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CLULAS Y TEJIDOS
VEGETALES
INTRODUCCIN
Es un mtodo de propagacin
asexual
Se obtiene plantas:
Genticamente idnticas entre s y con
planta madre
Limpias de patgenos
A gran escala
Sirve para:
Propagacin de variedades lite
Mejoramiento in vitro
Introduccin de genes forneos (Ingeniera
Gentica)
INTRODUCCIN
En qu consiste:
Tomar una parte de la planta (explante)
En condiciones aspticas
Introducirla en recipiente con medio de
cultivo
Inducir brotacin, elongacin y crecimiento
Inducir enraizamiento
Adaptar a las condiciones externas
Transferir a macetas en invernadero
Transferir al vivero y al campo
INTRODUCCIN
FACTOR
TRANSCRIPCIN
CASCADA
mRNA
En qu se basa?
En la totipotencia de las clulas
vegetales
PROTEINAS
RECEPTOR
HORMONA
INTRODUCCIN
Orden de totipotencialidad
Meristemos
Embrin
Yemas apicales y axilares
Partes jvenes de hojas, peciolos, tallos,
races, pednculos, ptalos
Partes adultas
Clulas muertas:
Esclernquima
Tubos cribosos
Trqueas y traqueidas
INTRODUCCIN
Dos tipos de explantes:
Meristemtico
Embriones, yemas
Fcil propagar
No se requiere incluir reguladores de crecimiento
en el medio de cultivo, porque posen un balance
hormonal endgeno adecuado
Estn activados los genes de la divisin celular
(mitosis)
Estn activados los genes de la organognesis
INTRODUCCIN
Dos tipos de explantes
Diferenciados o adultos
Requieren una fase de desdiferenciacin
(callo)
Reprogramacin de genes
Activacin de genes de mitosis
Activacin de genes de morfognesis
INTRODUCCIN
Clula meristemtica vs. Clula
adulta
Ncleo central grande
Nucleolo voluminoso
Relacin nucleoplsmica elevada
Vacuolo reducida
Numerosas mitocondrias
Ausencia de plastos diferenciados
INTRODUCCIN
Diferenciacin y desdiferenciacin
Diferenciacin
Embrionarias
Hormonas
Desdiferenciaci
INTRODUCCIN
Aplicaciones:
Cultivo de segmentos nodales
Cultivo de meristemos yemas limpieza de virus
Cultivo de explantos sin yemas (organognesis)
Variacin somaclonal
Embriognesis somtica
Cultivo de protoplastos
Cultivo de clulas en suspensin
Cultivo y rescate de embriones
Cultivo de anteras y microesporas
Cultivo de semillas de orqudea
Produccin de metabolitos secundarios
Conservacin de germoplasma in vitro
Establecimiento de un laboratorio de
cultivo de tejidos
Disposicin del
laboratorio
Alejado de caminos de alto trfico
Alejado de corrientes de aire
Alejado de otros laboratorios de
insectos o microorganismos
Alejado de almacenes de semillas u
otro material vegetal
Cuidados
Mantenerlo siempre limpio
No tener plantas dentro del
laboratorio
Fuente de caros y otros contaminantes
reas del
rea
rea
rea
rea
rea
rea
de
de
de
de
de
de
laboratorio
preparacin
lavado y esterilizacin
transferencia (inoculacin)
incubacin
observacin y Examen
oficina
INVERNADEROS
rea de crecimiento
rea de cuarentena y control fitosanitario
V AF
Sala de
siembra II
V
A
F
Sala de
incubacin
Sala de
siembra I
REAS DE LAS
Almacn
QUE CONSTA UN
LABORATORIO
DE CULTIVO DE
TEJIDOS
V
A
F
Sala de
lavado,
secado y
esterilizado
Oficina
Sala de
preparacin
de medios
de cultivo y
tejidos
Antesala
V
A
F
Oficina y antesala
Son reas en las cuales cualquier
persona puede ingresar ya que no
tienen condiciones aspticas.
Sala de lavado
1. Para lavar la cristalera en general
2. Tambin para el 1er. lavado con detergente
del material vegetativo.
Sala de lavado
Debe haber el siguiente material:
- cristalera
- gabinetes con puertas para la cristalera
- estufa de secado por conveccin
- autoclave
- agua caliente y fra
- destilador y desionizador de agua
- fregadero
- instalacin elctrica 110 y 220 V.
