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UNIVERSIDAD POLITCNICA

SALESIANA
BIOLOGA MOLECULAR
MARCADORES
MOLECULARES: AFLPs
POR: Dayana Castillo
Evelyn Oa
Andrea Polo
Daniel Regalado
Mnica Yuquilema
6to B

Estandarizacin de la tcnica molecular de AFLP en palma de


aceite tipo Dura (Elaeis guineensis Jacq.) y estudio preliminar de
caracterizacin.
Carlos Hernando Galeano
Universidad Nacional de Colombia
Bogot, Colombia

OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVO GENERAL:
Estandarizacin de
la tcnica de AFLP (Amplified
Fragment-Length Polymorphisms) en materiales Dura
del Programa de Fitomejoramiento de CENIPALMA.
1.2 OBEJTIVO ESPECFICOS:
Conocer la tcnica de AFLP (Amplified FragmentLength Polymorphisms) en investigaciones de origen
vegetal.
Observar los resultados que se obtiene con la
aplicacin de dicha tcnica en el presente proyecto.

RESUMEN
La palma de aceite (Elaeis guinnensis Jacq.) desempea un importante papel en
la economa de algunos pases tropicales.

En esta especie el mejoramiento gentico busca generar materiales con alta


produccin de aceite y adaptados a las caractersticas edafoclimticas de las
diferentes zonas palmeras.
Al protocolo de AFLP se le realizaron algunas modificaciones, como el aumento
de la concentracin del ADN (270 ng L-1) y la dilucin 1:10 del producto de la
preamplificacin.

Se determin que para teir los geles de poliacrilamida se utiliza nitrato de plata
y agua destilada deionizada (Milli Q)

Tambin se realiz un estudio preliminar de caracterizacin molecular en 12


palmas de los tipos Dura, Tnera y E. oleifera.

Palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq)

Es una planta
perenne tropical
originaria de frica
Central .

Incremento en la
produccin de
aceite

Se cultiva
ampliamente en el
trpico hmedo

El Centro de Investigacin
(CENIPALMA) busca
fortalecer un Programa de
Fito mejoramiento de
palmas tipo Dura.

Los programas de
mejoramiento estn
orientados hacia el
aumento de la
produccin de racimos
por palma.

Variabilidad
gentica existente
dentro de la
especie o especies
intercruzables

Identificar
individuos con
caractersticas
deseables

Genes disponible
para el
mejoramiento del
cultivo

Marcadores
Moleculares tipo
RFLP y AFLP

Obtener mejor
adaptacin con los
ms altos
rendimientos

MATERIALES Y
MTODOS

El material vegetal utilizado para la estandarizacin de AFLP correspondi a


palmas Dura de la Zona Central (departamento de Santander, municipio de
Puerto Wilches.

Consistieron en foliolos jvenes y sanos de la hoja.

Colectaron otros materiales de palma de aceite de las Zonas Central y Norte


(departamento del Atlntico, municipio de Fundacin

12 seleccionaron para realizar una evaluacin preliminar de la diversidad


gentica de las muestras: Dura, Tnera y E. oleifera

L
E
D
O
N
C

I
I
M
C

C
A
N
E
R
T
G
X
E

N
D
A

El tejido foliar fue


pulverizado con
ayuda de nitrgeno
lquido

agregar 85 L de SDS
(dodesilsulfato de
sodio) al 20%.

La mezcla se incub a
20 C durante toda la
noche.

En un tubo
Epependorff se tom
500 mg de tejido
molido.

Incubar en bao mara a


65C durante 30 min
Agregaron 390 L de
acetato de potasio 5 M.

Despus se centrifug
a 25.000 xg durante
30 min.

Agregar: 1,2 mL de solucin


de extraccin caliente
(Tris HCl 100 mM, EDTA 50
mM, NaCl 500 mM, mercaptoetanol 10 mM y
PVP 1% [p/v]

El sobrenadante se
transfiri a un tubo, al cual
se adicion 1 mL de
isopropanol
Fro.

Desechar el lquido
teniendo cuidado de
no perturbar el botn
de ADN.

El botn de ADN, se
lav con 2 mL de etanol
al 70% para luego
centrifugarlo a 25.000
xg durante 3 min.

Adicionar 350 L de
solucin TE-ARNasa
(10 mM de Tris HCl a pH
8,0; 1 mM de EDTA a pH
8,0; 5 mg mL-1 de
ARNasa)

Se incub a 37 C
durante 15 min

El ADN obtenido se
almacen a 4 C para
su posterior utilizacin.

CUANTIFICACIN DEL
ADN
Se utiliz un mtodo comparativo teniendo como patrn de
referencia un ADN genmico de tomate de concentracin conocida.

Se realiz una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % (p/v) en


donde se coloc el ADN de tomate a diferentes concentraciones,

La concentracin de las muestras se determin segn la intensidad


de fluorescencia emitida por el bromuro de etidio.

A
C
I
N
C

E
D

P
L
F
A

Digestin con las


enzimas EcoRI/MseI
(1,25U/uL-1), las cuales
se las incuba con 270ng
de ADN durante 2 horas
a 37C.

El termociclador se program a
94C durante 30 segundos,
56C durante 60 segundos y
72C durante 60 segundos por
20 ciclos.
Dicho resultado se corrobor
en una electroforesis en gel de
agarosa al 1% con una
posterior dilucin 1:10

Se adicion 24uL de una


mezcla de adaptadores
que junto con la enzima
T4 ligasa se unieron a
los extremos cohesivos
dejados por las enzimas
de restriccin.

