Mtodos moleculares

Son utilizados por laboratorios de

referencia para los parsitos de inters
prioritario, centrndose en el anlisis
de dos tipos de molculas: protenas y
cidos nucleicos (ADN Y ARNm) Entre
ellas estn:
PCR
Southern blot

Southern blot
Tcnica para detectar una secuencia de DNA en particular de
una mezcla de fragmentos de DNA, obtenidos por enzimas
digestivas de DNA usualmente una o mas endonucleasas o
enzimas de restriccin ( estas endonucleasas reconocen
secuencias especificas de DNA de doble cadena y cortan
ambas porciones en lugares concretos hidrolizando enlaces
fosfodiester).
Una vez que han sido separados los fragmentos de DNA en
gel agarosa mediante electroforesis se pueden transferir a una
matriz solida que puede ser una membrana de nitrocelulosa o
de nylon (blot); el DNA es hibridizado con una sonda de DNA
marcada y por autorradiografa se detectan las secuencias
especificas del DNA clonado o DNA gnico.
Se utiliza para el diagnostico de cistecercosis, oncocercosis,
triquinellosis, amibiasis, enfermedad de Chagas y otras
parasitosis

PCR. Reaccin en cadena de la

polimerasa
La PCR es una tcnica que permite
llevar a cabo la sntesis in vitro de
fragmentos de ADN. Est basada en
una reaccin enzimtica catalizada
por una ADN polimerasa, que
produce
mltiples
copias
(amplificacin)
de
un
mismo
fragmento de ADN.

Una PCR tpica incluye tres pasos:

Etapa de desnaturalizacin. Se calientan las muestras a
una temperatura por encima de 90C durante un periodo de
30s-1 minuto. Las molculas de ADN estn compuestas por
dos cadenas de nucletidos (son bicatenarias). Al incubar las
reacciones a esta temperatura elevada se rompen los puentes
de hidrgeno que unen las dos cadenas de nucletidos (la
molcula de ADN se desnaturaliza), de modo que cada una de
las dos cadenas sirve como molde para la copia de un nuevo
fragmento de ADN

 Etapa de cebado o annealing. Las reacciones se enfran

con rapidez a una temperatura que puede variar entre 50-65
C y se incuban a esta temperatura durante un periodo de
entre 30s a 1 minuto para que los cebadores se unan a las
secuencias complementarias en las cadenas molde. Los
cebadores son fragmentos cortos de ADN, entre 15 y 35
nucletidos, de secuencia inversa y complementaria a los
extremos de la regin de ADN que va a copiarse. Son
adems especficos, de modo que se unen exclusivamente a
los extremos del fragmento de ADN a amplificar, y no se
unen a ninguna otra secuencia de ADN cercana

 Etapa de polimerizacin. Las reacciones se incuban

durante un periodo de entre 30s a 1 minuto a 72C,
temperatura ptima de actuacin de la ADN polimerasa, que
aadir los desoxirribonucletidos trifosfato al extremo de los
cebadores e ir sintetizando las cadenas de ADN copia. Al
final de esta etapa, se obtienen dos molculas de ADN por
cada molcula de ADN original de la muestra

Estas tres etapas forman un ciclo que se repite unas 30

veces. En cada nuevo ciclo, tanto las cadenas de ADN
original como las cadenas copiadas sirven como molde para
la sntesis de nuevas copias, de modo que el nmero de
molculas de ADN se duplica en cada ciclo (aumentando la
cantidad de molculas de ADN de forma geomtrica).

El resultado final es un gran

nmero de fragmentos de ADN
flanqueados por los cebadores,
que se obtienen en apenas unas
horas (despus de 30 ciclos, cada
molcula de ADN molde inicial se
habr copiado ms de 1000
millones de veces).
Como los cebadores que se utilizarn en la reaccin son
especficos para secuencias de ADN presentes en el
genoma de un parsito (cebadores especficos de especie),
la PCR puede utilizarse para detectar la presencia de ADN
del parsito en cuestin en una muestra que contenga
tambin ADN que no sea del propio parsito (ADN del
hospedador).

Los resultados de la PCR se analizan

habitualmente mediante la tcnica de
electroforesis en gel de agarosa. En
esta tcnica, la aplicacin de un campo
elctrico permite la separacin a travs
de un soporte slido (gel de agarosa)
de molculas cargadas en funcin de su
tamao. Las molculas ms pequeas
avanzarn ms en el gel y las
molculas ms grandes avanzarn
menos. El ADN tiene carga negativa y
migrar desde el polo negativo hacia el
polo positivo. La separacin simultnea,
en diferentes pocillos del gel, de los
productos de PCR y de un marcador de
peso molecular con fragmentos de ADN
de
tamao
conocido,
permite
determinar
el
tamao
de
los
fragmentos
de
ADN
amplificados
mediante PCR.

METODOS
INMUNOLOGICOS

Tcnica de ELISA

La reaccin Ag-Ac, consiste en que al suero

problema se le agrega un conjugado que son
anticuerpos dirigidos contra anticuerpos humanos
o antgeno, los cuales se unirn a una enzima.
Las enzimas son capaces de modificar al sustrato
en presencia de un cromgeno produciendo un
producto coloreado que es detectado visualmente
o por un espectrofotmetro.

INMUNOFLUOERSCENCIA INDIRECTA
Es una tcnica de doble capa en donde se aplica el
anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de
tejido y se visualiza por tratamiento con un suero antiinmunoglobulina conjugado con fluorocromo.

El proceso consta de dos etapas:

Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los

antgenos que constituyen el substrato conocido
especfico (clulas que contiene virus, T. gondii, T.
pallidum, etc.) sobre l se coloca el suero de quien se
sospecha la presencia de anticuerpos especficos, si la
reaccin es positiva se dar formacin de complejo
antgeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no
estaba marcado.

Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina

humana marcada, que reaccionar con el anticuerpo
del complejo producido en la primera etapa.

BIBLIOGRAFA
Voller, A. The Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (E.L.I.S.A). W.H.O 1978. 2 (1)
Castro Castillo, Alfredo, Guerrero Bermdez, Olga
Marta. 1961.Tcnicas de diagnstico
parasitolgico. Editorial UCR. Pp 90

http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biot
ecnologia/2009/Metanal/claseAngel.pdf
http://es.slideshare.net/jmhr23/diagnstico-parasitolgicometo
do-directoindirecto-y-molecular-i-parcial
http://fciencias.ugr.es/practicasdocentes/wp-content/uploa
ds/guiones/aplicacionDeLaPCR.pdf

 el diagnstico de enfermedades parasitarias ha

logrado un avance significativo gracias a la
aplicacin de mtodos de diagnstico molecular
basados en la hibridacin del acido nucleco.
Estos estudios son factibles ya que todos los
organismos contienen secuencias de acido
nucleco que pueden ser usados en estudios de
hibridacin que ayudan a determinar cepas,
especies y gnero. Pueden detectarse
simultneamente varios parsitos dependiendo
de la especificidad del acido nucleco utilizado.