Area de siembra
bbbb
OPERADOR
SALA DE INCUBACIN
Las diferentes fases de crecimiento de los inculos
necesitan diferentes foto-perodos, temperatura,
intensidad lumnica, etc.
Debe tener:
- aire acondicionado 22-28 C
- Regulador de fotoperodo: 16 luz, 8 oscuridad
- anaqueles
Area de incubacin y
crecimiento
ALMACN
1.
2.
INVERNADERO
- regulacin de luz, tanto en intensidad como en
fotoperodo
- regulacin de la temperatura
- control de humedad
-
pisos de concreto
exclusin de insectos (mosquiteros)
sistema de nebulizacin
fertilizacin e irrigacin automtica
mezcla de suelos estriles
INVERNADERO
VIVERO
MEDIOS DE CULTIVO
Mezcla de sales minerales
Macronutrientes: N, P, K, Ca, Mg, S
Micronutrientes: Cu, Fe, Mn, Co, Cl,
Vitaminas
Reguladores de crecimiento
Agua
Otras sustancias
MEDIOS DE CULTIVO
Objetivo
Crear condiciones nutricionales,
ambientales , pH y de osmolaridad para
el crecimiento de plantas in vitro
I
II
III
IV
NH4NO3
82.5
KNO3
95
MgSO4. 7H2O
18.5
MnSO4. H2O
0.845
ZnSO4. 7H2O
0.43
CuSO4. 5H2O
0.00125
CaCl2. 2H2O
22
KI
0.0415
CoCl2.6H2O
0.00125
KH2PO4
8.5
H3BO3
0.31
Na2MoO4. 2H2O
0.0125
1650
1900
370
16.90
8.9
0.025
440
0.83
0.025
170
6.2
0.25
27.8
37.3
VITAMINAS:
CONCENTRACIN INICIAL Y FINAL
VITAMINAS
C. INICIAL
C. Final
mg/l
cido Nicotnico B
100 ppm
Piridoxina-HCl B
100 ppm
Tiamina-HCl B
100 ppm
0.1
Glicina
100 ppm
10.000 ppm
100
m-Inositol
azcar
aa
Alcohol
0.5
0.5
Antioxidantes y Antibiticos
cido ascrbico o
vitamina C
cido ctrico
Carbn activado
Antibiticos
PREPARACIN DE UN LITRO DE
M.S.
C1 x V1 = C2 x
V2
C1: 82.5 g/L x 1000 mg =
82.500 mg/L
V1: ?
C2: 1650 mg/L
V2: 1000 ml
82.000 mg/L
V1 = 1650 mg/L x 1000
ml
SALES
NH4NO3
ml/L
20
KNO3
II
MgSO4. 7H2O
10
MnSO4. H2O
ZnSO4. 7H2O
CuSO4. 5H2O
III
CaCl2. 2H2O
10
KI
CoCl2.6H2O
IV
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.
10
PREPARACIN DE UN LITRO DE
M.S.
VITAMINAS
ml/L
cido Nicotnico : B
Piridoxina-HCl : B
Tiamina-HCl : B
Glicina:
m-Inositol:
azcar
Sacarosa:
aa
20
Aalcohol
Azcar
10
30 g
Agar
8g
pH
5.8
5. REGULADORES DE
CRECIMIENTO
Reguladores de crecimiento
Fitorreguladores
compuestos orgnicos
Producidos en la planta o sintticamente
actan en muy pequeas cantidades
Inhiben, promueven o modifican el
crecimiento y formacin de rganos
vegetales.
- Su accin es poco especfica, por lo que
se solapan los efectos de muchos de ellos
- Cuando son producidos por plantas :
fitohormonas
-
Fitohormonas:
- son fitorreguladores producidos por las
plantas
- actan en un lugar diferente de donde son
producidas
- Se clasifican de acuerdo a los efectos que
producen sobre el crecimiento o desarrollo
vegetal.
- Las cuatro principales familias son:
- auxinas - abscisinas
- giberilinas - otros
- citoquininas
Auxinas y citocininas
AUXINAS
SOLUBLE
IBA
cido indolbutrico
Alcohol
2,4-D
cido 2, 4-diclorofenoxiactico
Acetona y
ter
ANA
cido naftalenactico
Acetona y
ter
IAA
Acetona y
ter
Dicamba
Acetona y
ter
Picloram
Acetona y
ter
BAP
Bencilaminopurina
HCl y NaOH
KIN
Cinetina = (N-6
furfurilaminopurina)
HCl y NaOH
CITOKININA
S
Auxinas naturales
Auxinas sintticas
Citocininas
Cotocininas
Balances hormonales
BALANCES HORMONALES
CITOQUININAS
AUXINAS
(ALTO)
(BAJO)
RACES
EMBRIONES
CALLOS
YEMAS
ADVENTICIAS
(BAJO)
(ALTO)
Giberelinas
GIBERILINAS: (GA3)
Inicialmente aisladas del hongo giberella fujikuroi.
