INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BILOGIC

Las cepas de referencia en las

pruebas de susceptibilidad a
antibiticos de uso clnico por
el mtodo de Kirby-Bauer y
Concentraciones Mnimas
Inhibitorias
P
R
E
S
E
N
T A
M. en C. SARA ARIADNA OCHOA PREZ

Antecedentes
1961, OMS, regularizar mtodos
empleados por los laboratorios para
determinacin de susceptibilidad
1971, FDA acept Kirby Bauer.
1979, CLSI (antes NCCLS) mtodos
establecidos
como
patrn
de
referencia para efectuar las pruebas
en discos de papel filtro.
ltima actualizacin: 2007

Instituto de estndares de
laboratorio clnico (Clinical and
Laboratory Standards
Institute=CLSI)
Organizacin
internacional,
interdisciplinaria, educacional,
no lucrativa que promueve el
desarrollo y uso de estndares
y directrices dentro del rea
de la salud

Finalidad de la susceptibilidad
a antimicrobianos (CLSI)
Desarrollar mtodos de referencia
Establecer parmetros de control de calidad
Establecer
criterios
de
interpretacin
de
resultados
Estrategias para ensayos y reportes con
relevancia clnica en efectividad y costo
Deteccin de mecanismos de : nuevos mtodos,
revisin de los actuales, criterios de interpretacin
y parmetros de control de calidad
Comunicacin con el usuario

Estndares de susceptibilidad
publicados por CLSI
Mtodos de referencia
Evaluar ensayos de susceptibilidad de
rutina para aislados clnicos
Evaluar dispositivos comerciales de uso en
el laboratorio clnico
Ensayar nuevos agentes antimicrobianos
Procesos de aprobacin o certificacin
(autoridades reguladoras)
CLSI documento M23: Desarrollo de E.S. a
antimicrobianos
in
vitro,
criterios
y
parmetros de control de calidad

Estndares para Ensayos de

Susceptibilidad a
Antimicrobianos
Documento
informativo
M100-S17.
Enero-2007 (ISBN 1-56238-625-5)
M2A9 Estndares para ensayos de
susceptibilidad a antimicrobianos por
la tcnica de difusin en disco (9a.ed.)
M7A7 Estndares para ensayos de
susceptibilidad a antimcrobianos por
la tcnica de dilucin, para bacterias
de crecimiento aerobio (7a.ed.)

OBJETIVO
Determinar la resistencia sensibilidad in
vitro, a determinados antimicrobianos en
bacterias de crecimiento rpido.

Enterobacteriaceae,

Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus spp.

Enterococcus spp.

Acinetobacter spp.

Burkholderia cepacia

Stenotrophomonas maltophilia
Practicar
la
determinacin
de
lactamasas.

Objetivos en la prctica
mdica:
Susceptibilidad del microorganismo in
vitro
Relacin de susceptibilidad entre el
microorganismo y bacterias de la
misma especie
Propiedades farmacolgicas
Experiencia clnica previa de la
eficacia del antimicrobiano
Historia
natural
del
proceso
patolgico
Estado inmune del husped

Mtodo a elegir:
No. De pruebas
que
procesen en laboratorio

se

Tipo de microorganismo
Cultivos puros de bacteria :
sitios estriles
Mecanismo de patogenicidad

FUNDAMENTO
DISCOS DE PAPEL
CONCENTRACIN
ANTIMICROBIANO
FORMACIN
INHIBICIN

DE

DEL
HALOS

SE MIDEN EN mm
PROPORCIONALES A LA CMI

DE

Cepas de referencia en KirbyBauer

Bacterias de crecimiento no
exigente
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli ATCC 35218

(combinacin de -lactmico/

Inhibidor de -lactamasas)
Staphylococcus aureus ATCC
25923
Pseudomonas aeruginosa ATCC

Cepas de referencia en KirbyBauer

Bacterias de crecimiento
exigente
Haemophilus influenzae ATCC
49247
Haemophilus influenzae ATCC
49766
Neisseria gonorrhoeae ATCC
49226
Streptococcus pneumoniae
ATCC

Cepas de referencia especiales

S. aureus ATCC BAA-977 (resistencia
inducible a clindamicina mediada-ermA)
S. aureus ATCC BAA-976 (resistencia a
macrlidos-Efflux mediado-msrA)
Enterococcus faecalis ATCC 29212
(HLAR con Discos de gentamicina 120
g y estreptomicina 300 g)
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
(ensayos de -lactamasas de espectro
extendido)

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
DE KIRBY-BAUER.
Indicaciones
Microorganismos con espectro no
predecible
Pacientes alrgicos a penicilina pero
con cepas sensibles
Investigacin para susceptibilidad de
neumococo a penicilina
Determinar MRSA en Staphylococcus y
SCN
Determinar resistencia a vancomicina
en S. aureus, SCN, Enteroccocus
Resistencia a carbapenemas y SBL en

PRUEBA DE SUSCPTIBILIDAD
DE KIRBY-BAUER.
INDICACIONES

Casos invasivos
Staphylococcus aureus
Streptococcus
pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Proteus spp.
Providencia spp.
Hafnia spp.
Citrobacter spp.
Acinetobacter spp.
Enterococcus spp.

