Merck Peruana S. A.

Divisin Qumica
Qco. Carlos Gmez Ventura
Setiembre - 2013

1. Introduccin :
Bases histricas:

En 1901 la cromatografa empieza a dar sus primeros

pasos, con los trabajos del cientfico ruso Mikhail
Semenovich Tswett.
En 1947, el estudiante Alemn Fritz Prior, desarrollo la
Cromatografa Gas Slido.

El Ingles Archer John Porter Martin, recibio

el Premio Nobel por su desarrollo en la
Cromatografa Lquida Lquida (1941),
Cromatografa de Papel (1944) y por el
desarrollo de la Cromatografa de Gases y
desarrollar luego la Cromatografa Gas
Lquido (1950)

Bases histricas:
1952

Martin & James utilizan las primeras columnas empacadas

1954

Inicia la comercializacin de los primeros instrumentos

1957

Golay presenta las primeras columnas capilares (Open Tubular)

1980

Se masifica el uso de columnas capilares

La Cromatografa reemplaza a la
destilacin como mtodo preferido para
separar materiales voltiles.
La separacin cromatogrfica depende
de muchas variables, sin embargo, esta
es una tcnica de separacin mucho
mas poderosa que cualquier otra.

 La Cromatografa es una de las tcnicas analticas ms ampliamente usada

en el mundo
Ms de 50 aos de desarrollo
Cerca de 2000 instrumentos vendidos al ao
Cerca de 25000 instrumentos en uso
La Cromatografa es la tcnica preferida para la separacin y anlisis de
compuestos voltiles
Aplicable a gases, lquidos y
slidos disueltos
Aplicable tanto a materiales
orgnicos e inorgnicos
Materiales
con
pesos
moleculares desde 2 a ms de
1000 UMA

2. Conceptos bsicos :
Cromatografa
Keulemans ha definido la Cromatografa como un
mtodo fsico de separacin en el cual los
componentes a separar se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales constituye la Fase
Estacionaria, de gran rea superficial, y la otra es
la Fase mvil que pasa a travs o a lo largo de la
fase estacionaria.

Analito
Es la sustancia que ha de ser purificada, separada o aislada durante la
cromatografa.

Cromatograma
Es el registro visual del proceso
cromatogrfico. Representa uno o
ms picos o formas que representan
a diferentes componentes que han
sido separados de una mezcla.

 Cromatgrafo
Es el instrumento que presenta una serie de
componentes que cumplen la funcin de
separar analitos en una mezcla y presentar
picos de elucin mediante un cromatograma.

Tiempo de retencin (tr)

Es el tiempo en minutos (o segundos), que
le toma a una molcula en particular, salir
del sistema cromatogrfico.
El tiempo de retencin se mide en el
mximo del pico obtenido.
El tiempo de retencin es un parametro de
identificacin referencial no absoluto, el
cual puede cambiar si las condiciones de
trabajo no son repetibles.

 Fase estacionaria
Es la sustancia que se encuentra fija en la
columna y que la genera el proceso de
separacin, cuando el analito y el solvente,
pasan a travs de ella.
En cromatografia de gases existen diferentes
fases estacionarias, para separar diferentes
analitos.

Fase Mvil
En cromatografa de Gases, la fase mvil es
un gas, el cual transporta al analito y lo
arrastra a travs de la columna, entrando en
contacto con la fase estacionarias sin
reaccionar con ella.

 Ventajas de la Cromatografa de Gases

Anlisis rpidos (Minutos y algunas veces hasta segundos)
Anlisis automatizados (Autoinyectores y Automuestreadores)
Pequea cantidad de muestra (uL o ug)
Alta Resolucin
Confiable, simple y econmico
Mtodos Destructivos y No Destructivos (TCD y MS por ejemplo)
Detectores universales y especficos (desde ppm hasta unos cuantos
ppb)
Mediciones de alta precisin (de 1 a 5% de RSD)

 Desventajas de la Cromatografa de Gases

La tcnica esta limitada al anlisis de compuestos voltiles (la columna
limita la temperatura de uso, el analito debe de tener punto de
ebullicin menor de 500 C).

 Desventajas de la Cromatografa de Gases

No es apropiado para muestras trmicamente labiles
Algunas muestras pueden requerir tediosas preparaciones (las
muestras deben de ser solubles y no reaccionar con la columna)
Requieren tcnica espectroscpicas para confirmar la identidad del
analito (usualmente el espectrmetro de Masas)

3. Componentes de un Cromatgrafo de Gases :

El gas portador o fase mvil, es el que transporta los

compuestos a travs de la columna.