Para la amplificacin se
tomaron 5uL de la
dilucin, 5uL del mix
( primer + 3dNTPs) y
10uL del mix 2 (taq
polimerasa + buffer
10X).

Para la preamplificacin se
tomaron 5uL de una
dilucin 1:10 del resultado
de la ligacin y se
agregaron 40uL de la
mezcla de cebadores con
un nucletido seleccionante
con 5uL de buffer 10X con
Mg y 1uL de TaQ ADN
polimerasa

En el termociclador se programo a
94C durante 30 segundos para
denaturar la molcula, 65C durante
30 segundos para alinear los
cebadores y 72C durante 60
segundos para la polimerizacin

Posteriormente la temperatura
de alineamiento bajo a 0,7C en
cada ciclo durante 12 ciclos
(touch down) y continu con
94C durante 30 segundos, 56C
por 60 s y 72C por 60 segundos
a lo largo de 23 ciclos

Luego se incub en una solucin de


tincin (2g de AgNO3, 3mL de
formaldehidol 37% en 2L de agua)
durante 30 minutos.
El exceso de plata se retir lavando
con agua destilada deionizada
durante 10 segundos

El producto de la
amplificacin se observ en
gel de poliacrilamida al 5% y
8M de urea a 100voltios
durante 2 horas o hasta que
la banda de Xilene-Cyanol
llegar a la parte inferior del
gel

Despus se sumergi en la
solucin de revelado ( 60g
de Na2CO3, 3mL de
formaldehido al 37% y 400uL
de tiosulfato de sodio) en 2
litros de agua. Durante 10
minutos hasta que se
visualicen las bandas

Para la tincin se coloc el


gel en una solucin de cido
actico al 10% durante 20
minutos y se lavo por un
minuto dos veces con agua
destilada deionizada

Finalmente el gel se coloc


en una solucin de cido
actico al 10% para detener
la reaccin y se lav con
agua destilada deionizada.

ANLISIS DE DATOS
Las Bandas polimrficas en el gel fueron contadas visualmente con la ayuda de un transiluminador de
luz blanca.
Se gener una matriz binaria en la que las bandas fueron contadas como `1` presente y `0` ausente. En
donde la matriz binaria fue convertida a una matriz de similaridad.

En donde Sij es la similitud entre los individuos i y j , a es el nmero de bandas presentes en ambos i y j,
b es el numero de bandas presentes en i y ausentes en j , c es el numero de bandas presentes en j y
ausentes en i.
El dendograma fue construido a partir dela matriz de similaridad agrupando los datos con el mtodo de
UPGMA. El anlisis de coordenadas se bas en la matriz de similaridad utilizando los algoritmos
DCENTER y EIGEN y todos los datos se analizaron con el Software NTSYS pc versin 2. 11 L

RESULTADOS
Uno de los cambios
fue:
El uso de SDS
(dodecil sulfato de
sodio)
SDS, al mercaptoetanol

Electroforsis: Gel de
Agarosa

Extraccin y
Cuantificacin
Detergente
aninico
Funcin: Solubilizar
protenas y
membranas;

ptima extraccin de
ADN
(pequeas cantidades
de
tejido foliar)

Funcin inhibitoria
de la oxidacin de
compuestos fenlicos

Fue posible obtener ADN


de alta calidad

Determina la
calidad del ADN
extrado
Identificar compuestos :
ARN o protenas que pueden
interferir en las reacciones
posteriores, ocasionando
problemas
No tiene impurezas(ARN o
protenas)
No presentan degradacin
las bandas por parte de las
ARNasas

MTODO DE
CUANTIFICACIN
Insuficiente digestin de las
enzimas

TCNICA DE AFLP

Diluciones: (1:50 y 1:10)

La primera
modificacin
La cantidad de
ADN con que se
inici la digestin
enzimtica:

Utilizaron 270 ng,


(20 ng) + de lo
sugerido por la casa
comercial.

El producto de
Posteriormente
pre
realizar
amplificacin
la reaccin de
se
amplificacin con los
diluy 1:50
cebadores
(RM)
Los productos de PCR
Se observaron en una electroforesis
en gel de poliacrilamida
Se evaluaron las 2 diluciones de la
pre amplificacin

Para la tincin se utiliz


*Agua de consumo humano.
*La concentracin 1:50 (r.f) no fue
ptima para la palma
*La concentracin 1:10 se pueden
visualizar las bandas.

Diluciones: (1:50 y 1:10)

El otro
problema
Deficiente calidad de la tincin
cuando se utiliza agua de
consumo humano (tiene
contaminantes, halgenos y/o
iones metlicos).

Generan una baja intensidad de


las bandas,
Se recomienda la utilizacin de
agua destilada y deionizada
Se evaluaron
tres tipos de
agua

Generaron turbidez en la
solucin

El uso de este tipo de agua


son geles manchados con
bandas opacas

1. Agua de consumo humano


2. Destilada
Milli Q permite observar un buen nmero
3. Milli Q.
de

ESTUDIO DE CARACTERIZACIN MOLECULAR

En las 12 muestras evaluadas se


detectaron
total de 134 bandas polimrficas con el
uso de 4 combinaciones de cebadores
La combinacin de cebadores:

E-ACA/M-CAG: Presenta el mayor


nmero
de polimorfismos con 68 bandas
polimrficas

E-ACC/M-CAG: Muestra slo 6 bandas


polimrficas.

La alta cantidad de bandas


polimrficas indica la variacin
gentica presente.
Reporta una corta distancia gentica
entre la palma americana y la africana

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