PRUEBA DE
SUSCEPTIBILIDAD DE KIRBYBAUER.
Casos especiales
pero no se
requiere

NO SE
REQUIERE

Neisseria meningitidis
Neisseria gonorrhoeae
Clostridium perfringens
Bacillus anthracis
Corynebacterium
diphtheriae
Actinomyces israeli
Bordetella pertussis
Brucella melitensis
Streptococcus pyogenes

INTERPRETACIN
SENSIBLE, INERMEDIO,
RESISTENTE

Depende del antibitico y

bacteria

Dimetro de zona mnima y

mxima
Seleccionar antibitico

Condiciones para KIRBYBAUER.

Condiciones ptimas
Medio: agar Mueller-Hinton
Inculo: Crecimiento en caldo o
suspensin directa de la colonia,
equivalente a la escala 0.5 del
Nefelmetro de McFarland
Incubacin: 35 +/- 20C en
ambiente aerobio de 16-18 h
Acinetobacter spp., B. cepacia,
S. maltophilia: 20-24 h

Condiciones para KIRBY-BAUER

en H. influenzae y H.
parainfluenzae
Medio: HTM
Mueller Hinton con sangre de
caballo al 10%, Isovitalex (BBL) o
polienriquecimiento
1%
(Difco,
Bioxon) o extracto de Fildes al 10%

Inculo: Suspensin directa de

la colonia, equivalente a la
escala 0.5 del Nefelmetro de
McFarland
Incubacin: 35 +/- 20C, 5% CO2,
16-18 h

Condiciones para KIRBYBAUER en Neisseria

gonorrhoeae

Medio: Base GC suplementado con

1% de polienriquecimiento o
Isovitalex
Suplemento: L-cistena, guanina, tiamina,
PABA, B12, NAD, adenina, L-glutamina,
glucosa, nitrato frrico

Inculo: Suspensin directa de la

colonia, equivalente a la escala 0.5
de McFarland
Incubacin: 36 +/- 10C (no exceder
de 370C), 5% CO2, 20-24 h

Condiciones para KIRBY-BAUER

en S. pneumoniae y
Enterococcus spp.
Medio: agar Mueller Hinton con 5%
sangre de carnero
Inculo: Suspensin directa de la
colonia, equivalente 0.5 de
McFarland
Incubacin: 35 +/- 20C, 5% CO2, 2024 h

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
DE KIRBY-BAUER.
Control de calidad
Evaluar el antimicrobiano (uno de cada
grupo, dentro de la caducidad)
La FDA recomienda discos de papel filtro,
grosor diametro, concentracin de
antimicrobiano determinado.
Medio de Mueller Hinton pH 7.2-7.4, grosor
de placa de 0.5 mm, no ms de 7d de
preparacin
LIMITACIONES DEL METODO
Microorganismos de crecimiento rapido
Cultivos puros

PRUEBA DE SUSCPTIBILIDAD
DE KIRBY-BAUER.
Staphylococcus a penicilina:
- Probar discos de oxacilina de 1 g/mL

- e intermedios en medio suplementado con NaCl

al 2% o medio Mueller-Hinton con NaCl al 4% y
6 g/mL de oxacilina (pba de escrutinio).

Enterococcus:
- Sensibilidad a vancomicina por el metodo de

dilucin en placas de agar.

- Prueba de escrutinio en placas de (BHI) 6 g/mL
vancomicina, 500 g/mL gentamicina y 2000 g/mL
estreptomicina

Mtodo de difusin en discos

de papel filtro KIRBY-BAUER
Material
Cajas de Petri de 15 cm (10cm) de
dimetro con medio Mueller Hinton
Tubos 13 x100 T/R con 4 mL de caldo
Mueller-Hinton (ajustar inculo)
Hisopos de al algodn estriles
Pinzas
Tubo 0.5 del Nefelmetro de McFarland
Sensidiscos individuales para Gram
positivos y Gram negativos seleccionados
segn el microorganismo problema)
Cepa de referencia
Regla

FORMACION DE HALO

Kirby- Bauer

Kirby- Bauer
Tira- E

Tincin Plata

CONCENTRACIN MNIMA
INHIBITORIA (CMI MIC) :
Es la concentracin del antibitico
que se necesita para inhibir el
crecimiento de una bacteria
Se mide en g/mL y es diferente
para cada especie bacteriana
Se realiza en caldo agar a travs
de la inhibicin de crecimiento

