CROMATOGRAFIA

Es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen

entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran rea
superficial, y la otra es un fluido (fase mvil) que pasa a travs (se infiltra) de la fase
estacionaria y que son dos fases mutuamente inmiscibles.
Estos mtodos utilizan una fase fija o estacionaria y una fase mvil
Medio fsico de las fases

Cromatografa en columna

CLASIFICACION

Cromatografa Plana
Tipo de fase mvil

Cromatografa gaseosa
Cromatografa lquida

la fase estacionaria slo puede ser un lquido o un slido

CROMATOGRAFIA

Separacin por tamao molecular (Cromatografa de permeacin de gel, de tamiz

molecular o de exclusin por tamaos).
Parmetros de columna
- Intervalo de trabajo: intervalo de M que pueden ser separados
- Lmite de exclusin: M mnimo a partir del cual las macromolculas no
experimentan retencin.
Las molculas pequeas penetran en los
poros de las partculas de gel, por lo que
necesitan ms tiempo para salir al final de
la columna. Las molculas grandes, en
cambio, al no penetrar en las partculas de
gel se mueven con el disolvente a una
velocidad mayor de elucin y salen antes
de la columna. Por tanto, a mayor masa
molecular menor tiempo de elucin. Este
mtodo permite separar por tamaos
moleculares siendo posible obtener incluso
distribuciones de masas moleculares a
distintos tiempos de elucin.

CROMATOGRAFIA
Separacin por Intercambio inico
La separacin se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de
iones de los componentes de la muestra.
Las especies cargadas
negativamente se unen a la
matriz slida cargada
positivamente y son retenidas,
mientras que las especies
positivas son rechazadas. De
esta manera en funcin de la
carga las especies se eluyen a
distintos tiempos dando lugar a
la correspondiente separacin.
La elucin de las especies
retenidas se consigue
cambiando el pH del disolvente
hasta igualarlo a su punto
isoelctrico o hasta invertir su
carga neta.

CROMATOGRAFA
Mecanismos de separacin
a) Separacin por adsorcin (cromatografa de adsorcin)
Diferente afinidad de los componentes de la muestra sobre la superficie
de un slido activo (componentes con polaridad baja o media)
b) Separacin por reparto (cromatografa de reparto)
Diferente solubilidad en fases estacionaria y mvil (Componentes con
polaridad media o alta)

CROMATOGRAFIA
Proceso de elucin : La
elusin es un proceso en el
cual los solutos son
arrastrados a travs de una
fase estacionaria por el
movimiento de una fase
mvil. La fase mvil que
sale de la columna se
denomina eluato.
Un eluyente es un
disolucin que se usa para
transportar los componentes
de una mezcla a travs de
una fase estacionaria

CROMATOGRAFIA

a.- cromatograma original con solapamiento

b.-mejora continua mediante un incremento de la separacin de
las bandas
c.- mejora con un decrecimiento de las anchuras de bandas

CROMATOGRAFIA
Parmetros bsicos en cromatografa
Constante de distribucin

La transferencia de una analito entre las fases

estacionaria y la mvil

CS = moles/Litro de analito
en la fase estacionaria.
CM = moles/Litro de analito
en la fase mvil.
El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona de
soluto conforme la fase mvil avanza a lo largo de la columna.

CROMATOGRAFIA

Parmetros bsicos en cromatografa

Tiempo de retencin tR:
Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico
de concentracin del analito alcanza el detector;
Tiempo muerto tM Es el tiempo
necesario para que la especie no
retenida alcance el detector

tR = tiempo de retencin corregido

tR = tR - tM

CROMATOGRAFIA
Parmetros bsicos en cromatografa

La velocidad lineal
promedio de migracin del
soluto v es

Velocidad de migracin del soluto

Si L es el largo de la columna
la velocidad lineal promedio u del
movimiento de las molculas de la fase
mvil
V = u x fraccin de tiempo que pasa
el soluto en la fase mvil
vu

moles de soluto en la fase mvil

moles totales de soluto

vu

CM

C M VM
u
VM C S VS

1
C V
1 S S
C M VM

L
tM

L
v
tR

Se puede definir un Volumen de

retencin como VR = tR . Qc
Qc Caudal volumtrico de la fase mvil

v u

1
1 K

VS
VM

CROMATOGRAFIA
Parmetros bsicos en cromatografa
Factor de retencin k Es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria
en relacin con el tiempo transcurrido en fase mvil
V
1
k' K S
v u
VM
Determinacin desde un cromatograma

L
L 1

tR
t M 1 k'

tR - tM
k'
tM

1 k'
t' R

tM

K menores que 1 elucin demasiado rpida no se logra separacin de los componentes

K mayor a 20 o 30 eluciones muy lentas picos muy anchos y superpuestos.
K entre 1 y 5 valores ptimos de trabajo.
Retencin relativa o factor de selectividad
La retencin relativa o factor de selectividad, de dos solutos, donde el soluto A
eluye antes del soluto B, es
B es la especie ms fuertemente
K B k' B (t R ) B - t M t' B retenida A menos retenida

KA

k' A

(t R ) A t M

t' A

es siempre mayor a 1

CROMATOGRAFIA
Parmetros bsicos en cromatografa
Resolucin cromatogrfica RS

es una medida cuantitativa de su capacidad para

separar dos analitos

RS = 1,0, que corresponde aproximadamente

a un 3% de sobreposicin (4 )
RS = 1.5 (para 6) representa una resolucin
completa, con slo 0.2% de sobreposicin