Luego se encontr que todas las plantas producen
esta fitohormona.
Presentes en semillas y tejidos en desarrollo
(meristemos, frutos jvenes).
- Inducen la elongacin de los entrenudos y el
crecimiento de los meristemos o yemas in vitro
- Puede romper la dormancia de embriones aislados o
yemas
- Inhiben la formacin de races y vstagos adventicios.
- AG3 es el ms usado, es muy sensible al calor (90.5
act. biol)
OTROS COMPUESTOS...
OTROS COMPUESTOS...
Carbn activado:(CONC. 0,2 - 3 % P/V)
- Se produce por la carbonizacin de la madera
- Absorbe pigmentos txicos, marrones, negros, y en
cultivo de pltano
- Absorbe otros compuestos orgnicos (auxinas,
citokininas)
- El clima luminoso del cultivo cambia (se obscurece) y
forma races.
- Promueve la embriognesis somtica y la
embriognesis en cultivo de anteras
- Efecto estimulador del crecimiento y la organognesis
de las especies leosas.
- Estabiliza el pH
- Ayuda a evitar la oxidacin
ESTERILIZACIN
ESTERILIZACIN
El xito del cultivo de tejidos
depende de la capacidad de
mantener el medio libre de
microorganismos
Compiten por nutrientes con las clulas
vegetales
Crecen ms rpido e invaden el medio
PRINCIPALES FUENTES DE
CONTAMINACIN
rea de trabajo
Instrumentos
Exterior de los recipientes
de cultivo
Material vegetal
Investigador
Esterilizacin
Desinfeccin de explantes
Esterilizacin de medios de cultivo y
soluciones
Esterilizacin de material de vidrio y
herramientas
Esterilizacin de papel, algodn, etc
Desinfeccin de explantes
Aconsejable iniciar con plantas
crecidas in vitro, por tanto libres de
contaminantes
De esto no ser posible:
Iniciar con material vegetal crecido en
ambientes controlados: invernadero o
laboratorio
Desinfectarlos antes de introducirlos in
vitro
Nunca:
Desinfeccin de explantes
Hipoclorito de calcio (9-10% por 5-30
minutos)
Hipoclorito de sodio (0.5 5% por 5-30
minutos)
Incluir en la solucin desinfectante
agentes humectantes (etanol 70:90%,
unas gotas de tween 20) u otros
detergentes tensin superficial
Agitacin o vaco mejora eficiencia
Enjaguar varias veces con agua estril
Desinfeccin de explantes
Si a pesar de la desinfeccin, luego
de varios das aparecen
contaminantes
Es probable que los microorganismos
estn en el interior del explante
Incluir fungistticos o
bacteriostticos en el medio de
cultivo
ej. sulfato de gentamincina, penicilina,
sulfato de estreptomicina, 10-50 mg /
Desinfeccin de explantes
El objetivo del proceso de desinfeccin es obtener
El mximo de esterilidad , y,
El mximo de sobrevivencia del tejido vegetal
ESTERILIZACIN DE
SOLUCIONES
AUTOCLAVEADO Calor hmedo vapor agua
Presin 15 psi o 2-2.2 atmsferas
Temperatura 121 C (mueren esporas)
Volumen mlTiempo min
25 20
50 25
100 28
250 31
500 35
1000 40
Control preventivo
de la contaminacin microbiana
Tejidos (explantes)
Fungistticos y bacteriostticos de amplio
espectro
Sulfato de gentamicina
Penicilina
Sulfato de estreptomicina
10 a 50 mg/L
35 a 40 oC
PLANTA
Esterilizacin = Asptico
Mtodos
Fsicos y qumicos
Axnico
Preparaciones libres de virus
viroides o micoplasmas
NaOCl
1 % al 3 % germicida y agente
oxidante
Alcohol al 70 % durante 30 a 60
segundos
Bicloruro de mercurio HgCl2
0.1% a 1.5 % (p/v)
3 a 4 minutos
Procedimientos de esterilizacin
AUTOCLAVES
ESTU
FA
INCUBADORA