CONCENTRACIN
MNIMA INHIBITORIA
Se realiza en Hospitales
Replicador de Steers
Mtodo de dilucin seriada en
placas de agar o tubos de caldo
Gelosa Mueller Hinton
Microscan

CONCENTRACIN MNIMA
INHIBITORIA
Material
Tubos 16x150 TR con agar MH mantenido
a 450C.
Tubos con sol diluyente (agua
desionizada, PBS pH 6.0, DMSO, c.
Actico glacial, c. Hidroclorhdrico)
Placas de Petri estriles vacias
Tubos con caldo MH para inculo
Hisopos
Sales de antibiticos (Stock=5120 g/mL)
Replicador de Steers
Cepas de referencia

Cepas de referencia en CMI

S. aureus ATCC 29213

E. faecalis ATCC 29212, 51219
E. coli ATCC 25922
E. coli ATCC 35218
P. aeruginosa ATCC 27853
H. influenzae ATCC 49247, 49766
S. pneumoniae ATCC 49619
Helicobacter pylori ATCC 43504

CMI por dilucin seriada en placa de agar con replicador de Steers. (NCCLS.
Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved
Standard- 9th Edition 2002) y Ensayo de tira-E (Ensayo de Epsilmetro; AB Biodisk,
Solna, Sweden 2001).
Descongelar
-700C

Gelosa Casman-10% SCb

Microaeroflia 370C/3-5 d
Confirmaron: UR (+), Gram (-)
Catalasa (+), oxidasa (+)
c. Nalidxico (R ), Cefalotina (S)

Dilucin seriada en placa con

Replicador de Steers
Caldo Brucella-10% SC
Escala 2.0 MF

Tira -E (AB Biodisk,Sweder 2001)

VALORES (NCCLS. 9th Ed 2002)

Cepa

Valores
de Am
(g/ml)

Valores
de Tt
(g/ml)

Valores
de CH
(g/ml)

H.pylori
ATCC
43504

0.015
--0.125

0.125 1.0

0.015
0.125

S.aureus
ATCC
29213

0.125 0.5

0.125 1.0

0.125 0.5

Replicar con Steers

250 L

Caldo Brucella-10% SC
Escala 3.0 MF

250 L

Absorber 10-15 min

VALOR
DE
CORTE

4.0

2.0

Mueller Hinto-10% SCb

Conc. 0.015-512 g/ml
Determinar
Por duplicado.

1.0

MICs

Helicobacter pylori
ATCC 43504

Mtodo: Dilucin seriada

En agar con replicador
De Steers
Antimicrobiano:
Metronidazol
Conc. de la placa:
32 g/ml
Pozo No. 1 Cepa de
referencia
H.pylori ATCC 43504
Pozo No. 2-26 Cepas
clnicas
De H.pylori

E-test para H.pylori

CMI 0.125 gLml

CMI 32 gLml

DETERMINACIN DE LACTAMASAS
INHIBEN
LA
SNTESIS
PARED BACTERIANA

DE

EFECTO BACTERIOSTTICO Y
BACTERICIDA
EXISTEN LACTAMASAS, SE
DETECTAN POR PRODUCCIN
DE CIDO PENICILOICO

DETECCIN DE CIDO
PENICILOICO
ACIDOMTRICO
YODOMTRICO
CEFALOSPORINA COLORIDA:
Cefinase
-LACTAMASAS:
PERIPLSMICO
NEGATIVAS

DE

ESPACIO
GRAM

CLASIFICACIN BUSH:
1

CEP-N Hidrolisan cefalosp no inhibidas por ac

clavulan

2a

PEN-Y Hidrolisan penis. Inhibidas por ac

clavulan

2b

BDS-Y Amplio espectro inhib por ac clav

2b

EBS-Y Amplico espectro.inhib ac clav

2c

CAR-Y Hidrolisan carbencilina, inhib por ac

clav

2d

CLX-Y

2e

CEP-Y Hidrolisan cefalosp, inhib por ac clav

MET-Y Metalobetalactamasas no inhib por ac

clav

PENN

Hidrolisan cloxacilina, inhib ac clav

Hidrolisan por penicilina, no inhib por

ac clav

DETERMINACIN DE LACTAMASAS
MTODO DE CEFINASE
S. aureus y/o E. coli,
Pseudomonas, Haemophilus, S.
pneumoniae que haya dado
resistencia a penicilina, ampicilina
Oxacilina a veces
BETA LACTAMASAS
Utiliza discos de papel filtro
impregnados con el reactivo
Cefalosporina colorida

GRACIAS