Debe ser qumicamente inerte, de alta pureza (> 99.9%),

compatible con el detector (bajo ruido y sin explosiones),
seco.

El tipo de gas portador depende de la velocidad requerida

para el anlisis y el tipo de detector a emplear. Los ms
utilizados son helio, nitrgeno, hidrgeno o una mezcla
argn con 5 % de metano.

Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas

de complemento en el detector (make-up). El make-up, es un gas de
arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al
detector.

El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o varios tamices
con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxgeno.

Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90

mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares.

3.2.- Controladores de Flujo

El sistema abastecedor de gases debe de proporcionar una razn

de flujo exacta y precisa. Esto nos asegura que los tiempos de
retencin sean reproducibles y minimiza la deriva del detector.

La razn de flujo depende del tipo de columna empleada

(Columnas empacadas de 25 a 100 mL/min y Columnas Capilares
desde unos pocos uL/min a 1 mL/min)
Para el control de flujo de gas de arrastre, es mejor usar un
sistema Electrnico de Control de Flujo (EFC).

La razn de flujo puede decrecer cuando la temperatura de la

columna se incrementa (la viscosidad del gas de transporte se
incrementa con la temperatura)

3.3.- Puerto de Inyeccin

Parte fsica del equipo que separa el medio ambiente del interior del
cromatgrafo. Permite el ingreso de la muestra a la columna para
producir bandas simtricas (picos cromatogrficos).

Propiedades y particularidades del puerto de inyeccin:

Debe de encontrarse cerca de 50 C por encima del punto de

ebullicin del analito.

Debe de ser verstil,

rpido
y
totalmente
cuantitativo.

Debe de prevenir
descomposicin de
muestra en su interior.

la
la

3.3.1.- Modos de Inyeccin (Split & Splitless)

Split

Splitless

Modo con divisin para analitos en concentraciones altas

Modo sin divisin para analitos en concentraciones traza

3.3.2.- Inyeccin On Column

Inyeccin
On Column
(En la columna)

Se utiliza bsicamente para aquellos solutos que son termolbiles y

para los que tienen altos puntos de ebullicin.

La inyeccin se hace directamente en la columna manteniendo la

temperatura inferior al punto de ebullicin del disolvente.

La zona de inyeccin se refrigera con aire.
Aumento brusco de temperatura despus de la inyeccin

3.3.3.- Vaporizacin de Temperatura Programada (PTV)

Se puede emplear en modo split o splitless. Tiene la ventaja de

que se puede trabajar de forma isobrica e isotrmica o bien
empleando rampas de presin y temperatura.

Se puede enriquecer la muestra dentro del inyector, introduciendo

grandes volmenes de muestra.

3.4.- Otras tcnicas de introduccin de muestras

Estas tcnicas se utilizan cuando la matriz presenta caractersticas

complejas y la separacin analtica no es buena.

La tcnica se utiliza para analizar compuestos Volatiles y

Semivolatiles en diferentes tipos de compuestos (Slidos, Lquidos
y Gases)

Las tcnicas ms populares son:

Headspace
Purge & Trap
La popularidad de estas tcnicas, se debe a
que permite el rpido y fcil anlisis de
compuestos orgnicos volatiles (ejemplo:
Alcohol en Sangre, Orgnicos Residuales en
materia Prima para la industria farmacutica,
Aromas en Industrias de Alimentos, etc).

3.4.1.- Otras tcnicas de introduccin de muestras - Headsapce

La muestra se coloca en un vial,

dejando un espacio considerable de
vacio. Se coloca un septum y se
sella hermticamente.

La muestra se calienta y se agita

para poder separar los compuestos
orgnicos en fase vapor, en el
espacio libre del vial.

Una vez agotada la extraccin

(cuando se establece el equilibrio
Lquido-Gas, se introduce la jeringa
en el espacio vaci del vial, tomando
la fase gaseosa del sistema.

La muestra en fase gaseosa de esta forma tomada, se inyecta en el

Cromatgrafo de Gases.

3.4.2.- Otras tcnicas de introduccin de muestras Purge & Trap

En la tcnica del Purge & Trap, la muestra se coloca en un vial y sobre

ella se burbujea un gas inerte (por lo general Helio). En algunas
ocasiones, tambien se aplica temperatura a fin de ayudar a desligar el
analito de la matriz.

Los analitos de inters, son

arrastrados por el gas de
transporte y son captados por
un elemento absorbente, el cual
retiene el analito.

Una vez agotado el analito de la

matriz, el elemento adsorbente
es calentado para desorber a
los analitos y dirigirlos hacia la
columna del inyector y ser
cuantificado.

3.5.- Columnas

Es la parte del sistema cromatogrfico en la cual ocurre la separacin.