CROMATOGRAFIA
Parmetros bsicos en cromatografa
Refleja el nmero de veces que el soluto se reparte
Eficiencia en cromatografa entre las dos fases durante su paso a travs de la
columna.
El nmero efectivo de platos
L es la longitud de la columna, H es la altura del plato
L
L
nos sirve para comparar columnas de diferentes longitudes
N
H
H
N
La altura del plato H, es la distancia que el soluto se
mueve mientras se lleva a cabo un reparto. La altura
del plato es una buena forma de expresar la
eficiencia de la columna en unidades de longitud, sin
especificar la longitud de la columna
Como la eficiencia se mide en funcin de la
amplitud de la curva gaussiana, podemos
entonces expresarla en funcin de la desviacin
standard

tR
N 16

CROMATOGRAFIA
Cromatografa de gases (Gas-Lquido)
Distribucin de un componente entre una fase mvil gaseosa
y una lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido
inerte.
Componentes bsicos
- Gas portador segn detector (He, Ar, N2, CO2, H2)
- Sistema de inyeccin de muestra
- Columnas
Caracterizacin

Sistema de inyeccin de muestra

Inyector directo de vaporizacin instantnea

CROMATOGRAFIA

Columna
Es el lugar donde ocurre la separacin. Se dice que es el corazn de un cromatgrafo.
Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: cobre,
aluminio, acero inoxidable, vidrio tefln.
El relleno puede ser un slido, un lquido recubriendo un slido.
Podemos clasificar las columnas segn el propsito del proceso cromtografico
Empacadas
Analtica
Preparativas
Capilares
W.C.O.T. (Wall Coated Open
Tubular)
S.C.O.T. (Support Coated Open
Tubular)

Factores que Afectan la Eficiencia de una

Columna
Longitud de la Columna
Dimetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de
dimetro externo)
Tamao de las partculas del relleno
Naturaleza de las fases
Cantidad de fase estacionaria
Temperatura de la columna
Velocidad del gas portador
Cantidad de muestra inyectada
Material del cual est elaborada la columna
Enrollado de la columna

CROMATOGRAFIA
Soporte
La funcin bsica del soporte es la
de "mantener" (sostener, retener)
la fase estacionaria. Idealmente
debera ser un material inerte que
"mantiene" la fase estacionaria
sobre su superficie como una
pelcula delgada.
La mayora de los soportes
cromatogrficos est hecha de
diatomita. Qumicamente es casi
todo slice, con algunas
impurezas. Tambin se conoce
como Tierras Diatomceas
Kiselguhr (palabra alemana).
Domina el campo de los soportes
debido a su estructura,
superficie y disponibilidad.

Un buen soporte debe reunir las siguientes

caractersticas:
Elevada Superficie por unidad de volmen
Estabilidad Trmica
Dureza mecnica suficiente para que pueda
resistir los procedimientos de revestimientos y
relleno
Inactividad qumica o de adsorcin
Baja resistencia al paso de la fase mvil

CROMATOGRAFIA
Fase Estacionaria Lquida
polaridad de una fase estacionaria lquida se refiere a las interacciones
intermoleculares que involucra dipolos permanentes.
Selectividad es definida como las diferentes atracciones intermoleculares
cualidades ha de reunir un lquido para servir como fase estacionaria:
Viscosidad
Tensin Superficial
Tensin de Vapor
Selectividad respecto a los componentes de la fase mvil
Reversibilidad del Reparto
Estabilidad Trmica
Gas Portador : Propsitos
Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el
detector
Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase
estacionaria)
Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa
Fcilmente disponible y puro
Econmico
Adecuado al detector a utilizar

CROMATOGRAFIA
Detectores
Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas
a la salida de la columna cromatogrfica. Podemos expresar que el detector son
los "ojos" de un cromatgrafo.
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible
directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la
naturaleza y magnitud de la propiedad fsica.
En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el
gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes
que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una
seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador
grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los
componentes.

CROMATOGRAFIA
Clasificacin de los detectores
Detectores segn su Grado de Selectividad :
Universales. Responde a la mayora de los solutos que pasan por l.
Especficos Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de
substancias con un mnimo de respuesta a otras.
Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificacin, es en referencia a si la
muestra es destruida o no.
Detectores segn su Modo de Respuesta:
Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la
cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es
independiente del volumen de gas portador requerido para la elucin.
Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad de
soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a travs de l.
Detectores segn el proceso de deteccin Ionizacin, ptico-espectroscpico,
Electroqumico, etc.

CROMATOGRAFIA
Caractersticas de los Detectores
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una
seal elctrica medible.
Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector
mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado
prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin
para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la curva de linealidad:
El lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin y,
El lmite Superior, definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la curva
de linealidad, normalmente se toma un 5% de desviscin.
Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es
constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El
significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la
determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal.
Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de substancia que puede
producir una seal que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un
detector est operativo sin que alguna substancia pasa a travs de l. Esta seal es
muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.

Detector de ionizacin de llama

Uso: Compuestos orgnicos que se someten a pirlisis en la llama forman intermediarios inicos
que conducen electricidad.

Se mezcla el hidrgeno con el gas acarreador y el

eluyente mezclado con oxgeno se quema en un
mechero equipado con un par de electrodos. El
detector registra la corriente generada por el
cmulo de iones y electrones producidos en los
electrodos durante el proceso de combustin.
La ionizacin en la llama de los compuestos que
contienen carbono es un proceso bien
establecido, el nmero de iones que se produce
es relativamente proporcional al N de tocmo
de C reducidos en la llama. El detector de
ionizacin de llama respondeal n de tomos de
carono que entra en el detector por unidad de
tiempo, es ms un detector sensible a la masa
que un sistema sensible a la concentracin

Desventaja: destruye la muestra en

el proceso de deteccin

DETECTORES DE EMISIN ATMICA