten la recuperacin de
producto.
Diseo del medio de cultivo
Cunta biomasa vamos a generar?
Composicin celular
Fuente de cada elemento
Rendimientos
A. RANGO DE CONCENTRACIN DE BIOMASA
Matraces 0,5 - 2 g/l
Fermentador de laboratorio 1-10 g/l
Fermentador industrial 10-50 g/l
Alta densidad 120-250 g/l
Compuesto Bacteria
(% base seca)
Levaduras
(% base seca)
Hongos
(% base seca)


Promedio

Promedio

Promedio

Carbono 48 46-52 48 46-52 48 45-55
Nitrgeno 12.5 10-14 7.5 6-8.5 6 4-7
Protenas 55 50-60 40 35-45 32 25-40
Carbohidratos 9 6-15 38 30-45 49 40-55
Lpidos 7 5-10 8 5-10 8 5-10
Acidos nucleicos 23 15-25 8 5-10 5 2-8
Cenizas 6 4-10 6 4-10 6 4-10

b. Composicin celular
g/100 g en peso seco
Elemento Bacteria Hongos Levaduras
Fsforo 2-3 0.4-4.5 0.8-2.6
Azufre 0.2-1.0 0.1-0.5 0.01-0.24
Potasio 1-4.5 0.2-2.5 1-4
Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.3 0.1-0.5
Sodio 0.5-1 0.02-0.5 0.01-0.1
Calcio 0.01-1.1 0.1-1.4 0.1-0.3
Fierro 0.02-0.2 0.1-0.2 0.01-0.5
Cobre 0.01-0.02 --------- 0.002-0.01
Manganeso 0.001-0.01 --------- 0.0005-0.007
Molibdeno -------- --------- 0.0001-0.0002
Total Cenizas 7-12 2-8 5-10

Composicin tpica de compuestos
orgnicos e inorgnicos de m.o.
Constituyentes inorgnicos
Sustratos
S1
S2
Sn
Clulas
X
Productos
P1
P2
Pn
Producto:
Compuesto qumico diferente de material celular
que es liberado al medio.

Sustrato:
Compuestos que son consumidos a partir del medio
como resultado de crecimiento celular o formacin
de producto.

Factores que limitan la formulacin de medios de
cultivo:

Algunos elementos del sustrato liberados como
productos no asimilados a material celular.
Velocidades limitantes y estequiometra, deben
considerarse los rendimientos.
Nutrientes especficos que pudieran ser limitantes, o
productos especficos que pueden ser inhibitorios.
Factores ambientales.
Factores de crecimiento.

c. Fuente de cada elemento
MEDIOS INDUSTRIALES

-Fuentes de C y E
Almidn de maz, glucosa de maz, melaza, aceites vegetales, suero

-Fuentes de N
Licor de maceracin de maz, harina de soya, amonio (gas), Urea,
extracto de levadura.

-Suplementos
Sales minerales, vitaminas, aminocidos




MEDIOS DEFINIDOS

Fuente de Nitrgeno: (NH4)2SO4
Fuente de K y P: K2PO3
Sulfatos
Cloruros

En un medio definido podemos elegir el sustrato LIMITANTE
Todos los dems elementos (nutrientes) irn en exceso entre
el 30 y el 50 %



Zabriskie, D. W., Armiger, W. B., Philips, D. H. & Albano, P. A. (1980) Traders' Guide to
Fermentation Media Formulation.
D. Rendimiento biomasa sustrato (Y
X/S
)
Y
X/S
X
s
Biomasa producida (X
f
X
0
)
Sustrato consumido (S
0
S
f
)
=
Se puede calcular:

Experimentalmente
Tericamente
Y
X/S
Xf-Xo
= =
=
So-Sf
So
X - Xo
YX/S
Estimacin terica del Yx/s
Y x/S
Ei
% Ei en la clula
% Ei en el nutriente
Ei
% Ei en el nutriente
% Ei en la clula
=
=
Y x/S
=
% Ei en el nutriente
% Ei en la clula
* F
F= 0.6 crecimiento aerbico
F= 0.1 crecimiento anaerbico
Para otros elementos

F= 1
Para el caso de la fuente de
C y E,
Una parte del C es
excretado como
CO2
Elemento Ei Ei %Ei en clula Nutriente % Ei en el
nutriente
C 12 48 glucosa 40
N 14 7.5 (NH4)2SO4 21.2
P 31 1.7 kH2PO4 22.8
K 39 2.5 K2HPO4 28.7
Mg 24 0.3 MgSO4.7H2O 9.7
S 32 0.13 (NH4)2SO4 24.2
Fe 56 0.26 FeSO4.7H2O 20
Ca 40 0.20 CaCl2 36.2
Na 23 0.06 NaCl 39.3
Zn 65 0.02 ZnSO4.7H2O 22.8
Mn 55 0.004 MnCl2.6H2O 27.7
Mo 99 0.0002 MoO3 66.6
Co 59 0.003 CoCl2.6H2O 24.8
otros <0.01
Nutriente Y X/S Concentracin g/l
glucosa
0.5 18
(NH4)2SO4

2.8 2.14 fuente limitante
kH2PO4 (P)

13.4 0.67
MgSO4.7H2O
32 0.28
FeSO4.7H2O

77 0.12
CaCl2
181 0.05
NaCl
655 0.014
ZnSO4.7H2O
1140 0.008
MnCl2.6H2O
6925 0.0013
CoCl2.6H2O
8267 0.0011
MoO3
333000 0.00003
Ejemplo medio para X= 6 g/l de biomasa
Ejemplo:

Calcular la concentracin de glucosa que requiere para
producir una biomasa final de 6 g/l, en aerobiosis

Peso Glucosa: 180 g
% Ei en el nutriente: 40%




Y x/S
=
% Ei en el nutriente
% Ei en la clula
* F
Y x/S
=
40 * 0.6 0.5
48
=
=
So
X - Xo
YX/S
=
So
6 g/l - 0
0.5
=
* 1.5
18 g/l
Productividad volumtrica
y Productividad especfica
Desde el punto de vista de un proceso industrial, el solo
rendimiento no constituye elemento de juicio
suficiente para evaluar el comportamiento de una
fermentacin.
Es necesario considerar el factor cintico
Productividad volumtrica =
Masa de producto
Tiempo X Volumen
Productividad especfica =
Masa de producto
Tiempo X masa de clulas
Cintica de crecimiento de la S. cereviceae y del
consumo de sustrato (glucosa) en medio definido
Revisar los siguientes videos y
responder:

1. En general, qu se genera durante la fermentacin?
2. Cules son los aspectos importantes para la seleccin del medio de
fermentacin?
3. Qu es el sustrato limitante?
4. Por qu el rendimiento de Carbono en biomasa es menor para la levadura en
anaerobiosis que en aerobiosis (0.12 y 0.56 g/g, respectivamente)?
5. Por qu la melaza puede resultar un medio adecuado para fermentacin. En
qu caso se ha utilizado a nivel industrial?
6. En qu consiste la reaccin de Maillard y cmo afecta el medio de cultivo
para la fermentacin?