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SALESIANA
BIOLOGA MOLECULAR
MARCADORES
MOLECULARES: AFLPs
POR: Dayana Castillo
Evelyn Oa
Andrea Polo
Daniel Regalado
Mnica Yuquilema
6to B
OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVO GENERAL:
Estandarizacin de
la tcnica de AFLP (Amplified
Fragment-Length Polymorphisms) en materiales Dura
del Programa de Fitomejoramiento de CENIPALMA.
1.2 OBEJTIVO ESPECFICOS:
Conocer la tcnica de AFLP (Amplified FragmentLength Polymorphisms) en investigaciones de origen
vegetal.
Observar los resultados que se obtiene con la
aplicacin de dicha tcnica en el presente proyecto.
RESUMEN
La palma de aceite (Elaeis guinnensis Jacq.) desempea un importante papel en
la economa de algunos pases tropicales.
Se determin que para teir los geles de poliacrilamida se utiliza nitrato de plata
y agua destilada deionizada (Milli Q)
Es una planta
perenne tropical
originaria de frica
Central .
Incremento en la
produccin de
aceite
Se cultiva
ampliamente en el
trpico hmedo
El Centro de Investigacin
(CENIPALMA) busca
fortalecer un Programa de
Fito mejoramiento de
palmas tipo Dura.
Los programas de
mejoramiento estn
orientados hacia el
aumento de la
produccin de racimos
por palma.
Variabilidad
gentica existente
dentro de la
especie o especies
intercruzables
Identificar
individuos con
caractersticas
deseables
Genes disponible
para el
mejoramiento del
cultivo
Marcadores
Moleculares tipo
RFLP y AFLP
Obtener mejor
adaptacin con los
ms altos
rendimientos
MATERIALES Y
MTODOS
L
E
D
O
N
C
I
I
M
C
C
A
N
E
R
T
G
X
E
N
D
A
agregar 85 L de SDS
(dodesilsulfato de
sodio) al 20%.
La mezcla se incub a
20 C durante toda la
noche.
En un tubo
Epependorff se tom
500 mg de tejido
molido.
Despus se centrifug
a 25.000 xg durante
30 min.
El sobrenadante se
transfiri a un tubo, al cual
se adicion 1 mL de
isopropanol
Fro.
Desechar el lquido
teniendo cuidado de
no perturbar el botn
de ADN.
El botn de ADN, se
lav con 2 mL de etanol
al 70% para luego
centrifugarlo a 25.000
xg durante 3 min.
Adicionar 350 L de
solucin TE-ARNasa
(10 mM de Tris HCl a pH
8,0; 1 mM de EDTA a pH
8,0; 5 mg mL-1 de
ARNasa)
Se incub a 37 C
durante 15 min
El ADN obtenido se
almacen a 4 C para
su posterior utilizacin.
CUANTIFICACIN DEL
ADN
Se utiliz un mtodo comparativo teniendo como patrn de
referencia un ADN genmico de tomate de concentracin conocida.
A
C
I
N
C
E
D
P
L
F
A
El termociclador se program a
94C durante 30 segundos,
56C durante 60 segundos y
72C durante 60 segundos por
20 ciclos.
Dicho resultado se corrobor
en una electroforesis en gel de
agarosa al 1% con una
posterior dilucin 1:10
Para la amplificacin se
tomaron 5uL de la
dilucin, 5uL del mix
( primer + 3dNTPs) y
10uL del mix 2 (taq
polimerasa + buffer
10X).
Para la preamplificacin se
tomaron 5uL de una
dilucin 1:10 del resultado
de la ligacin y se
agregaron 40uL de la
mezcla de cebadores con
un nucletido seleccionante
con 5uL de buffer 10X con
Mg y 1uL de TaQ ADN
polimerasa
En el termociclador se programo a
94C durante 30 segundos para
denaturar la molcula, 65C durante
30 segundos para alinear los
cebadores y 72C durante 60
segundos para la polimerizacin
Posteriormente la temperatura
de alineamiento bajo a 0,7C en
cada ciclo durante 12 ciclos
(touch down) y continu con
94C durante 30 segundos, 56C
por 60 s y 72C por 60 segundos
a lo largo de 23 ciclos
El producto de la
amplificacin se observ en
gel de poliacrilamida al 5% y
8M de urea a 100voltios
durante 2 horas o hasta que
la banda de Xilene-Cyanol
llegar a la parte inferior del
gel
Despus se sumergi en la
solucin de revelado ( 60g
de Na2CO3, 3mL de
formaldehido al 37% y 400uL
de tiosulfato de sodio) en 2
litros de agua. Durante 10
minutos hasta que se
visualicen las bandas
ANLISIS DE DATOS
Las Bandas polimrficas en el gel fueron contadas visualmente con la ayuda de un transiluminador de
luz blanca.
Se gener una matriz binaria en la que las bandas fueron contadas como `1` presente y `0` ausente. En
donde la matriz binaria fue convertida a una matriz de similaridad.
En donde Sij es la similitud entre los individuos i y j , a es el nmero de bandas presentes en ambos i y j,
b es el numero de bandas presentes en i y ausentes en j , c es el numero de bandas presentes en j y
ausentes en i.
El dendograma fue construido a partir dela matriz de similaridad agrupando los datos con el mtodo de
UPGMA. El anlisis de coordenadas se bas en la matriz de similaridad utilizando los algoritmos
DCENTER y EIGEN y todos los datos se analizaron con el Software NTSYS pc versin 2. 11 L
RESULTADOS
Uno de los cambios
fue:
El uso de SDS
(dodecil sulfato de
sodio)
SDS, al mercaptoetanol
Electroforsis: Gel de
Agarosa
Extraccin y
Cuantificacin
Detergente
aninico
Funcin: Solubilizar
protenas y
membranas;
ptima extraccin de
ADN
(pequeas cantidades
de
tejido foliar)
Funcin inhibitoria
de la oxidacin de
compuestos fenlicos
Determina la
calidad del ADN
extrado
Identificar compuestos :
ARN o protenas que pueden
interferir en las reacciones
posteriores, ocasionando
problemas
No tiene impurezas(ARN o
protenas)
No presentan degradacin
las bandas por parte de las
ARNasas
MTODO DE
CUANTIFICACIN
Insuficiente digestin de las
enzimas
TCNICA DE AFLP
La primera
modificacin
La cantidad de
ADN con que se
inici la digestin
enzimtica:
El producto de
Posteriormente
pre
realizar
amplificacin
la reaccin de
se
amplificacin con los
diluy 1:50
cebadores
(RM)
Los productos de PCR
Se observaron en una electroforesis
en gel de poliacrilamida
Se evaluaron las 2 diluciones de la
pre amplificacin
El otro
problema
Deficiente calidad de la tincin
cuando se utiliza agua de
consumo humano (tiene
contaminantes, halgenos y/o
iones metlicos).
Generaron turbidez en la
solucin