Frecuentemente es llamada el corazn del sistema.

La columna cromatogrfica tiene en su interior la fase estacionaria

(lquido o slido).

La resolucin de una columna depende de diferentes factores (longitud

de la columna, fase estacionaria, flujo de gas portador, temperatura de
trabajo, etc)

Dos tipos de columnas: Empacadas y Capilares

3.5.1.- Columnas Empacadas

Columnas Empacadas
Las dimensiones de una columna empacada oscilan entre:

Diametro Interno (DI): 2 y 4.6 mm y de 1/8 a 1/4 de pulgada de dimetro

externo (DO). Longitud entre 6 y 30 pies para las ms comunes.
Soporte slido (diatomita), de partculas porosas y uniformes (10mm),

libre de xidos catalticos (causan descomposicin parcial de la muestra).

Fase estable trmica y qumicamente.
Superficie especfica grande (1 a 20 m 2/g), un ejemplo de stas son la serie

Chromosorb (tierra de diatomeas) (G, P y W).

Columnas capilares de slice fundida recubiertas con poli-imida.

El empaque puede ser un slido, un lquido o un slido recubierto
por un lquido.

3.5.2.- Columnas Capilares

W.C.O.T.
(Wall Coated Open Tubular)

Columnas capilares de slice fundida

recubiertas con poli-imida. El empaque
puede ser un slido, un lquido o un
slido recubierto por un lquido.

(Porous layer Open Tubular)

Columnas: Factores que afectan la eficiencia de la columna

Longitud de la Columna

Dimetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de dimetro externo)

Tamao de las partculas del empaque

Naturaleza de las fases

Grosor de fase estacionaria

Temperatura de la columna

Velocidad del gas portador

Cantidad de muestra inyectada

Columna Empacada

Columna Capilar

Columnas: Factores que afectan la eficiencia de la columna

Columnas: Empacadas vs. Capilares

Columnas: Empacadas vs. Capilares

Baja Resolucin
Pocos Picos (16)
Pocos platos Tericos

Pequea cantidad de muestra

Mejor resolucin
Ms picos
Anlisis ms rpidos

Columnas: Fases Estacionarias

Polidimetilsiloxano

Polietilenglicol

Columnas: Fases Estacionarias

3.6.- Horno de Columna

Es la parte del sistema cromatogrfico que

proporciona la temperatura adecuada para
llevar a cabo la separacin de los analitos.

La temperatura del horno de columna debe de

tener una precisin de 0.1 C

La temperatura del horno depende del tipo de

analito y de la columna que se esta usando.

El horno de la columna debe de tener la

capacidad de trabajar en forma isotrmica y en
rampa de temperaturas (ideal que presente
hasta 6 rampas de temperatura)

El horno de la columna debe de tener la capacidad de ser programado para

subir y bajar de temperatura en forma rpida

Horno de Columna Efecto de la Temperatura en el Tiempo de retencin

3.7.- Detector
Un detector cromatogrfico es el dispositivo que localiza en espacio y tiempo la
posicin de un componente de la mezcla que ha sido sujeto al proceso
cromatogrfico. El detector es el dispositivo que nos permite percibir y apreciar
la naturaleza de la separacin.
La respuesta de un detector puede ser proporcional, diferencial o Integral
Respuesta proporcional: Concentracin
directamente relacionada a la concentracin
del analito. Esto significa que los detectores
nos dan una respuesta casi lineal como sea
posible.
Casi todos los detectores no dan respuesta
proporcional. La respuesta de estos
detectores se someten a conversiones
logartmicas o exponenciales a fin de dar
una
respuesta
lineal
frente
a
la
concentracin del analito.

3.7.1.- Detector de Ionizacin de Flama (FID)

Consiste de una Flama de
Hidrgeno/Aire
y
una
placa
colectora. El efluente de la
columna pasa a travs de la llama,
que
ioniza
las
molculas
orgnicas. Los iones se recogen
en un electrodo de polarizacin
negativa y producen una seal
elctrica.
El FID es extremadamente sensible
y es el detector ms ampliamente
utilizado, su desventaja es que
destruye la muestra.

Empleado para hidrocarburos, poco

sensible a compuestos muy
oxidados

3.7.2.- Detector de Ionizacin de Flama (FID) - Aplicaciones

3.7.3.- Detector de Conductividad Trmica (TCD)

Utilizado particularmente con columnas empacadas, detecta H2O, CO, CO2

e H2
Mide la conductividad trmica de un analito en un gas portador.
La velocidad de prdida de calor de un cuerpo caliente hacia un cuerpo
ms fro es proporcional a la conductividad trmica del gas que separa
estos cuerpos.

3.7.4.- Detector de Conductividad Trmica (TCD) - Aplicaciones

3.7.5.- Detector de Captura de Electrones (ECD)

Utiliza un emisor beta radioactivo

(electrones) para ionizar parte del gas
portador y para producir una corriente
entre un par de electrodos. Cuando las
molculas orgnicas que contienen
grupos funcionales electronegativos,
tales como halgenos, fsforo y grupos
nitro, pasan por el detector, capturan
algunos de los electrones y reducen la
corriente medida entre los electrodos.
Empleado frecuentemente para
compuestos halogenados

3.7.6.- Detector de Captura de Electrones (ECD) - Aplicaciones

p,p'-DDE

13 Endosulphan 11

Heptachlor

Aldrin

Heptachlor Epox.

Endosulphan

10

Dieldrin

11 Endrin

12 p,p'-DDD

14

p,p'-DDt

15 Endrin Aldehyde

16 Endosulphan 2

Detector

Lmite de
deteccin g

Comentarios

Tratamiento
soluto

TCD

10-5-10-6

103-104

Detector
universal

No destructivo

FID

10-12

106-107

Detector
universal

Destructivo

ECD

10-14

102-103

Detector
selectivo

No destructivo

FPD

10-13

102

Detector
Selectivo S,P

Destructivo

NPD

10-8-10-14

105-107

Detector
Selectivo N,P

Destructivo

MSD

10-12

Segn tipo
detector

Detector
universal

Destructivo

Rango lineal

3.8.- Sistema integrador de Datos y Perifericos

El sistema cromatogrfico no estar completo si es que la

informacin obtenida de la separacin no es procesada, registrada y
presentada en la forma conveniente.

La estacin integradora de datos es una PC (Workstation o Laptop),

con la suficiente capacidad de memoria y velocidad, de tal forma que
los datos digitales enviados por el GC sean captados y procesados
de acuerdo a los comandos de integracin especificados por el
usuario.

Las principales y ms importantes caractersticas de una estacin de

trabajo son:
Velocidad en procesamiento de Datos
Capacidad grfica
Compatibilidad con el software de trabajo

4. Cuidados y precauciones para usar un GC :

Instalacin de columnas: medidas de los extremos de
columna

Cuidados y precauciones para usar un GC

Instalacin de columnas: corte de los extremos

Inyector: cambio del Inserto o liners

Inyector: cambio del Inserto o liners

Rutina de mantenimiento
Puerto de inyeccin

(4) Septa
( 9 ) Liners o inserto
( 7 ) O-rings and seals
Ferrules
Mantener un apropiado inventario de
herremientas y consumibles
Desarrollar un horario de rutina de
mantenimiento
Verificar la performance del
instrumento despues del
mantenimiento

Rutina de mantenimiento
Partes del inyector

Resolucin de problemas
Bases para resolver un problema
Define the problem
Isolate potential causes
Check the obvious
Use logical sequence of
troubleshooting steps
Document everything

GC Trace

Contamination
TRACE GC-FID
XTI 30m #2
XTI_30m_070208_2.DAT

Problemas comunes

45

40

35

30

Picoamps

Reproducibility
Noise / Baseline Drift
Ghost Peaks
Tailing Peaks
Fronting Peaks

Septum Bleed

25

20

15

10

0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5
Minutes

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

problemas
GC Trace

20

TRACE GC-FID
XTI 30m
XTI_30m_070208002.DAT

18

Tailing Peaks
Leak in system
Activity / Adsorption
Improper installation

16

14

Picoamps

12

10

16.4

16.6

16.8

17.0

17.2

17.4

17.6

17.8

18.0

18.2

18.4

18.6

18.8

19.0

Minutes

GC Trace

TRACE GC-FID
XTI 30m
XTI_30m_070208.DAT

18

16

14

12

Picoamps

Fronting Peaks
Column overload
Phase incompatibility

10

5.3

5.4

5.5

5.6

5.7

5.8

5.9

6.0

6.1

6.2
Minutes

6.3

6.4

6.5

6.6

6.7

6.8

6.9

7.0

problemas
Baseline Drift
-Carrier Gas leaks
-Temp differences between oven and
detector
-Contamination
-Column bleed

Ghost Peaks
Syringe carryover
Contamination

Resolucin de Problemas
Poor precision, reproducibility or quantitation of peaks
Check or replace syringe
Check or replace inlet liner
May be due to poor solvent focusing
Optimize injection parameters
Check vial caps
Change septum
Background noise
Improper conditioning
Contamination
On-column
Carrier Gas

Oxidation
Detection system

muchas gracias!
carlos.gomez@merckgroup.com